CN112292452A - 生产霉孢菌素样氨基酸的微生物及利用其生产霉孢菌素样氨基酸的方法 - Google Patents

生产霉孢菌素样氨基酸的微生物及利用其生产霉孢菌素样氨基酸的方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及霉孢菌素样氨基酸生产微生物和通过使用该微生物的霉孢菌素样氨基酸的生产方法。根据本申请的具有提高的霉孢菌素样氨基酸生产潜力的微生物可以有效地用于生产霉孢菌素样氨基酸。

Description

生产霉孢菌素样氨基酸的微生物及利用其生产霉孢菌素样氨 基酸的方法
技术领域
本公开涉及生产霉孢菌素样氨基酸的微生物，以及利用该微生物生产霉孢菌素样氨基酸的方法。
背景技术
从太阳发射的紫外(UV)光线由UVA(具有约320nm至约400nm的波长)、UVB(具有约290nm至约320nm的波长)、和UVC(具有约100nm至约280nm的波长)组成。众所周知，UVA光线穿透到真皮层中，主要诱发色素形成和皮肤老化，并参与光敏性皮肤病的发生，而UVB光线是能穿透表皮和真皮基底层的高能光线，参与晒斑、色素形成、和皮肤癌的发生。
为了防止紫外光线的这些副作用，已经尝试了阻挡UV光线。防晒剂的种类包括化学防晒剂和物理防晒剂。化学防晒剂主要通过UV光线的吸收来防止UV光线的穿透，而物理防晒剂则通过反射和散射来防止UV光线的穿透。
已知包含在化学防晒剂中的成分可以包括主要吸收UVB光线的成分(例如，PABA、PABA酯(戊基二甲基PABA、辛基二甲基PABA)、肉桂酸酯(西诺沙酯)、水杨酸酯(水杨酸高孟酯(homomenthyl salicylate))、樟脑等)；以及主要吸收UVA光线的成分(例如，二苯甲酮(氧苯酮、二羟苯宗、和磺异苯酮(suliso benzene))、二苯甲酰甲烷、邻氨基苯甲酸酯等)。尽管这些化学防晒剂可提供吸收和阻挡UV光线的作用，但已知这些化学防晒剂中的一些可刺激皮肤或眼睛，且特别地，PABA、PABA酯、二苯甲酮、和肉桂酸酯等可引起接触性皮炎。另外，已经报道这些化学防晒剂中的其它一些在皮肤中引起光敏反应等。因此，在一些国家，这些化学防晒剂的使用或使用量受到限制。
已知包含在物理防晒剂中的成分可以包括二氧化钛、滑石(硅酸镁)、氧化镁、氧化锌、高岭土等。物理防晒剂的优点在于它们不会引起副作用，如接触性皮炎，并且它们不容易被水移除。然而，它们的缺点在于，对于它们难以在实现期望的制剂同时维持有效含量，并且当它们被应用于皮肤时会发生白浊(white cast)等。
霉孢菌素样氨基酸(MAA)是存在于天然生物中的物质，并已知它们能有效地吸收UVA和UVB。已知自然界中存在多于35种MAA(Mar.Biol.,1991,108:157-166；Planta Med.,2015,81:813-820)。最近，已报道微观藻类中存在附着有各种糖的MAA，并且它们具有优异的抗氧化功能(Journal of Photochemistry and Photobiology,2015,142:154-168)。而且，已知MAA不仅提供阻挡UV光线的能力，而且还提供抗氧化、抗渗透和抗热应力等(Comp.Biochem.Physiol.CToxicol.Pharmacol.,2007,146:60-78；J.Photochem.Photobiol.B.,2007,89:29-35)。
然而，微观藻类内生产的MAA的量很低，仅为几微克的水平，而且微观藻类培养后，分离、提取、和纯化MAA的条件复杂。因此，难于大量生产MAA材料。
[现有技术文献]
[非专利文献]
(非专利文献1)Comp.Biochem.Physiol.B 1995,112:105-114。
(非专利文献2)FEMS Microbiol Lett.2007,269:1-10。
(非专利文献3)Ann.Rev.Physiol.2002,64:223-262。
(非专利文献4)Mar.Biol.1991,108:157-166。
(非专利文献5)Journal of Photochemistry and Photobiology B:Biology.2015,142:154-168
(非专利文献6)Biol.Rev.1999,74:311-345。
(非专利文献7)Mol.Biol.Evol.2006,23:1437-1443。
(非专利文献8)Science,2010,329:1653-1656。
(非专利文献9)Genomics 2010,95:120-128。
(非专利文献10)Geomicrobiol.J.1997.14:231-241。
(非专利文献11)Comp.Biochem.Physiol.C Toxicol.Pharmacol.2007.146:60-78。
(非专利文献12)Can.J.Bot.2003.81:131-138。
(非专利文献13)J.Photochem.Photobiol.B.2007,89:29-35。
(非专利文献14)J.Bacteriol.2011.193(21):5923-5928。
(非专利文献15)Planta Med.2015.81:813-820
(非专利文献16)ACS Appl.Mater.Interfaces.2015.7:16558-16564
(非专利文献17)Appl Environ Microbiol.2016,82(20):6167-6173
(非专利文献18)ChemBioChem.2015,16:320-327
(非专利文献19)Methods Mol Biol.2013,1073:43-7
(非专利文献20)Nature Review,2011,9:791-802
发明内容
技术问题
本发明人已经作出了许多努力来增加微生物中MAA的生产。结果，他们通过与微生物中2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶(2-dehydro-3-deoxyphosphoheptonatealdolase)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(phosphoenolpyruvate synthetase)和转酮醇酶(transketolase)蛋白质的活性增强相关的各种研究，确认了可以在生产MAA的微生物中增加MAA的生产，从而完成了本公开。
技术方案
本发明的目的是提供生产霉孢菌素样氨基酸(MMA)的微生物，其中至少一种选自2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、和转酮醇酶的蛋白质的活性被增强。
本发明的另一个目的是提供生产霉孢菌素样氨基酸的方法，该方法包括：在培养基中培养微生物；以及从培养的微生物或培养基中回收霉孢菌素样氨基酸。
本发明的又一个目的是提供该微生物用于生产霉孢菌素样氨基酸的用途。
有益效果
由于本公开的微生物具有提高的霉孢菌素样氨基酸(MMA)生产能力，因此其可以有效地用于生产霉孢菌素样氨基酸。
具体实施方式
在下文中详细描述本公开。同时，本公开中公开的各自的描述和实施方式还可以应用于其它描述和实施方式。即，本公开中公开的各种要素的所有组合均落入本公开的范围内。另外，本公开的范围不受下面的具体描述限制。另外，本领域普通技术人员可仅使用常规实验就能够识别或鉴定关于本公开的某些方面的许多等同物。进一步，意图将这些等同物包括在本公开中。
为了实现上述目的，本公开的一方面提供了生产霉孢菌素样氨基酸(MMA)的微生物，其中增强了至少一种选自2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、和转酮醇酶的蛋白质的活性。
如本文所用，术语“2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶”是指催化以下反应方案的可逆反应的酶，并且可以具体地可以指合成3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate)(DAHP)的酶，但不限于此。
[反应方案]
Figure BDA0002710587000000031
在本公开中，2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶可与3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合酶互换使用。
如本文所用，术语“磷酸烯醇丙酮酸合酶”是指催化下述反应方案的可逆反应的酶，并且具体地，可以指合成磷酸烯醇丙酮酸的酶，但不限于此。
[反应方案]
Figure BDA0002710587000000032
如本文所用，术语“转酮醇酶”是指催化下述反应方案的可逆反应的酶。
[反应方案]
Figure BDA0002710587000000041
或
Figure BDA0002710587000000042
2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、和转酮醇酶的遗传信息可从已知数据库获得(例如，美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information(NCBI))的GenBank数据库等)，但是不限于此。
因为存在展示活性的蛋白质根据微生物物种或微生物本身在氨基酸序列中有差异的情况，2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、和转酮醇酶不限于它们的来源或序列。
具体地，2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶可以是包括SEQ ID NO:2、37或124的氨基酸序列的蛋白质；磷酸烯醇丙酮酸合酶可以是包括SEQ ID NO:19或98的氨基酸序列的蛋白质；以及转酮醇酶可以是包括SEQ ID NO:24、96或123的氨基酸序列的蛋白质，但这些蛋白质的氨基酸序列不限于此。如本文所用，术语“包括氨基酸序列的蛋白质”可以与“具有氨基酸序列的蛋白质”或“由氨基酸序列组成的蛋白质”的表述互换使用。
另外，在本公开中，只要这些蛋白质具有与这些酶中的每种酶的生物活性相同或相应的生物活性，这些酶可以包括具有上述SEQ ID NOS的氨基酸序列的那些蛋白质，以及与上述氨基酸序列具有80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高的同源性或同一性的那些蛋白质。
另外，明显的是，只要氨基酸序列具有与上述SEQ ID NOS的同源性或同一性，并且具有与上述SEQ ID NOS的酶蛋白实质上相同或相应的生物活性，则在部分序列中具有缺失、修饰、取代、或添加的氨基酸序列的任何蛋白质也都包括在本公开的范围内。
如本文所用，术语“同源性或同一性”是指与给定氨基酸序列或核苷酸序列的匹配程度，并且可以表示为百分比。在本公开中，具有与给定氨基酸序列或核苷酸序列相同或相似活性的同源序列表示为“％同源性”或“％同一性”。例如，可以使用用于计算参数(如得分、同一性和相似性)的标准软件(具体地，BLAST 2.0)，或通过在限定的严格条件下经由southern杂交比较序列，来确认同源性。限定的适当的杂交条件可在本领域范围内并且可以通过本领域技术人员众所周知的方法来确定(例如，J.Sambrook等人,MolecularCloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel等人,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York)。术语“严格条件”是指在多核苷酸之间能够特异性杂交的条件。例如，这些条件被具体地公开于文献(例如，J.Sambrook等人，同上)中。
只要这些多核苷酸具有与这些酶中的每种酶相同或相应的生物活性，则本公开的2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、和转酮醇酶可以包括编码具有上述SEQ ID NOS的氨基酸序列，或与上述SEQ ID NOS的氨基酸序列具有80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高同源性或同一性的蛋白质的多核苷酸。
另外，由于密码子简并性，考虑到待表达的蛋白质所在的生物中优选的密码子，可以在不改变来自编码区待表达的蛋白质的氨基酸序列的范围内，对核苷酸序列的编码区进行各种修饰。因此，可以不受限制地包括具有编码每种酶蛋白的序列的任何多核苷酸。
另外，可以不受限制地包括通过与任何探针杂交编码蛋白质(具有2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、或转酮醇酶蛋白的活性)的任何序列，所述探针可在严格条件下由已知基因序列(例如，与上述多核苷酸序列的全部或部分互补的序列)制备。
术语“严格条件”是指使多核苷酸之间能够特异性杂交的条件。这些条件被具体地描述于文献(例如J.Sambrook等人，同上)中。例如，可以列出，在具有高同源性或同一性(40％或更高，具体地90％或更高，更具体地95％或更高，甚至更具体地97％或更高、和最具体地99％或更高的同源性或同一性)的基因之间的杂交，而在具有低于上述同源性或同一性的同源性或同一性的基因之间不进行杂交的条件；或在southern杂交的常规洗涤条件(即，在对应于60℃，1×SSC，0.1％SDS，具体地60℃，0.1×SSC，0.1％SDS，和更具体地68℃，0.1×SSC，0.1％SDS的盐浓度和温度下，洗涤一次、具体地洗涤两次或三次)。
尽管根据杂交的严格程度，碱基之间的错配是可能的，但杂交要求两个多核苷酸具有互补序列。术语“互补”用于描述可彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，关于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，以及胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开还可包括与整个序列互补的分离的多核苷酸片段以及实质上相似的多核苷酸序列。
具体地，可以使用杂交条件(其包括在55℃的Tm值下的杂交步骤)并使用上述条件来检测具有同源性或同一性的多核苷酸。另外，Tm值可以是60℃、63℃、或65℃，但温度不限于此，并且可以由本领域技术人员根据目的适当地调节。
适于多核苷酸杂交的严格程度取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且其变量在本领域是公知的(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51和11.7-11.8)。如本文所用，术语“活性的增强”意指酶蛋白的活性被引入或与其中微生物具有的其内源性活性或其修饰前的活性相比，活性被增强。活性的“引入”意思是微生物天然或人工展示微生物中本来不具有的特定蛋白质的活性。具体地，具有增强的酶蛋白活性的微生物是指其中与天然野生型微生物或未修饰微生物的活性相比，酶蛋白活性增强的微生物。活性的增强可以包括，例如，通过引入外源性2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、和/或转酮醇酶到微生物中的活性的增强；或内源性2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、和/或转酮醇酶的活性的增强。
具体地，在本公开中，活性的增强方法可以包括：
(1)增加编码酶的多核苷酸的拷贝数的方法；
(2)用于增加多核苷酸表达的修饰表达控制序列的方法；
(3)用于增强酶活性的修饰染色体上的多核苷酸序列的方法；或
(4)通过上述方法(1)至(3)的组合来增强的修饰的方法等，但方法不限于此。
增加多核苷酸的拷贝数的方法(1)可以以其中将多核苷酸可操作地连接至载体的形式进行，或者通过将多核苷酸插入到宿主细胞的染色体中来进行，但方法不特别限于此。另外，作为替代，拷贝数可以通过将展示酶活性的外源多核苷酸或上述多核苷酸的密码子优化的修饰多核苷酸引入到宿主细胞中来增加。只要多核苷酸展示与酶相同或相似的活性，外源多核苷酸就可以不受其来源或序列的限制而使用。可以由本领域技术人员通过适当地选择已知的转化方法来进行引入，并且酶的活性可以被增强，使得引入的多核苷酸在宿主细胞中表达，从而生产酶。
接下来，用于增加多核苷酸表达的修饰表达控制序列的方法(2)，可以通过以下来进行：通过缺失、插入、非保守或保守取代、或其组合来诱导序列中的修饰，以进一步增强表达控制序列的活性；或通过用具有更强活性的核酸序列置换核酸序列，但方法不特别限于此。表达控制序列可以包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列、控制转录和翻译的终止的序列等，但表达控制序列不特别限于此。
具体地，代替原始启动子的强异源启动子可能被连接到多核苷酸表达单元的上游，且强启动子的实例包括CJ7启动子、lysCP1启动子、EF-Tu启动子、groEL启动子、aceA或aceB启动子等。更具体地，多核苷酸表达单元可以可操作地连接到棒杆菌属(Corynebacterium)来源的启动子，如lysCP1启动子(WO 2009/096689)、CJ7启动子(WO2006/065095)、SPL启动子(KR 10-1783170B)、或o2启动子(KR 10-1632642B)，以提高编码酶的多核苷酸的表达率，但方法不限于此。
进一步，修饰染色体上的多核苷酸序列的方法(3)的可以通过以下进行：通过缺失、插入、非保守或保守取代、或其组合来诱导表达控制序列中的修饰，以进一步增强多核苷酸序列的活性；或通过用具有更强活性的改进的多核苷酸序列置换核酸序列，但方法不特别限于此。
最后，通过方法(1)至方法(3)的组合来增强的修饰的方法(4)可以通过应用方法中的一个或多个方法一起来进行：增加编码酶的多核苷酸的拷贝数的方法；修饰用于增加表达的表达控制序列的方法；以及修饰染色体上的多核苷酸序列的方法，或修饰展示酶的活性的外源多核苷酸或其密码子优化的修饰的多核苷酸的方法。
当多核苷酸是能够发挥功能的多核苷酸的集合时，它们可以被描述为基因。在本公开中，多核苷酸和基因可以互换使用，并且多核苷酸序列和核苷酸序列可以互换使用。
如本文所用，术语“载体”是指包括编码目标蛋白的多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建体，其中目标蛋白可操作地被连接至适合的控制序列，使得它能够在适当的宿主中被表达。控制序列可以包括能够起始转录的启动子、用于控制转录的任何操纵子序列、编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列、和控制转录和翻译的终止的序列。在转化到适合的宿主细胞中之后，载体可以与宿主基因组无关地复制或起作用，或可以被整合到宿主基因组本身中。
只要载体可在宿主细胞中复制，则本公开中使用的载体不受特别地限制，并且可以使用本领域中已知的任何载体。常规载体的实例可包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、和Charon21A等，且作为质粒载体，可以使用pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、和pET等。具体地，可以使用载体如pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC、pSKH、pRS-413、pRS-414、和pRS-415等，但载体不限于此。
可以在本公开中使用的载体不受特别地限制，并且可以使用任何已知的表达载体。另外，可通过用于在细胞中染色体插入的载体将编码染色体中目标蛋白的多核苷酸插入到染色体中。可以使用本领域已知的任何方法(例如通过同源重组)，将多核苷酸插入到染色体中，但插入的方法不限于此。可以进一步包括用于确认插入到染色体中的选择标记。选择标记用于选择用载体转化的细胞(即，为了确认目标核酸分子是否已被插入)，以及可以使用能够提供可选表型(例如，药物耐性、辅源营养、对细胞毒剂的耐性、和表面蛋白的表达)的标记。在用选择剂处理的环境下，只有能够表达选择标记的细胞才能存活或表达其它表型性状，并且因此转化的细胞可容易地被选择。
如本文所用，术语“转化”是指将包括编码目标蛋白的多核苷酸的载体引入到宿主细胞中，使得由多核苷酸编码的蛋白质可在宿主细胞中表达。无论转化的多核苷酸是被插入到宿主细胞的染色体中以位于其中还是位于染色体外，只要转化的多核苷酸可在宿主细胞中表达，那么转化的多核苷酸不特别地被限制。另外，多核苷酸包括编码目标蛋白的DNA和RNA。只要多核苷酸可被引入到宿主细胞中并在其中表达，多核苷酸被引入的形式无关紧要。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式被引入到宿主细胞中，表达盒是包括用于自主表达(self-expression)的所有必要元件的基因构建体。表达盒可包括常规地可操作地连接到多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点、和翻译终止信号。表达盒可以是能够自复制的表达载体。另外，多核苷酸可以是以多核苷酸本身被引入到宿主细胞中并被连接到在宿主细胞中表达所必要的序列的多核苷酸，但不限于此。转化的方法包括将核酸引入到细胞中的任何方法，并且可以通过根据宿主细胞选择本领域已知的适合的标准技术来进行。例如，转化方法可以包括电穿孔、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)方法、EAE-葡聚糖方法、阳离子脂质体方法、乙酸锂-DMSO方法等，但方法不限于此。
另外，如本文所用，术语“可操作地连接”意指起始和介导编码本公开的目标蛋白的多核苷酸转录的启动子序列和多核苷酸序列之间的功能性连接。可操作连接可通过本领域已知的遗传重组技术制备，并且位点特异性DNA切割和连接可使用本领域已知的限制酶、连接酶等制备，但不限于此。
在本公开的微生物中，3-脱氢奎尼酸脱水酶的活性可以进一步被失活。
如本文所用，术语“3-脱氢奎尼酸脱水酶”是指在下面的反应方案中催化可逆反应的酶，并且具体地，它可以将3-脱氢奎尼酸转化为3-脱氢莽草酸，但不限于此。
[反应方案]
Figure BDA0002710587000000081
因为存在根据微生物的物种或微生物而显示3-脱氢奎尼酸脱水酶活性的蛋白质在它们的氨基酸序列中有差异的情况，所以3-脱氢奎尼酸脱水酶不受其来源或序列的限制。具体地，3-脱氢奎尼酸脱水酶可以是包括SEQ ID NO:90的氨基酸序列的蛋白质，但不限于此。另外，3-脱氢奎尼酸脱水酶可包括SEQ ID NO:90的氨基酸序列或与SEQ ID NO:90具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同源性或同一性的氨基酸序列。另外，明显地，只要氨基酸序列具有上述同源性或同一性并且具有与上述蛋白质相同或相应的生物活性，在部分的序列中具有缺失、修饰、取代、或添加的任何氨基酸序列也可被包括在本公开的范围内。
如本文所用，术语“失活”是指酶蛋白的活性与微生物最初具有的酶蛋白的内源活性或修饰前的酶蛋白活性相比被减弱的情况；蛋白质完全不表达的情况；或蛋白质表达但无活性的情况。失活是这样的概念，其包括：由于编码酶的多核苷酸的修饰等，酶本身的活性与微生物具有的其内源活性相比被减弱或活性被移除的情况；由于编码酶的基因的表达的抑制或翻译的抑制等，酶的总细胞内活性程度与其野生型微生物相比较低或活性被移除的情况；编码酶的基因的部分或全部缺失的情况；以及其组合，但失活不限于此。即，酶的活性被失活的微生物是指其中酶蛋白的活性与其天然野生型微生物或未修饰微生物的活性相比较低或其中活性被移除的微生物。
酶活性的失活可以通过应用本领域已知的各种方法而实现。以上方法的实例包括：1)缺失染色体上编码酶的基因的部分或全部的方法；2)修饰表达控制序列以减少染色体上编码蛋白质的基因的表达的方法；3)修饰染色体上编码蛋白质的基因序列使得蛋白质的活性被移除或减弱的方法；4)引入与染色体上编码蛋白质的基因的转录物互补结合的反义寡核苷酸(例如，反义RNA)的方法；5)通过在染色体上编码蛋白质的基因的SD序列前端上添加与Shine-Dalgarno(SD)序列互补的序列以形成二级结构，使核糖体不可能附着的方法；6)逆转录工程(RTE)方法，其中将反向转录的启动子添加到编码蛋白质的多核苷酸序列的开放阅读框(ORF)的3'端等；并且失活可以通过其组合来实现，但方法不特别限于此。
缺失染色体上编码酶的基因的部分或全部的方法可以通过使用用于染色体插入的载体，用具有部分缺失的核苷酸序列的多核苷酸或标记基因置换染色体内编码内源性目标蛋白的多核苷酸来进行。作为缺失多核苷酸的全部或部分的方法的实例，可以使用通过同源重组缺失多核苷酸的方法，但方法不限于此。
修饰表达控制序列的方法可以通过经由缺失、插入、保守或非保守取代、或其组合来诱导表达控制序列中的核酸序列的修饰，以进一步减弱表达控制序列的活性来进行；或通过用具有更弱活性的核酸序列置换核酸序列来进行。表达控制序列可包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列、以及调控转录和翻译的序列，但不限于此。
修饰染色体上的基因序列的方法可以通过经由缺失、插入、保守或非保守取代、或其组合来诱导基因序列中的修饰，以进一步减弱酶的活性来进行；或通过用修饰以具有更弱活性的基因序列、或修饰以完全不具有活性的基因序列置换基因序列来进行，但方法不限于此。
在上面，尽管术语“部分”可根据多核苷酸的种类而变化，但可具体地指1个核苷酸至300个核苷酸、更具体地1个核苷酸至100个核苷酸、和甚至更具体地1个核苷酸至50个核苷酸，但不特别地限于此。
在本公开的微生物中，与未修饰的微生物相比，3-脱氢奎尼酸合酶蛋白的活性可以进一步加强。
3-脱氢奎尼酸合酶是指催化下述反应方案的可逆反应的酶，并且具体地可以合成3-脱氢奎尼酸(3-DHQ)，但不限于此。
[反应方案]
Figure BDA0002710587000000091
如本文所用，术语“霉孢菌素样氨基酸(MAA)”是指吸收紫外(UV)光线的环状化合物。在本公开中，只要霉孢菌素样氨基酸能吸收UV光线，霉孢菌素样氨基酸不受限制，且具体地，其可以是具有环己烯酮或环己烯亚胺(cyclohexenimine)的中心环的化合物；或可以是其中各种物质(例如，氨基酸等)被结合到中心环的化合物，且更具体地，它可以是霉孢菌素-2-甘氨酸、palythinol、palythenic acid、deoxygadusol、霉孢菌素-甲胺-苏氨酸、霉孢菌素-甘氨酸-缬氨酸、palythine、asterina-330、shinorine、porphyra-334、euhalothece-362、霉孢菌素-甘氨酸、霉孢菌素-鸟氨酸、霉孢菌素-赖氨酸、霉孢菌素-谷氨酸-甘氨酸、霉孢菌素-甲胺-丝氨酸、霉孢菌素-牛磺酸、palythene、palythine-丝氨酸、palythine-丝氨酸-硫酸盐、palythinol、usujirene、或其组合。
