KR102351059B1 - 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 마이코스포린 유사 아미노산의 생산방법 - Google Patents
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Abstract
마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물 및 상기 미생물을 이용한 마이코스포린 유사 아미노산의 생산 방법이 제공된다. 상기 미생물은 자일로오스로부터 마이코스포린 유사 아미노산을 생산할 수 있다.
Description
마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물 및 상기 미생물을 이용한 마이코스포린 유사 아미노산의 생산 방법에 관한 것이다.
자외선으로부터 피부를 보호하기 위해 다양한 화학, 물리적 자외선 차단 소재들이 사용되고 있다. 특히, 옥시벤존(oxybenzone), 산화아연(ZnO), 및 이산화타이타늄(TiO2)은 화장품 첨가제로 널리 사용되는 자외선 차단 물질이지만, 피부염을 초래하거나 환경오염 문제 등의 부정적인 효과 때문에, 보다 안전한 바이오 기반의 자외선 차단 물질의 개발이 요구된다.
마이코스포린(Mycosporine) 및 마이코스포린 유사 아미노산(mycosporine-like amino acids; MAAs)은 생태계에 존재하는 미세조류, 균계, 조류 등의 원핵 및 진핵 미생물이 생산하는 천연 자외선 차단 소재이다. 특히, 마이코스포린 유사 아미노산은 사이클로헥센이민 코어(cyclohexenimine core) 구조에 질소 화합물이 결합한 형태로서, 결합된 화합물의 종류에 따라 30여개 이상의 다양한 마이코스포린 유사 아미노산이 보고되었다.
마이코스포린 유사 아미노산의 대표적인 예로서, 시노린(shinorine)을 들 수 있는데, 시노린은 글라이신(glycine)과 세린(serine) 치환기를 가지고 있는 화합물로, 효과적인 자외선 차단제로 각광 받고 있다. 시노린은 매우 높은 흡광 계수(ε=28,100-50,000 M-1cm-1)를 갖는데, 이는 효과적인 자외선 차단 소재로 알려진 옥시벤존의 흡광 계수(ε=14,295) 보다 세배 가량 높은 수치이다. 따라서, 시노린은 매우 고효율의 자외선 차단물질이라 할 수 있다. 뿐만 아니라, 시노린은 지구상에 가장 많이 도달하는 자외선인 UV-A에 특이적으로 자외선 차단이 가능한 효과적인 소재이다.
시노린을 포함한 마이코스포린 유사 아미노산은 미세조류 등의 미생물에서 자연적으로 생산되지만, 그 양이 극소량이고, 미세조류를 배양하고 마이코스포린 유사 아미노산을 분리, 추출, 및 정제하는 조건들이 복잡하여 마이코스포린 유사 아미노산을 대량 생산하기 어려운 문제가 있다.
따라서, 마이코스포린 유사 아미노산 생산 효율이 우수한 새로운 균주의 개발이 필요하다.
일 예는,
(a) 자일로오스 동화(xylose assimilation) 효소, 및/또는 이를 암호화하는 유전자; 및 (b) 마이코스포린 유사 아미노산 (mycosporine-like amino acid; MAA) 생합성 효소, 및/또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 미생물을 제공한다.
상기 미생물은 추가로 오탄당인산경로가 강화된 것일 수 있다. 상기 자일로오스 동화 효소는 자일로오스의 자일룰로오스로의 전환 효소, 자일룰로오스 인산화 효소, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 자일로오스 동화 효소, 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 효소, 또는 이들 모두는 상기 미생물 내재 단백질 및/또는 외래 단백질일 수 있다. 상기 오탄당인산경로의 강화는 오탄당인산경로에 관여하는 단백질이 비변이 미생물과 비교하여 활성화된 것을 의미할 수 있다. 상기 미생물은 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 것 및/또는 마이코스포린 유사 아미노산을 생산에 사용하기 위한 것일 수 있다.
다른 예는, (i) 자일로오스 동화 효소, 이를 암호화하는 유전자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터; (ii) 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 효소, 이를 암호화하는 유전자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터; 및/또는 (iii) 상기 (i), (ii), 또는 이들의 조합을 포함하는 미생물을 포함하는 마이코스포린 유사 아미노산 생산용 조성물을 제공한다. 상기 조성물 또는 상기 조성물에 포함된 미생물은 오탄당인산경로 강화를 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는, (1) 자일로오스 동화 효소, 이를 암호화하는 유전자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 미생물에 도입하는 단계; (2) 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 효소, 이를 암호화하는 유전자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 미생물에 도입하는 단계; 또는 상기 단계 (1) 및 (2)의 조합을 포함하는, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 (3) 오탄당인산경로를 강화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 마이코스포린 유사 아미노산의 생산 방법을 제공한다.
본 명세서는 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 효소, 및/또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 미생물이 자일로오스 동화 효소, 및/또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하거나, 및/또는 오탄당인산경로가 강화된 경우, 마이코스포린 유사 아미노산의 생산 효율이 개선됨을 제안한다.
본 명세서에서, '아미노산 서열 또는 핵산 서열을 포함하는 또는 이루어진'이라 함은, 기재된 소정의 서열을 포함하거나, 상기 서열을 필수적으로 포함하여 이루어지는 경우를 의미하기 위하여 사용될 수 있다.
또한, 본 명세서에 기재된 특정 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 포함하는 단백질(예, 효소) 또는 유전자는 (1) 상기 특정 아미노산 서열 또는 핵산 서열과 100% 동일한 서열을 포함하는 단백질 또는 유전자로 해석되거나, (2) 이와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하는 단백질 또는 유전자를 모두 포함하는 의미로 해석될 수 있다. (2)의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하는 단백질 또는 유전자는 원래 (100% 동일한 서열을 포함하는) 단백질의 기능 (예컨대, 본래의 효소 활성)을 유지하는 것 또는 이를 암호화하는 것일 수 있다. 상기 단백질의 기능을 유지한다 함은, 예컨대, 미생물 내 및/또는 시험관내에서 측정된 바로서, 원래 (100% 동일한 서열을 포함하는) 단백질의 효소 활성의 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상을 유지하는 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "변이 미생물", "변이 균주", "재조합 미생물", "재조합 균주", "유전적으로 변형된 미생물" 또는 "유전적으로 변형된 균주"는 내재 유전자 및/또는 발현조절 서열의 변형(핵산 결실, 추가, 치환 등), 외래 유전자의 유전체(genome) 내 삽입, 및/또는 외래 유전자를 포함하는 플라스미드의 도입을 포함하는 미생물을 의미할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 미생물은 통상의 재조합 기술 및/또는 유전체 또는 유전자 교정 기술에 의하여 인위적으로 생산(non-naturally occurring)된 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, "변형전 균주" 또는 "변형전 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 본 출원에 있어서, 상기 형질 변화는 특정 단백질 (또는 유전자)의 도입 및/또는 특정 단백질의 활성 강화일 수 있다. 상기 "변형전 균주" 또는 "변형전 미생물"은 "모균주", "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물", "비변형 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "벡터"는 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드 단편을 숙주 세포에 전달하는데 사용되는 모든 유형의 핵산 서열 운반 구조체를 통칭하기 위한 것으로, 특별한 언급이 없는 한, 담지된 핵산 서열이 숙주 세포 유전체 내 삽입되어 발현되도록 하는 것 및/또는 독자적으로 발현되도록 하는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "단백질을 암호화하는 유전자"는 상기 단백질의 아미노산 서열과 대응되는 (암호화하는) 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 상기 핵산 서열은 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 단백질을 발현시키고자 하는 미생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 암호화 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열 및/또는 기능을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어진 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 일 예는, 다음의 특징을 갖는 변이 미생물을 제공한다:
(a) 자일로오스 동화(xylose assimilation) 효소, 및/또는 이를 암호화하는 유전자; 및 (b) 마이코스포린 유사 아미노산 (mycosporine-like amino acid; MAA) 생합성 효소, 및/또는 이를 암호화하는 유전자를을 포함하는, 변이 미생물을 제공한다.
상기 변이 미생물은 추가로 오탄당인산경로가 강화된 것일 수 있다. 상기 자일로오스 동화 효소는 자일로오스의 자일룰로오스로의 전환 효소, 자일룰로오스 인산화 효소, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 자일로오스 동화 효소, 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 효소, 또는 이들 모두는 상기 변이 미생물 내재 단백질 및/또는 외래 단백질일 수 있다. 상기 오탄당인산경로의 강화는 오탄당인산경로에 관여하는 단백질이 비변이 미생물과 비교하여 활성화된 것을 의미할 수 있다.
상기 오탄당인산경로의 강화는, 비변이 미생물과 비교하여, 오탄당인산경로에서 세도헵툴로스 7-포스페이트를 생성하는 트랜스케톨라아제 활성 증가, NADPH 생성을 조절하는 단백질 활성 증가, 및/또는 세도헵툴로스 7-포스페이트 및 글리세르알데하이드 3-포스페이트 간의 전환 반응에 관여하는 트랜스알돌라아제(transaldolase) 활성 감소로 달성되는 것일 수 있다.
상기 변이 미생물은 마이코스포린 유사 아미노산의 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 변이 미생물은 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 것일 수 있다. 상기 변이 미생물은 탄소원으로 자일로오스를 이용할 수 있는 것일 수 있다. 상기 변이 미생물은 자일로오스로부터 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 것일 수 있다.
다른 예는, (i) 자일로오스 동화 효소, 이를 암호화하는 유전자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터; (ii) 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 효소, 이를 암호화하는 유전자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터; 및/또는 (iii) 상기 (i), (ii), 또는 이들의 조합을 포함하는 변이 미생물을 포함하는 마이코스포린 유사 아미노산 생산용 조성물을 제공한다. 상기 조성물 또는 상기 조성물에 포함된 변이 미생물은 오탄당인산경로 강화를 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다.
상기 자일로오스 동화 효소, 이를 암호화하는 유전자 및/또는 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 효소, 이를 암호화하는 유전자는 상기 변이 미생물 내재 단백질 (유전자) 및/또는 외래 단백질 (유전자)일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 자일로오스 동화 효소를 암호화하는 유전자는, 외래 유전자로서, 자일로오스의 자일룰로오스로의 전환 효소, 및/또는 자일룰로오스 인산화 효소를 암호화하는 유전자 일 수 있다.
다른 예에서, 상기 오탄당인산경로의 강화는, 오탄당인산경로에서 세도헵툴로스 7-포스페이트를 생성하는 트랜스케톨라아제 활성 증가, NADPH 생성을 조절하는 단백질 활성 증가, 및 세도헵툴로스 7-포스페이트 및 글리세르알데하이드 3-포스페이트 간의 전환 반응에 관여하는 트랜스알돌라아제(transaldolase) 활성 감소 중에서 선택된 하나 이상으로 달성되는 것일 수 있다.
상기 트랜스알돌라아제 활성 감소는 트랜스알돌라아제를 암호화하는 유전자의 발현을 억제하는 억제자 (repressor)를 도입하거나, 발현조절 서열의 약화시키거나 (예, 교체 전보다 약한 발현조절 서열로 교체), 또는 상기 유전자의 결실및/또는 치환을 위한 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드를 도입하여 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 트랜스알돌라아제 암호화 유전자의 발현조절 서열 교체, 또는 유전자 전부 또는 일부의 결실 또는 치환을 위한 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드는 RNA-가이드 엔도뉴클레아제 시스템 (RNA-guided endonuclease system; 예컨대, (a) RNA-가이드 엔도뉴클레아제(예, Cas9 단백질 등), 이를 암호화하는 유전자, 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터; 및 (b) 가이드 RNA (예, single guide RNA (sgRNA) 등), 이의 암호화 DNA, 또는 상기 DNA를 포함하는 벡터를 포함하는 혼합물 (예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 단백질과 가이드 RNA의 혼합물 등), 복합체 (예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 단백질과 가이드 RNA가 융합된 리보핵산 단백질 (RNP), 재조합 벡터 (예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 암호화 유전자 및 가이드 RNA 암호화 DNA를 포함하는 벡터 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 조성물은 자일로오스로부터 마이코스포린 유사 아미노산을 생산할 수 있는 것일 수 있다.
다른 예는, (1) 자일로오스 동화 효소, 이를 암호화하는 유전자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 미생물 내 도입하는 단계; (2) 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 효소, 이를 암호화하는 유전자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 미생물 내 도입하는 단계; 또는 상기 단계 (1) 및 (2)의 조합을 포함하는, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 변이 미생물의 제조 방법을 제공한다. 상기 단계 (1) 및 단계 (2)는 동시에 수행하거나 또는 순서에 상관없이 순차적으로 수행(즉, 단계 (1) 수행 후 단계 (2) 수행하거나, 또는 단계 (2) 수행 후 단계 (1) 수행)할 수 있다.
상기 방법은 (3) 오탄당인산경로를 강화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 경우, 단계 (1) 내지 (3)은 동시에 수행하거나 또는 순서에 상관없이 수행할 수 있다.
다른 예는 상기 변이 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 마이코스포린 유사 아미노산의 생산 방법을 제공한다. 상기 생산 방법은, 상기 배양하는 단계 이후에, 상기 배양된 미생물, 배지, 또는 이들의 조합으로부터 마이코스포린 유사 아미노산을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다:
자일로오스 동화(xylose assimilation) 효소 및 이를 암호화 하는 유전자
상기 자일로오스 동화(xylose assimilation) 효소는 자일로오스를 오탄당인산경로에 유입 가능한 형태로 전환시키는 일련의 대사(발효) 경로에 관여하는 효소들 중 하나 이상을 포함할 수 있고, 이를 암호화하는 유전자는 상기 효소를 암호화하는 유전자로서, 형질도입될 세포에 최적화 (optimized)된 코돈을 포함하도록 설계된 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 자일로오스 동화 효소 및/또는 이를 암호화하는 유전자는 상기 변이 미생물에 대하여 이종 유래의 것, 즉, 상기 변이 미생물과 상이한 종의 미생물에서 유래하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 자일로오스 동화 효소는,
자일로오스의 자일룰로오스로의 전환 효소, 예컨대, 자일로오스 이소머라아제(xylose isomerase; XI), 자일로오스 리덕타아제(xylose reductase; XR), 자일리톨 디하이드로게나아제(xylitol dehydrogenase; XDH) 또는 이들의 조합; 자일룰로오스 인산화 효소, 예컨대 자일룰로키나아제(xylulokinase; XK); 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일 예에서, 상기 변이 미생물은 동종 또는 이종 유래의 자일로오스 동화 효소를 암호화하는 유전자가 도입된 것일 수 있다.