在本公开中，术语霉孢菌素样氨基酸可与MAA和MAAs互换使用。
如本文所用，术语“生产霉孢菌素样氨基酸(MAA)的微生物”可以指包括参与MAA的生物合成的酶的基因或这些基因的簇的微生物，或其中簇被引入或增强的微生物。另外，如本文所用，术语“霉孢菌素样氨基酸(MAA)生物合成基因簇”可以指编码参与MAA生物合成的酶的基因的组，且具体地，可以包括MAA生物合成基因、具有将附加氨基酸残基附接到MAA的活性的酶的基因、或上述基因的簇。只要包括这种基因的微生物可以生产MAA，MAA生物合成基因包括微生物的外源基因和/或内源基因。外源基因可以是同源的和/或异源的。
只要包括MAA生物合成基因的微生物可生产参与MAA生物合成的酶并因此生产MAA，则微生物的物种(MAA生物合成基因源自该微生物)不受限制。具体地，微生物的物种(MAA生物合成基因源自该微生物)可以是蓝细菌(cyanobacteria)(例如，多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)、点状念珠藻(Nostoc punctiforme)、产泡节球藻(Nodulariaspumigena)、蓝丝菌属PCC 7424(Cyanothece sp.PCC 7424)、鞘丝藻属PCC 8106(Lyngbyasp.PCC 8106)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、原型微鞘藻(Microcoleuschthonoplastes)、蓝丝菌属ATCC 51142(Cyanothece sp.ATCC 51142)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaera watsonii)、蓝丝菌属CCY 0110(Cyanothece sp.CCY 0110)、静水柱孢藻属PCC 7417(Cylindrospermum stagnale sp.PCC 7417)、嗜盐隐杆藻(Aphanothecehalophytica)或红海束毛藻(Trichodesmium erythraeum))；或真菌(例如，稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、小麦黄斑叶枯病菌(Pyrenophora tritici-repentis)、棒曲霉菌(Aspergillus clavatus)、赤球丛赤壳(Nectria haematococca)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)、苜蓿黄萎病菌(Verticillium albo-atrum)、灰葡萄孢霉(Botryotinia fuckeliana)、或小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum))；或海葵(Nematostella vectensis)、三角异囊藻(Heterocapsa triquetra)、尖尾藻(Oxyrrhis marina)、微小卡罗藻(Karlodinium micrum)、奇迹束丝放线菌(Actinosynnemamirum)等，但不限于此。
根据实施方式，生产MAA的本公开的微生物包括MAA生物合成基因或其簇。具体地，在微生物中，可以引入MAA生物合成基因簇，或者与内源活性或修饰前的活性相比，可以增强由基因编码的蛋白质的活性，但微生物不限于此。
另外，虽然只要微生物可生产MAA，则MAA生物合成基因可以不受酶的它们的名称或这些基因源自的微生物限制，但MAA生物合成基因可以包括编码酶蛋白的基因，酶蛋白具有与选自2-脱甲基(demetyl)4-deoxygadusol合酶、O-甲基转移酶和C-N连接酶的一种或多种、具体地一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、或所有的酶蛋白相同和/或相似的活性。
例如，2-脱甲基4-deoxygadusol合酶是将景天庚酮糖-7-磷酸转化为2-脱甲基-4-deoxygadusol的酶。O-甲基转移酶是将2-脱甲基-4-deoxygadusol转化为4-deoxygadusol的酶，并且4-deoxygadusol的糖基化(glycylation)由C-N连接酶催化。
另外，生产MAA的微生物可以包括具有将附加氨基酸残基附接到MAA的活性的酶的基因，或者基因的簇。虽然只要生产MAA的微生物可以生产附接有两个或更多个氨基酸残基的MAA，则上述基因或基因簇不受酶的它们的名称或这些基因源自的微生物限制，但生产MAA的微生物可以包括编码酶蛋白的基因，酶蛋白具有与选自以下酶蛋白的一种或多种、具体地一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、或所有的酶蛋白相同和/或相似活性：非核糖体肽合成酶(NRPS)、非核糖体肽合成酶样酶(non-ribosomal peptide synthetase-likeenzyme)(NRPS样酶(NRPS-like enzyme))、和D-丙氨酸D-丙氨酸连接酶(D-Ala D-Ala连接酶；DDL)。
MAA中的一些在霉孢菌素-甘氨酸中包括第二个氨基酸残基。选自非核糖体肽合成酶、非核糖体肽合成酶样酶、和D-Ala D-Ala连接酶的一种或多种酶可以将第二个氨基酸残基附接至霉孢菌素-甘氨酸。
根据一个实施方式，只要酶(如非核糖体肽合成酶、非核糖体肽合成酶样酶、和D-Ala D-Ala连接酶)具有能够将第二个氨基酸附接至霉孢菌素-甘氨酸的活性，生产MAA的微生物可以不受酶的名称或MAA生物合成基因源自的微生物的物种限制地包括这些酶。
例如，在多变鱼腥藻中的非核糖体肽合成酶样酶(Ava_3855)或在点状念珠藻中的D-Ala D-Ala连接酶(NpF5597)可以将丝氨酸残基附接到霉孢菌素-甘氨酸以形成shinorine。在另一个实例中，霉孢菌素-2-甘氨酸可以通过嗜盐隐杆藻中的D-Ala D-Ala连接酶同系物(Ap_3855)使第二个甘氨酸残基附接而形成。相似地，在奇迹束丝放线菌中，丝氨酸或丙氨酸可通过D-Ala D-Ala连接酶被附接，并且从而可以形成shinorine或霉孢菌素-甘氨酸-丙氨酸。根据本公开的一个实施方式的微生物可以在上述酶或具有与上述酶相同和/或相似活性的酶中选择和包括适合于生产期望的MAA的那些酶。
可以在本公开中使用的2-脱甲基4-deoxygadusol合酶、O-甲基转移酶、C-N连接酶、非核糖体肽合成酶、非核糖体肽合成酶样酶、和/或D-Ala D-Ala连接酶可不受这些酶衍生自的微生物的物种限制，只要已知这些酶能够执行与上述酶的功能和作用相同和/或相似的功能和作用，且它们之间的同源性或相似性值的范围也不受限制。例如，静水柱孢藻PCC7417的MylA、MylB、MylD、MylE和MylC与源自多变鱼腥藻和点状念珠藻的2-脱甲基4-deoxygadusol合酶、O-甲基转移酶、C-N连接酶、和D-Ala D-Ala连接酶同源，并且它们之间的相似性的程度在约61％至约88％的范围内(Appl Environ Microbiol,2016,82(20),6167-6173；J Bacteriol,2011,193(21),5923-5928)。即，只要已知可以用于本公开中的酶展示相同和/或相似的功能和效果，则可以用于本公开中的酶可以不显著地受酶源自的物种、序列同源性、或序列同一性限制。另外，将现有技术文件中描述的非专利文献通过引用以其整体总体上被包括到本公开中。
另外，MAA生物合成基因可以是编码包括SEQ ID NO:115、116、117、118、119、120、121、或122的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸，但MAA生物合成基因不限于此。
另外，MAA生物合成基因可以包括编码包括与SEQ ID NO:115、116、117、118、119、120、121、或122的氨基酸序列具有50％、60％、或70％或更高、具体地80％或更高、更具体地90％或更高、甚至更具体地95％或更高、和最具体地99％或更高的同源性或同一性的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列，以及只要微生物可生产MAA，就可以不受限制地包括编码上述同源性或同一性范围外的蛋白质的核苷酸序列。具体地，MAA生物合成基因可以包括SEQID NO:102、103、104、105、106、107、108、或109的核苷酸序列，但不限于此。
另外，明显地，只要氨基酸序列具有与上述序列的同源性或同一性，且实质上具有与上述SEQ ID NOS的蛋白质相同或相应的生物活性，在部分序列中具有缺失、修饰、取代、或添加的任何氨基酸序列也可被包括在本公开中。
另外，由于密码子简并性，考虑到待表达蛋白质的生物中优选的密码子，可以在不改变来自编码区的待表达蛋白质的氨基酸序列的范围内，在核苷酸序列的编码区域中进行各种修饰。因此，关于MAA生物合成基因，只要核苷酸序列是编码参与MAA生物合成的蛋白质的核苷酸序列，任何核苷酸序列都可以不受限制地被包括在本公开中。
可选地，编码参与MAA生物合成的蛋白质的任何序列——通过在严格条件下与可以由已知的基因序列制备的任何探针(例如，与全部或部分核苷酸序列互补的序列)杂交——可以不受限制地被包括在本公开中。
根据一个实施方式，生产MAA的微生物可以包括具有不同来源的MAA生物合成基因。
在本公开中，蛋白质活性的增强和/或基因的引入可以不管顺序地同时、顺序地、和以相反的顺序进行。
生产MAA的微生物通过包括MAA生物合成基因簇来生产MAA，且另外，可以是其中通过增强选自2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶和转酮醇酶的一种或多种蛋白质的活性而增加MAA生产能力的微生物。另外，只要它是通过增强选自2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶和转酮醇酶的一种或多种蛋白质的活性而提高MAA生产能力的微生物，本公开的微生物不受限制。具体地，本公开的微生物可以是棒杆菌属(genus Corynebacterium)的微生物、埃希氏菌属(genus Escherichia)的微生物、或酵母。
棒杆菌属的微生物可以具体地是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、热氨基棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)等，并且更具体地，可以是谷氨酸棒杆菌，但微生物不限于此。
埃希氏菌属的微生物可以具体地是艾伯替埃希氏菌(Escherichia albertii)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、弗氏埃希氏菌(Escherichia fergusonii)、赫氏埃希氏菌(Escherichia hermannii)、伤口埃希氏菌(Escherichia vulneris)等，并且更具体地，可以是大肠埃希氏菌，但微生物不限于此。
酵母可以具体地是属于子囊菌门(phylum Ascomycota)的酵母亚门(Saccharomycotina)、外囊菌亚门(Taphrinomycotina)、或担子菌门(phylumBasidiomycota)的伞菌亚门(Agaricomycotina)、属于柄锈菌亚门(phylumPucciniomycotina)的微生物等，更具体地，酵母菌属(genus Saccharomyces)的微生物、裂殖酵母属(genus Schizosaccharomyces)的微生物、发夫酵母属(genus of Phaffia)的微生物、克鲁维酵母属(genus of Kluyveromyces)的微生物、毕赤酵母属(genus of Pichia)的微生物、和假丝酵母属(genus of Candida)的微生物、并且更具体地，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，但微生物不限于此。
本公开的又一方面提供了生产霉孢菌素样氨基酸的方法，其包括在培养基中培养本公开的微生物；以及从培养的微生物或培养基中回收霉孢菌素样氨基酸(MAA)。
“微生物”和“霉孢菌素样氨基酸(MAA)”如上所述。
如本文所用，术语“培养”意指在适当控制的环境条件下使微生物生长。本公开的培养过程可以在本领域已知的适合的培养基和培养条件中进行。根据待选择的微生物，本领域技术人员可以容易地调节培养过程用于使用。培养微生物的步骤可以通过本领域已知的分批培养法、连续培养法、补料分批培养法等进行，但培养微生物的步骤不特别限于此。对用于培养本公开的微生物的培养基和其它培养条件没有特别限制，但可以使用用于微生物常规培养的任何培养基。具体地，本公开的微生物可以在含有适当的碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素等的常规培养基中在需氧条件下，同时调节温度、pH等来培养。具体地，可以使用碱性化合物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾、或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)调节pH以获得最佳的pH(例如，pH 5至9、具体地pH 6至8、和最具体地pH 6.8)，但调节pH的方法不限于此。另外，为了维持培养物的需氧状态，可以将氧气或含氧气体注入到培养物中；或为了维持培养物的厌氧或微需氧状态，可以将氮气、氢气或二氧化碳气体注入到培养物中、或不注入气体，但气体不限于此。另外，培养温度可以维持在20至45℃、且具体地在25至40℃，并且培养可以进行约10至160小时，但不限于此。另外，在培养期间，可以添加消泡剂(例如，脂肪酸聚乙二醇酯)以防止泡沫生成，但不限于此。
另外，作为在用于培养的培养基中使用的碳源，可以单独或组合使用糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、花生油、和椰子油)、脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如，甘油和乙醇)、有机酸(例如，乙酸)等，但碳源不限于此。作为氮源，可以单独或组合使用含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉、和尿素)和无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、和硝酸铵)等，但氮源不限于此。作为磷源，可以单独或组合使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、和其相应的含钠盐等，但磷源不限于此。另外，培养基可包括必需的促生长物质，如金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸、和维生素。
通过培养生产的MAA可能被分泌到培养基中，或者保留在细胞中。
如本文所用，术语“培养基”是指用于培养本公开的微生物的培养基和/或培养后获得的产物。培养基是包括以下两种形式的概念：包含微生物的形式；通过离心、过滤等从含有微生物的培养溶液中移除微生物的形式。
在回收在上述本公开的培养步骤中生产的MAAs的步骤中，可以根据培养方法使用本领域已知的适当方法从培养液中收集期望的MAAs。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等，并且可以使用本领域已知的适当方法从培养的微生物或培养基中回收期望的MAAs。另外，回收MAAs的步骤可以进一步包括分离步骤和/或纯化步骤。
本公开的又一方面提供了本公开的微生物用于生产霉孢菌素样氨基酸(MAA)的用途。
“微生物”和“霉孢菌素样氨基酸”如上所述。
实施例
在下文，将参考以下实施例更详细地描述本公开。然而，这些实施例仅是出于说明性目的，并且本公开的范围不受这些实施例限制。
＜基于大肠埃希氏菌(E.coli)的生产MAAs的重组微生物的制备及使用其的MAAs的生产>
实施例1：其中2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶的活性被增强的菌株的制备
为了增加微生物的MAAs生产的能力，制备了其中2-脱氢-3-脱氧磷酸庚酸醛缩酶的活性被增强的大肠埃希氏菌菌株。具体地，基于大肠埃希氏菌W3110菌株进一步引入aroG基因(2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶；SEQ ID NOS:1和2)。用于制备质粒的模板和引物显示在下面的表1中。
[表1]
Figure BDA0002710587000000141
用上述模板和引物通过PCR扩增基因片段后，使用In-FusionR HD克隆试剂盒(Clontech)将扩增的片段连接到pSKH载体(PCT/KR2007/006933)(其中用BamH1-SpeI限制性酶处理了fhuA arm 1和fhuA arm 2基因片段)上，且制备的载体命名为pSKH-ΔfhuA。由于fhuA基因的缺失，大肠埃希氏菌的噬菌体感染被抑制。
使用In-FusionR HD克隆试剂盒(Clontech)将Pn_aroG基因片段连接到用Spe1-EcoRV限制性酶切割的pSKH-ΔfhuA载体上。用Spe1-Nde1限制性酶消化已知作为增强启动子的Ptrc和Pcj1基因片段并用Nde1-EcoRV限制性酶消化aroG基因片段后，使用In-FusionRHD克隆试剂盒(Clontech)将Ptrc和aroG基因片段或Pcj1(韩国专利号10-620092)和aroG基因片段分别连接到用Spe1-EcoRV限制性酶切割的pSKH-ΔfhuA载体上。制备的载体分别命名为pSKH-ΔfhuA-Pn-aroG、pSKH-ΔfhuA-Ptrc-aroG、和pSKH-ΔfhuA-Pcj1-aroG。
关于成功克隆和每个载体中的基因序列，通过测序对上述载体进行了确认，然后将上述载体通过电穿孔转化到各野生型大肠埃希氏菌W3110菌株中。每个转化的基因通过一次重组(交叉(cross-over))被引入到染色体中，然后通过二次重组(交叉)将质粒区域从染色体切除。对于每种转化的大肠埃希氏菌菌株(其中完成了二次重组)，使用SEQ ID NO:14(正向)和8(反向)的引物通过PCR确认了aroG基因的引入。
实施例2：过表达源自微观藻类的shinorine生物合成基因的载体的制备
基于多变鱼腥藻(A.variabilis)的用于shinorine生物合成的基因簇由四个基因(Ava_ABCD)组成，四个基因编码2-脱甲基4-deoxygadusol合酶、O-甲基转移酶、C-N连接酶和非核糖体肽合成酶。使用多变鱼腥藻ATCC29413的基因组DNA鉴定了用于shinorine生物合成的基因簇。使用pECCG117_Pcj1_GFP_终止子载体，制备了包括源自多变鱼腥藻ATCC29413的shinorine生物合成基因的载体。shinorine生物合成基因表达载体的名称以及用于载体制备的各自模板和引物示于下表2中。
[表2]
Figure BDA0002710587000000151
使用上面的模板和引物获得了基因片段，然后使用In-FusionR HD克隆试剂盒(Clontech)将每个基因片段连接到用EcoRV-XbaI限制性酶处理的pECCG 117_Pcj1_GFP_终止子载体上。制备的载体命名为pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD，且通过测序确认了成功克隆和载体的基因序列。Ava_ABCD基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO:17中。
实施例3：其中2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶的活性被增强的菌株的 Shinorine生产能力的评价
将实施例2中制备的pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD质粒通过电穿孔引入到实施例1中制备的菌株(其中增强了aroG基因)和野生型W3110菌株中的每一种菌株，并将每种转化的菌株平皿接种在LB固体培养基上。菌株在37℃培养箱中培养过夜，然后将一个铂环(platinum loop)的菌株接种到了25mL滴定培养基[培养基组成：40g/L的葡萄糖、0.3g/L的KH2PO4、0.6g/L的K2HPO4、15g/L的(NH4)2SO4、1g/L的MgSO4·7H2O、2.5g/L的NaCl、1.2g/L的柠檬酸钠、2.5g/L的酵母提取物、40g/L的碳酸钙：pH7.0]中，将其在37℃培养箱中以200rpm温育了48小时。所得菌株通过HPLC(Waters Corp.)进行了分析，且其结果显示于下表3中。
[表3]
Figure BDA0002710587000000161
如上表3中所示，与对照组的浓度相比，在菌株(W3110ΔfhuA::Pn-aroG/pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD)(其中aroG基因被增强)中生产的shinorine的浓度增加了约20％。特别地，在其中通过增强启动子增强aroG基因的菌株(即，W3110ΔfhuA::Ptrc-aroG/pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD和W3110ΔfhuA::Pcj1-aroG/pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD)的情况下，shinorine浓度分别增加了69％和94％。
实施例4：其中磷酸烯醇丙酮酸合酶的活性被增强的菌株的制备
为了增加微生物的MAA生产能力，制备了其中磷酸烯醇丙酮酸合酶的活性被增强的大肠埃希氏菌菌株。具体地，基于大肠埃希氏菌W3110菌株进一步引入pps基因(磷酸烯醇丙酮酸合酶；SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19)。用于制备质粒的模板和引物示于下表4中。
[表4]
Figure BDA0002710587000000171
使用上述模板和引物扩增基因片段后，使用In-FusionR HD克隆试剂盒(Clontech)将Pn_pps基因片段连接到用Spe1-EcoRV限制性酶切割的pSKH-Δfhu载体上。用Spe1-Nde1限制性酶消化实施例1中制备的Ptrc和Pcj1基因片段并且用Nde1-EcoRV限制性酶消化pps基因片段后，用In-FusionR HD克隆试剂盒(Clontech)将Ptrc和pps基因片段或Pcj1和pps基因片段分别连接到用Spe1-EcoRV限制性酶切割的pSKH-ΔfhuA载体上。制备的载体分别命名为pSKH-ΔfhuA-Pn-pps、pSKH-ΔfhuA-Ptrc-pps、和pSKH-ΔfhuA-Pcj1-pps。
关于成功克隆和每个载体中的基因序列，通过测序对上述载体进行了确认，然后将上述载体通过电穿孔转化到各野生型大肠埃希氏菌W3110菌株中。将每种转化的基因通过一次重组(交叉)引入到染色体中，然后通过二次重组(交叉)将质粒区域从染色体切除。对于每种转化的大肠埃希氏菌菌株(其中完成了二次重组)，使用SEQ ID NO:14(正向)和SEQ ID NO:21(反向)的引物通过PCR确认了pps基因的引入。
实施例5：其中磷酸烯醇丙酮酸合酶的活性被增强的菌株的Shinorine生产能力的 评价
将实施例2中制备的pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD质粒通过电穿孔引入到实施例4中制备的其中引入了pps基因的菌株和野生型W3110菌株中的每一中菌株，并将每种转化的菌株平皿接种在LB固体培养基上。菌株在37℃培养箱中培养过夜，然后将一个铂环的菌株接种到实施例3的25mL滴定培养基中，然后将其在37℃培养箱中以200rpm温育了48小时。结果示于下文表5中。
[表5]
菌株的名称 OD(600nm) Shinorine浓度(mg/L)
W3110/pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD 19.4 348
W3110ΔfhuA::Pn-pps/pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD 21.3 494
W3110ΔfhuA::Ptrc-pps/pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD 20.8 511
W3110ΔfhuA::Pcj1-pps/pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD 21.4 556
如上表5中所示，与对照组的浓度相比，在pps基因增强的菌株中生产的shinorine浓度增加了41％，并且在通过用强启动子置换使其活性增强的情况下，shinorine浓度增加高达60％。
实施例6：其中转酮醇酶I/II的活性被增强的菌株的制备
为了增加微生物的MAA生产能力，制备了其中转酮醇酶的活性被增强的大肠埃希氏菌菌株。具体地，基于大肠埃希氏菌W3110菌株，将tktA基因(转酮醇酶；SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24)引入其中。质粒制备中使用的模板和引物示于下表6中。
[表6]
Figure BDA0002710587000000181
使用上述模板和引物通过PCR扩增基因片段后，使用In-FusionR HD克隆试剂盒(Clontech)将Pn_tktA基因片段连接到用Spe1-EcoRV限制性酶切割的pSKH-ΔfhuA载体上。用Spe1、Nde1限制性酶消化实施例1中制备的Ptrc和Pcj1基因片段并用Nde1-EcoRV限制性酶消化tktA基因片段后，使用In-FusionR HD克隆试剂盒(Clontech)将Ptrc和tktA基因片段或Pcj1和tktA基因片段分别连接到用Spe1-EcoRV限制性酶切割的pSKH-ΔfhuA载体上。制备的载体分别命名为pSKH-ΔfhuA-Pn-tktA、pSKH-ΔfhuA-Ptrc-tktA、和pSKH-ΔfhuA-Pcj1-tktA。