상기 자일로오스 이소머라아제(XI)는 D-자일로오스와 D-자일룰로오스 간 상호변환(interconversion)을 촉매하는 효소로서, 미생물(예, 박테리아)에서 대부분의 자일로오스를 소비하는데 관여하는 효소이다. 일 구체예에서, 상기 자일로오스 이소머라아제는 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 파라부르크홀데리아 사카리(Paraburkholderia sacchari), 악티노마이세스 올리보시네레우스(Actinomyces olivocinereus), 악티노플라네스 미소우리엔시스(Actinoplanes missouriensis), 아에로박터 레바니쿰(Aerobacter levanicum), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 속(Bacillus sp.), 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis), 박테로이데스 레타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron), 클로스트리움 셀룰로보란스(Clostridium cellulovorans), 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스(Clostridium phytofermentans), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 오르피노마이세스 속(Orpinomyces sp.), 피로마이세스 속(Piromyces sp.), 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophiles), 비브리오 속(Vibrio sp.) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래하는 것일 수 있다.
상기 자일로오스 리덕타아제(XR) 및 자일리톨 디하이드로게나아제(XDH) 는 자일로오스를 자일리톨로, 자일리톨을 자일룰로오스로 연속적으로 전환시키데 관여하는 효소이다. 일 구체예에서, 상기 자일로오스 리덕타아제(XR) 및 자일리톨 디하이드로게나아제(XDH)는 피키아 속 (예, 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 피키아 세고비엔시스(Pichia segobiensis) 등), 아스페르길루스 카보나리우스(Aspergillus carbonarius), 칸디다 속 (예, 칸디다 보이디니(Candida boidinii), 칸디다 디덴시애(Candida diddensiae), 칸디다 인테르메디아(Candida intermedia), 칸디다 테누이스(Candida tenuis), 칸디다 쉐하태(Candida shehatae) 등), 클루이베르마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 뉴로스포라 클라사(Neurospora crassa), 오가타애 시아멘시스(Ogataea siamensis), 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 파키솔렌 탄노필루스(Pachysolen tannophilus), 오돈토타에니우스 디스준크투스(Odontotaenius disjunctus), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 자일로오스의 자일룰로오스로의 전환을 위하여, 이종 세포내 도입시에 효소 활성이 비교적 잘 유지되는 XR/XDH를 사용할 수 있다.
상기 자일룰로키나아제(XK)는 자일룰로오스를 자일룰로오스-5-포스페이트(xylulose-5-phosphate; X5P)로 전환시키는데 관여하는 효소이다. 일 구체예에서, 상기 자일룰로키나아제(XK)는 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 바실리서 코아굴란스(Bacillus coagulans), 클레브시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumonia), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 테르모토가 마리티마(Thermotoga maritime), 트리콘데르마 레세이(Trichoderma reesei), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 미생물에서 유래하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 자일로오스 동화 효소는 Pichia stipitis 유래의 자일로오스 리덕타아제(XR), 자일리톨 디하이드로게나아제(XDH), 및 자일룰로키나아제(XK)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 자일로오스 동화 효소가 관여하는 대사 경로를 도 1a에 예시적으로 나타내었다.
상기 자일로오스 동화 효소가 관여하는 대사 경로의 산물 (예, X5P)는 오탄당인산경로의 중간산물(예, 세도헵툴로스 7-포스페이트(sedoheptulose 7-phosphate, S7P)의 생산을 증가시킬 수 있다.
상기 자일로오스 동화 효소 및 이를 암호화하는 유전자를 하기의 표 1에 예시하였다:
오탄당인산경로의
강화
상기 오탄당인산경로(pentose phosphate pathway; PP pathway)는 탄소원으로부터 NADPH 및 오탄당(pentose)을 생성시키는 일련의 경로를 의미하는 것으로, 이 경로의 중간산물, 예컨대, 세도헵툴로스 7-포스페이트(sedoheptulose 7-phosphate, S7P)이 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 경로를 통하여 마이코스포린 유사 아미노산으로 전환될 수 있다. 따라서 오탄당인산경로를 강화시켜 세도헵툴로스 7-포스페이트의 생성을 증가시키면, 마이코스포린 유사 아미노산 합성이 증대될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, 오탄당인산경로의 강화는 오탄당인산경로에서 생성되는 세도헵툴로스 7-포스페이트의 양을 증가시키는 모든 작용을 의미하는 것으로, (i) 세도헵툴로스 7-포스페이트의 생산 증가 및/또는 (ii) 세도헵툴로스 7-포스페이트의 다른 물질로의 전환 억제와 관련된 작용일 수 있다 (도 1a 참조).
보다 구체적으로, 오탄당인산경로의 강화는,
오탄당인산경로에서 세도헵툴로스 7-포스페이트를 생성하는 트랜스케톨라아제 활성 증가,NADPH 생성을 조절하는 단백질 활성 증가, 및세도헵툴로스 7-포스페이트 및 글리세르알데하이드 3-포스페이트 간의 전환 반응에 관여하는 트랜스알돌라아제(transaldolase) 활성 감소중에서 선택된 하나 이상으로 달성되는 것일 수 있다.
(i) 세도헵툴로스 7-포스페이트의 생산 증가
일 예에서, 상기 세도헵툴로스 7-포스페이트의 생산 증가는 오탄당인산경로에서 세도헵툴로스 7-포스페이트를 생성하는데 관여하는 효소의 활성 증가에 의한 것일 수 있다. 상기 "활성 증가"는 상기 효소를 암호화하는 유전자의 과발현 및/또는 상기 효소 또는 이를 암호화하는 유전자의 외부(동종 또는 이종 유래)로부터의 도입 등에 의하여, 미생물이 가진 내재적 활성 또는 변형(과발현 또는 도입) 전 (예, 비변이 미생물, 또는 모균주) 활성에 비하여 효소 활성이 향상된 것을 의미할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 세도헵툴로스 7-포스페이트를 생성하는데 관여하는 효소 또는 단백질은, 오탄당인산경로에서, 기질[(리보오스-5-포스페이트(ribose-5-phosphate; R5P) 또는 자일룰로오스-5-포스페이트(xylulose-5-phosphate; X5P)]로부터 세도헵툴로스 7-포스페이트를 생성하는데 관여하는 트랜스케톨라아제(transketolase; 예컨대 TKL1), NADPH 생성을 조절하여 산화스트레스를 조절하는 단백질 (예컨대, Stb5), 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 세도헵툴로스 7-포스페이트의 생산 증가는 상기 트랜스케톨라아제(예컨대, TKL1), Stb5 , 또는 이들 모두의 활성 강화에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 효소 또는 단백질의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하다. 상기 방법은 이로 제한되는 것은 아니나, 유전자 공학 또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있다.
상기 유전자 공학을 이용하여 효소 활성을 강화하는 방법은, 예를 들면,
1) 상기 효소를 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가,
2) 상기 효소를 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열을 변형하는 방법,
3) 상기 효소의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시키는 방법,
4) 상기 효소 활성이 증가되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티스 서열을 변형시키는 방법,
5) 상기 효소의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 도입, 또는
6) 상기 방법들의 조합 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단백질 공학을 이용하여 효소 활성을 강화하는 방법은, 예를 들면, 단백질의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
1) 상기 효소를 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가 는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 외래(미생물(숙주 세포)과 동종 및/또는 이종 유래)의 유전자가, i) 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 숙주 세포에 도입되어 수행되거나, ii) 숙주 세포의 염색체(유전체) 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 상기 ii) 숙주 세포의 염색체(유전체) 내로 삽입되는 경우, 삽입 위치는 숙주 세포의 성장에 영향이 없는 위치 (예컨대, 비전사 영역(non-transcriptional spacer; NTS) 등) 및/또는 삽입 효율을 높일 수 있는 위치 (예컨대, 레트로트랜스포존 등)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 외래 유전자는 숙주 세포 내 효소와 동등한 활성을 나타내는 한 그 유래나 핵산 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 일 예에서, 상기 외래의 유전자는 숙주 세포에 맞게 코돈 최적화된 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 도입되는 유전자는 1카피 이상, 예컨대, 1 내지 20카피, 1 내지 15카피, 1 내지 10카피, 또는 1 내지 5카피(예, 1카피, 2카피, 3카피, 4카피, 5카피, 6카피, 7카피, 8카피, 9카피, 10카피, 11카피, 12카피, 13카피, 14카피, 15카피, 16카피, 17카피, 18카피, 19 카피, 또는 20카피)일 수 있으며, 2 이상의 유전자가 도입되는 경우, 각각의 유전자의 도입되는 카피수는 서로 같거나 다를 수 있다. 숙주 세포 내에서 상기 도입된 외래의 유전자가 발현됨으로써 효소가 생성되어, 숙주 세포 내재적 효소 활성에 더하여, 그 활성이 증가될 수 있다.
상기 2) 상기 효소를 암호화하는 유전자의 발현조절 서열을 변형시키는 것은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 핵산 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 암호화하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 유전자가 숙주 세포에 내재하는 유전자인 경우, 본래의 발현조절 서열(예, 프로모터)을 대체하거나 이에 더하여, 상기 유전자의 발현이 증가하도록 변형된 발현조절 서열을 포함할 수 있다. 상기 유전자가 외래 유전자 (예컨대, 상기 1)의 숙주 세포에 도입되는 외래 유전자)인 경우, 상기 유전자는 상기 전자의 발현이 증가하도록 변형된 발현조절 서열과 작동 가능하게 연결된 형태(벡터 또는 발현 카세트 등)로 도입될 수 있다.
일 구체예에서, 유전자 발현 증가를 위하여, 유전자 발현 단위의 상부에 본래의 프로모터 대신 강력한 동종 또는 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 강력한 프로모터의 예로는 TDH3 프로모터(Saccharomyces cerevisiae), TEF1(translation elongation factor 1, Saccharomyces cerevisiae) ADH1 프로모터(Saccharomyces cerevisiae), CJ7 프로모터, lysCP1 프로모터, EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 또는 aceB 프로모터 등이 있다. 예컨대, 상기 프로모터는 코리네박테리움 속 유래 프로모터인 lysCP1 프로모터(WO2009/096689), CJ7 프로모터(WO2006/065095), SPL프로모터(KR 10-1783170 B), 또는 o2 프로모터(KR 10-1632642 B)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
(ii) 세도헵툴로스 7-포스페이트의 다른 물질로의 전환 억제
다른 예에서, 상기 세도헵툴로스 7-포스페이트의 다른 물질로의 전환 억제는, 오탄당인산경로에서, 세도헵툴로스 7-포스페이트를 다른 산물로 전환(대사 또는 발효)시키는 반응에 관여하는 효소의 활성 억제에 의한 것일 수 있다. 상기 "활성 억제"는 상기 효소를 암호화하는 유전자의 발현 억제 및/또는 상기 효소 활성의 블활성화 등에 의하여, 미생물이 가진 내재적 활성 또는 변형(발현 억제 또는 도입) 전 (예, 비변이 미생물) 활성에 비하여 활성이 감소되거나 효소 활성이 상실된 것을 의미할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 세도헵툴로스 7-포스페이트를 다른 산물로 전환시키는 반응에 관여하는 단백질 또는 효소는, 오탄당인산경로에서, 세도헵툴로스 7-포스페이트 및 글리세르알데하이드 3-포스페이트(glyceraldehyde 3-phosphate; G3P) 간의 전환 반응에 관여하는 트랜스알돌라아제(transaldolase; 예컨대, TAL1)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 세도헵툴로스 7-포스페이트의 다른 물질로의 전환 억제는,
1') 상기 효소를 암호화하는 유전자의 변이 (예컨대, 결실, 하나 이상의 핵산 치환, 및/또는 하나 이상의 핵산 삽입),
2') 상기 효소를 암호화하는 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절 서열의 변형,
3') 상기 효소의 활성이 제거 또는 약화되도록 이를 암호화하는 유전자 서열의 변형,
4') 상기 효소를 암호화하는 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입,
5') 상기 효소를 암호화하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열을 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착 저해 또는 방지,
6') 상기 효소를 암호화하는 유전자의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터 부가(Reverse transcription engineering, RTE)
등으로 이루어진 군에서 선택된 한 가지 이상(예컨대, 한 가지, 2 가지, 3가지, 4가지, 5가지, 또는 6가지)에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 1) 내지 6)의 효소를 암호화하는 유전자는 미생물 유전체(염색체)에 내재하는 유전자일 수 있다.
상기 1') 상기 효소(트랜스알돌라아제; 예컨대, TAL1)를 암호화하는 유전자의 결실은 상기 유전자의 전부 결실 또는 효소(트랜스알돌라아제)를 발현하지 못하거나 발현된 효소가 본래의 온전한 기능을 갖지 못하도록 하는 상기 유전자의 일부 결실을 의미하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 일부 결실은 유전자 내 연속하거나 연속하지 않은 1개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상, 40개 이상, 45개 이상 또는 50개 이상, 예컨대, 1 내지 500개, 5 내지 500개, 10 내지 500개, 15 내지 500개, 20 내지 500개, 25 내지 500개, 30 내지 500개, 35 내지 500개, 40 내지 500개, 45 내지 500개, 50 내지 500개, 1 내지 200개, 5 내지 200개, 10 내지 200개, 15 내지 200개, 20 내지 200개, 25 내지 200개, 30 내지 200개, 35 내지 200개, 40 내지 200개, 45 내지 200개, 50 내지 200개, 1 내지 100개, 5 내지 100개, 10 내지 100개, 15 내지 100개, 20 내지 100개, 25 내지 100개, 30 내지 100개, 35 내지 100개, 40 내지 100개, 45 내지 100개, 50 내지 100개, 1 내지 50개, 5 내지 50개, 10 내지 50개, 15 내지 50개, 20 내지 50개, 25 내지 50개, 30 내지 50개, 35 내지 50개, 40 내지 50개, 또는 45 내지 50개의 핵산(뉴클레오타이드)가 결실된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 2') 상기 효소를 암호화하는 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절 서열을 변형 또는 3') 상기 효소의 활성이 제거 또는 약화되도록 이를 암호화하는 유전자 서열을 변형시키는 것은, 상기 발현 조절 서열의 활성이 약화되거나 상기 암호화 유전자가 활성이 제거 또는 약화된 효소를 암호화하도록 핵산의 전부 또는 일부 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 또는 이들의 조합에 의하여 핵산 서열을 변이시키거나, 더욱 약한 활성을 갖는 발현조절 서열 또는 유전자로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 상기 오탄당인산경로가 강화된 변이 미생물은,
트랜스케톨라아제(예컨대, TKL1)를 암호화하는 유전자, Stb5를 암호화하는 유전자, 또는 이들 모두의 과발현;
트랜스알돌라아제(예컨대, TAL1)를 암호화하는 유전자 전부 또는 일부 결실; 또는
이들의 조합
을 포함하는 미생물일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 트랜스케톨라아제(예컨대, TKL1), Stb5, 및 트랜스알돌라아제(예컨대, TAL1) 는 Saccharomyces cerevisiae 유래의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 오탄당인산경로의 강화에 사용 가능한 효소 또는 단백질, 및 이를 암호화하는 유전자를 하기의 표 2에 예시하였다:
마이코스포린
유사 아미노산
본 명세서에서, "마이코스포린 유사 아미노산(mycosporine-like amino acid; MAA)"은 자외선을 흡수하는 고리형 화합물을 의미한다. 본 명세서에서 마이코스포린 유사 아미노산은 자외선을 흡수할 수 있는 한 제한이 없으나, 구체적으로, 사이클로헥세논(cyclohexanone) 또는 사이클로헥센이민(cyclohexenimine)의 중심 링을 가지는 화합물, 또는 상기 중심 링에 아미노산 등의 다양한 물질이 결합된 화합물일 수 있으며; 예컨대, 마이코스포린-2-글라이신 (Mycosporine-2-glycine), 팰라이티놀 (Palythinol), 팰라이텐산 (Palythenic acid), 데옥시가두솔(deoxygadusol), 마이코스포린-메틸아민-트레오닌 (Mycosporine-methylaminethreonine), 마이코스포린-글라이신-발린 (Mycosporine-glycine-valine), 팰라이틴(Palythine), 아스테리나-330 (Asterina-330), 시노린(Shinorine), 포르피라-334(Porphyra-334), 유하로테스-362(Euhalothece-362), 마이코스포린-글라이신(Mycosporine-glycine), 마이코스포린-오르니틴 (Mycosporine-ornithine), 마이코스포린-라이신 (Mycosporine-lysine), 마이코스포린-글루탐산-글라이신(Mycosporine-glutamic acid-glycine), 마이코스포린-메틸아민-세린(Mycosporine-methylamine-serine), 마이코스포린-타우린(Mycosporine-taurine), 팰라이텐(Palythene), 팰라이텐-세린(Palythine-serine), 팰라이텐-세린-설페이트(Palythine-serine-sulfate), 팰라이티놀(Palythinol), 우수지렌(Usujirene) 또는 이들의 조합일 수 있다.
마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물 및 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자
본 명세서에서, "미생물"은 원핵 생물 또는 진핵 미생물(단세포 생물)을 의미할 수 있고, 구체적으로 상기 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물을 의미할 수 있다.
상기 "마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물"은 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자 또는 상기 유전자들의 클러스터를 포함하는 미생물을 의미할 수 있다. 상기 미생물은 상기 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자 또는 상기 클러스터가 도입 또는 강화된 미생물을 의미할 수 있다.
본 명세서에서, "마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자"는 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 경로에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자들 중에서 선택된 유전자를 의미하는 것일 수 있으며, 상기 마이코스포린 유사 아미노산 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자들 중에서 선택된 어느 하나의 유전자뿐 아니라, 2개 이상, 예컨대, 2개, 3개, 4개, 또는 5개를 포함하는 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자 클러스터도 포괄할 수 있다. 상기 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자는, 이를 포함하는 미생물이 마이코스포린 유사 아미노산을 생산할 수 있는 한, 미생물의 외래 및/또는 내재적인 유전자를 모두 포함한다. 상기 외래 유전자는 동종 및/또는 이종일 수 있다.
상기 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자는, 이를 포함하는 미생물이 마이코스포린 유사 아미노산 생합성에 관여하는 효소를 생산하고 결과적으로 마이코스포린 유사 아미노산을 생산할 수 있는 한, 상기 유전자들의 유래 미생물 종에는 제한이 없으나, 예컨대, 남세균(cyanobacteria)인 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노스톡 펑크티포르메(Nostoc punctiforme), 노두라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 시아노테스 속 PCC 7424(Cyanothece sp. PCC 7424), 라인비아 속 PCC 8106(Lyngbya sp. PCC 8106), 마이크로카이스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 마이크로코레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 시아노테스 속 ATCC 51142(Cyanothece sp. ATCC 51142), 크로코스파에라 와트소니(Crocosphaera watsonii), 시아노테스 속 CCY 0110(Cyanothece sp. CCY 0110), 시린드로스페르멈 스태그날 속 PCC 7417(Cylindrospermum stagnale sp,PCC 7417), 아파노테스 할로피티카(Aphanothece halophytica) 또는 트리코데스미운 에리트라에움(Trichodesmium erythraeum)이거나; 또는 균류(fungi)인 마그나포르테 오르지아에(Magnaporthe orzyae), 피레노포라 트리티씨-레펜티스(Pyrenophora tritici-repentis), 아스퍼질러스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 넥트리아 헤마토코카(Nectria haematococca), 아스퍼질러스 니두란스(Aspergillus nidulans), 지베렐라 제아에(Gibberella zeae), 베르티씰리움 알보-아트룸(Verticillium albo-atrum), 보트리오티니아 푸케리아나(Botryotinia fuckeliana), 파에오스파에리아 노도룸(Phaeosphaeria nodorum)이거나; 또는 네마토르텔라 벡텐시스(Nematostella vectensis), 헤테로카프사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra), 옥시리스 마리나(Oxyrrhis marina), 칼로디니움 미크룸(Karlodinium micrum), 또는 악티노신네마 미룸(Actinosynnema mirum) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에 따르면, 본 명세서에 기재된 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물은, 상기한 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 효소, 또는 이를 암호화하는 유전자 또는 상기 유전자의 클러스터를 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 미생물은 외래(동종 또는 이종 유래) 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자 클러스터가 도입되거나 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성이 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예에서, 상기 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 효소는, 이를 포함하는 미생물이 마이코스포린 유사 아미노산을 생산할 수 있는 한, 효소 명칭이나 유래 미생물에 제한 되지 않으며, 예를 들어,
세도헵툴로스 7-포스페이트(sedoheptulose 7-phosphate, S7P)를 2-디메틸-4-데옥시가두솔(2-demethyl-4-deoxygadusol; DDG)로 변환시키는 효소, 예컨대, 2-디메틸 4-데옥시가두솔 합성 효소(2-demethyl 4-deoxygadusol synthase, DDGS), 2-디메틸-4-데옥시가두솔을 4-데옥시가두솔(4-deoxygadusol, 4-DG)로 변환시키는 효소, 예컨대, O-메틸 전이 효소(O-methyltransferase, O-MT), 및
4-데옥시가두솔의 글라이실레이션(glycylation; 글리신 결합)을 촉매하여 마이코스포린-글리신(mycosporine-glycine; MG)을 형성하는 효소, 예컨대, ATP-grasp 리가아제(ATP-grasp ligase), 보다 구체적으로 C-N 리가아제(C-N ligase)
로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 예컨대, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 또는 이들 모두를 포함할 수 있다.
또한, 상기 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물은, 마이코스포린 유사 아미노산에 추가적인 아미노산 잔기를 부착하는 활성을 가진 효소의 유전자 또는 상기 유전자들의 클러스터를 포함할 수 있다.
상기 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 효소는, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물이 두 개 이상의 아미노산 잔기가 부착된 마이코스포린 유사 아미노산을 생산할 수 있는 한 효소 명칭이나 유래 미생물에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 효소는 비리보좀 펩타이드 합성 효소(nonribosomal peptide synthetase: NRPS), 비리보좀 펩타이드 합성 효소 유사 효소(non-ribosomal peptide synthetase-like enzyme: NRPS-like enzyme), 및 D-알라닌 D-알라닌 리가아제(D-Ala D-Ala ligase: DDL)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상, 구체적으로, 1개, 2개, 또는 3개를 포함하는 것일 수 있다.
일부 마이코스포린 유사 아미노산은, 마이코스포린-글라이신에 두 번째 아미노산 잔기를 포함한다. 상기 논-리보좀 펩티드 신테타제, 논-리보좀 펩티드 신테타제 유사 효소, 및 D-알라닌 D-알라닌 리가아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소는, 마이코스포린-글라이신에 두 번째 아미노산 잔기를 부착시킬 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 마이코스포린 유사 아미노산에 추가적인 아미노산 잔기를 부착하는 활성을 가진 효소는, 비리보좀 펩타이드 합성 효소, 비리보좀 펩타이드 합성 효소 유사 효소, 및 D-알라닌 D-알라닌 리가아제와 같이, 마이코스포린-글라이신에 두 번째 아미노산을 부착시킬 수 있는 활성을 가진 효소라면, 효소 명칭이나 유래 미생물 종에 제한 없이 이들 효소들 중에서 선택된 하나 이상, 예컨대, 1개, 2개, 또는 3개를 포함하는 것일 수 있다.
예를 들면, 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis) 유래 비리보좀 펩타이드 합성 효소 유사 효소(Ava_3855) 또는 노스톡 펑크티포르메(Nostoc punctiforme) 유래 D-알라닌 D-알라닌 리가아제(NpF5597)은 마이코스포린-글라이신에 세린 잔기를 부착시켜 시노린을 형성시킬 수 있다. 또 다른 예시로, 마이코스포린-2-글라이신은, 아파노테스 할로피티카 (Aphanothece halophytica) 유래 D-알라닌 D-알라닌 리가아제 호몰로그 (Ap_3855)에 의한 두 번째 글라이신 잔기의 부착으로 형성될 수 있다. 유사하게, 악티노신네마 미룸(Actinosynnema mirum)에서는, D-알라닌 D-알라닌 리가아제에 의하여 세린 또는 알라닌이 부착되어 시노린 또는 마이코스포린-글라이신-알라닌이 형성될 수 있다.
본 명세서의 일 실시예에 따른 미생물은, 전술된 효소 또는 이와 동일 및/또는 유사한 활성을 가진 효소 및/또는 이를 암화화하는 유전자들 중에서 목적하는 마이코스포린 유사 아미노산 생산에 적합한 것들을 선택하여 포함할 수 있다.
일 예에서, 상기 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 효소는
2-디메틸 4-데옥시가두솔 합성 효소(DDGS),
O-메틸 전이 효소(O-MT),
C-N 리가아제 및/또는 ATP-grasp 리가아제, 및
비리보좀 펩타이드 합성효소, 비리보좀 펩타이드 합성효소 유사 효소, 및/또는 D-알라닌 D-알라닌 리가아제
로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 유전자를 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 유전자는 노스탁 펑크티포르메(Nostoc punctiforme) 또는 아나베나 바리아빌리스(Anabaena variabilis) 유래의 것일 수 있다.
상기 2-디메틸 4-데옥시가두솔 합성 효소, O-메틸 전이 효소, C-N 리가아제, ATP-grasp 리가아제, 비리보좀 펩타이드 합성효소, 비리보좀 펩타이드 합성효소 유사 효소, 및 D-알라닌 D-알라닌 리가아제는 유래되는 미생물 종에 한정되지 않고, 동일 및/또는 유사한 기능과 역할을 수행하는 효소로 알려진 것이면 제한 되지 않으며, 이들 간의 상동성 수치 범위 또한 제한되지 않는다. 예를 들면, 시린드로스페르멈 스태그날 PCC 7417 (C. stagnale PCC 7417)의 MylA, MylB, MylD, MylE 및 MylC는, 아나바에나 바리아빌리스 (Anabaena variabilis) 및 노스톡 펑크티포르메 (Nostoc punctiforme) 유래의 2-디메틸 4-데옥시가두솔 신타제, O-메틸트랜스퍼라제, C-N 리가아제, 및 D-알라닌 D-알라닌 리가아제에 상응하고 (homologous), 이들 사이의 유사도는 약 61 내지 88% 이다(Appl Environ Microbiol, 2016, 82(20), 6167-6173; J Bacteriol, 2011, 193(21), 5923-5928). 즉, 본 명세서에서 사용될 수 있는 효소는, 동일 및/또는 유사한 기능 및 효과를 나타내는 것으로 알려진 것이라면 유래되는 미생물 종이나 서열 상동성에 크게 제한되지 않는다.
예를 들어, 노스탁 펑크티포르메(Nostoc punctiforme) ATCC 29133과 아나베나 바리아빌리스(Anabaena variabilis) ATCC 29413는 세도헵툴로오스 7-포스페이트(S7P)를 중간체로 사용하여 마이코스포린 유사 아미노산 (예; 시노린)을 생산한다(도 1 참조). 오탄당인산경로의 중간체인 S7P는 다음의 4 단계의 효소반응을 통해 마이코스포린 유사 아미노산 (예; 시노린)으로 전환된다: 먼저, 2-디메틸 4-디옥시가두졸 합성 효소(2-demethyl 4-deoxygadusol synthase, DDGS)와 O-메틸 전이 효소(O-methyltransferase, O-MT)에 의하여 S7P이 4-데옥시가두솔(4-deoxygadusol, 4-DG)로 전환된다. 다음으로, ATP-grasp 리가아제(ATP-grasp ligase)에 의해 글리신이 상기 4-DG에 결합되어 마이코스포린-글리신(mycosporine-glycine; MG)이 형성된다. 마지막으로, 노스탁 펑크티포르메의 D-ala-D-ala 리가아제 또는 아나베나 바리아빌리스의 비리보좀 펩티드 합성 효소(nonribosomal peptide synthetase; NRPS)와 같은 효소에 의하여 세린이 상기 형성된 MG에 부착되어 시노린이 생성된다.