关于成功克隆和每个载体中的基因序列，通过测序对上述载体进行了确认，然后将上述载体通过电穿孔转化到各野生型大肠埃希氏菌W3110菌株中。将每种转化的基因通过一次重组(交叉)引入到染色体中，然后通过二次重组(交叉)将质粒区域从染色体切除。对于每种转化的大肠埃希氏菌菌株(其中完成了二次重组)，使用SEQ ID NO:14(正向)和SEQ ID NO:26(反向)的引物通过PCR确认了tktA基因的引入。
实施例7：其中转酮醇酶的活性被增强的菌株的Shinorine生产能力的评价
将实施例2中制备的pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD质粒通过电穿孔引入到实施例6中制备的其中引入了tktA基因的菌株和野生型W3110菌株中的每一种菌株，并将每个转化的菌株平皿接种在LB固体培养基上。将菌株在37℃培养箱中培养过夜，然后将一个铂环的的每种菌株的过夜培养物接种到实施例3的25mL滴定培养基中，然后将其在37℃培养箱中以200rpm温育了48小时。结果示于下文表7中。
[表7]
Figure BDA0002710587000000191
如上表7中所示，与对照组的浓度相比，在tktA基因增强的菌株中生产的shinorine浓度增加了4.5％，并且在通过用强启动子置换使其活性增强的情况下，shinorine浓度增加高达32％。
实施例8：其中2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶/磷酸烯醇丙酮酸合酶/转酮醇酶 的活性被增强的菌株的制备
为了增加微生物的MAA生产能力，制备了其中2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶/磷酸烯醇丙酮酸合酶/转酮醇酶中的每种酶的活性都被增强的大肠埃希氏菌菌株。具体地，基于大肠埃希氏菌W3110菌株，进一步将aroG基因、pps基因、和tktA基因中的每一个引入其中。质粒制备中使用的模板和引物示于下表8中。
[表8]
Figure BDA0002710587000000192
使用上述模板和引物扩增基因片段后，使用In-FusionR HD克隆试剂盒(Clontech)将其每个基因片段连接到用Spe1-EcoRV限制性酶切割的pSKH-ΔfhuA载体上。制备的载体命名为pSKH-ΔfhuA-Pcj1-aroG-Pcj1-ppsA-Pcj1-tktA。
关于成功克隆和每个载体中的基因序列，通过测序对上述载体进行了确认，然后将上述载体通过电穿孔被转化到各野生型大肠埃希氏菌W3110菌株中。将转化的基因通过一次重组(交叉)引入到染色体中，然后通过二次重组(交叉)将质粒区域从染色体切除。对于转化的大肠埃希氏菌菌株(其中完成了二次重组)，使用SEQ ID NO:14(正向)和SEQ IDNO:26(反向)的引物通过PCR确认了aroG、pps、和tktA基因的引入。
实施例9：其中2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、和转酮醇 酶的活性被增强的菌株中Shinorine生产能力的评价
将实施例2中制备的pECCG117_Pcj1_Ava_ABCD质粒通过电穿孔引入实施例8中制备的其中引入了aroG、pps、和tktA基因的菌株和野生型W3110菌株中的每一种菌株，然后将每种转化菌株平皿接种在LB固体培养基上。菌株在37℃培养箱中培养过夜，并将一个铂环的每种菌株的过夜培养物接种到实施例3的25mL滴定培养基中，然后将其在37℃培养箱中以200rpm温育了48小时。结果示于下文表9中。
[表9]
Figure BDA0002710587000000201
如上表9中所示，与对照组的浓度相比，其中三种基因(即，aroG、pps、和tktA)被组合并增强的菌株中生产的shinorine浓度增加了267％。这是意料之外的结果，显示出与用强启动子置换每个基因的启动子所获得的最大增加的总和相比，超出预期的提高。即，确认了当三种基因(即，aroG、pps、和tktA)被组合时，有可能生产更高浓度的shinorine。
实施例10：其中3-脱氢奎尼酸脱水酶的活性被失活的菌株的制备
为了增加微生物的MAA生产能力，制备了其中3-脱氢奎尼酸脱水酶(aroD)的活性失活的大肠埃希氏菌菌株。
具体地，使用pKD3质粒的氯霉素耐性基因作为基因插入标记，并且使用SEQ IDNO:32(正向)和SEQ ID NO:33(反向)的引物通过PCR制备包括部分aroD基因和pKD3质粒的氯霉素耐性基因的aroD缺失盒(aroD-deleted cassette)。通过用包括λ红重组酶基因的pKD46质粒转化野生型大肠埃希氏菌W3110菌株和实施例8中制备的其中引入了aroG、pps、和tktA基因的菌株，然后使用阿拉伯糖诱导相应基因的表达，来制备感受态细胞。通过电穿孔将AroD缺失盒引入到感受态细胞中后，将所得感受态细胞平皿接种在含有30mg/L氯霉素的LB固体培养基上。使用SEQ ID NO:34(正向)和SEQ ID NO:35(反向)的引物对由此获得的菌株进行PCR，并且通过观察1,300bp的扩增片段来确认aroD基因缺失。
实施例11：其中3-脱氢奎尼酸脱水酶失活的菌株的Shinorine生产能力的评价
通过电穿孔将实施例2中制备的pECCG117 Pcj1_Ava_ABCD质粒引入到实施例10中制备的其中缺失了aroD基因的菌株中，并将所得菌株平皿接种在LB固体培养基上。将菌株在37℃培养箱中培养过夜，并将一个铂环的菌株接种到实施例3的25mL滴定培养基中，将其在37℃培养箱中以200rpm温育48小时。结果示于下文表10中。
[表10]
Figure BDA0002710587000000211
如上表10中所示，与其中aroG、pps、和tktA基因被增强的生产shinorine的菌株的shinorine浓度相比，在进一步缺失了aroD基因的菌株中生产的shinorine浓度增加了66％。W3110ΔfhuA::Pcj1-aroG-Pcj1-ppsA-Pcj1-tktA/pECCG117_PCJ1_Ava_ABCD菌株是其中增强了aroG、pps、和tktA基因的菌株，被命名为CB06-0020，并于2018年2月14日根据布达佩斯条约保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM)中，且保藏号为KCCM12224P。
<基于谷氨酸棒杆菌的生产MAAs的重组微生物的制备及使用其的MAAs的生产>
实施例12：其中2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶的活性被增强的载体的制备及 其Shinorine生产能力的评价
为了增加微生物的MAA生产能力，制备了其中2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶的活性被增强的大肠埃希氏菌菌株。具体地，基于谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株，进一步引入了aroG基因(2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶；SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37)。用于制备质粒的模板和引物示于下表11中。
[表11]
Figure BDA0002710587000000212
使用上述模板和引物获得基因片段后，使用In-FusionR HD克隆试剂盒(Clontech)将每个基因片段连接到用EcoRV/XbaI限制性酶处理的pECCG 117和pECCG 117_Pcj7_GFP_终止子(韩国专利号10-620092，p117-cj7-gfp)载体上。制备的载体分别命名为pECCG117_Pn_cgl aroG和pECCG117_Pcj7_cgl aroG。关于成功克隆和每个载体中的基因序列，通过测序对上述载体进行了确认。
首先，由于棒杆菌属的微生物不能生产shinorine，因此制备了其中引入shinorine生物合成途径的菌株。具体地，使用pECCG117_Ptrc_Ava_ABCD作为模板，以及SEQID NO:42(正向)和SEQ ID NO:43(反向)的引物对，对Ava_ABCD基因进行PCR。通过使用In-FusionR HD克隆试剂盒(Clontech)将约7kb的PCR片段连接到用NdeI限制性酶处理的pDZTn载体(WO 2009-125992A)，制备了pDZTn_Ava_ABCD。然后，使用SEQ ID NO:44(正向)和SEQID NO:45(反向)的引物对，对O2启动子(韩国专利号10-1632642)的片段进行PCR，并使用In-FusionR HD克隆试剂盒(Clontech)将O2启动子的片段连接到用NdeI限制性酶处理的pDZTn_Ava_ABCD，从而制备pDZTn_PO2_Ava_ABCD。
通过电穿孔将重组质粒转化到野生型ATCC13032中(van der Rest等人1999)，并通过一次重组(交叉)将质粒引入到染色体中，然后通过二次重组(交叉)将质粒区域从染色体上切除。
对于其中每种转化的谷氨酸棒杆菌菌株(完成了二次重组)，使用SEQ ID NO:42(正向)和SEQ ID NO:43(反向)的基因特异性引物对通过PCR确认了Ava_ABCD基因的引入。制备的菌株命名为谷氨酸棒杆菌13032ΔN1021PO2_Ava_ABCD。
将pECCG117_Pn_cgl aroG和pECCG117_Pcj7_cgl aroG载体各自通过电穿孔转化到谷氨酸棒杆菌13032ΔN1021_PO2_Ava_ABCD菌株中。
将上述制备的菌株和对照组谷氨酸棒杆菌ATCC13032(c.gl 13032)在含有卡那霉素的BHIS固体培养基中培养过夜，并将一个铂环的菌株接种到25mL滴定培养基[培养基组成：40g/L的葡萄糖、1g/L的KH2PO4、10g/L的(NH4)2SO4、5g/L的MgSO47H2O、5g/L的NaCl、5g/L的酵母提取物、30g/L的碳酸钙：pH7.0]中，将其在37℃培养箱中以200rpm温育48小时。结果示于下表12中。
[表12]
Figure BDA0002710587000000221
如上表12中所示，当在含有shinorine生物合成基因的菌株中aroG表达水平增加时，shinorine的浓度增加了39％。特别地，当启动子被增强时，确认了shinorine浓度可以提高高达80％。
实施例13：其中磷酸烯醇丙酮酸合酶/转酮醇酶的活性被增强的载体的制备及其 Shinorine生产能力的评价
为了增加微生物的MAA生产能力，制备了其中tkt或pps的活性被增强的谷氨酸棒杆菌菌株。具体地，基于谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株，进一步引入tkt(转酮醇酶；SEQ IDNO:95和SEQ ID NO:96)或pps(磷酸烯醇丙酮酸合酶；SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98)。用于制备质粒的模板和引物示于下表13中。
[表13]
Figure BDA0002710587000000231
使用In-FusionR HD克隆试剂盒(Clontech)，通过将通过PCR技术(其中模板与引物的组合相匹配)获得的基因片段与用EcoRV/XbaI限制性酶处理的pECCG117、pECCG117_Ptrc_GFP_终止子、和pECCG117_Pcj7_GFP_终止子载体连接，制备了载体。制备的载体分别命名为pECCG117-Pn-tkt/pECCG117-Pcj7-tkt和pECCG117-Ptrc-pps/pECCG117-Pcj7-pps。关于成功克隆和每个载体中的基因序列，通过测序对上述载体进行了确认，然后将上述载体通过电穿孔法转化到谷氨酸棒杆菌13032ΔN1021_PO2_Ava_ABCD菌株中。将每种菌株在含有卡那霉素的BHIS固体培养基中培养过夜，然后将一个铂环的每种菌株接种到实施例12的25mL滴定培养基中，将其在37℃培养箱中以200rpm温育48小时。结果示于下表14中。
[表14]
Figure BDA0002710587000000241
如上表14中所示，确认了当tkt基因或pps基因被增强时，shinorine的生产分别提高高达57％或72％。
实施例14：其中2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶/磷酸烯醇丙酮酸合酶/转酮醇 酶的活性被增强的菌株的制备及其的评价
为了增加微生物的MAA生产能力，制备了其中aroG、pps和tkt基因的活性被增强的大肠埃希氏菌菌株，并且为了确认更高MAA生产量的存在，进一步失活了3-脱氢奎尼酸脱水酶(aroD)。具体地，为了增强aroG、pps、和tkt基因，制备了pDZ-ΔaroD-Pcj7-aroG-Pcj7-pps-Pcj7-tktA质粒。用于制备pDZ-ΔaroD-Pcj7-aroG-Pcj7-pps-Pcj7-tktA质粒的模板和引物示于下表15中。
[表15]
Figure BDA0002710587000000242
首先，为了制备其中缺失了谷氨酸棒杆菌的aroD基因(SEQ ID NO:89和SEQ IDNO:90)的菌株，制备了其中内部缺失了aroD基因的开放阅读框的pDZ-ΔaroD质粒。通过使用谷氨酸棒杆菌ATCC 13032菌株的基因组DNA作为模板，以及SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92以及SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94作为一对正向和反向引物进行交叉PCR(cross-PCR)，然后将所得的基因片段引入到pDZ载体中，实现了pDZ-ΔaroD质粒的内部基因缺失。
然后，使用上表15中所示的模板和引物通过PCR扩增了aroG、pps和tkt基因的每个基因片段，然后将其分别引入到用SpeI限制性酶切割的pDZ-ΔaroD载体中。关于成功克隆和每个载体中的基因序列，通过测序对上述两种载体进行了确认，然后将上述两种载体通过电穿孔转化到谷氨酸棒杆菌13032ΔN1021_PO2_Ava_ABCD菌株中。将每种菌株在含有卡那霉素的BHIS固体培养基中培养过夜，并将一个铂环的每种菌株的过夜培养物接种到实施例12的25mL的滴定培养基中，将其在37℃培养箱中以200rpm温育48小时。结果示于下表16中。
[表16]
Figure BDA0002710587000000251
如上表16中所示，在三种基因(aroG、pps、和tktA)被增强的菌株中生产的shinorine的浓度增加了约25％。确认了即使在通过aroD基因的缺失而增加了shinorine生产能力的菌株中，通过这三种基因的组合也可以以高浓度生产shinorine。另外，可以解释，当在组合了三种基因的菌株中进一步失活aroD基因时，可以以甚至更高的浓度生产shinorine。
<基于酵母的生产MAAs的重组微生物的制备和使用其的MAAs的生产>
实施例15：生产shinorine的酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株的制备
为了将酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株用作生产shinorine的菌株，将源自多变鱼腥藻ATCC29413的shinorine生物合成基因引入到用于酵母表达的载体中。使用GPD启动子将Ava_A和Ava_B基因插入到pRS-413载体中。具体地，通过重叠PCR将pGPD-Ava_A区和pGPD-Ava_B区连接。用BamHI和SalI限制性酶处理了载体和PCR产物，然后使用T4连接酶连接，以制备pRS-413-pGPD-Ava_A-pGPD-Ava_B载体。
然后，使用GPD启动子将Ava_A和Ava_B基因插入到pRS-414载体中。具体地，通过重叠PCR将pGPD-Ava_C区和pGPD-Ava_D区连接，然后将载体和PCR产物用BamHI和SalI处理，并用T4连接酶连接以制备pRS-414-pGPD-Ava_C-pGPD-Ava_D载体。用于制备载体的引物和模板DNA显示在下表17中。
[表17]
Figure BDA0002710587000000261
通过乙酸锂转化，将pRS-413-pGPD-Ava_A-pGPD-Ava_B载体和pRS-414-pGPD-Ava_C-pGPD-Ava_D载体引入到酿酒酵母CEN.PK-1D(S.cerevisiae CEN.PK-1D)菌株中，然后确认了shinorine生产的存在。将菌株平皿接种在其中不包括Trp和His(即，营养缺陷型标记)的合成完全(SC)固体培养基上，然后在30℃培养箱中培养过夜。将一个铂环的在合成完全(SC)固体培养基(其中不包括Trp和His)中培养过夜的菌株接种到25mL表18的滴定培养基中，然后在30℃培养箱中以150rpm培养24小时。结果示于下表19中。
[表18]
Figure BDA0002710587000000271
[表19]
Figure BDA0002710587000000272
实验结果确认了，不生产shinorine的野生型酿酒酵母菌株由于shinorine生物合成基因的引入而生产了331mg/L的shinorine。
实施例16：通过增强酿酒酵母的TKL1(转酮醇酶)而增加shinorine的生产量
为了增加MAA生产能力，制备了其中TKL1的活性被增强的酿酒酵母菌株。为此目的，通过将TKL1基因(SEQ ID NO:110和123)克隆到pRS-415-pGPD、pRS-415-pADH、和pRS-415-pTEF载体中增强了TKL1基因的表达。
pRS-415-pGPD载体中包括的GPD启动子是甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和同工酶3(TDH3)基因的启动子，且其包括从THD3基因的ORF起始密码子的-674bp至-1bp的序列。
pRS-415-pADH载体中包括的ADH启动子是醇脱氢酶(ADH1)基因的启动子，且其包括从ADH1基因的ORF起始密码子的-1,500bp至-1bp的序列。
pRS-415-pTEF载体中包括的TEF启动子是翻译延伸因子EF-1α(TEF1)基因的启动子，且其包括从TEF1基因的ORF起始密码子的-500bp至-1bp的序列。
具体地，使用下表20的引物对TEF1基因进行PCR，并将PCR产物和pRS-415-pGPD、pRS-415-pADH、和pRS-415-pTEF载体用BamHI和SalI限制性酶处理，然后使用T4连接酶连接以制备pRS-415-pGPD-TKL1、pRS-415-pADH-TKL1、和pRS-415-pTEF-TKL1载体。
[表20]
Figure BDA0002710587000000281
然后，将实施例15中制备的用于shinorine生物合成的质粒与pRS-415-pGPD-TKL1、pRS-415-pADH-TKL1、和pRS-415-pTEF-TKL1一起引入到酿酒酵母CEN.PK-1D菌株中，然后将每种所得菌株平皿接种在其中不包括Trp、Ura、和His的合成完全(SC)固体培养基上，并在30℃培养箱中培养过夜。将一个铂环的在合成完全(SC)固体培养基(其中不包括Trp、Ura、和His)中培养过夜的菌株接种到25mL的滴定培养基中，然后在30℃培养箱中以150rpm培养24小时。结果示于下表21中。
[表21]
Figure BDA0002710587000000282
如上表21中所示，确认了与WT菌株的shinorine生产量相比，在其中使用GPD启动子增强了TKL1基因表达的菌株中，shinorine生产量增加了。另外，进一步确认了，随着启动子强度增加(即，pGPD>pTEF>pADH)，shinorine生产量增加了。
实施例17：通过增强酿酒酵母的ARO4(3-脱氧-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)合 酶)的shinorine的生产量的增加
为了增加MAA生产能力，制备了其中ARO4的活性被增强的酿酒酵母菌株。为此目的，采用了一种策略，其中通过将ARO4基因(SEQ ID NO:111和124)克隆到pRS-415-pGPD、pRS-415-pADH、和pRS-415-pTEF载体中增强了ARO4基因的表达。具体地，使用下表22的引物，对ARO4基因进行PCR，并且将ARO4的PCR产物和pRS-415-pGPD、pRS-415-pADH、和pRS-415-pTEF载体用BamHI和SalI限制性酶处理，然后使用T4连接酶连接以制备pRS-415-pGPD-ARO4、pRS-415-pADH-ARO4、和pRS-415-pTEF-ARO4载体。
[表22]
Figure BDA0002710587000000291
然后，将实施例15中制备的用于shinorine生物合成的质粒与pRS-415-pGPD-ARO4、pRS-415-pADH-ARO4、和pRS-415-pTEF-ARO4一起引入到酿酒酵母CEN.PK-1D菌株中，然后将每种所得菌株平皿接种在其中不包括Trp、Ura和His的合成完全(SC)固体培养基上，并在30℃培养箱中培养过夜。将一个铂环的在合成完全(SC)固体培养基(其中不包括Trp、Ura和His)中培养过夜的菌株接种到25mL的滴定培养基中，然后在30℃培养箱中以150rpm培养24小时。结果示于下表23中。
[表23]
Figure BDA0002710587000000292
Figure BDA0002710587000000301
如上表23中所示，确认了与WT菌株的shinorine的生产量相比，在其中使用GPD启动子增强了ARO4基因表达的菌株中，shinorine的生产量增加了187％。
实施例18：通过增强酿酒酵母的磷酸烯醇丙酮酸合酶(pps)来增加shinorine的生 产量
为了增加MAA生产能力，制备了其中pps的活性被增强的酿酒酵母菌株。为此目的，采用了一种策略，其中通过将pps基因克隆到pRS-415-pGPD、pRS-415-pADH、和pRS-415-pTEF载体中增强了pps基因的表达。
具体地，使用下表24的引物，对pps基因进行PCR，并将pps的PCR产物和pRS-415-pGPD、pRS-415-pADH、和pRS-415-pTEF载体用BamHI和SalI限制性酶处理，然后用T4连接酶连接以制备pRS-415-pGPD-pps、pRS-415-pADH-pps、和pRS-415-pTEF-pps载体。
[表24]
Figure BDA0002710587000000302
然后，将实施例15中制备的用于shinorine生物合成的质粒与pRS-415-pGPD-pps、pRS-415-pADH-pps、和pRS-415-pTEF-pps一起引入到酿酒酵母CEN.PK-1D菌株中，并将每种所得到的菌株平皿接种在合成完全(SC)固体培养基(其中不包括Trp、Ura、和His)上，并在30℃培养箱中培养过夜。将一个铂环的在合成完全(SC)固体培养基(其中不包括Trp、Ura、和His)中培养过夜的菌株接种到25mL的滴定培养基中，然后在30℃培养箱中以150rpm培养了24小时。结果示于下表25中。
[表25]
Figure BDA0002710587000000311
如上表25中所示，确认了与WT菌株的shinorine的生产量相比，在其中pps基因过表达的菌株中，shinorine的生产量增加了70％。另外，进一步确认了，随着启动子强度增加(即，pGPD>pTEF>pADH)，shinorine的生产量增加了。
实施例19：通过在酿酒酵母菌株中TKL1的增强、ARO4的增强、和pps基因的引入增 加shinorine的生产量
基于实施例16、17和18的结果，选择TKL1、ARO4、和pps(大肠埃希氏菌)基因作为影响酿酒酵母中shinorine生物合成的有效因子，并尝试通过这三种基因的同时增强来增加shinorine的生物合成。为了这三种基因的引入，制备了pRS-415-pGPD-TKL1-pGPD-ARO4、和pRS-416-pGPD-pps载体。具体地，在通过重叠PCR将pGPD-TKL1区和pGPD-ARO4区连接后，将载体和PCR产物用BamHI和SalI限制性酶处理，然后用T4连接酶连接，以制备pRS-415-pGPD-TKL1-pGPD-ARO4载体。
然后，对源自大肠埃希氏菌的pps基因进行了PCR。将pps基因的PCR产物和pRS-416-pGPD载体用BamHI和SalI限制性酶处理，然后用T4连接酶连接以制备pRS-416-pGPD-pps载体。用于制备载体的引物和模板DNA示于下表26中。
[表26]
Figure BDA0002710587000000321
然后，将实施例15中制备的用于shinorine生物合成的质粒与pRS-415-pGPD-TKL1-pGPD-ARO4和pRS-416-pGPD-pps载体一起引入到酿酒酵母CEN.PK-1D菌株中，并将每种所得菌株平皿接种在合成完全(SC)固体培养基(其中不包括Leu、Trp、Ura和His)上，并在30℃培养箱中培养过夜。将一个铂环的在合成完全(SC)固体培养基(其中不包括Leu、Trp、Ura和His)中培养过夜的菌株接种到25mL的滴定培养基中，然后在30℃培养箱中以150rpm培养了24小时。结果示于下表27中。
[表27]
Figure BDA0002710587000000322
如上表27中所示，确认了与WT菌株的shinorine的生产量相比，在其中三种有效基因(即，pps、TKL1、和ARO4)过表达的菌株中，shinorine的生产量显著增加了230％。
在本说明书中，省略了可以由本公开所属领域的普通技术人员完全认识和推断的内容的详细描述。除了在本说明书中描述的具体实施方式之外，在不改变本公开的技术精神或必要构成的情况下，各种修改是可能的。因此，可以以不同于本说明书中具体描述和示例的那些方式来实施本公开，这可以被本领域普通技术人员所理解。
Figure BDA0002710587000000341
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 生产霉孢菌素样氨基酸的微生物及利用其生产霉孢菌素样氨基酸的方法
<130> OPA18547-PCT
<150> KR10-2018-0022185
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<160> 124
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1053
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌W3110
<400> 1
atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60
gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120
aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180
tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240
gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300
acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360
gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420
gcaggtgagt ttctcgatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480
gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct 540
tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600
aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660
gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720
tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780
caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840
gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900
gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960
ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020
ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa 1053
<210> 2
<211> 350
<212> PRT
<213> 大肠埃希氏菌W3110
<400> 2
Met Asn Tyr Gln Asn Asp Asp Leu Arg Ile Lys Glu Ile Lys Glu Leu
1 5 10 15
Leu Pro Pro Val Ala Leu Leu Glu Lys Phe Pro Ala Thr Glu Asn Ala
20 25 30
Ala Asn Thr Val Ala His Ala Arg Lys Ala Ile His Lys Ile Leu Lys
35 40 45
Gly Asn Asp Asp Arg Leu Leu Val Val Ile Gly Pro Cys Ser Ile His
50 55 60
Asp Pro Val Ala Ala Lys Glu Tyr Ala Thr Arg Leu Leu Ala Leu Arg
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Asp Glu Leu Glu Ile Val Met Arg Val Tyr Phe Glu
85 90 95
Lys Pro Arg Thr Thr Val Gly Trp Lys Gly Leu Ile Asn Asp Pro His
100 105 110
Met Asp Asn Ser Phe Gln Ile Asn Asp Gly Leu Arg Ile Ala Arg Lys
115 120 125
Leu Leu Leu Asp Ile Asn Asp Ser Gly Leu Pro Ala Ala Gly Glu Phe
130 135 140
Leu Asp Met Ile Thr Pro Gln Tyr Leu Ala Asp Leu Met Ser Trp Gly
145 150 155 160
Ala Ile Gly Ala Arg Thr Thr Glu Ser Gln Val His Arg Glu Leu Ala
165 170 175
Ser Gly Leu Ser Cys Pro Val Gly Phe Lys Asn Gly Thr Asp Gly Thr
180 185 190
Ile Lys Val Ala Ile Asp Ala Ile Asn Ala Ala Gly Ala Pro His Cys
195 200 205
Phe Leu Ser Val Thr Lys Trp Gly His Ser Ala Ile Val Asn Thr Ser
210 215 220
Gly Asn Gly Asp Cys His Ile Ile Leu Arg Gly Gly Lys Glu Pro Asn
225 230 235 240
Tyr Ser Ala Lys His Val Ala Glu Val Lys Glu Gly Leu Asn Lys Ala
245 250 255
Gly Leu Pro Ala Gln Val Met Ile Asp Phe Ser His Ala Asn Ser Ser
260 265 270
Lys Gln Phe Lys Lys Gln Met Asp Val Cys Ala Asp Val Cys Gln Gln
275 280 285
Ile Ala Gly Gly Glu Lys Ala Ile Ile Gly Val Met Val Glu Ser His
290 295 300
Leu Val Glu Gly Asn Gln Ser Leu Glu Ser Gly Glu Pro Leu Ala Tyr
305 310 315 320
Gly Lys Ser Ile Thr Asp Ala Cys Ile Gly Trp Glu Asp Thr Asp Ala
325 330 335
Leu Leu Arg Gln Leu Ala Asn Ala Val Lys Ala Arg Arg Gly
340 345 350
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> fhuA arm 1_F
<400> 3
ccaagcgacg cccaacctgc catcatggcg cgttccaaaa ctgctcagc 49
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> fhuA arm 1_R
<400> 4
tatcctcgag actagtgagc tcctttcagc ggttcggtgg 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> fhuA arm 2_F
<400> 5
ctagtctcga ggatatcgac cacaccctgc tgaccggtgt 40
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> fhuA arm 2_R
<400> 6
atagaatacc aattggcatg ctttttagaa acggaaggtt gcggttgc 48
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pn_aroG_F
<400> 7
aaaggagctc actagtagga tgctcctgtt atgg 34
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pn_aroG_R
<400> 8
cagggtgtgg tcgatatctt acccgcgacg cgcttt 36
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ptrc_F
<400> 9
aaaggagctc actagtccgc ttgctgcaac tctc 34
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ptrc_R
<400> 10
tggacgatac tcatatgttt cctgtgtgaa attgttatcc 40
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pcj1_F
<400> 11
aaaggagctc actagtaccg cgggcttatt ccatt 35
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pcj1_R
<400> 12
atctatagtc tgcatatgtt aatctcctag attgggtttc a 41
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aroG_F
<400> 13
taggagatta acatatgaat tatcagaacg ac 32
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 验证引物
<400> 14
ggaacgctca gattgcgt 18
<210> 15
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ava_ABCD_F
<400> 15
acaatttcac acaggaaaga tatcatgagt atcgtccaag caaag 45
<210> 16
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ava_ABCD_R
<400> 16
ctcatccgcc aaaacagctc tagattatga attattttcc agaca 45
<210> 17
<211> 6461
<212> DNA
<213> 多变鱼腥藻ATCC29413
<400> 17
atgagtatcg tccaagcaaa gtttgaagct aaggaaacat cttttcatgt agaaggttac 60
gaaaagattg agtatgattt ggtgtatgta gatggtattt ttgaaatcca gaattctgca 120
ctagcagatg tatatcaagg ttttggacga tgcttggcga ttgtagatgc taacgtcagt 180
cggttgtatg gtaatcaaat tcaggcatat ttccagtatt atggtataga actgaggcta 240
tttcctatta ccattactga accagataag actattcaaa ctttcgagag agttatagat 300
gtctttgcag atttcaaatt agtccgcaaa gaaccagtat tagtcgtggg tggcggttta 360
attacagatg ttgtcggctt tgcttgttct acatatcgtc gcagcagcaa ttacatccgc 420
attcctacta cattgattgg attaattgat gccagtgtag caattaaggt agcagttaat 480
catcgcaaac tgaaaaaccg tttgggtgct tatcatgctt ctcgcaaagt atttttagat 540
ttctccttgt tgcgtactct ccctacagac caagtacgta acgggatggc ggaattggta 600
aaaatcgctg tagtagcgca tcaagaagtt tttgaattgt tggagaagta cggcgaagaa 660
ttactacgta ctcattttgg caatatagat gcaactccag agattaaaga aatagcccat 720
cgtttgactt acaaagctat ccataagatg ttggaattgg aagttcccaa cctgcatgag 780
ttagacctag atagggtgat tgcttacggt cacacttgga gtcccacctt ggaacttgcg 840
cctcgtctac ccatgttcca cggacacgcc gttaatgtag atatggcttt ctcggcaacg 900
atcgccgccc gtagaggata tattacaatt gcagaacgcg atcgtatttt aggattaatg 960
agtcgcgttg gtctatccct cgaccatccc atgttggata tagatatttt gtggcgtggt 1020
actgaatcta tcacattaac tcgtgatggt ttgttaagag ctgctatgcc aaaacccatt 1080
ggtgattgtg tcttcgtcaa tgacctgaca agagaagaat tagcagccgc attagctgac 1140
cacaaagaac tttgtaccag ttatccccgt ggtggtgaag gtgtggatgt gtatcccgtt 1200
tatcaaaaag aattaatcgg gagtgttaaa taatgacttt tttgaattca aaatgcaaaa 1260
tactccacgg atacactgcg cgagcgcggt agcatttctg ttcgcggagc gtcccgtagg 1320
gaaagagaag gctacgcaaa taatcggaca ctaattgtct ttaattttga attttgaatt 1380
ttgaattttg aattggagcg aagcgacttg acaaatgtga ttgtccaacc aacagctaga 1440
cctgttacac cattgggaat tttaaccaag cagttagaag ccatagtcca agaggttaag 1500
caacatccag atttacctgg ggaattgata gcaaacatcc atcaggcttg gcgtttagcc 1560
gcaggtatag acccttattt ggaagaatgc accactccag aatctcctga actcgctgca 1620
ttggcaaaaa ccacagccac cgaagcctgg ggagaacact tccacggagg tacaaccgtc 1680
cgtcctctag aacaagagat gctttctggt catatcgaag gacaaacctt aaagatgttt 1740
gttcacatga ccaaagctaa aaaagtctta gaaattggga tgtttaccgg ttattcggcg 1800
ctggcgatgg cggaagcatt accagaggat ggactgcttg tggcttgtga agttgaccct 1860
tacgcggcgg aaattggaca gaaagccttt caacaatctc cccacggtgg aaagattcgt 1920
gtggaattgg atgcagcctt agcaactctt gataagttag cagaagctgg ggagtctttt 1980
gacttggtat ttatcgacgc agataaaaaa gagtatgtag cctattttca caagttgcta 2040
ggtagcagtt tgttagcacc agatggcttt atttgtgtag ataacacctt attacaaggg 2100
gaagtttatc taccagcaga ggaacgtagc gtcaatggtg aagcgatcgc gcaatttaat 2160
catacagtag ctatagaccc ccgtgtagaa caggttttgt tgccgttgcg agatggttta 2220
acaattatcc gcagaataca accttaattg tccaatcgac tatggcacaa tcccttcccc 2280
tttcttccgc acctgctaca ccgtctcttc cttcccagac gaaaatagcc gcaattatcc 2340
aaaatatctg cactttggct ttgttattac tagcattgcc cattaatgcc accattgttt 2400
ttatatcctt gttagtcttc cgaccgcaaa aggtcaaagc agcaaacccc caaaccattc 2460
ttatcagtgg cggtaagatg accaaagctt tacaactagc aaggtcattc cacgcggctg 2520
gacatagagt tgtcttggtg gaaacccata aatactggtt gactggtcat cgtttttccc 2580
aagcagtgga taagttttac acagtccccg caccccagga caatccccaa gcttacattc 2640
aggctttggt agatatcgtc aaacaagaaa acatcgatgt ttatattccc gtcaccagtc 2700
cagtgggtag ctactacgac tcattagcca aaccagagtt atcccattat tgcgaagtgt 2760
ttcactttga cgcagatatt acccaaatgt tggatgataa atttgcgttg acacaaaaag 2820
cgcgatcgct tggtttatca gtacccaaat cctttaaaat tacctcacca gaacaagtca 2880
tcaacttcga tttttctgga gagacacgta aatacatcct caaaagcatt ccctacgact 2940
cagtgcggcg gttggactta accaaactcc cctgtgctac tccagaggaa acagcagcat 3000
tcgtcagaag tttgccaatt actcccgaaa aaccgtggat tatgcaggaa tttatccccg 3060
gtaaggaatt ctgcacccat agcaccgttc ggaatgggga actcagactg cattgctgtt 3120
gcgaatcttc agccttccaa gttaattatg agaatgtaaa taacccgcaa attaccgaat 3180
gggtacagca ttttgtcaag gaactgaaac tgacaggaca gatttccttt gactttatcc 3240
aagccgaaga cggaacagtt tacgccatcg agtgtaaccc ccgcacacat tcagcaatta 3300
ccacatttta cgaccacccc caggtagcag aagcgtactt gagtcaagca ccgacgactg 3360
aaaccataca accactaacg acaagcaagc ctacctattg gacttatcac gaagtttggc 3420
gtttaactgg tatccgttct ttcacccagt tgcaaagatg gctggggaat atttggcgcg 3480
ggactgatgc gatttatcag ccagatgacc ccttaccgtt tttgatggta catcattggc 3540
aaattcccct actgttattg aataatttgc gtcgtcttaa aggttggacg cggatagatt 3600
tcaatattgg gaagttggtg gaattggggg gagattagtt tttaaacgca gagggacgct 3660
gaggttagcg cagcgaaaag ttctggagga gggtttccct ccgtaggaaa cttttcaaga 3720
gagagggacg cggagtgtgt tttctctgcg tctctgcgtg agaaattttt tattattgag 3780
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acgcgaccca cagagattat gatctttccc agagtttaca tgaactaatt gtagctcaag 3900
tagaacgaac acctgaggcg atcgctgtca cctttgacaa gcaacaacta acttatcaag 3960
aactaaatca taaagcaaac cagctaggac attatttaca aacattagga gtccagccag 4020
aaaccctggt aggcgtttgt ttagaacgtt ccttagaaat ggttatctgt cttttaggaa 4080
tcctcaaagc tgggggtgct tatgttccta ttgaccctga atatcctcaa gaacgcatag 4140
cttatatgct agaagattct caggtgaagg tactactaac tcaagaaaaa ttactcaatc 4200
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cacaagctaa taccaatccc aaaagtaata taaaaacgga taatcttgct tatgtaattt 4320
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atcgcttatt gtggatgcag gaagcttatc aaatcgattc cacagatagc attttacaaa 4440
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cacgtttggt aatagccaaa ccaggcggac ataaagatag tgcttacctc atcgatttaa 4560
ttactcaaga acaaatcact acgttgcatt ttgtcccctc aatgctgcaa gtgtttttac 4620
aaaatcgcca tgtaagcaaa tgcagctctc taaaaagagt tatttgtagc ggtgaagctt 4680
tatctataga tttacaaaat agatttttcc agcatttgca atgtgaatta cataacctct 4740
atggcccgac agaagcagca attgatgtca cattttggca atgtagaaaa gatagtaatt 4800
taaagagtgt acctattggt cgtcccattg ctaatactca aatttatatt cttgatgccg 4860
atttacaacc agtaaatatt ggtgtcactg gtgaaattta tattggtggt gtaggggttg 4920
ctcgtggtta tttgaataaa gaagaattga ccaaagaaaa atttattatt aatccctttc 4980
ccaattctga gtttaagcga ctttataaaa caggtgattt agctcgttat ttacccgatg 5040
gaaatattga atatcttggt agaacagatt atcaagtaaa aattcggggt tatagaattg 5100
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tagcgcggga tgataacgct caagaaaaac aaatcatcgc ttatattacc tataactcca 5220
tcaaacctca gcttgataat ctgcgtgatt tcctaaaagc aaggctacct gattttatga 5280
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aagtaggtgt gacagaaaac tttttcgcta ttggtggtaa ttccctcaaa gctctacatt 5520
taatttctca aattgaagag ttatttgcta aagagatatc cttagcaaca cttttaacaa 5580
atccagtaat tgcagattta gccaaggtta ttcaagcaaa caaccaaatc cataattcac 5640
ccctagttcc aattcaacca caaggtaagc agcagccttt cttttgtata catcctgctg 5700
gtggtcatgt tttatgctat tttaaactcg cacaatatat aggaactgac caaccatttt 5760
atggcttaca agctcaagga ttttatggag atgaagcacc cttgacgcga gttgaagata 5820
tggctagtct ctacgtcaaa actattagag aatttcaacc ccaagggcct tatcgtgtcg 5880
gggggtggtc atttggtgga gtcgtagctt atgaagtagc acagcagtta catagacaag 5940
gacaagaagt atctttacta gcaatattag attcttacgt accgattctg ctggataaac 6000
aaaaacccat tgatgacgtt tatttagttg gtgttctctc cagagttttt ggcggtatgt 6060
ttggtcaaga taatctagtc acacctgaag aaatagaaaa tttaactgta gaagaaaaaa 6120
ttaattacat cattgataaa gcacggagcg ctagaatatt cccgcctggt gtagaacgtc 6180
aaaataatcg ccgtattctt gatgttttgg tgggaacttt aaaagcaact tattcctata 6240
taagacaacc atatccagga aaagtcactg tatttcgagc cagggaaaaa catattatgg 6300