상기 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 효소 및 이를 암호화하는 유전자를 표 3에 예시하였다:
본 명세서에 기재된 서열과 상동성을 가지는 서열로서 실질적으로 기재된 서열번호의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 경우도 역시 본원의 범주에 포함됨은 자명하다.
본 명세서에 기재된 핵산 서열은 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 단백질(효소)을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 상기 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자는 마이코스포린 유사 아미노산 생합성에 관여하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이면 제한없이 포함될 수 있다.
또는, 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 핵산 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 마이코스포린 유사 아미노산 생합성에 관여하는 단백질을 암호화하는 서열이라면 본원에 제한 없이 포함될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물은, 서로 유래가 다른 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자들을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 모든 단계, 예컨대 효소의 활성 강화 및/또는 유전자의 도입은 순서에 상관없이 동시, 순차, 역순으로 수행될 수 있다.
상기 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물은 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 효소, 이를 암화화하는 유전자, 또는 상기 유전자의 클러스터를 포함하여 마이코스포린 유사 아미노산을 생산할 수 있고, 추가적으로, 앞서 설명한 자일로오스 동화 효소를 포함하거나, 및/또는 오탄당인산경로가 강화됨으로써, 마이코스포린 유사 아미노산의 생산능을 증가시킨 미생물일 수 있다. 특히, 상기 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물은 탄소원으로 자일로오스를 사용할 수 있으며, 자일로오스로부터 마이코스포린 유사 아미노산을 생산할 수 있다.
상기 미생물은, 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 효소를 포함하고 앞서 설명한 자일로오스 동화 효소를 포함하거나, 및/또는 오탄당인산경로가 강화되도록 변이됨으로써, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산할 수 있는 미생물 중에서 제한 없이 선택될 수 있으며, 예를 들어, 효모, 코리네박테리움 속 미생물, 또는 에스케리키아속 미생물일 수 있다.
상기 효모는 자낭균문(Ascomycota)인 사카로미케스아문(Saccharomycotina), 외자낭균아문(Taphrinomycotina), 또는 담자균문(Basidiomycota)인 담자균아문(Agaricomycotina), 녹균아문(Pucciniomycotina)등에 속하는 미생물들 중에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 구체적으로 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 미생물, 쉬조사카로미세스(Schizosaccharomyces) 속 미생물, 파피아(Phaffia) 속 미생물, 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 속 미생물, 피키아(Pichia) 속 미생물, 칸디다(Candida) 속 미생물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범(Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스(Corynebacterium efficiens) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 에스케리키아 속 미생물은 에스케리키아 알베르티(Escherichia albertii), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 에스케리키아 페르구소니(Escherichia fergusonii), 에스케리키아 헤르마니(Escherichia hermannii), 에스케리키아 불네리스(Escherichia vulneris)등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 에스케리키아 콜라이일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구체예에서, 상기 미생물은 효모일 수 있다. 효모(Saccharomyces cerevisiae)는 안전하고 다양한 유전자 조작 기술이 보고되어 있는 천연물 생산에 유망한 균주이다. 예를 들어, 효모 내에서 노스탁 펑크티포르메 또는 아나베나 바리아빌리스 유래의 시노린 생산 유전자를 도입하여 시노린 생산을 증가시키기 위해서는 S7P의 유입이 원활해야 한다. 효모를 포도당을 탄소원으로 배양하면 대부분의 탄소원은 해당과정을 통해 피루브산(pyruvate)으로 전환된다. 따라서 포도당을 단일 탄소원으로 사용하는 경우에는 오탄당인상경로를 강화하기 힘들고 따라서 S7P의 유입량을 증가시킬 수 없다. 자일로오스를 탄소원으로 사용하는 경우, 동화작용을 통해 오탄당인상경로로 유입되기 때문에 S7P의 생산량이 증가한다. 효모는 자연적으로 자일로오스를 이용할 수 없지만, 자일로오스 이성화 효소(xylose isomerase, XI) 또는 자일로오스 환원 효소(xylose reductase, XR) 및/또는 자일리톨 디하이드로게나아제(xylitol dehydrogenase, XDH)로 이루어진 이종 경로를 도입하여 자일로오스를 이용할 수 있다. XI는 대부분의 박테리아에서 자일로오스를 분해하는 효소이며 자일로오스 발효 중 보조 인자 불균형을 제거 할 수 있는 이점이 있다. 그러나, 효모에서 발현될 때의 효소 활성을 고려하여, 효모에서 자일로오스 발효에 XR/XDH 경로를 이용할 수 있다. 자일로오스 환원 효소(XR)와 자일리톨 디하이드로게나아제(XDH)는 자일로오스를 자일리톨로, 자일리톨을 자일룰로스(xylulose) 연속적으로 전환시킨다. 자일룰로스는 자일룰로키나아제(xylulokinase, XK)에 의해 자일루로스-5-인산(xylulose-5-phosphate)로 전환되고, 이어서 자일루로스-5-인산가 오탄당인산경로로 유입된다(도면 1). 따라서 탄소원으로 자일로오스를 사용하면 오탄당인산경로를 통해 S7P 유입을 증가시킬 수 있다. 또한, 자일로오스 발효 효모인 피키아 스티피티스(Pichia stipitis)의 XR(Xyl1), XDH(Xyl2) 및 XK(Xyl3)를 암호화하는 자일로오스 동화 유전자를 S. cerevisiae 발현함으로써 자일로오스 발효능을 가지는 S. cerevisiae 균주를 구축할 수 있음이 제안된다.
유전자 도입, 삽입, 또는 변이
본 명세서에 기재된 유전자 도입은, 외래(미생물(숙주 세포)과 동종 및/또는 이종 유래)의 유전자가, i) 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 숙주 세포에 도입되어 수행되거나, ii) 숙주 세포의 염색체(유전체) 내로 삽입(예컨대, 무작위 삽입)됨으로써 수행될 수 있다. 상기 ii) 숙주 세포의 염색체(유전체) 내로 삽입되는 경우, 삽입 위치는 숙주 세포의 성장에 영향이 없는 위치 (예컨대, 비전사 영역(non-transcriptional spacer; NTS) 등) 및/또는 무작위 삽입 효율을 높일 수 있는 위치 (예컨대, 레트로트랜스포존 등)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유전자 또는 벡터 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 예컨대, 전기천공법(electroporation), 리포펙션(lipofection), 미세주입법(microinjection), 입자 총법(particle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake) 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유전자의 숙주 세포 유전체 (염색체) 내 삽입은 공지된 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 시스템 (RNA-guided endonuclease system; 예컨대, (a) RNA-가이드 엔도뉴클레아제(예, Cas9 단백질 등), 이를 암호화하는 유전자, 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터; 및 (b) 가이드 RNA (예, single guide RNA (sgRNA) 등), 이의 암호화 DNA, 또는 상기 DNA를 포함하는 벡터를 포함하는 혼합물(예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 단백질과 가이드 RNA의 혼합물 등), 복합체 (예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 단백질과 가이드 RNA가 융합된 리보핵산 단백질 (RNP), 재조합 벡터 (예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 암호화 유전자 및 가이드 RNA 암호화 DNA를 포함하는 벡터 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상)을 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
마이코스포린
유사 아미노산의 생산
일 예는 상기 변이 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 마이코스포린 유사 아미노산의 생산 방법을 제공한다. 상기 생산 방법은, 상기 배양하는 단계 이후에, 상기 배양된 미생물, 배지, 또는 이들의 조합으로부터 마이코스포린 유사 아미노산을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 "미생물" 및 "마이코스포린 유사 아미노산"은 전술한 바와 같다.
상기 "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 상기 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미생물에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 상기 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으며, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다. 구체적으로, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나, 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 또한, 배양온도는 20 내지 45℃, 구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 1 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.
사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 자일로오스, 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분, 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 배지는 탄소 공급원으로 자일로오스를 필수적으로 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 배지는 탄소 공급원으로 자일로오스 및 그 외의 당, 예컨대 글루코오스를 포함하는 것일 수 있다. 상기 배지가 탄소 공급원으로 자일로오스와 글루코오스를 포함하는 경우, 마이코스포린 유사 아미노산 생산 정도, 미생물 생장 정도, 및/또는 부산물 생성 정도를 고려하여, 배지 내 탄소 공급원으로서의 자일로오스와 글루코오스 간 함량비는, 중량 기준으로, 1:9 내지 9:1 (자일로오스 함량:글루코오스 함량), 2:8 내지 5:5, 3:7 내지 5:5, 또는 4:6 내지 5:5 범위일 수 있다.
상기 배양에 의하여 생산된 마이코스포린 유사 아미노산은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바로서, 용어 "배지"는 미생물을 배양할 배양 배지 및/또는 배양한 다음 수득한 산물을 의미할 수 있다. 상기 배지는 미생물을 포함하는 형태 및 상기 미생물을 포함하는 배양액에서 원심분리, 여과 등으로 미생물을 제거한 형태도 모두 포함하는 개념이다.
상기 배양 단계에서 생산된 마이코스포린 유사 아미노산을 회수하는 단계는 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 마이코스포린 유사 아미노산을 수집하는 단계일 수 있다. 예를 들어, 상기 단계는, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등을 사용하여 수행될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양된 미생물 또는 배지로부터 목적하는 마이코스포린 유사 아미노산을 회수할 수 있다. 상기 마이코스포린 유사 아미노산을 회수하는 단계는 통상의 분리 공정 및/또는 정제 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 미생물은 자일로오스를 탄소원으로 소비하여 마이코스포린 유사 아미노산을 생산할 수 있는 균주로서, 마이코스포린 유사 아미노산 생산능이 향상되어, 리그노 셀룰로오스계 바이오 매스를 활용한 발효를 통해 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는데 효율적으로 사용될 수 있다.
도 1a는 마이코스포린 유사 아미노산 중 시노린 생합성 경로를 예시적으로 보여주는 모식도이다.
도 1b는 노스탁 펑크티포르메(Nostoc punctiforme) 및 아나베나 바리아빌리스(Anabaena variabilis)의 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자 클러스터를 보여준다.
도 2a는 DDGS(NpR5600), O-MT(NpR5599), ATP-grasp ligas(NpR5598), 및 D-ala-D-ala ligase(NpR5597) 유전자를 포함하는 플라스미드가 도입된 효모 균주 JHYS10의 48시간 배양 후의 세포 추출물의 HPLC 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2b는 효모 균주 JHYS10의 48시간 배양 후의 시노린 생산 결과를 야생형 균주(WT-1)와 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 2c는 효모 균주 JHYS10의 48시간 배양 동안의 세포 생장을 야생형 균주(WT-1)와 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 3은 효모 균주 JHYS10의 48시간 배양 후의 세포 추출물의 tandem mass spectrometry 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4a는 D-ala-D-ala ligase(NpR5597) 및 DDGS(NpR5600) 유전자를 포함하는 발현 카세트, 및 ATP-grasp ligase(NpR5598) 및 O-MT(NpR5599) 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 벡터의 개열지도이다.
도 4b는 상기 도 4a의 두 개의 발현 카세트로 형질전환시켜 상기 유전자를 무작위 삽입시킨 효모 균주 JHYS12 및 JHYS13의 시노린 생산 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4c는 상기 도 4a의 두 개의 발현 카세트로 형질전환시켜 상기 유전자를 무작위 삽입시킨 효모 균주 JHYS11, JHYS12, 및 JHYS13의 각 유전자 카피수를 보여주는 그래프이다.
도 5는 효모 균주 JHYS13에 자일로오스 동화 유전자인 XYL1 , XYL2 , 및 XYL3 유전자를 포함하는 플라스미드를 도입시킨 JHYS13-2 균주를 자일로오스와 글루코오스를 포함하는 배지에서 배양하여 얻어진 글루코오스 및/또는 자일로오스의 소비량, 이에 따른 세포 성장 정도, 및 시노린 생산 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6a는 자일로오스 동화 효소를 암호화하는 유전자가 염색체 내 NTS-삽입된 효모 균주 제작을 위한 벡터의 개열 지도이다.
도 6b는 효모 균주 JHYS13의 염색체 내에 자일로오스 동화 유전자인 XYL1 , XYL2, 및 XYL3 유전자가 무작위 삽입된 효모 균주 JHYS14, JHYS15, 및 JHYS16을 자일로오스와 글루코오스를 포함하는 배지에서 배양하여 얻어진 글루코오스 및/또는 자일로오스의 소비량, 및 이에 따른 세포 성장 정도를 보여주는 그래프이다.
도 6c는 효모 균주 JHYS14, JHYS15, 및 JHYS16의 시노린 생산 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 JHYS16 균주에서 TAL1 유전자를 결손시킨 JHYS17 균주를 자일로오스와 글루코오스를 포함하는 배지에서 배양하여 얻어진 글루코오스 및/또는 자일로오스의 소비량, 이에 따른 세포 성장 정도, 및 시노린 생산 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8a는 JHYS17 균주에 STB5 유전자를 도입시킨 JHYS17-2 균주, TKL1 유전자를 도입시시킨 JHYS17-3 균주, 및 STB5 유전자와 TKL1 유전자를 모두 도입시킨 JHYS17-4 균주를 자일로오스와 글루코오스를 포함하는 배지에서 배양하여 얻어진 글루코오스 및/또는 자일로오스의 소비량 및 이에 따른 세포 성장 정도를 보여주는 그래프이다.
도 8b는 JHYS17-2 균주, JHYS17-3 균주, 및 JHYS17-4 균주를 자일로오스와 글루코오스를 포함하는 배지에서 배양하여 얻어진 시노린 생산 결과를 보여주는 그래프이다.
도 9a는 JHYS17-4 균주를 자일로오스와 글루코오스를 다양한 비율로 포함하는 배지에서 배양하여 얻어진 글루코오스 및/또는 자일로오스의 소비량 및 이에 따른 세포 성장 정도를 보여주는 그래프이다.