ctcctgaccc gaccttagtt tgggtagaat tattttctgt aatggcggct caagaaatta 6360
agattattga tgtccctgga aaccattatt cgtttgttct agaaccccat gtacaggttt 6420
tagcacagcg tttacaagat tgtctggaaa ataattcata a 6461
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<211> 2379
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌W3110
<400> 18
atgtccaaca atggctcgtc accgctggtg ctttggtata accaactcgg catgaatgat 60
gtagacaggg ttgggggcaa aaatgcctcc ctgggtgaaa tgattactaa tctttccgga 120
atgggtgttt ccgttccgaa tggtttcgcc acaaccgccg acgcgtttaa ccagtttctg 180
gaccaaagcg gcgtaaacca gcgcatttat gaactgctgg ataaaacgga tattgacgat 240
gttactcagc ttgcgaaagc gggcgcgcaa atccgccagt ggattatcga cactcccttc 300
cagcctgagc tggaaaacgc catccgcgaa gcctatgcac agctttccgc cgatgacgaa 360
aacgcctctt ttgcggtgcg ctcctccgcc accgcagaag atatgccgga cgcttctttt 420
gccggtcagc aggaaacctt cctcaacgtt cagggttttg acgccgttct cgtggcagtg 480
aaacatgtat ttgcttctct gtttaacgat cgcgccatct cttatcgtgt gcaccagggt 540
tacgatcacc gtggtgtggc gctctccgcc ggtgttcaac ggatggtgcg ctctgacctc 600
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gaactggcaa aacaggccgt acaaattgag aaacactacg gtcgcccgat ggatattgag 960
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cgctcacgcg gtcaggtcat ggagcgttat acgctgcatt cacagggtaa gattatcgcc 1080
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gatctgccgt tgaaagtgat gatgaacgtc ggtaacccgg accgtgcttt cgacttcgcc 1500
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atccgcgaga tgatgaaagg ttttgattct ccgcgtgaat tttacgttgg tcgtctgact 1680
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gattttaaat cgaacgaata tgccaacctg gtcggtggtg agcgttacga gccagatgaa 1800
gagaacccga tgctcggctt ccgtggcgcg ggccgctatg tttccgacag cttccgcgac 1860
tgtttcgcgc tggagtgtga agcagtgaaa cgtgtgcgca acgacatggg actgaccaac 1920
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gaattgttcg atgagcgcaa cgatgcggtg aaagcactgc tgtcgatggc tatccgtgcc 2220
gcgaagaaac agggcaaata tgtcgggatt tgcggtcagg gtccgtccga ccacgaagac 2280
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<213> 大肠埃希氏菌W3110
<400> 19
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Gly Met Asn Asp Val Asp Arg Val Gly Gly Lys Asn Ala Ser Leu Gly
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Glu Met Ile Thr Asn Leu Ser Gly Met Gly Val Ser Val Pro Asn Gly
35 40 45
Phe Ala Thr Thr Ala Asp Ala Phe Asn Gln Phe Leu Asp Gln Ser Gly
50 55 60
Val Asn Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Leu Asp Lys Thr Asp Ile Asp Asp
65 70 75 80
Val Thr Gln Leu Ala Lys Ala Gly Ala Gln Ile Arg Gln Trp Ile Ile
85 90 95
Asp Thr Pro Phe Gln Pro Glu Leu Glu Asn Ala Ile Arg Glu Ala Tyr
100 105 110
Ala Gln Leu Ser Ala Asp Asp Glu Asn Ala Ser Phe Ala Val Arg Ser
115 120 125
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130 135 140
Glu Thr Phe Leu Asn Val Gln Gly Phe Asp Ala Val Leu Val Ala Val
145 150 155 160
Lys His Val Phe Ala Ser Leu Phe Asn Asp Arg Ala Ile Ser Tyr Arg
165 170 175
Val His Gln Gly Tyr Asp His Arg Gly Val Ala Leu Ser Ala Gly Val
180 185 190
Gln Arg Met Val Arg Ser Asp Leu Ala Ser Ser Gly Val Met Phe Ser
195 200 205
Ile Asp Thr Glu Ser Gly Phe Asp Gln Val Val Phe Ile Thr Ser Ala
210 215 220
Trp Gly Leu Gly Glu Met Val Val Gln Gly Ala Val Asn Pro Asp Glu
225 230 235 240
Phe Tyr Val His Lys Pro Thr Leu Ala Ala Asn Arg Pro Ala Ile Val
245 250 255
Arg Arg Thr Met Gly Ser Lys Lys Ile Arg Met Val Tyr Ala Pro Thr
260 265 270
Gln Glu His Gly Lys Gln Val Lys Ile Glu Asp Val Pro Gln Glu Gln
275 280 285
Arg Asp Ile Phe Ser Leu Thr Asn Glu Glu Val Gln Glu Leu Ala Lys
290 295 300
Gln Ala Val Gln Ile Glu Lys His Tyr Gly Arg Pro Met Asp Ile Glu
305 310 315 320
Trp Ala Lys Asp Gly His Thr Gly Lys Leu Phe Ile Val Gln Ala Arg
325 330 335
Pro Glu Thr Val Arg Ser Arg Gly Gln Val Met Glu Arg Tyr Thr Leu
340 345 350
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355 360 365
Ile Gly Ala Gly Pro Val Lys Val Ile His Asp Ile Ser Glu Met Asn
370 375 380
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385 390 395 400
Trp Glu Pro Ile Met Lys Lys Ala Ser Ala Ile Val Thr Asn Arg Gly
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Ala Val Val Gly Cys Gly Asp Ala Thr Glu Arg Met Lys Asp Gly Glu
435 440 445
Asn Val Thr Val Ser Cys Ala Glu Gly Asp Thr Gly Tyr Val Tyr Ala
450 455 460
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465 470 475 480
Asp Leu Pro Leu Lys Val Met Met Asn Val Gly Asn Pro Asp Arg Ala
485 490 495
Phe Asp Phe Ala Cys Leu Pro Asn Glu Gly Val Gly Leu Ala Arg Leu
500 505 510
Glu Phe Ile Ile Asn Arg Met Ile Gly Val His Pro Arg Ala Leu Leu
515 520 525
Glu Phe Asp Asp Gln Glu Pro Gln Leu Gln Asn Glu Ile Arg Glu Met
530 535 540
Met Lys Gly Phe Asp Ser Pro Arg Glu Phe Tyr Val Gly Arg Leu Thr
545 550 555 560
Glu Gly Ile Ala Thr Leu Gly Ala Ala Phe Tyr Pro Lys Arg Val Ile
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Val Arg Leu Ser Asp Phe Lys Ser Asn Glu Tyr Ala Asn Leu Val Gly
580 585 590
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595 600 605
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Val Glu Ile Met Ile Pro Phe Val Arg Thr Val Asp Gln Ala Lys Ala
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Val Val Glu Glu Leu Ala Arg Gln Gly Leu Lys Arg Gly Glu Asn Gly
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Leu Lys Ile Ile Met Met Cys Glu Ile Pro Ser Asn Ala Leu Leu Ala
675 680 685
Glu Gln Phe Leu Glu Tyr Phe Asp Gly Phe Ser Ile Gly Ser Asn Asp
690 695 700
Met Thr Gln Leu Ala Leu Gly Leu Asp Arg Asp Ser Gly Val Val Ser
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Glu Leu Phe Asp Glu Arg Asn Asp Ala Val Lys Ala Leu Leu Ser Met
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Ala Ile Arg Ala Ala Lys Lys Gln Gly Lys Tyr Val Gly Ile Cys Gly
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Gln Gly Pro Ser Asp His Glu Asp Phe Ala Ala Trp Leu Met Glu Glu
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Gly Ile Asp Ser Leu Ser Leu Asn Pro Asp Thr Val Val Gln Thr Trp
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Leu Ser Leu Ala Glu Leu Lys Lys
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌W3110
<400> 23
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<213> 大肠埃希氏菌W3110
<400> 24
Met Ser Ser Arg Lys Glu Leu Ala Asn Ala Ile Arg Ala Leu Ser Met
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Met Ala Asp Ile Ala Glu Val Leu Trp Arg Asp Phe Leu Lys His Asn
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Asp Leu Pro Met Glu Glu Leu Lys Asn Phe Arg Gln Leu His Ser Lys
85 90 95
Thr Pro Gly His Pro Glu Val Gly Tyr Thr Ala Gly Val Glu Thr Thr
100 105 110
Thr Gly Pro Leu Gly Gln Gly Ile Ala Asn Ala Val Gly Met Ala Ile
115 120 125
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130 135 140
Val Asp His Tyr Thr Tyr Ala Phe Met Gly Asp Gly Cys Met Met Glu
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Gly Ile Ser His Glu Val Cys Ser Leu Ala Gly Thr Leu Lys Leu Gly
165 170 175
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Val Glu Gly Trp Phe Thr Asp Asp Thr Ala Met Arg Phe Glu Ala Tyr
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Gly Trp His Val Ile Arg Asp Ile Asp Gly His Asp Ala Ala Ser Ile
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Lys Arg Ala Val Glu Glu Ala Arg Ala Val Thr Asp Lys Pro Ser Leu
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Leu Met Cys Lys Thr Ile Ile Gly Phe Gly Ser Pro Asn Lys Ala Gly
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Thr His Asp Ser His Gly Ala Pro Leu Gly Asp Ala Glu Ile Ala Leu
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Thr Arg Glu Gln Leu Gly Trp Lys Tyr Ala Pro Phe Glu Ile Pro Ser
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Ser Ala Trp Asn Glu Lys Phe Ala Ala Tyr Ala Lys Ala Tyr Pro Gln
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Glu Ala Ala Glu Phe Thr Arg Arg Met Lys Gly Glu Met Pro Ser Asp
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Phe Asp Ala Lys Ala Lys Glu Phe Ile Ala Lys Leu Gln Ala Asn Pro
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Ala Lys Ile Ala Ser Arg Lys Ala Ser Gln Asn Ala Ile Glu Ala Phe
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Gly Pro Leu Leu Pro Glu Phe Leu Gly Gly Ser Ala Asp Leu Ala Pro
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Ala Gly Asn Tyr Ile His Tyr Gly Val Arg Glu Phe Gly Met Thr Ala
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<210> 37
<211> 462
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒杆菌ATCC13032
<400> 37
Met Ser Trp Thr Val Asp Ile Pro Lys Glu Val Leu Pro Asp Leu Pro
1 5 10 15
Pro Leu Pro Glu Gly Met Gln Gln Gln Phe Glu Asp Thr Ile Ser Arg
20 25 30
Asp Ala Lys Gln Gln Pro Thr Trp Asp Arg Ala Gln Ala Glu Asn Val
35 40 45
Arg Lys Ile Leu Glu Ser Val Pro Pro Ile Val Val Ala Pro Glu Val
50 55 60
Leu Glu Leu Lys Gln Lys Leu Ala Asp Val Ala Asn Gly Lys Ala Phe
65 70 75 80
Leu Leu Gln Gly Gly Asp Cys Ala Glu Thr Phe Glu Ser Asn Thr Glu
85 90 95
Pro His Ile Arg Ala Asn Val Lys Thr Leu Leu Gln Met Ala Val Val
100 105 110
Leu Thr Tyr Gly Ala Ser Thr Pro Val Ile Lys Met Ala Arg Ile Ala
115 120 125
Gly Gln Tyr Ala Lys Pro Arg Ser Ser Asp Leu Asp Gly Asn Gly Leu
130 135 140
Pro Asn Tyr Arg Gly Asp Ile Val Asn Gly Val Glu Ala Thr Pro Glu
145 150 155 160
Ala Arg Arg His Asp Pro Ala Arg Met Ile Arg Ala Tyr Ala Asn Ala
165 170 175
Ser Ala Ala Met Asn Leu Val Arg Ala Leu Thr Ser Ser Gly Thr Ala
180 185 190
Asp Leu Tyr Arg Leu Ser Glu Trp Asn Arg Glu Phe Val Ala Asn Ser
195 200 205
Pro Ala Gly Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Ala Arg Glu Ile Asp Ser Gly
210 215 220
Leu Arg Phe Met Glu Ala Cys Gly Val Ser Asp Glu Ser Leu Arg Ala
225 230 235 240
Ala Asp Ile Tyr Cys Ser His Glu Ala Leu Leu Val Asp Tyr Glu Arg
245 250 255
Ser Met Leu Arg Leu Ala Thr Asp Glu Glu Gly Asn Glu Glu Leu Tyr
260 265 270
Asp Leu Ser Ala His Gln Leu Trp Ile Gly Glu Arg Thr Arg Gly Met
275 280 285
Asp Asp Phe His Val Asn Phe Ala Ser Met Ile Ser Asn Pro Ile Gly
290 295 300
Ile Lys Ile Gly Pro Gly Ile Thr Pro Glu Glu Ala Val Ala Tyr Ala
305 310 315 320
Asp Lys Leu Asp Pro Asn Phe Glu Pro Gly Arg Leu Thr Ile Val Ala
325 330 335
Arg Met Gly His Asp Lys Val Arg Ser Val Leu Pro Gly Val Ile Gln
340 345 350
Ala Val Glu Ala Ser Gly His Lys Val Ile Trp Gln Ser Asp Pro Met
355 360 365
His Gly Asn Thr Phe Thr Ala Ser Asn Gly Tyr Lys Thr Arg His Phe
370 375 380
Asp Lys Val Ile Asp Glu Val Gln Gly Phe Phe Glu Val His Arg Ala
385 390 395 400
Leu Gly Thr His Pro Gly Gly Ile His Ile Glu Phe Thr Gly Glu Asp
405 410 415
Val Thr Glu Cys Leu Gly Gly Ala Glu Asp Ile Thr Asp Val Asp Leu
420 425 430
Pro Gly Arg Tyr Glu Ser Ala Cys Asp Pro Arg Leu Asn Thr Gln Gln
435 440 445
Ser Leu Glu Leu Ala Phe Leu Val Ala Glu Met Leu Arg Asn
450 455 460
<210> 38
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pn-cgl aroG_F
<400> 38
ggtatcgata agcttgattc gatctgctcc cattcc 36
<210> 39
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pn-cgl aroG_R
<400> 39
cggtggcggc cgctctagtt agttacgcag catttc 36
<210> 40
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pcj7-cgl aroG_F
<400> 40
cgaaaggaaa cactcgatgt gagttggaca gttgatatc 39
<210> 41
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pcj7-cgl aroG_R
<400> 41
ccgccaaaac agctctagtt tagttacgca gcatttc 37
<210> 42
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ava_ABCD_F
<400> 42
ccaaacacca acaaaaggct ctacccatat gatgagtatc gtccaagcaa agtttgaagc 60
60
<210> 43
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ava_ABCD_R
<400> 43
agagggtgac gctagtcaga actagtttat gaattatttt ccagacaatc ttgtaaacgc 60
60
<210> 44
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> O2启动子_F
<400> 44
ccaaacacca acaaaaggct ctacccatat gcaataatcg tgaattttgg cagc 54
<210> 45
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> O2启动子_R
<400> 45