도 9b 및 9c는 JHYS17-4 균주를 자일로오스와 글루코오스를 다양한 비율로 포함하는 배지에서 배양하여 얻어진 시노린 생산 결과를 보여주는 그래프이다.
도 10은 JHYS17-4 균주를 자일로오스와 글루코오스를 다양한 비율로 포함하는 배지에서 배양하여 얻어진 부산물 (자일리톨, 에탄올, 글리세롤, 및 아세테이트) 생산량을 보여주는 그래프이다.
도 1b는 노스탁 펑크티포르메(Nostoc punctiforme) 및 아나베나 바리아빌리스(Anabaena variabilis)의 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자 클러스터를 보여준다.
도 2a는 DDGS(NpR5600), O-MT(NpR5599), ATP-grasp ligas(NpR5598), 및 D-ala-D-ala ligase(NpR5597) 유전자를 포함하는 플라스미드가 도입된 효모 균주 JHYS10의 48시간 배양 후의 세포 추출물의 HPLC 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2b는 효모 균주 JHYS10의 48시간 배양 후의 시노린 생산 결과를 야생형 균주(WT-1)와 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 2c는 효모 균주 JHYS10의 48시간 배양 동안의 세포 생장을 야생형 균주(WT-1)와 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 3은 효모 균주 JHYS10의 48시간 배양 후의 세포 추출물의 tandem mass spectrometry 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4a는 D-ala-D-ala ligase(NpR5597) 및 DDGS(NpR5600) 유전자를 포함하는 발현 카세트, 및 ATP-grasp ligase(NpR5598) 및 O-MT(NpR5599) 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 벡터의 개열지도이다.
도 4b는 상기 도 4a의 두 개의 발현 카세트로 형질전환시켜 상기 유전자를 무작위 삽입시킨 효모 균주 JHYS12 및 JHYS13의 시노린 생산 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4c는 상기 도 4a의 두 개의 발현 카세트로 형질전환시켜 상기 유전자를 무작위 삽입시킨 효모 균주 JHYS11, JHYS12, 및 JHYS13의 각 유전자 카피수를 보여주는 그래프이다.
도 5는 효모 균주 JHYS13에 자일로오스 동화 유전자인 XYL1 , XYL2 , 및 XYL3 유전자를 포함하는 플라스미드를 도입시킨 JHYS13-2 균주를 자일로오스와 글루코오스를 포함하는 배지에서 배양하여 얻어진 글루코오스 및/또는 자일로오스의 소비량, 이에 따른 세포 성장 정도, 및 시노린 생산 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6a는 자일로오스 동화 효소를 암호화하는 유전자가 염색체 내 NTS-삽입된 효모 균주 제작을 위한 벡터의 개열 지도이다.
도 6b는 효모 균주 JHYS13의 염색체 내에 자일로오스 동화 유전자인 XYL1 , XYL2, 및 XYL3 유전자가 무작위 삽입된 효모 균주 JHYS14, JHYS15, 및 JHYS16을 자일로오스와 글루코오스를 포함하는 배지에서 배양하여 얻어진 글루코오스 및/또는 자일로오스의 소비량, 및 이에 따른 세포 성장 정도를 보여주는 그래프이다.
도 6c는 효모 균주 JHYS14, JHYS15, 및 JHYS16의 시노린 생산 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 JHYS16 균주에서 TAL1 유전자를 결손시킨 JHYS17 균주를 자일로오스와 글루코오스를 포함하는 배지에서 배양하여 얻어진 글루코오스 및/또는 자일로오스의 소비량, 이에 따른 세포 성장 정도, 및 시노린 생산 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8a는 JHYS17 균주에 STB5 유전자를 도입시킨 JHYS17-2 균주, TKL1 유전자를 도입시시킨 JHYS17-3 균주, 및 STB5 유전자와 TKL1 유전자를 모두 도입시킨 JHYS17-4 균주를 자일로오스와 글루코오스를 포함하는 배지에서 배양하여 얻어진 글루코오스 및/또는 자일로오스의 소비량 및 이에 따른 세포 성장 정도를 보여주는 그래프이다.
도 8b는 JHYS17-2 균주, JHYS17-3 균주, 및 JHYS17-4 균주를 자일로오스와 글루코오스를 포함하는 배지에서 배양하여 얻어진 시노린 생산 결과를 보여주는 그래프이다.
도 9a는 JHYS17-4 균주를 자일로오스와 글루코오스를 다양한 비율로 포함하는 배지에서 배양하여 얻어진 글루코오스 및/또는 자일로오스의 소비량 및 이에 따른 세포 성장 정도를 보여주는 그래프이다.
도 9b 및 9c는 JHYS17-4 균주를 자일로오스와 글루코오스를 다양한 비율로 포함하는 배지에서 배양하여 얻어진 시노린 생산 결과를 보여주는 그래프이다.
도 10은 JHYS17-4 균주를 자일로오스와 글루코오스를 다양한 비율로 포함하는 배지에서 배양하여 얻어진 부산물 (자일리톨, 에탄올, 글리세롤, 및 아세테이트) 생산량을 보여주는 그래프이다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.
<효모 균주 기반 외래의
마이코스포린
유사 아미노산 생합성 경로 도입>
실시예
1: 미세조류 유래
마이코스포린
유사 아미노산 생합성 유전자의 효모 내 발현용 벡터 제작
효모(Saccharomyces cerevisiae)를 마이코스포린 유사 아미노산 생산 균주로 사용하기 위해서, 시아노박테리아의 하나인 노스탁 펑크티포르메(Nostoc punctiforme; ATCC 29133) 유래의 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자를 효모 발현용 벡터에 도입하였다. N. punctiforme 시노린 생합성은 세도헵툴로스 7-포스페이트(sedoheptulose 7-phosphate, S7P)를 기질로 하는 2-디메틸 4-디옥시가두졸 합성 효소(2-demethyl 4-deoxygadusol synthase, DDGS), O-메틸 전이 효소(O-methyltransferase, O-MT), ATP-grasp ligase, 및 D-ala-D-ala ligase의 4종의 효소 반응을 수반한다(도 1a 참조). N. punctiforme 유전체에서 상기 4종의 효소를 암호화하는 유전자는 각각 다음과 같다(도 1b 왼쪽 참조): DDGS: NpR5600(GenBanK Accession No. ACC83905.1; REGION: 6913123..6914355), O-MT: NpR5599(GenBanK Accession No. ACC83904.1; REGION: 6912285..6913118), ATP-grasp ligase: NpR5598(GenBanK Accession No. ACC83903.1; REGION:6910776..6912161) , 및 D-ala-D-ala ligase: NpR5597(GenBanK Accession No. ACC83902.1; REGION: 6909563..6910609).
상기 4종의 유전자를 포함하는 플라스미드의 제작에 사용된 프라이머를 하기 표 4에 정리하였다:
| PCR 산물 | 사용한 주형 | 프라이머명(F: 정방향; R: 역방향) | 서열(5'→3') | 서열번호 |
| NpR5600 | Nostoc punctiforme genomic DNA (GenBank Accession No. CP001037.1) |
NpR5600 F | GCGGGATCCATGAGTAATGTTCAAGCATCG | 1 |
| NpR5600 R | GCGCTCGAGTCACACTCCCAATAGTTTGG | 2 | ||
| NpR5599 | NpR5599 F | GCGGGATCCATGACCAGTATTTTAGGACG | 3 | |
| NpR5599 R | GCGCTCGAGTTATACCAAGCGTCTAATCAG | 4 | ||
| NpR5598 | NpR5598 F | GCGGGATCCATGGCACAATCAATCTCTTTA | 5 | |
| NpR5598 R | GCGCTCGAGTAGTCGCCCCCTAATTCC | 6 | ||
| NpR5597 | NpR5597 F | GCGGGATCCATGCCAGTACTTAATATCCTT | 7 | |
| NpR5597 R | GCGCTCGAGTCAATTTTGTAACACCTTTTTATTA | 8 | ||
| P TDH3 -NpR5600-T CYC1 | p413GPD-NpR5600 | Univ F2 | GACTCGCGCGCGGGAACAAAAGCTGGAGCTC | 32 |
| Univ R | GACTACGCGTGCGGCCGCTAATGGCGCGCCATAGGGCGAATTGGGTACC | 33 | ||
| P TDH3 -NpR5599-T CYC1 | p414GPD-NpR5599 | Univ F2 | GACTCGCGCGCGGGAACAAAAGCTGGAGCTC | 32 |
| Univ R | GACTACGCGTGCGGCCGCTAATGGCGCGCCATAGGGCGAATTGGGTACC | 33 | ||
| P TEF1 -NpR5598-T GPM1 | coex414TEF-NpR5598 | Univ F2 | GACTCGCGCGCGGGAACAAAAGCTGGAGCTC | 32 |
| Univ R | GACTACGCGTGCGGCCGCTAATGGCGCGCCATAGGGCGAATTGGGTACC | 33 |
N. punctiforme 의 유전체(GenBank Accession No. CP001037.1) 를 주형으로 하고 상기 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 상기 4개의 시노린 생합성 관여 유전자 단편을 증폭한 후, 이들을 BamHI-XhoI 제한효소로 절단하고, 같은 제한효소를 처리한 p413GPD, coex413TEF, p414GPD, 및 coex414TEF에 각각 클로닝하였다. 이와 같이 제작된 벡터는 각각 p413GPD-NpR5600, p414GPD-NpR5599, coex414TEF-NpR5598, 및 coex413TEF-NpR5597 로 명명하였다. 제작된 벡터를 주형으로 Univ F2(서열번호 32) - Univ R 프라이머(서열번호 33)로 PCR을 통해 증폭하여, [Promoter-ORF-Terminator] 유전자 단편을 확보한 후, MauBI-NotI 제한효소로 절단하고, AscI-NotI으로 절단한 coex413TEF-NpR5597 벡터에 연속적으로 클로닝함으로써, 4개의 유전자를 하나의 벡터에 도입하여, 이를 coex413-NpR4로 명명하였다. 상기 사용된 벡터 및 제작된 벡터를 하기 표 5에 정리하였다:
| Plasmid | Description |
| coex413TEF | CEN/ARS plasmid, HIS3, P TEF1, T GPM1 |
| coex414TEF | CEN/ARS plasmid, TRP1, P TEF1, T GPM1 |
| p413GPD(ATCC® 87354TM) | CEN/ARS plasmid, HIS3, P TDH3, T CYC1 |
| p414GPD(ATCC® 87356TM) | CEN/ARS plasmid, TRP1, P TDH3, T CYC1 |
| p414ADH(ATCC® 87372TM) | CEN/ARS plasmid, TRP1, P ADH1, T CYC1 |
| p416GPD(ATCC® 87360TM) | CEN/ARS plasmid, URA3, P TDH3, T CYC1 |
| p413GPD-NpR5600 | CEN/ARS plasmid, HIS3, P TDH3 -NpR5600-T CYC1 |
| p414GPD-NpR5599 | CEN/ARS plasmid, TRP1, P TDH3 -NpR5599-T CYC1 |
| coex414TEF-NpR5598 | CEN/ARS plasmid, TRP1, P TEF1 -NpR5598-T GPM1 |
| coex413TEF-NpR5597 | CEN/ARS plasmid, HIS3, P TEF1 -NpR5597-T GPM1 |
| coex413-NpR4 | CEN/ARS plasmid, HIS3, P TEF1 -NpR5597-T GPM1 , P TDH3 -NpR5600-T CYC1 , P TEF1 -NpR5598-T GPM1 , P TDH3 -NpR5599-T CYC1 |
(상기 표 5에서, coex413TEF 및 coex414TEF는 대한민국 특허공개 제10-2016-0093492호에 기재된 방법을 참조하여, 각각 p413TEF (ATCC® 87362) 및 p414TEF (ATCC® 87364)로부터 제작됨)
실시예
2:
마이코스포린
유사 아미노산 생합성 유전자의 벡터 기반
효모내의
발현을 통한 균주의
시노린
생산능
평가
N. punctiforme 유래의 이종 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 경로 유전자를 야생형 S. cerevisiae 균주인 CEN.PK2-1C 균주에 LiAc/SS carrier DNA/PEG 방법으로 형질전환시켰다. 본 실시예에 사용된 야생형 균주 및 4종 유전자(coex413-NpR4)가 도입된 재조합 효모 균주(JHYS10)를 표 6에 정리하였다:
| 균주명 | 유전자 타입 |
| CEN. PK2-1C | MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3 Δ1 MAL2-8 C SUC2 |
| WT-1 | CEN. PK2-1C harboring p413TEF |
| JHYS10 | CEN. PK2-1C harboring coex413-NpR4 |
WT-1과 coex413-NpR4를 발현하는 효모 균주(JHYS10)를 synthetic complex(SC)-His(20 g/L glucose 포함) 배지에서 전 배양 후, OD600=0.2 로 10 mL의 같은 배지에 접종하여, 100 mL 플라스크에서 30℃ 및 170 rpm의 조건으로 48시간 동안 배양하였다. 마이코스포린 유사 아미노산, 구체적으로는. 시노린의 농도를 정량하기 위해, 2 mL 씩 2개의 배양 배지를 샘플링하였다. 하나는 오븐에서 건조후, 건조 셀 중량 (DCW)을 측정하고 다른 하나는 원심 분리 후, 상층액 제거 후 얻은 효모 세포를 1mL의 증류수, 1.5mL의 클로로포름을 첨가한 후 3분 동안 볼텍싱하여 세포 내 시노린을 추출하였다. 원심 분리 후, 수층을 분리 및 여과하여 세포 내 시노린 농도 측정에 이용하였다. Agilent Eclipse XDB-C18 컬럼 (5 μm, 4.6 × 250 mm)을 갖춘 Ultimate3000 HPLC 시스템 (Thermo Fisher Scientific)를 이용하였고, 컬럼 온도는 40 ℃로 유지하며 0.5 mL / 분의 유속으로 용매 (물 : 아세토 니트릴 = 95 : 5)를 흘려주었다. 334 nm에서 UV-vis 검출기로 시노린을 검출하였다.
상기와 같이 HPLC로 분석한 결과를 도 2a 및 2b에 나타내었다. 도 2a 및 2b에 나타난 바와 같이, 시노린 생합성 유전자를 도입하지 않은 WT-1에서는 시노린이 생산되지 않은 반면, JHYS10에서는 미량의 시노린이 생산되었다(도 2b: 0.46 mg/L 및 0.085 mg/gDCW). 또한, 상기 48시간 배양 기간 동안의 배양물의 OD600값을 측정하여 도 2c에 나내었다. 도 2c에 나타난 바와 같이, 두 균주(WT-1 및 JHYS10)는 세포 생장 속도에 있어서 차이를 보이지 않았다.
상기 시험된 세포 추출물에서 생산된 물질이 시노린인지 확인하기 위하여, tandem mass spectrometry 분석 (Thermofisher TSQ quantum access max) 수행하였다. 상기 얻어진 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 보여지는 바와 같이, p413GPD 플라스미드를 보유하는 야생형 균주(WT-1)는 시노린을 생산하지 않는 반면, N. punctiforme의 생합성 유전자가 도입된 효모 균주(JHYS10)는 시노린을 생산하는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 이종 숙주에서 N. punctiforme의 시노린 생합성 유전자의 기능적 발현이 가능함을 보여준다.
실시예 3: 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자의 효모 내 염색체 내 도입을 위한 delta-integration용 벡터 제작
S. cerevisiae 의 genome 에는 delta 서열로 알려진 수백 개의 레트로 트랜스포존 서열이 산재되어 있다. 이러한 delta 서열을 genome 내 유전자 도입 위치로 타겟팅하면 다량의 유전자를 무작위적으로 동시에 염색체 내에 도입할 수 있다. S. cerevisiae 염색체의 delta site에 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자를 도입하기 위하여 delta 서열을 양 말단에 가지는 integration 벡터를 제작하였으며, 여기에 사용된 프라이머를 하기 표 7에 정리하였다:
| PCR 산물 | 사용한 주형 | 프라이머명(F: 정방향; R: 역방향) | 서열(5'→3') | 서열번호 |
| Delta1 | Saccharomyces cerevisiae genomic DNA(GenBank Accession No. JRIV01000000) | Delta1 R | ATAGCGGCCGCATGTTTATATTCATTGATCCTATTACA | 19 |
| Delta1 F | CACATTTCCCCGAAAAGTGCATTTAAATTGTTGGAATAGAAATCAACTATC | 20 | ||
| Amp-Ori | p413GPD vector | Amp-Ori F | GCACTTTTCGGGGAAATGTG | 21 |
| Amp-Ori R | CTCAACATTCACCCATTTCTCAATTTAAATCGCAGGAAAGAACATGTGAG | 22 | ||
| Delta2 | Saccharomyces cerevisiae genomic DNA(GenBank Accession No. JRIV01000000) | Delta2 R | TGAGAAATGGGTGAATGTTGAG | 23 |
| Delta2 F | GCGGCTAGCATAAAACGGAATGAGGAATAATC | 24 | ||
| P TEF1 -NpR5597-T GPM1 -P TDH3 -NpR5600-T CYC1 | coex413-NpR4 vector | Promoter up F | GCGGCTAGCGAGCTCGGAAACAGCTATGACCATGA | 25 |
| Univ R | GACTACGCGTGCGGCCGCTAATGGCGCGCCATAGGGCGAATTGGGTACC | 33 | ||
| P TEF1 -NpR5598-T GPM1 -P TDH3 -NpR5599-T CYC1 | coex413-NpR4 vector | Promoter up F | GCGGCTAGCGAGCTCGGAAACAGCTATGACCATGA | 25 |
| Univ R | GACTACGCGTGCGGCCGCTAATGGCGCGCCATAGGGCGAATTGGGTACC | 33 |
상기 얻어진 PCR 산물을 주형으로 하여, overlapping PCR 방법으로 [Amp-Ori-delta1-P TEF1 -NpR5597-T GPM1 -P TDH3 -NpR5600-T CYC1 -delta2]와 [Amp-Ori-delta1-P TEF1 -NpR5598-T GPM1 -P TDH3 -NpR5599-T CYC1 -delta2]를 제작하여 pUG6MCS 벡터 (pUG6(P30114)에 클로닝 사이트 PacI, NheI, BamHI, SmaI, EcoRI, ApaI, KpnI, 및 AscI를 도입하여 얻어진 벡터)의 NheI/NotI 제한효소 자리를 이용하여 클로닝하였다. 이를 각각 Delta6M-NPR1, 및 Delta6M-NPR2로 명명하였다. 제작에 사용한 벡터 및 제작된 벡터를 하기 표 8에 정리하였다:
| Plasmid | Description |
| pUG6MCS | pUG6 plasmid containing additional restriction enzyme sites |
| Delta6M-NPR1 | Delta6M plasmid, P TEF1 -NpR5597-T GPM1 , P TDH3 -NpR5600-T CYC1 |
| Delta6M-NPR2 | Delta6M plasmid, P TEF1 -NpR5598-T GPM1 , P TDH3 -NpR5599-T CYC1 |
실시예
4:
마이코스포린
유사 아미노산 생합성 유전자의 delta-integration
실시예 1.3에서 얻어진 Delta6M-NPR1 및 Delta6M-NPR2 벡터는 SwaI 제한효소를 처리하면 양 말단에 delta1, delta2 서열이 노출되도록 제작되었다. 따라서, 상기 Delta6M-NPR1 및 Delta6M-NPR2 벡터를 SwaI으로 처리하고, NpR5597 및 NpR5600 유전자 또는 NpR5598 및 NpR5599 유전자를 함유하는 2 개의 카세트를 섞어, S.cerevisiae CEN.PK2-1C로 함께 형질 전환시키고(도 4a 참조), 얻어진 형질전환체를 2mg/L의 G418(Geneticin)을 함유하는 YPD배지 (10 g/L yeast extract, 20 g/L bacto-peptone, 20 g/L glucose) 에서 선별하였다.
총 18 종의 형질전환체가 선별되었으며, 이 중에서, JHYS12와 JHYS13로 명명된 균주를 synthetic complex(SC)(20 g/L glucose 포함) 배지에서 전 배양 후, OD600=0.2 로 10 mL의 같은 배지에 접종하여, 100 mL 플라스크에서 30℃ 및 170 rpm의 조건으로 48시간 동안 배양하였다. JHYS12와 JHYS13의 세포내 추출한 시노린 생산량을 측정하여 도 4b에 나타내었다. 도 4b에 보여지는 바와 같이, JHYS12와 JHYS13는 coex413-NpR4를 보유한 세포(JHYS10)보다 더 많은 양의 시노린을 생산하였다. 보다 구체적으로, JHYS13 균주의 시노린 생산량은 0.67 mg/L 및 0.125 mg/gDCW로, JHYS12 균주의 시노린 생산량(0.51 mg/L 및 0.106 mg/gDCW)보다 높게 나타났다.
상기 선별된 형질전환체 중 JHYS11, JHYS12, 및 JHYS13로 명명된 균주들의 염색체에 도입된 유전자 NpR5597, NpR5598, NpR5599, 및 NpR5600의 copy 수를 qPCR 방법으로 확인하였다. 도입된 유전자 copy 수 결정하기 위해 NpR5600, NpR5599, NpR5598, 및 NpR5597을 유전자 특이적 프라이머(표 9 참조)와 1xSYBR Green I master mix(Roche Applied Science)를 사용하여 수행하였다. qPCR은 LightCycler 480 II System(Roche Applied Science)에서 45 cycle(95 ℃에서 40 초, 60 ℃에서 20 초, 72 ℃에서 20 초)로 수행하였다. ACT1 유전자를 대조군으로 사용하였다. 교차점(Cp) 값은 LightCycler Software 버전 1.5(Roche Applied Science)를 사용하여 처리하였고, 발현 수준은 표적/참조 비율로 표준화하였다. qPCR에 사용된 프라이머는 하기 표 9와 같다.
| 타겟 유전자 | 프라이머명(F: 정방향; R: 역방향) | 서열(5'→3') | 서열번호 |
| NpR5600 | NpR5600 qPCR F | ATGGCGAAGAGTTGCTTTCC | 40 |
| NpR5600 qPCR R | GTGTGACCGTAGGCAATGAC | 41 | |
| NpR5599 | NpR5599 qPCR F | CCCTCAGAATGGCAGAGGAA | 42 |
| NpR5599 qPCR R | GACGCACTGTTTCACCATCA | 43 | |
| NpR5598 | NpR5598 qPCR F | CTAGCTGCACCTTTGGAACC | 44 |
| NpR5598 qPCR R | GAGCGAATCCCAGTCAATCG | 45 | |
| NpR5597 | NpR5597 qPCR F | AAACTGACGATGGCGACTTG | 46 |
| NpR5597 qPCR R | ACCAAGGTTGTCCCTTTGGA | 47 |
상기와 같이 측정된 유전자 copy 수를 도 4c에 나타내었다. 도 4c에 보여지는 바와 같이, JHYS12 genome(주황색)은 NpR5600 및 NpR5597을 각각 5개 copy 포함하고, NpR5599 및 NpR5598를 각각 2개 copy 포함하는 반면, JHYS13(초록색)은 NpR5600 및 NpR5597을 각각 4개 copy 포함하고, NpR5599 및 NpR5598를 각각 9개 및 8개 copy 포함하는 것으로 나타난 반면, 균주 JHYS11는 상기 4개의 유전자를 염색체 내에 하나씩만 포함하는 것을 확인할 수 있다.
<자일로오스를 탄소원으로 이용 가능한 효모 균주 구축 및 이를 활용한 시노린 생산>
실시예 5: 자일로오스 동화 효소 발현용 벡터 제작
시노린은 오탄당인산경로의 중간물인 S7P로부터 생산되므로, 오탄당인산경로의 강화를 통해 시노린 생산량을 증대시킬 수 있다(도 1a 참조). 하지만 효모는 대부분의 포도당을 해당과정을 통한 피루베이트 생산에 이용하기 때문에, 포도당을 탄소원으로 사용시 오탄당인산경로를 강화하는 것이 어렵다. 반면, 자일로오스를 탄소원으로 이용하는 경우, 자일로오스의 분해 산물인 자일룰로오스-5-포스페이트(xylulose-5-phosphate)가 오탄당인산경로로 바로 유입되기 때문에, 오탄당인산경로를 강화할 수 있다.
효모는 자연적으로 자일로오스를 발효하지 못하지만, 자일로오스 이소머라아제(xylose isomerase; XI) 또는 자일로오스 리덕타아제/자일리톨 디하이드로게나아제(xylose reductase/xylitol dehydrogenase; XR/XDH)로 구성된 이종 경로를 도입함으로써, 자일로오스를 이용하여 생장할 수 있다. XI는 박테리아에서 대부분의 자일로오스를 소비하는 효소이며, 자일로오스 발효 중의 보조 인자 불균형을 제거할 수 있는 이점이 있다. 그러나, XI는 효모에서 발현시 효소 활성이 낮아지기 때문에, 효모에서의 자일로오스 발효에는 XR/XDH 경로가 더 자주 사용된다. 자일로오스 리덕타아제(XR)와 자일리톨 디하이드로게나아제(XDH)는 자일로오스를 자일리톨로, 자일리톨을 자일룰로오스로 연속적으로 전환시킨다. 자일룰로오스는 자일룰로키나아제(xylulokinase; XK)에 의해 자일룰로오스-5-포스페이트(xylulose-5-phosphate; X5P)로 전환되고, 이어서 자일룰로오스-5-포스페이트가 오탄당인산경로로 유입된다(도 1a 참조). 따라서 탄소원으로 자일로오스를 사용하면 오탄당인산경로를 통해 S7P 생산을 증가시킬 수 있다. Pichia stipitis 유래의 XR(Xyl1), XDH(Xyl2) 및 XK(Xyl3)를 암호화하는 자일로오스 동화 유전자를 효모에 도입하여 발현시킴으로써, 효과적으로 자일로오스를 발효할 수 있는 효모 균주를 구축할 수 있다.
자일로오스 발효 효모 균주를 개발하기 위하여, 강력한 프로모터 P TDH3 의 제어하에 Pichia stipitis 유래의 XYL1(자일로오스 리덕타아제(XR) 암호화), XYL2(자일리톨 디하이드로게나아제(XDH) 암호화) 및 XYL3(자일룰로키나아제(XK) 암호화) 유전자를 발현할 수 있는 플라스미드를 제작하였다. 플라스미드의 제작에 사용된 프라이머는 하기 표 10과 같다.
| PCR 산물 | 사용한 주형 | 프라이머명(F: 정방향; R: 역방향) | 서열(5'→3') | 서열번호 |
| XYL1 | pSR306-X123(Pichia stipitis 유래의 XYL1, XYL2, XYL3 발현 플라스미드) | XYL1 F | GCGGGATCCATGCCTTCTATTAAGTTGAACTC | 9 |
| XYL1 R | GCGCTCGAGTTAGACGAAGATAGGAATCTTGT | 10 | ||
| XYL2 | XYL2 F | GCGGGATCCATGACTGCTAACCCTTCCTT | 11 | |
| XYL2 R | GCGCTCGAGTTACTCAGGGCCGTCAATG | 12 | ||
| XYL3 | XYL3 F | GCGGGATCCATGACCACTACCCCATTTG | 13 | |
| XYL3 R | GCGCTCGAGTTAGTGTTTCAATTCACTTTCCATC | 14 | ||
| P TDH3 -XYL2-T CYC1 | p416GPD-XYL2 | Univ F2 | GACTCGCGCGCGGGAACAAAAGCTGGAGCTC | 32 |
| Univ R | GACTACGCGTGCGGCCGCTAATGGCGCGCCATAGGGCGAATTGGGTACC | 33 | ||
| P TDH3 -XYL3-T CYC1 | p416GPD-XYL3 | Univ F2 | GACTCGCGCGCGGGAACAAAAGCTGGAGCTC | 32 |
| Univ R | GACTACGCGTGCGGCCGCTAATGGCGCGCCATAGGGCGAATTGGGTACC | 33 |
Pichia stipitis 유래의 XYL1 , XYL2 , 및 XYL3 발현 플라스미드인 pSR306-X123 (Pichia stipitis 유래의 XYL1 , XYL2 , 및 XYL3 유전자 발현 카세트 TDH3p-XYL1-TDH3t, PGK1p-XYL2-PGK1t, 및 TDH3p-XYL3-TDH3t로 서브클로닝된 pSR306 벡터)에 대하여 상기 표 7의 프라이머를 사용한 PCR를 수행하여, pSR306-X123로부터 XYL1, XYL2, 및 XYL3 유전자를 각각 확보한 후, BamHI/XhoI 제한효소를 처리하고, p416GPD 플라스미드 (ATCC® 87360™)에 각각 클로닝하여, p416GPD-XYL1, p416GPD-XYL2, 및 p416GPD-XYL3 플라스미드를 제작하였다, 제작된 p416GPD-XYL2 및 p416GPD-XYL3를 원형으로하여 프로모터와 터미네이터를 포함한 DNA 절편을 서열번호 32 및 33의 프라이머쌍(표 7 참조)을 사용한 PCR로 확보하여, MauBI/NotI 제한효소를 처리하고, p416GPD-XYL1 벡터에 잇달아 클로닝하여, 최종적으로 XYL1, XYL2, 및 XYL3 유전자를 모두 포함하는 coex416-XYL 벡터를 제작하였다.