caaactttgc ttggacgata ctcattgttt tgatctcctc caataatcta tgc 53
<210> 46
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pn-cgl tkt_F
<400> 46
ggtatcgata agcttgataa gattgatcac acctttg 37
<210> 47
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pn-cgl tkt_R
<400> 47
cggtggcggc cgctctagtt aaccgttaat ggagtc 36
<210> 48
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pcj7-cgl tkt_F
<400> 48
cgaaaggaaa cactcgattt gaccaccttg acgctg 36
<210> 49
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pcj7-cgl tkt_R
<400> 49
ccgccaaaac agctctagtt taaccgttaa tggagtc 37
<210> 50
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ptrc-cgl pps_F
<400> 50
tcacacagga aagatatcat gaccaacagt ttgaac 36
<210> 51
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ptrc-cgl pps_R
<400> 51
ccgccaaaac agctctagtt tacttcgtgc cggtcattg 39
<210> 52
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pcj7-cgl pps_F
<400> 52
cgaaaggaaa cactcgatat gaccaacagt ttgaac 36
<210> 53
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pcj7-aroG_F
<400> 53
ttagaaatgg aacctaaaag aaacatccca gcgctac 37
<210> 54
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pcj7-aroG_R
<400> 54
tagcgctggg atgtttcttt agttacgcag catttc 36
<210> 55
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pcj7-tkt_F
<400> 55
gaaatgctgc gtaactaaag aaacatccca gcgcta 36
<210> 56
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pcj7-tkt_R
<400> 56
gtagcgctgg gatgtttctt taaccgttaa tggagtc 37
<210> 57
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pcj7-pps_F
<400> 57
gactccatta acggttaaag aaacatccca gcgctac 37
<210> 58
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pcj7-pps_R
<400> 58
ggagaatact gtcgttcatt tacttcgtgc cggtcattg 39
<210> 59
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGPD_F
<400> 59
ggatccacag tttattcctg gcatcc 26
<210> 60
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGPD_R
<400> 60
tttgcttgga cgatactcat ttgtttgttt atgtgtgttt 40
<210> 61
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ava_A_F
<400> 61
aaacacacat aaacaaacaa atgagtatcg tccaagcaaa 40
<210> 62
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ava_A_R
<400> 62
ggatgccagg aataaactgt ttatttaaca ctcccgatta 40
<210> 63
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGPD_F
<400> 63
taatcgggag tgttaaataa acagtttatt cctggcatcc 40
<210> 64
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGPD_R
<400> 64
tggacaatca catttgtcaa ttgtttgttt atgtgtgttt 40
<210> 65
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ava_B_F
<400> 65
aaacacacat aaacaaacaa ttgacaaatg tgattgtcca 40
<210> 66
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ava_B_R
<400> 66
gtcgacttaa ggttgtattc tgcgga 26
<210> 67
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGPD_F
<400> 67
ggatccacag tttattcctg gcatcc 26
<210> 68
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGPD_R
<400> 68
aaagagattg attgtgccat ttgtttgttt atgtgtgttt 40
<210> 69
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ava_C_F
<400> 69
aaacacacat aaacaaacaa atggcacaat caatctcttt 40
<210> 70
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ava_C_R
<400> 70
ggatgccagg aataaactgt ttagtcgccc cctaattcca 40
<210> 71
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGPD_F
<400> 71
tggaattagg gggcgactaa acagtttatt cctggcatcc 40
<210> 72
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGPD_R
<400> 72
aggatattaa gtactggcat ttgtttgttt atgtgtgttt 40
<210> 73
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ava_D_F
<400> 73
aaacacacat aaacaaacaa atgccagtac ttaatatcct 40
<210> 74
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ava_D_R
<400> 74
gtcgactcaa ttttgtaaca cctttt 26
<210> 75
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TKL1_F
<400> 75
ggatccatga ctcaattcac tgacat 26
<210> 76
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TKL1_R
<400> 76
gtcgacttag aaagcttttt tcaaag 26
<210> 77
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ARO4_F
<400> 77
ggatccatga gtgaatctcc aatgtt 26
<210> 78
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ARO4_R
<400> 78
gtcgacctat ttcttgttaa cttctc 26
<210> 79
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pps_F
<400> 79
ggatccatgt ccaacaatgg ctcgtc 26
<210> 80
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pps_R
<400> 80
gtcgacttat ttcttcagtt cagcca 26
<210> 81
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGPD_F
<400> 81
ggatccacag tttattcctg gcatcc 26
<210> 82
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGPD_R
<400> 82
atgtcagtga attgagtcat ttgtttgttt atgtgtgttt 40
<210> 83
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TKL1_F
<400> 83
aaacacacat aaacaaacaa atgactcaat tcactgacat 40
<210> 84
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TKL1_R
<400> 84
ggatgccagg aataaactgt ttagaaagct tttttcaaag 40
<210> 85
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGPD_F
<400> 85
ctttgaaaaa agctttctaa acagtttatt cctggcatcc 40
<210> 86
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGPD_R
<400> 86
aacattggag attcactcat ttgtttgttt atgtgtgttt 40
<210> 87
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ARO4_F
<400> 87
aaacacacat aaacaaacaa atgagtgaat ctccaatgtt 40
<210> 88
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ARO4_R
<400> 88
gtcgacctat ttcttgttaa cttctc 26
<210> 89
<211> 438
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌ATCC13032
<400> 89
atgcctggaa aaattctcct cctcaacggc ccaaacctga acatgctggg caaacgcgag 60
cctgacattt acggacacga caccttggaa gacgtcgtcg cgctggcaac cgctgaggct 120
gcgaagcacg gccttgaggt tgaggcgctg cagagcaatc acgaaggtga gctaatcgat 180
gcgctgcaca acgctcgcgg cacccacatc ggttgcgtga ttaaccccgg cggcctgact 240
cacacttcgg tggcgctttt ggatgctgtg aaggcgtctg agcttcctac cgttgaggtg 300
cacatttcca atccgcatgc ccgtgaagag ttccgccacc attcttacat ttccctcgcc 360
gcggtctccg ttatcgctgg cgctggcatc cagggttacc gtttcgcggt cgatatcctg 420
gcaaatctca aaaagtag 438
<210> 90
<211> 145
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒杆菌ATCC13032
<400> 90
Met Pro Gly Lys Ile Leu Leu Leu Asn Gly Pro Asn Leu Asn Met Leu
1 5 10 15
Gly Lys Arg Glu Pro Asp Ile Tyr Gly His Asp Thr Leu Glu Asp Val
20 25 30
Val Ala Leu Ala Thr Ala Glu Ala Ala Lys His Gly Leu Glu Val Glu
35 40 45
Ala Leu Gln Ser Asn His Glu Gly Glu Leu Ile Asp Ala Leu His Asn
50 55 60
Ala Arg Gly Thr His Ile Gly Cys Val Ile Asn Pro Gly Gly Leu Thr
65 70 75 80
His Thr Ser Val Ala Leu Leu Asp Ala Val Lys Ala Ser Glu Leu Pro
85 90 95
Thr Val Glu Val His Ile Ser Asn Pro His Ala Arg Glu Glu Phe Arg
100 105 110
His His Ser Tyr Ile Ser Leu Ala Ala Val Ser Val Ile Ala Gly Ala
115 120 125
Gly Ile Gln Gly Tyr Arg Phe Ala Val Asp Ile Leu Ala Asn Leu Lys
130 135 140
Lys
145
<210> 91
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aroD_F
<400> 91
gatcggatcc cactggacgt ttgggtgaga cc 32
<210> 92
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aroD_R
<400> 92
gatcggatcc actagtttta ggttccattt ctaattg 37
<210> 93
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aroD_F
<400> 93
gatcactagt atgaacgaca gtattctcc 29
<210> 94
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aroD_D
<400> 94
gatcaagctt gttacatcct gacgttgtgg 30
<210> 95
<211> 2103
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌ATCC13032
<400> 95
ttgaccacct tgacgctgtc acctgaactt caggcgctca ctgtacgcaa ttacccctct 60
gattggtccg atgtggacac caaggctgta gacactgttc gtgtcctcgc tgcagacgct 120
gtagaaaact gtggctccgg ccacccaggc accgcaatga gcctggctcc ccttgcatac 180
accttgtacc agcgggttat gaacgtagat ccacaggaca ccaactgggc aggccgtgac 240
cgcttcgttc tttcttgtgg ccactcctct ttgacccagt acatccagct ttacttgggt 300
ggattcggcc ttgagatgga tgacctgaag gctctgcgca cctgggattc cttgacccca 360
ggacaccctg agtaccgcca caccaagggc gttgagatca ccactggccc tcttggccag 420
ggtcttgcat ctgcagttgg tatggccatg gctgctcgtc gtgagcgtgg cctattcgac 480
ccaaccgctg ctgagggcga atccccattc gaccaccaca tctacgtcat tgcttctgat 540
ggtgacctgc aggaaggtgt cacctctgag gcatcctcca tcgctggcac ccagcagctg 600
ggcaacctca tcgtgttctg ggatgacaac cgcatctcca tcgaagacaa cactgagatc 660
gctttcaacg aggacgttgt tgctcgttac aaggcttacg gctggcagac cattgaggtt 720
gaggctggcg aggacgttgc agcaatcgaa gctgcagtgg ctgaggctaa gaaggacacc 780
aagcgaccta ccttcatccg cgttcgcacc atcatcggct tcccagctcc aactatgatg 840
aacaccggtg ctgtgcacgg tgctgctctt ggcgcagctg aggttgcagc aaccaagact 900
gagcttggat tcgatcctga ggctcacttc gcgatcgacg atgaggttat cgctcacacc 960
cgctccctcg cagagcgcgc tgcacagaag aaggctgcat ggcaggtcaa gttcgatgag 1020
tgggcagctg ccaaccctga gaacaaggct ctgttcgatc gcctgaactc ccgtgagctt 1080
ccagcgggct acgctgacga gctcccaaca tgggatgcag atgagaaggg cgtcgcaact 1140
cgtaaggctt ccgaggctgc acttcaggca ctgggcaaga cccttcctga gctgtggggc 1200
ggttccgctg acctcgcagg ttccaacaac accgtgatca agggctcccc ttccttcggc 1260
cctgagtcca tctccaccga gacctggtct gctgagcctt acggccgtaa cctgcacttc 1320
ggtatccgtg agcacgctat gggatccatc ctcaacggca tttccctcca cggtggcacc 1380
cgcccatacg gcggaacctt cctcatcttc tccgactaca tgcgtcctgc agttcgtctt 1440
gcagctctca tggagaccga cgcttactac gtctggaccc acgactccat cggtctgggc 1500
gaagatggcc caacccacca gcctgttgaa accttggctg cactgcgcgc catcccaggt 1560
ctgtccgtcc tgcgtcctgc agatgcgaac gagaccgccc aggcttgggc tgcagcactt 1620
gagtacaagg aaggccctaa gggtcttgca ctgacccgcc agaacgttcc tgttctggaa 1680
ggcaccaagg agaaggctgc tgaaggcgtt cgccgcggtg gctacgtcct ggttgagggt 1740
tccaaggaaa ccccagatgt gatcctcatg ggctccggct ccgaggttca gcttgcagtt 1800
aacgctgcga aggctctgga agctgagggc gttgcagctc gcgttgtttc cgttccttgc 1860
atggattggt tccaggagca ggacgcagag tacatcgagt ccgttctgcc tgcagctgtg 1920
accgctcgtg tgtctgttga agctggcatc gcaatgcctt ggtaccgctt cttgggcacc 1980
cagggccgtg ctgtctccct tgagcacttc ggtgcttctg cggattacca gaccctgttt 2040
gagaagttcg gcatcaccac cgatgcagtc gtggcagcgg ccaaggactc cattaacggt 2100
taa 2103
<210> 96
<211> 700
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒杆菌ATCC13032
<400> 96
Met Thr Thr Leu Thr Leu Ser Pro Glu Leu Gln Ala Leu Thr Val Arg
1 5 10 15
Asn Tyr Pro Ser Asp Trp Ser Asp Val Asp Thr Lys Ala Val Asp Thr
20 25 30
Val Arg Val Leu Ala Ala Asp Ala Val Glu Asn Cys Gly Ser Gly His
35 40 45
Pro Gly Thr Ala Met Ser Leu Ala Pro Leu Ala Tyr Thr Leu Tyr Gln
50 55 60
Arg Val Met Asn Val Asp Pro Gln Asp Thr Asn Trp Ala Gly Arg Asp
65 70 75 80
Arg Phe Val Leu Ser Cys Gly His Ser Ser Leu Thr Gln Tyr Ile Gln
85 90 95
Leu Tyr Leu Gly Gly Phe Gly Leu Glu Met Asp Asp Leu Lys Ala Leu
100 105 110
Arg Thr Trp Asp Ser Leu Thr Pro Gly His Pro Glu Tyr Arg His Thr
115 120 125
Lys Gly Val Glu Ile Thr Thr Gly Pro Leu Gly Gln Gly Leu Ala Ser
130 135 140
Ala Val Gly Met Ala Met Ala Ala Arg Arg Glu Arg Gly Leu Phe Asp
145 150 155 160
Pro Thr Ala Ala Glu Gly Glu Ser Pro Phe Asp His His Ile Tyr Val
165 170 175
Ile Ala Ser Asp Gly Asp Leu Gln Glu Gly Val Thr Ser Glu Ala Ser
180 185 190
Ser Ile Ala Gly Thr Gln Gln Leu Gly Asn Leu Ile Val Phe Trp Asp
195 200 205
Asp Asn Arg Ile Ser Ile Glu Asp Asn Thr Glu Ile Ala Phe Asn Glu
210 215 220
Asp Val Val Ala Arg Tyr Lys Ala Tyr Gly Trp Gln Thr Ile Glu Val
225 230 235 240
Glu Ala Gly Glu Asp Val Ala Ala Ile Glu Ala Ala Val Ala Glu Ala
245 250 255
Lys Lys Asp Thr Lys Arg Pro Thr Phe Ile Arg Val Arg Thr Ile Ile
260 265 270
Gly Phe Pro Ala Pro Thr Met Met Asn Thr Gly Ala Val His Gly Ala
275 280 285
Ala Leu Gly Ala Ala Glu Val Ala Ala Thr Lys Thr Glu Leu Gly Phe
290 295 300
Asp Pro Glu Ala His Phe Ala Ile Asp Asp Glu Val Ile Ala His Thr
305 310 315 320
Arg Ser Leu Ala Glu Arg Ala Ala Gln Lys Lys Ala Ala Trp Gln Val
325 330 335
Lys Phe Asp Glu Trp Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Lys Ala Leu Phe
340 345 350
Asp Arg Leu Asn Ser Arg Glu Leu Pro Ala Gly Tyr Ala Asp Glu Leu
355 360 365
Pro Thr Trp Asp Ala Asp Glu Lys Gly Val Ala Thr Arg Lys Ala Ser
370 375 380