실시예
6:
자일로스
동화 효소가 도입된 효모의
자일로오스
소비능
및
마이코스포린
유사 아미노산
생산능
평가
실시예 5에서 제작한 coex416-XYL를 실시예 4에서 얻어진 시노린 생산 균주 JHYS13에 LiAc/SS carrier DNA/PEG 방법으로 형질전환시켰다. 본 실시예에 사용된 재조합 효모(S. cerevisiae) 균주를 표 11에 정리하였다.
| 균주명 | 유전자 타입 |
| JHYS13 | Selected strain from delta-integration of P TEF1 -NpR5597-T GPM1 -P TDH3 -NpR5600-T CYC1 and P TEF1 -NpR5598-T GPM1 -P TDH3 -NpR5599-T CYC1 into CEN. PK2-1C |
| JHYS13-1 | JHYS13 harboring p416GPD |
| JHYS13-2 | JHYS13 harboring coex416-XYL |
공벡터 p416GPD를 형질전환시킨 JHYS13 균주(JHYS13-1; 대조군)와 coex416-XYL를 형질전환시킨 JHYS13 균주(JHYS13-2)를 자일로오스와 글루코오스를 포함한 다양한 배지에서 배양하여, 자일로오스 소비능을 확인하였다. JHYS13-1 및 JHYS13-2 균주를 SC-Ura(20 g/L glucose 포함) 배지에서 전 배양 후, 100 mL 플라스크에서, 10 mL의 SC-Ura(20 g/L glucose 포함), SC-Ura(10 g/L glucose 및 10 g/L xylose 포함), SC-Ura(2 g/L glucose 및 18 g/L xylose 포함), 및 SC-Ura(20 g/L xylose 포함) 배지에 각각 OD600=0.2 로 접종하여 30 ℃ 및 170 rpm의 조건으로 배양하였다.
상기 4종류의 배지에서 JHYS13-1 및 JHYS13-2 균주를 120시간 배양하였다. 배지 내 글루코오스 및 자일로오스의 농도를 측정하기 위해 500 μl의 배양 상층액을 수집하고 0.22-㎛ 시린지 필터로 여과 한 후 HPLC를 이용하여 분석을 수행하였다. Aminex HPX-87H 컬럼 (300 mm x 7.8 mm, 5 μm, Bio-Rad)이 장착된 UltiMate 3000 HPLC 시스템 (Thermo Fisher Scientific)에 60℃에서 0.6 mL/분의 유속으로 5mM H2SO4를 용매로 흘려주었고 refractive index (RI) 검출기 (35℃)를 통해 글루코오스 및 자일로오스의 농도를 측정하였다. 배양물의 세포 밀도(OD600값), 및 120시간 배양 동안의 시노린 생산량(세포 추출물 및 배지에서의 titer(mg/L) 및 content(mg/gDCW))을 측정하여, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 시노린의 농도를 정량하기 위해, 2 mL 씩 2개의 배양 배지를 샘플링하였다. 하나는 오븐에서 건조 후, 건조 셀 중량 (DCW)을 측정하고 다른 하나는 원심 분리 후, 상층액은 여과 후, HPLC로 배지로 분비된 시노린의 농도를 측정하였다. 상층액을 분리한 효모 세포는 1mL의 증류수, 1.5mL의 클로로포름을 첨가한 후 3분 동안 볼텍싱하여 세포 내 시노린을 추출하였다. 원심 분리 후, 수층을 분리 및 여과하여 세포 내 시노린 농도 측정에 이용하였다. Agilent Eclipse XDB-C18 컬럼 (5 ㎛, 4.6 × 250 mm)을 갖춘 Ultimate3000 HPLC 시스템 (Thermo Fisher Scientific)를 이용하였고, 컬럼 온도는 40 ℃로 유지하며 0.5 mL / 분의 유속으로 용매 (물 : 아세토 니트릴 = 95 : 5)를 흘려주었다. 334 nm에서 UV-vis 검출기로 시노린을 검출하였다.
도 5에서 보여지는 바와 같이, JHYS13-1 및 JHYS13-2 균주는 글루코오스(20 g/L)만을 함유하는 배지에서는 유사한 성장 속도를 나타내었으며, 시노린 생산량도 유사함을 확인하였다(도 5의 A 및 E 참조). 또한, JHYS13-1 균주는 자일로오스를 소비하지 못하는 것이 확인되었다(도 5의 B, C, 및 D의 노란색 원 그래프 참조). 반면 JHYS13-2 균주는 자일로오스 소비가 가능함이 확인되었고(도 5의 B, C, 및 D의 노란색 삼각형 그래프 참조), 자일로오스 소비량이 높을수록 시노린의 생산량도 증가하는 것을 확인하였다(도 5의 B, C, 및 D의 노란색 삼각형 그래프와 도 5의 E 결과 비교). 특히, 자일로오스만 포함한 배지(도 5의 D 참조)에서는 자일로오스의 소비 속도가 매우 느렸고, 소량의 글루코오스가 포함된 배지에서 자일로오스를 더 잘 소비하는 경향성을 나타내었다(도 5의 B 및 C 참조). 이러한 결과는 오탄당인산경로를 통한 자일로오스 이용이 시노린 생산을 증가시키는데 효과적이지만, 자일로오스의 이용 효율이 낮기 때문에, 배지에 일정량의 포도당이 포함되는 경우에 세포 성장과 시노린 생산을 촉진하는데 보다 유리함을 보여준다.
실시예 7: 자일로오스 동화 효소를 효모 내 염색체에 도입하기 위한 NTS-인테그레이션(NTS-integration)용 벡터 제작
실시예 6에서와 같이 자일로오스를 기질로 이용한 시노린 생산 효과를 확인한 후, XYL1, XYL2 및 XYL3 유전자의 염색체 도입을 통해 자일로오스 발효 균주를 개발하였다. 효모(S. cerevisiae)에서 XII 염색체에 있는 리보솜 DNA(rDNA) 영역은 9.1kb 크기로 150개의 non-transcriptional spacer(NTS1과 NTS2)를 반복적으로 포함하고 있다. 이 서열을 유전자 도입 서열로 이용하면 무작위적으로 동시에 여러 copy의 유전자를 염색체 내에 도입할 수 있다. XYL1, XYL2, XYL3(XYL) 유전자를 NTS 사이트에 도입하기 위한 벡터를 다음과 같이 제작하였다.
NTS1-2a(400 bp) 및 NTS1-2b(400 bp)의 DNA 절편을 하기 표 12의 프라이머를 한 PCR에 의해 효모 게놈으로부터 증폭하였다. AmpR 카세트 및 bleOR DNA 카세트를 하기 표 12의 프라이머를 사용한 PCR에 의해 pUG66 벡터로부터 확보하였다. 이와 같이 얻어진 4 개의 PCR 산물에 대하여 overlapping PCR을 수행하여 연결된 하나의 단편 NTS1-2a-bleOR-AmpR-NTS1-2b을 제작한 후, 상기 생성된 DNA 단편 NTS1-2a-bleOR-AmpR-NTS1-2b를 NheI 및 NotI 부위를 통해 XYL1 발현 카세트(P TDH3 -XYL1-T CYC1 )와 연결시켜 NTS66M-XYL1 플라스미드를 제작하였다. XYL2를 p414TEF(ATCC® 87364™)에 BamHI, XhoI 제한효소를 이용하여 클로닝하여 p414TEF-XYL2 벡터를 제작하였다. 또한 coex414TPI1 벡터 (대한민국 특허공개 제 10-2016-0093492호 참조)에 BamHI, XhoI 제한효소를 이용하여 XYL3를 클로닝하여 p414TPI1-XYL3을 제작하였다. 이를 주형으로 PCR로 MauBI 및 NotI 부위가 있는 XYL2 발현 카세트(P TEF1 -XYL2-T GPM1 ) 및 XYL3 발현 카세트(P TPI1 -XYL3-T TPI1 )를 확보하였고 NTS66M-XYL1의 AscI 및 NotI 부위 사이에서 순차적으로 클로닝하여, XYL1, XYL2, XYL3(XYL) 유전자의 NTS 사이트 도입을 위한 NTS66M-XYL 플라스미드를 제작하였다(도 6a 참조). 상기 PCR에 사용된 프라이머를 표 12에 정리하였다.
| PCR 산물 | 사용한 주형 | 프라이머명(F: 정방향; R: 역방향) | 서열(5'→3') | 서열번호 |
| NTS1-2a | Saccharomyces cerevisiae genomic DNA(GenBank Accession No. JRIV01000000) | NTS1-2a F | CCGAGCGTGAAAGGATTTGCC | 30 |
| NTS1-2a R | GCGGCTAGCCAACCATTCCATATCTGTTAAG | 31 | ||
| NTS1-2b | NTS1-2b F | GCGAAGTAAATTTTTGGCG | 28 | |
| NTS1-2b Amp R | TTTCCCCGAAAAGTGCATTTAAATCTAGTTTCTTGGCTTCCTATG | 29 | ||
| AmpR | pUG66 (EUROSCARF) | Amp-Ori F | GCACTTTTCGGGGAAATGTG | 21 |
| Amp-Ori R | CTCAACATTCACCCATTTCTCAATTTAAATCGCAGGAAAGAACATGTGAG | 22 | ||
| bleOR | pUG66 (P30116) |
TEF prom F | GCCAAAAATTTACTTCGCGCGGCCCGACATGGAGGCCCAGAAT | 27 |
| NTS term R | GCGGGCGCGCCGCGGCCGCTAAGGGTTCTCGAGAGCTC | 26 | ||
| P TEF1 -XYL2-T GPM1 | p414TEF-XYL2 | Univ F2 | GACTCGCGCGCGGGAACAAAAGCTGGAGCTC | 32 |
| Univ R | GACTACGCGTGCGGCCGCTAATGGCGCGCCATAGGGCGAATTGGGTACC | 33 | ||
| P TPI1 -XYL3-T TPI1 | p414TPI1-XYL3 | Univ F2 | GACTCGCGCGCGGGAACAAAAGCTGGAGCTC | 32 |
| Univ R | GACTACGCGTGCGGCCGCTAATGGCGCGCCATAGGGCGAATTGGGTACC | 33 |
실시예
8:
자일로오스
동화 효소의
NTS
-integration 및 이를 통해 제작된 효모 균주의
자일로오스
소비능
및
마이코스포린
유사 아미노산
생산능
평가
상기 실시예 7에서 준비된 NTS66M-XYL 플라스미드는 SwaI 제한효소를 처리하면 DNA 양말단에 NTS site가 노출되도록 제작되었다(도 6a 참조). 효모 염색체의 rDNA 부위에 XYL 유전자를 삽입하기 위하여, 상기 준비된 NTS66M-XYL 플라스미드를 SwaI로 절단하고, JHYS13 균주에 LiAc/SS carrier DNA/PEG 방법으로 형질 전환시킨 후, zeocin 500 mg/L를 함유한 YPX(10 g/L 효모 추출물, 20 g/L 박토 펩톤 및 20g/L xylose) 플레이트에서 선별하였다. 이와 같이 선별된 재조합 효모 균주를 표 13에 정리하였다.
| 균주명 | 유전자 타입 |
| JHYS14 | Selected strain from NTS-integration of P TDH3 -XYL1-T CYC1 -P TEF1 -XYL2-T GPM1 -P TPI1 -XYL3-T TPI1 into CEN. PK2-1C |
| JHYS15 | Selected strain from NTS-integration of P TDH3 -XYL1-T CYC1 -P TEF1 -XYL2-T GPM1 -P TPI1 -XYL3-T TPI1 into CEN. PK2-1C |
| JHYS16 | Selected strain from NTS-integration of P TDH3 -XYL1-T CYC1 -P TEF1 -XYL2-T GPM1 -P TPI1 -XYL3-T TPI1 into CEN. PK2-1C |
상기 선별된 균주를 각각 SC 배지 (2 g/L glucose, 18 g/L xylose)에 OD600=0.2 로 접종하여 30 ℃ 및 170 rpm의 조건으로 96시간 동안 배양하면서, 배지 내 글루코오스 및 자일로오스의 농도와 배양물의 세포 밀도(OD600값)를 측정하여 도 6b에 나타내고, 96시간 배양 동안의 시노린 생산량(세포 추출물 및 배지에서의 titer(mg/L) 및 content(mg/gDCW))을 측정하여 도 6c에 나타내었다. 도 6b 및 도 6c에 보여지는 바와 같이, 상기 선별된 3종의 균주는 모두 자일로오스 소비능 및 시노린 생산능을 보유하고, 특히 JHYS16 균주가 가장 높은 시노린을 생산량(17.72 mg/L 및 8.7 mg/gDCW)을 나타내었다.