Glu Ala Ala Leu Gln Ala Leu Gly Lys Thr Leu Pro Glu Leu Trp Gly
385 390 395 400
Gly Ser Ala Asp Leu Ala Gly Ser Asn Asn Thr Val Ile Lys Gly Ser
405 410 415
Pro Ser Phe Gly Pro Glu Ser Ile Ser Thr Glu Thr Trp Ser Ala Glu
420 425 430
Pro Tyr Gly Arg Asn Leu His Phe Gly Ile Arg Glu His Ala Met Gly
435 440 445
Ser Ile Leu Asn Gly Ile Ser Leu His Gly Gly Thr Arg Pro Tyr Gly
450 455 460
Gly Thr Phe Leu Ile Phe Ser Asp Tyr Met Arg Pro Ala Val Arg Leu
465 470 475 480
Ala Ala Leu Met Glu Thr Asp Ala Tyr Tyr Val Trp Thr His Asp Ser
485 490 495
Ile Gly Leu Gly Glu Asp Gly Pro Thr His Gln Pro Val Glu Thr Leu
500 505 510
Ala Ala Leu Arg Ala Ile Pro Gly Leu Ser Val Leu Arg Pro Ala Asp
515 520 525
Ala Asn Glu Thr Ala Gln Ala Trp Ala Ala Ala Leu Glu Tyr Lys Glu
530 535 540
Gly Pro Lys Gly Leu Ala Leu Thr Arg Gln Asn Val Pro Val Leu Glu
545 550 555 560
Gly Thr Lys Glu Lys Ala Ala Glu Gly Val Arg Arg Gly Gly Tyr Val
565 570 575
Leu Val Glu Gly Ser Lys Glu Thr Pro Asp Val Ile Leu Met Gly Ser
580 585 590
Gly Ser Glu Val Gln Leu Ala Val Asn Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala
595 600 605
Glu Gly Val Ala Ala Arg Val Val Ser Val Pro Cys Met Asp Trp Phe
610 615 620
Gln Glu Gln Asp Ala Glu Tyr Ile Glu Ser Val Leu Pro Ala Ala Val
625 630 635 640
Thr Ala Arg Val Ser Val Glu Ala Gly Ile Ala Met Pro Trp Tyr Arg
645 650 655
Phe Leu Gly Thr Gln Gly Arg Ala Val Ser Leu Glu His Phe Gly Ala
660 665 670
Ser Ala Asp Tyr Gln Thr Leu Phe Glu Lys Phe Gly Ile Thr Thr Asp
675 680 685
Ala Val Val Ala Ala Ala Lys Asp Ser Ile Asn Gly
690 695 700
<210> 97
<211> 1095
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌ATCC13032
<400> 97
atgaccaaca gtttgaacat cccgtttgtc cagcgcttcg atgaaggcct ggatcctgtt 60
ctagaagtac tcggtggcaa gggcgcttca ctagtcacca tgacagatgc tggaatgccc 120
gttccacctg gatttgtggt cactactgcc agctttgatg aattcatccg tgaagcaggg 180
gttgctgaac acatcgataa attcctaaac gatctcgatg cagaagatgt taaggaagtg 240
gatcgagttt ctgcgatcat ccgcgatgag ctgtgcagtc ttgacgttcc agagaatgct 300
cgtttcgcag tgcaccaggc ttatcgcgat ctcatggaac gatgcggtgg cgacgtcccg 360
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tgggcttcgc tgttcacttc ccgtgccatt atctaccgtc tgaaaaacaa catccccaat 540
gagggcctct ccatggcggt agttgttcaa aaaatggtca actctcgtgt cgcaggcgtg 600
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accggcacga agtaa 1095
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<211> 364
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒杆菌ATCC13032
<400> 98
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1 5 10 15
Leu Asp Pro Val Leu Glu Val Leu Gly Gly Lys Gly Ala Ser Leu Val
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Thr Met Thr Asp Ala Gly Met Pro Val Pro Pro Gly Phe Val Val Thr
35 40 45
Thr Ala Ser Phe Asp Glu Phe Ile Arg Glu Ala Gly Val Ala Glu His
50 55 60
Ile Asp Lys Phe Leu Asn Asp Leu Asp Ala Glu Asp Val Lys Glu Val
65 70 75 80
Asp Arg Val Ser Ala Ile Ile Arg Asp Glu Leu Cys Ser Leu Asp Val
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Pro Glu Asn Ala Arg Phe Ala Val His Gln Ala Tyr Arg Asp Leu Met
100 105 110
Glu Arg Cys Gly Gly Asp Val Pro Val Ala Val Arg Ser Ser Ala Thr
115 120 125
Ala Glu Asp Leu Pro Asp Ala Ser Phe Ala Gly Gln Gln Asp Thr Tyr
130 135 140
Leu Trp Gln Val Gly Leu Ser Ala Val Thr Glu His Ile Arg Lys Cys
145 150 155 160
Trp Ala Ser Leu Phe Thr Ser Arg Ala Ile Ile Tyr Arg Leu Lys Asn
165 170 175
Asn Ile Pro Asn Glu Gly Leu Ser Met Ala Val Val Val Gln Lys Met
180 185 190
Val Asn Ser Arg Val Ala Gly Val Ala Ile Thr Met Asn Pro Ser Asn
195 200 205
Gly Asp Arg Ser Lys Ile Thr Ile Asp Ser Ser Trp Gly Val Gly Glu
210 215 220
Met Val Val Ser Gly Glu Val Thr Pro Asp Asn Ile Leu Leu Asp Lys
225 230 235 240
Ile Thr Leu Gln Val Val Ser Glu His Ile Gly Ser Lys His Ala Glu
245 250 255
Leu Ile Pro Asp Ala Thr Ser Gly Ser Leu Val Glu Lys Pro Val Asp
260 265 270
Glu Glu Arg Ala Asn Arg Arg Ser Leu Thr Asp Glu Glu Met Leu Ala
275 280 285
Val Ala Gln Met Ala Lys Arg Ala Glu Lys His Tyr Lys Cys Pro Gln
290 295 300
Asp Ile Glu Trp Ala Leu Asp Ala Asp Leu Pro Asp Gly Glu Asn Leu
305 310 315 320
Leu Leu Leu Gln Ser Arg Pro Glu Thr Ile His Ser Asn Gly Val Lys
325 330 335
Lys Glu Thr Pro Thr Pro Gln Ala Ala Lys Thr Ile Gly Thr Phe Asp
340 345 350
Phe Ser Ser Ile Thr Val Ala Met Thr Gly Thr Lys
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<212> DNA
<213> 酿酒酵母
<400> 99
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atgaaaccct cgtttacccc ttcaaggaca tccctgctga tcaacagaaa gttgttatcc 420
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aaaaattcgg tatcaatgtt gaaacttcta ctacagaacc ttacacttat tatattccaa 1080
agggacatta tattaaccca tcagaatacg tcattgaaag tgatgcctca agtgctacat 1140
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accagcgtgt caaagagtgt aacagaattt tggccatggc tacagagctc gccaaatttg 1500
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ccttaaaaga ttttgcctca tcaggtggat acgttttaca cttacatagg gatattgagg 2160
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aagtttggaa cagaagggag gggtggtata aagaatgctc aaatttctct ttctttgctc 2280
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caaccattac aggtgtcaga gaaatagaaa ttccaagcgg aagatctgcc tttgtgtgtt 2400
taacctttga tgacttaact gaacaaactg agaatttgac tccaatctgt tatggttgtg 2460
aggctgtaga ggtcagagta gaccatttgg ctaattactc tgctgatttc gtgagtaaac 2520
agttatctat attgcgtaaa gccactgaca gtattcctat catttttact gtgcgaacca 2580
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aaggattata ctcctgggac gacgctgaat gggaaaacag attcaatcaa gcgttaactc 2820
ttgatgtgga tgttgtaaaa tttgtgggta cggctgttaa tttcgaagat aatttgagac 2880
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<213> 多变鱼腥藻ATCC29413
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cggttgtatg gtaatcaaat tcaggcatat ttccagtatt atggtataga actgaggcta 240
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ttctccttgt tgcgtactct ccctacagac caagtacgta acgggatggc ggaattggta 600
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cctcgtctac ccatgttcca cggacacgcc gttaatgtag atatggcttt ctcggcaacg 900
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cacaaagaac tttgtaccag ttatccccgt ggtggtgaag gtgtggatgt gtatcccgtt 1200
tatcaaaaag aattaatcgg gagtgttaaa taatgacttt tttgaattca aaatgcaaaa 1260
tactccacgg atacactgcg cgagcgcggt agcatttctg ttcgcggagc gtcccgtagg 1320
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<212> DNA
<213> 多变鱼腥藻ATCC29413
<400> 101
tccagaattc tgcactagca gatgtatatc aaggttttgg acgatgcttg gcgattgtag 60
atgctaacgt cagtcggttg tatggtaatc aaattcaggc atatttccag tattatggta 120
tagaactgag gctatttcct attaccatta ctgaaccaga taagactatt caaactttcg 180
agagagttat agatgtcttt gcagatttca aattagtccg caaagaacca gtattagtcg 240
tgggtggcgg tttaattaca gatgttgtcg gctttgcttg ttctacatat cgtcgcagca 300
gcaattacat ccgcattcct actacattga ttggattaat tgatgccagt gtagcaatta 360
aggtagcagt taatcatcgc aaactgaaaa accgtttggg tgcttatcat gcttctcgca 420
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agtacggcga agaattacta cgtactcatt ttggcaatat agatgcaact ccagagatta 600
aagaaatagc ccatcgtttg acttacaaag ctatccataa gatgttggaa ttggaagttc 660
ccaacctgca tgagttagac ctagataggg tgattgctta cggtcacact tggagtccca 720
ccttggaact tgcgcctcgt ctacccatgt tccacggaca cgccgttaat gtagatatgg 780
ctttctcggc aacgatcgcc gcccgtagag gatatattac aattgcagaa cgcgatcgta 840
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cttggcgttt agccgcaggt atagaccctt atttggaaga atgcaccact ccagaatctc 1500
ctgaactcgc tgcattggca aaaaccacag ccaccgaagc ctggggagaa cacttccacg 1560
gaggtacaac cgtccgtcct ctagaacaag agatgctttc tggtcatatc gaaggacaaa 1620
ccttaaagat gtttgttcac atgaccaaag ctaaaaaagt cttagaaatt gggatgttta 1680
ccggttattc ggcgctggcg atggcggaag cattaccaga ggatggactg cttgtggctt 1740
gtgaagttga cccttacgcg gcggaaattg gacagaaagc ctttcaacaa tctccccacg 1800
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gcaaattacc gaatgggtac agcattttgt caaggaactg aaactgacag gacagatttc 3120
ctttgacttt atccaagccg aagacggaac agtttacgcc atcgagtgta acccccgcac 3180
acattcagca attaccacat tttacgacca cccccaggta gcagaagcgt acttgagtca 3240
agcaccgacg actgaaacca tacaaccact aacgacaagc aagcctacct attggactta 3300
tcacgaagtt tggcgtttaa ctggtatccg ttctttcacc cagttgcaaa gatggctggg 3360
gaatatttgg cgcgggactg atgcgattta tcagccagat gaccccttac cgtttttgat 3420
ggtacatcat tggcaaattc ccctactgtt attgaataat ttgcgtcgtc ttaaaggttg 3480
gacgcggata gatttcaata ttgggaagtt ggtggaattg gggggagatt ag 3532
<210> 102
<211> 1233
<212> DNA
<213> 多变鱼腥藻ATCC29413
<400> 102
atgagtatcg tccaagcaaa gtttgaagct aaggaaacat cttttcatgt agaaggttac 60
gaaaagattg agtatgattt ggtgtatgta gatggtattt ttgaaatcca gaattctgca 120
ctagcagatg tatatcaagg ttttggacga tgcttggcga ttgtagatgc taacgtcagt 180
cggttgtatg gtaatcaaat tcaggcatat ttccagtatt atggtataga actgaggcta 240
tttcctatta ccattactga accagataag actattcaaa ctttcgagag agttatagat 300
gtctttgcag atttcaaatt agtccgcaaa gaaccagtat tagtcgtggg tggcggttta 360
attacagatg ttgtcggctt tgcttgttct acatatcgtc gcagcagcaa ttacatccgc 420
attcctacta cattgattgg attaattgat gccagtgtag caattaaggt agcagttaat 480
catcgcaaac tgaaaaaccg tttgggtgct tatcatgctt ctcgcaaagt atttttagat 540
ttctccttgt tgcgtactct ccctacagac caagtacgta acgggatggc ggaattggta 600
aaaatcgctg tagtagcgca tcaagaagtt tttgaattgt tggagaagta cggcgaagaa 660
ttactacgta ctcattttgg caatatagat gcaactccag agattaaaga aatagcccat 720
cgtttgactt acaaagctat ccataagatg ttggaattgg aagttcccaa cctgcatgag 780
ttagacctag atagggtgat tgcttacggt cacacttgga gtcccacctt ggaacttgcg 840
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agtcgcgttg gtctatccct cgaccatccc atgttggata tagatatttt gtggcgtggt 1020
actgaatcta tcacattaac tcgtgatggt ttgttaagag ctgctatgcc aaaacccatt 1080
ggtgattgtg tcttcgtcaa tgacctgaca agagaagaat tagcagccgc attagctgac 1140
cacaaagaac tttgtaccag ttatccccgt ggtggtgaag gtgtggatgt gtatcccgtt 1200
tatcaaaaag aattaatcgg gagtgttaaa taa 1233
<210> 103
<211> 840
<212> DNA
<213> 多变鱼腥藻ATCC29413
<400> 103
ttgacaaatg tgattgtcca accaacagct agacctgtta caccattggg aattttaacc 60
aagcagttag aagccatagt ccaagaggtt aagcaacatc cagatttacc tggggaattg 120
atagcaaaca tccatcaggc ttggcgttta gccgcaggta tagaccctta tttggaagaa 180
tgcaccactc cagaatctcc tgaactcgct gcattggcaa aaaccacagc caccgaagcc 240
tggggagaac acttccacgg aggtacaacc gtccgtcctc tagaacaaga gatgctttct 300
ggtcatatcg aaggacaaac cttaaagatg tttgttcaca tgaccaaagc taaaaaagtc 360
ttagaaattg ggatgtttac cggttattcg gcgctggcga tggcggaagc attaccagag 420
gatggactgc ttgtggcttg tgaagttgac ccttacgcgg cggaaattgg acagaaagcc 480
tttcaacaat ctccccacgg tggaaagatt cgtgtggaat tggatgcagc cttagcaact 540
cttgataagt tagcagaagc tggggagtct tttgacttgg tatttatcga cgcagataaa 600
aaagagtatg tagcctattt tcacaagttg ctaggtagca gtttgttagc accagatggc 660
tttatttgtg tagataacac cttattacaa ggggaagttt atctaccagc agaggaacgt 720
agcgtcaatg gtgaagcgat cgcgcaattt aatcatacag tagctataga cccccgtgta 780
gaacaggttt tgttgccgtt gcgagatggt ttaacaatta tccgcagaat acaaccttaa 840
840
<210> 104
<211> 1377
<212> DNA
<213> 多变鱼腥藻ATCC29413
<400> 104
atggcacaat cccttcccct ttcttccgca cctgctacac cgtctcttcc ttcccagacg 60
aaaatagccg caattatcca aaatatctgc actttggctt tgttattact agcattgccc 120
attaatgcca ccattgtttt tatatccttg ttagtcttcc gaccgcaaaa ggtcaaagca 180
gcaaaccccc aaaccattct tatcagtggc ggtaagatga ccaaagcttt acaactagca 240
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<210> 105
<211> 2358
<212> DNA
<213> 多变鱼腥藻ATCC29413
<400> 105
gttcctattg accctgaata tcctcaagaa cgcatagctt atatgctaga agattctcag 60
gtgaaggtac tactaactca agaaaaatta ctcaatcaaa ttccccacca tcaagcacaa 120
actatctgtg tagataggga atgggagaaa atttccacac aagctaatac caatcccaaa 180
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ccaaaaggtg caatgaacac ccacaaaggt atctgtaatc gcttattgtg gatgcaggaa 300
gcttatcaaa tcgattccac agatagcatt ttacaaaaaa ccccctttag ttttgatgtt 360
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gatgtcacat tttggcaatg tagaaaagat agtaatttaa agagtgtacc tattggtcgt 720
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ttcgctattg gtggtaattc cctcaaagct ctacatttaa tttctcaaat tgaagagtta 1440
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aaactcgcac aatatatagg aactgaccaa ccattttatg gcttacaagc tcaaggattt 1680
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attagagaat ttcaacccca agggccttat cgtgtcgggg ggtggtcatt tggtggagtc 1800
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atattagatt cttacgtacc gattctgctg gataaacaaa aacccattga tgacgtttat 1920
ttagttggtg ttctctccag agtttttggc ggtatgtttg gtcaagataa tctagtcaca 1980
cctgaagaaa tagaaaattt aactgtagaa gaaaaaatta attacatcat tgataaagca 2040
cggagcgcta gaatattccc gcctggtgta gaacgtcaaa ataatcgccg tattcttgat 2100
gttttggtgg gaactttaaa agcaacttat tcctatataa gacaaccata tccaggaaaa 2160
gtcactgtat ttcgagccag ggaaaaacat attatggctc ctgacccgac cttagtttgg 2220
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cattattcgt ttgttctaga accccatgta caggttttag cacagcgttt acaagattgt 2340
ctggaaaata attcataa 2358
<210> 106
<211> 1233
<212> DNA
<213> 点状念珠藻ATCC29133
<400> 106
atgagtaatg ttcaagcatc gtttgaagca acggaagctg aattccgcgt ggaaggttac 60
gaaaaaattg agtttagtct tgtctatgta aatggtgcat ttgatatcag taacagagaa 120
attgcagaca gctatgagaa gtttggccgt tgtctgactg tgattgatgc taatgtcaac 180
agattatatg gcaagcaaat caagtcatat tttagacact atggtattga tctgaccgta 240
gttcccattg tgattactga gcctactaaa acccttgcaa cctttgagaa aattgttgat 300
gctttttctg actttggttt aatccgcaag gaaccagtat tagtagtggg tggtggttta 360
accactgatg tagctgggtt tgcgtgtgct gcttaccgtc gtaagagtaa ctatattcgg 420
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aaaattgctg ttgtggcgaa ctctgaagtc tttgaattgt tgtatgaata tggcgaagag 660
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actcaagaag aatccaaact attgggagtg tga 1233
<210> 107
<211> 834
<212> DNA
<213> 点状念珠藻ATCC29133
<400> 107
atgaccagta ttttaggacg agataccgca agaccaataa cgccacatag cattctggta 60
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actacccctg aatcgaccgc attgacagca ctagcgcaga agacaagcat tgaagactgg 240
agtaaacgct tcagtgatgg tgaaacagtg cgtcaattag agcaagaaat gctctcagga 300
catcttgaag gacaaacact aaagatgttt gtgcatatca ctaaggctaa aagcatccta 360
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atctgtgtag ataatacttt gttgcaagga caagtttacc tgccatcaga acagcgtaca 720
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caagttctgt tacccatacg agatggtata accctgatta gacgcttggt ataa 834
<210> 108
<211> 1086
<212> DNA
<213> 点状念珠藻ATCC29133
<400> 108
tactggttat cagggcatag attctcaaat tctgtgagtc gtttttatac agttcctgca 60
ccacaagacg acccagaagg ctatacccaa gcgctattgg aaattgtcaa acgagagaag 120
attgacgttt atgtacccgt atgcagccct gtagctagtt attacgactc tttggcaaag 180
tctgcactat cagaatattg tgaggttttt cactttgatg ctgatataac caagatgctg 240
gatgataaat ttgcctttac cgatcgggcg cgatcgcttg gtttatcagc cccgaaatct 300
tttaaaatta ccgatcctga acaagttatc aacttcgatt ttagtaaaga gacgcgcaaa 360
tatattctta agagtatttc ttacgactca gttcgccgct taaatttaac caaacttcct 420
tgtgataccc cagaagagac agcagcgttt gtcaagagtt tacccatcag cccagaaaaa 480
ccttggatta tgcaagaatt tattcctggg aaagaattat gcacccatag cacagtccga 540
gacggcgaat taaggttgca ttgctgttca aattcttcag cgtttcagat taactatgaa 600
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gcctatcttg gtaaaactcc tctagctgca cctttggaac ctcttgcaga tagcaagccc 840
acttactgga tatatcacga aatctggcga ttgactggga ttcgctctgg acaacaatta 900
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ataccatttt taactttgca ccattggcag attactttac ttttgctaca aaatttgcaa 1020
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gactaa 1086
<210> 109
<211> 1047
<212> DNA
<213> 点状念珠藻ATCC29133
<400> 109
atgccagtac ttaatatcct tcatttagtt gggtctgcac acgataagtt ttactgtgat 60
ttatcacgtc tttatgccca agactgttta gctgcaacag cagatccatc gctttataac 120
tttcaaattg catatatcac acccgatcgg cagtggcgat ttcctgactc tctcagtcga 180
gaagatattg ctcttaccaa accgattcct gtgtttgatg ccatacaatt tctaacaggc 240
caaaacattg acatgatgtt accacaaatg ttttgtattc ctggaatgac tcagtaccgt 300
gccctattcg atctgctcaa gatcccttat ataggaaata ccccagatat tatggcgatc 360
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ttgggttgtc gccactacag tttatttgac ttccgaatcg atccaaaggg acaaccttgg 900
ttcttagaag ctggattata ttgttctttt gcccccaaaa gtgtgatttc ttctatggcg 960
aaagcagccg gaatccctct aaatgattta ttaataaccg ctattaatga aacattgggt 1020
agtaataaaa aggtgttaca aaattga 1047
<210> 110
<211> 1626
<212> DNA
<213> 酿酒酵母CEN.PK-1D
<400> 110
aacaagccgg gctttacctt gtctgacaac tacacctatg ttttcttggg tgacggttgt 60
ttgcaagaag gtatttcttc agaagcttcc tccttggctg gtcatttgaa attgggtaac 120
ttgattgcca tctacgatga caacaagatc actatcgatg gtgctaccag tatctcattc 180
gatgaagatg ttgctaagag atacgaagcc tacggttggg aagttttgta cgtagaaaat 240
ggtaacgaag atctagccgg tattgccaag gctattgctc aagctaagtt atccaaggac 300
aaaccaactt tgatcaaaat gaccacaacc attggttacg gttccttgca tgccggctct 360
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ggtttcaacc cagacaagtc ctttgttgtt ccacaagaag tttacgacca ctaccaaaag 480
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caaaagaaat tcccagaatt aggtgctgaa ttggctagaa gattgagcgg ccaactaccc 600
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actccaagta tcattgcttt gtccagacaa aacttgccac aattggaagg tagctctatt 1200
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ttctaa 1626
<210> 111
<211> 1113
<212> DNA
<213> 酿酒酵母CEN.PK-1D
<400> 111
atgagtgaat ctccaatgtt cgctgccaac ggcatgccaa aggtaaatca aggtgctgaa 60
gaagatgtca gaattttagg ttacgaccca ttagcttctc cagctctcct tcaagtgcaa 120
atcccagcca caccaacttc tttggaaact gccaagagag gtagaagaga agctatagat 180
attattaccg gtaaagacga cagagttctt gtcattgtcg gtccttgttc catccatgat 240
ctagaagccg ctcaagaata cgctttgaga ttaaagaaat tgtcagatga attaaaaggt 300
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ggtctaatta atgaccctga tgttaacaac actttcaaca tcaacaaggg tttgcaatcc 420
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gataccattt ctcctcaata cttggctgat ttggtctcct tcggtgccat tggtgccaga 540
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aagaacggta ccgatggtac cttaaatgtt gctgtggatg cttgtcaagc cgctgctcat 660
tctcaccatt tcatgggtgt tactaagcat ggtgttgctg ctatcaccac tactaagggt 720
aacgaacact gcttcgttat tctaagaggt ggtaaaaagg gtaccaacta cgacgctaag 780
tccgttgcag aagctaaggc tcaattgcct gccggttcca acggtctaat gattgactac 840
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actgatgctt gtataggttg ggaaactact gaagacgtct tgaggaaatt ggctgctgct 1080
gtcagacaaa gaagagaagt taacaagaaa tag 1113
<210> 112
<211> 1588
<212> PRT
<213> 酿酒酵母
<400> 112
Met Val Gln Leu Ala Lys Val Pro Ile Leu Gly Asn Asp Ile Ile His
1 5 10 15
Val Gly Tyr Asn Ile His Asp His Leu Val Glu Thr Ile Ile Lys His
20 25 30
Cys Pro Ser Ser Thr Tyr Val Ile Cys Asn Asp Thr Asn Leu Ser Lys
35 40 45
Val Pro Tyr Tyr Gln Gln Leu Val Leu Glu Phe Lys Ala Ser Leu Pro
50 55 60
Glu Gly Ser Arg Leu Leu Thr Tyr Val Val Lys Pro Gly Glu Thr Ser
65 70 75 80
Lys Ser Arg Glu Thr Lys Ala Gln Leu Glu Asp Tyr Leu Leu Val Glu
85 90 95
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100 105 110
Gly Asp Met Ile Gly Phe Val Ala Ser Thr Phe Met Arg Gly Val Arg
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Val Glu Gly Tyr Glu Lys Ile Glu Tyr Asp Leu Val Tyr Val Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Glu Ile Gln Asn Ser Ala Leu Ala Asp Val Tyr Gln Gly Phe
35 40 45
Gly Arg Cys Leu Ala Ile Val Asp Ala Asn Val Ser Arg Leu Tyr Gly
50 55 60
Asn Gln Ile Gln Ala Tyr Phe Gln Tyr Tyr Gly Ile Glu Leu Arg Leu
65 70 75 80
Phe Pro Ile Thr Ile Thr Glu Pro Asp Lys Thr Ile Gln Thr Phe Glu
85 90 95
Arg Val Ile Asp Val Phe Ala Asp Phe Lys Leu Val Arg Lys Glu Pro
100 105 110
Val Leu Val Val Gly Gly Gly Leu Ile Thr Asp Val Val Gly Phe Ala
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Cys Ser Thr Tyr Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Ile Arg Ile Pro Thr Thr
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Leu Ile Gly Leu Ile Asp Ala Ser Val Ala Ile Lys Val Ala Val Asn
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His Arg Lys Leu Lys Asn Arg Leu Gly Ala Tyr His Ala Ser Arg Lys
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305 310 315 320
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Arg Ala Ala Met Pro Lys Pro Ile Gly Asp Cys Val Phe Val Asn Asp
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Leu Thr Arg Glu Glu Leu Ala Ala Ala Leu Ala Asp His Lys Glu Leu
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35 40 45
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50 55 60
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115 120 125
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Val Ala Cys Glu Val Asp Pro Tyr Ala Ala Glu Ile Gly Gln Lys Ala
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165 170 175
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180 185 190
Leu Val Phe Ile Asp Ala Asp Lys Lys Glu Tyr Val Ala Tyr Phe His
195 200 205
Lys Leu Leu Gly Ser Ser Leu Leu Ala Pro Asp Gly Phe Ile Cys Val
210 215 220
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275
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<400> 118
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245 250 255
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275 280 285
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Lys Asp Asp Arg Val Leu Val Ile Val Gly Pro Cys Ser Ile His Asp
65 70 75 80
Leu Glu Ala Ala Gln Glu Tyr Ala Leu Arg Leu Lys Lys Leu Ser Asp
85 90 95
Glu Leu Lys Gly Asp Leu Ser Ile Ile Met Arg Ala Tyr Leu Glu Lys
100 105 110
Pro Arg Thr Thr Val Gly Trp Lys Gly Leu Ile Asn Asp Pro Asp Val
115 120 125
Asn Asn Thr Phe Asn Ile Asn Lys Gly Leu Gln Ser Ala Arg Gln Leu
130 135 140
Phe Val Asn Leu Thr Asn Ile Gly Leu Pro Ile Gly Ser Glu Met Leu
145 150 155 160
Asp Thr Ile Ser Pro Gln Tyr Leu Ala Asp Leu Val Ser Phe Gly Ala
165 170 175
Ile Gly Ala Arg Thr Thr Glu Ser Gln Leu His Arg Glu Leu Ala Ser
180 185 190
Gly Leu Ser Phe Pro Val Gly Phe Lys Asn Gly Thr Asp Gly Thr Leu
195 200 205
Asn Val Ala Val Asp Ala Cys Gln Ala Ala Ala His Ser His His Phe
210 215 220
Met Gly Val Thr Lys His Gly Val Ala Ala Ile Thr Thr Thr Lys Gly
225 230 235 240
Asn Glu His Cys Phe Val Ile Leu Arg Gly Gly Lys Lys Gly Thr Asn
245 250 255
Tyr Asp Ala Lys Ser Val Ala Glu Ala Lys Ala Gln Leu Pro Ala Gly
260 265 270
Ser Asn Gly Leu Met Ile Asp Tyr Ser His Gly Asn Ser Asn Lys Asp
275 280 285
Phe Arg Asn Gln Pro Lys Val Asn Asp Val Val Cys Glu Gln Ile Ala
290 295 300
Asn Gly Glu Asn Ala Ile Thr Gly Val Met Ile Glu Ser Asn Ile Asn
305 310 315 320
Glu Gly Asn Gln Gly Ile Pro Ala Glu Gly Lys Ala Gly Leu Lys Tyr
325 330 335
Gly Val Ser Ile Thr Asp Ala Cys Ile Gly Trp Glu Thr Thr Glu Asp
340 345 350
Val Leu Arg Lys Leu Ala Ala Ala Val Arg Gln Arg Arg Glu Val Asn
355 360 365
Lys Lys
370
PCT/RO/134表
Figure 0000011

Claims (7)

1.生产霉孢菌素样氨基酸的微生物，其中选自2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、和转酮醇酶中的至少一种蛋白质的活性被增强。
2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物进一步包含霉孢菌素样氨基酸生物合成基因簇。
3.根据权利要求2所述的微生物，其中所述霉孢菌素样氨基酸生物合成基因簇包含编码选自2-脱甲基4-deoxygadusol合酶、O-甲基转移酶和C-N连接酶中的至少一种蛋白质的基因。
4.根据权利要求2所述的微生物，其中所述霉孢菌素样氨基酸生物合成基因簇包含编码选自非核糖体肽合成酶、非核糖体肽合成酶样酶(NRPS样酶)、和D-丙氨酸D-丙氨酸连接酶(D-Ala D-Ala连接酶)中的至少一种蛋白质的基因。
5.根据权利要求1所述的微生物，其中所述微生物是棒杆菌属(genusCorynebacterium)的微生物或埃希氏菌属(genus Escherichia)的微生物或酵母。
6.根据权利要求1所述的微生物，其中所述霉孢菌素样氨基酸是选自霉孢菌素-2-甘氨酸、palythinol、palythenic acid、deoxygadusol、霉孢菌素-甲胺-苏氨酸、霉孢菌素-甘氨酸-缬氨酸、palythine、asterina-330、shinorine、porphyra-334、euhalothece-362、霉孢菌素-甘氨酸、霉孢菌素-鸟氨酸、霉孢菌素-赖氨酸、霉孢菌素-谷氨酸-甘氨酸、霉孢菌素-甲胺-丝氨酸、霉孢菌素-牛磺酸、palythene、palythine-丝氨酸、palythine-丝氨酸-硫酸盐、palythinol、和usujirene中的至少一种。
7.生产霉孢菌素样氨基酸的方法，其包括：
在培养基中培养权利要求1至6中任一项所述的微生物；以及
从培养的所述微生物或培养基中回收所述霉孢菌素样氨基酸。
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