상기 JHYS16 균주를 부다페스트 조약하에 2019년 11월 14일자로 대한민국 서울시 서대문구에 소재하는 한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM12628P를 부여받았다.
<오탄당인산경로의 강화를 통한 마이코스포린 유사 아미노산 생산>
실시예 9: Transaldolase(Tal1) 결손 균주 제작
실시예 8에서 시노린 생산능이 우수한 것으로 확인된 JHYS16 균주에서 시노린 생산을 더욱 향상시키기 위하여, 중간산물인 S7P 생산량을 증가시키는 방안을 고안하였다. 이를 위하여, 오탄당인산경로에서 S7P와 글리세르알데하이드 3-포스페이트(glyceraldehyde 3-phosphate) 사이의 전환 반응에 관여하는 트랜스알돌라아제(transaldolase)인 TAL1을 제거하고자 하였다(도 1a 참조). CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 TAL1을 제거하기 위해 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하였다. 구체적으로, Streptococcus pyogenes의 Cas9(NP_269215.1)의 코딩 유전자와 gRNA 단편(P SNR52 -structural component-T SUP4 )을 p413TEF (ATCC ® 87362™)에 클로닝하여, coex413-Cas9-gRNA 플라스미드를 생성했다. TAL1 표적 gRNA(sgRNA)는 Yeastriction v0.1(http://yeastriction.tnw.tudelft.nl)에 의해 디자인하였고, PCR에 기초한 DpnI-매개 부위 유도 돌연변이 유발에 의해 coex413-Cas9-gRNA에 삽입하여, coex413-Cas9-TAL1gRNA를 제작하였다. 성가 PCR에 사용된 프라이머 및 제작된 플라스미드를 각각 하기 표 14 및 표 15에 나타내었다.
| PCR 산물 | 사용한 주형 | 프라이머명(F: 정방향; R: 역방향) | 서열(5'→3') | 서열번호 |
| TAL1 deletion cassette | - | TAL1_del F | TAGTACGATAGTAAAATACTTCTCGAACTCGTCACATATACGTGTACATAGGAAGTATCT | 34 |
| TAL1_del R | AGAAACGTGCATAAGGACATGGCCTAAATTAATATTTCCGAGATACTTCCTATGTACACG | 35 | ||
| coex413-Cas9-TAL1gRNA | coex413-Cas9-gRNA | TAL1 gRNA F | AACTAACCCATCATTGATCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC | 38 |
| TAL1 gRNA R | AGATCAATGATGGGTTAGTTGATCATTTATCTTTCACTGC | 39 |
| Plasmid | Description |
| coex413-Cas9-TAL1gRNA | CEN/ARS plasmid, HIS3, P TDH3 -CAS9-T TPI1 , P SNR52 -TAL1gRNA-T SUP4 |
Cas9 유전자 및 TAL1 유전자를 표적으로 하는 guide RNA(gRNA)를 발현하는 coex413-Cas9-TAL1gRNA와 TAL1 ORF 위아래로 homologous arm을 가지는 TAL1 deletion cassette 를 JHYS16세포에 형질 전환시킨 후, SC-His(2중량% glucose) 배지에서 TAL1 결손 균주를 선별하였다. TAL1 결손 확인은 PCR(사용된 프라이머: TAL1_C F primer: CGGGAATAAAGCGGAACT(서열번호 36); TAL1_C R primer: GGTGGTTCCGGATGTTTT(서열번호 37))로 확인하였다. PCR에 의한 TAL1 결실을 확인한 후, YPD(10 g/L 효모 추출물, 20 g/L 박토 펩톤 및 20g/L glucose) 배지에서 밤새 배양하여 coex413-Cas9-TAL1gRNA 플라스미드를 제거하였다. 이와 같이 얻어진 Tal1이 결손된 균주를 JHYS17이라고 명명하였다.
실시예 10: 트랜스알돌라아제(Transaldolase; Tal1) 결손 균주의 마이코스포린 유사 아미노산 생산능 평가
상기 준비된 JHYS16 및 JHYS17을 각각 SC 배지(2g/L 글루코오스 및 18g/L 자일로오스 포함) 또는 SC 배지(10 g/L 글루코오스과 10 g/L 자일로오스 포함) 배지에 OD600=0.2 로 접종하여 30 ℃ 및 170 rpm의 조건하에서 120시간 동안 배양하면서, 배지 내 글루코오스 및 자일로오스 농도, 배양물의 세포 밀도(OD600값), 및 120시간 배양 동안의 시노린 생산량(세포 추출물 및 배지에서의 titer(mg/L) 및 함량(mg/gDCW))을 측정하여 도 7에 나타내었다.
JHYS16에서 TAL1을 결실시킴으로써 생성된 JHYS17 균주를 SC 배지(2g/L 글루코오스 및 18g/L 자일로오스 포함)에서 배양한 결과, 자일로오스가 풍부한 배지에서 심각한 성장 결함을 보이는 것이 확인되었으며(도 7의 A), 이로써 TAL1이 자일로오스 동화작용에 필수적이라는 사실을 확인할 수 있었다.
따라서 글루코오스와 자일로오스의 비율을 바꾸어 생장 결함을 완화하여 배양을 실시하였다. JHYS16과 JHYS17를 SC 배지(10 g/L 글루코오스과 10 g/L 자일로오스 포함)에서 배양하고, 그 결과를 도 7의 B에 나타내었다. 도 7의 B에 나타난 바와 같이, JHYS16과 JHYS17은 비슷한 글루코오스 소비속도를 보였으나, JHYS16가 배지의 대부분 자일로오스를 소비한 것과 달리, 자일로오스 동화 작용에 결함이 있는 JHYS17은 5.7 g/L의 자일로오스만을 소비했다. 그러나, JHYS17은 JHYS16에 비해 약 3.3 배 높은 titer(21.9 mg/L)와 7.2 배 높은 양(7.67 mg/gDCW)의 시노린을 생산하였다(도 6의 C 참조). JHYS17의 시노린 생산 수준은 2 g/L 글루코오스와 18 g/L 자일로오스를 함유한 배지에서 배양한 JHYS16에서 생산된 것(도 5의 C 참조)보다 훨씬 높았다. 따라서, TAL1이 결손된 경우, 자일로오스로부터 생성된 S7P는 시노린 생합성에 보다 유용할 수 있지만, 불완전한 오탄당인산경로로 인해 자일로오스 동화작용이 제한됨을 확인할 수 있었다.
실시예 11: 전사조절인자 Stb5 및 트랜스케톨라아제(transketolase; Tkl1)의 효모 내 과발현용 벡터 제작
JHY17은 오탄당인산경로에 결함이 있으므로, 오탄당인산경로와 관련된 다른 유전자의 발현을 강화하면 자일로오스 발효와 그 이후의 시노린 생성을 도울 수 있다. 따라서 과발현 타겟 유전자로 전사조절 인자를 암호화하는 Stb5(GenBank accession no. JRIV01000036.1)와 트랜스케톨라아제(transketolase)를 암호화하는 TKL1(GenBank accession no. JRIV01000030.1)을 선택했다. Stb5는 ZWF1(glucose-6-phosphate dehydrogenase), GND1(6-phosphogluconate dehydrogenase), TKL1 및 다른 NADPH 생성 경로를 포함하는 오탄당인산경로에서 유전자를 활성화시켜 NADPH를 생성함으로써 산화 스트레스 반응에 중요한 역할을 한다. Tkl1은 두 가지 주요 대사 경로인 오탄당인산경로와 해당과정(도 1a 참조) 사이에 가역적인 연결 고리를 만들어 주며, 탄소원으로 자일로오스를 이용하여 효모를 배양할 때 중요한 역할을 한다. STB5 및 TKL1의 과발현 효과를 확인하기 위해, 이들 유전자를 개별적으로 또는 조합하여 발현하는 플라스미드를 제작하였다. 각각 유전자의 단편은 PCR로 확보하였고, PCR에 사용된 프라이머는 하기 표 16과 같다.
| PCR 산물 | 사용한 주형 | 프라이머명(F: 정방향; R: 역방향) | 서열(5'→3') | 서열번호 |
| TKL1 | Saccharomyces cerevisiae genomic DNA(GenBank Accession No. JRIV01000000) | TKL1 F | GCGGGATCCATGACTCAATTCACTGACA | 17 |
| TKL1 R | GCGCTCGAGTTAGAAAGCTTTTTTCAAAGGAG | 18 | ||
| STB5 | STB5 F | GCGGGATCCATGGATGGTCCCAATTTTG | 15 | |
| STB5 R | GCGGTCGACTCATACAAGTTTATCAACCCAAG | 16 | ||
| P TDH3 -TKL1-T CYC1 | p414GPD-TKL1 | Univ F2 | GACTCGCGCGCGGGAACAAAAGCTGGAGCTC | 32 |
| Univ R | GACTACGCGTGCGGCCGCTAATGGCGCGCCATAGGGCGAATTGGGTACC | 33 |
TKL1은 P TDH3 의 조절하에 발현되도록 p414GPD 벡터(ATCC® 87356TM)에 BamHI, XhoI을 제한효소 site로 하여 클로닝하여, p414GPD-TKL1(표 16)를 얻었다. STB5는 강한 프로모터를 사용한 과발현의 경우, 효모 균주 성장 억제 효과로 인해 약한 프로모터 P ADH1 의 조절하에 발현되도록 p414ADH 벡터(ATCC® 87372TM)에 클로닝하였다. STB5 DNA 단편은 BamHI, SalI으로 처리하였고, p414ADH는 BamHI, XhoI 처리하여 클로닝을 하였다(p414ADH-STB5). p414GPD-TKL1를 주형으로 한 PCR로 확보한 MauBI 및 NotI 부위가 있는 TKL1 발현 카세트(P TDH3 -TKL1-T CYC1 )를 p414ADH-STB5의 AscI 및 NotI 부위 사이에 클로닝하여 coex414-STB5-TKL1 플라스미드를 제작하였다. 제작된 플라스미드는 하기 표 17과 같다.
| Plasmid | Description |
| p414ADH-STB5 | CEN/ARS plasmid, TRP1, P ADH1 -STB5-T CYC1 |
| p414GPD-TKL1 | CEN/ARS plasmid, TRP1, P TDH3 -TKL1-T CYC1 |
| coex414-STB5-TKL1 | CEN/ARS plasmid, TRP1, P ADH1 -STB5-T CYC1 , P TDH3 -TKL1-T CYC1 |
실시예
12:
오탄당인산경로의
전사조절인자
Stb5
및
Tkl1의
효모 내 과발현을 통한
마이코스포린
유사 아미노산
생산능
평가
추가 유전자 과발현을 통한 오탄당인산경로의 강화가 시노린 생산 증가에 효과가 있는지 확인하기 위해, JHYS17 균주를 p414ADH-STB5, p414GPD-TKL1, 또는 coex414-STB5-TKL1 플라스미드로 LiAc/SS carrier DNA/PEG 방법을 사용하여 형질 전환시켰다. 형질전환 효모 균주는 하기 표 18와 같다.
| 균주명 | 유전자 타입 |
| JHYS17 | JHYS16 tal1Δ |
| JHYS17-1 | JHYS17 harboring p414GPD |
| JHYS17-2 | JHYS17 harboring p414ADH-STB5 |
| JHYS17-3 | JHYS17 harboring p414GPD-TKL1 |
| JHYS17-4 | JHYS17 harboring coex414GPD-STB5-TKL1 |
상기 얻어진 형질전환 효모 균주를 각각 SC-Trp (10 g/L 글루코오스, 10 g/L 자일로오스) 배지에 OD600=0.2 로 접종하여 30 ℃ 및 170 rpm의 조건하에서 120시간 동안 배양하면서, 배지 내 글루코오스 및 자일로오스 농도 및 배양물의 세포 밀도(OD600값)를 측정하여 도 8a에 나타내고, 120시간 배양 동안의 시노린 생산량(세포 추출물 및 배지에서의 titer(mg/L) 및 content(mg/gDCW))을 측정하여 도 8b에 나타내었다. 도 8b에 나타난 바와 같이, 두 유전자(STB5 및 TKL1) 모두 과발현시킨 경우 시노린 생산을 증가 시키는데 효과적이었다. STB5 또는 TKL1을 과발현하는 JHYS17-2 및 JHYS17-3 균주는 공벡터를 보유하는 대조군 JHYS17-1 균주와 비교하여 자일로오스를 소량 더 소비했으며, 시노린 생산도 증가하였다(도 8b). STB5와 TKL1 모두를 과발현하는 JHYS17-4 균주가 가장 시노린 생산량이 높았고 자일로오스 소비량도 많았다. 이들 유전자의 과발현이 자일로오스 소비율을 증가시키는 데 효과적이었기 때문에(도 8a), 이 유전자들의 과발현은 TAL1이 결핍 된 JHYS17 균주에서의 자일로오스 동화 과정에서 발생하는 세포 생장 저하 문제를 완화시킬 수 있다.
실시예 13: 배지 내 포도당과 자일로오스의 최적 비율 탐색
Tal1 결손 균주의 자일로오스의 비효율적인 이용으로 인해, 배지에 더 많은 포도당을 첨가하면 세포 성장을 촉진할 수 있다. 반면에 시노린 생산에 있어서 중요한 중간체 S7P는 주로 자일로오스 동화 작용을 통해 제공된다. 그러므로 배지 내 글루코오스와 자일로오스의 비율을 조절하여 적절한 세포 생장과 시노린의 최대 생산 효과를 얻을 수 있다.
이들 탄소원(글루코오스 및 자일로오스)의 최적 비율을 찾기 위하여, 전체 탄소원의 농도를 20 g/L로 유지하면서 자일로오스와 글루코오스를 다양한 비율로 함유하는 8 개의 다른 배지(도 9a의 A 참조)에 JHYS17-4 균주를 OD600=0.2 로 접종하여 30 ℃ 및 170 rpm의 조건으로 120시간 동안 배양하여 배양하였다. 상기 배양으로 얻어진 배양물의 세포 밀도(OD600값) 및 배지 내 글루코오스 및 자일로오스 농도를 측정하여 각각 도 9a의 B, C, 및 D에 나타내고, 120시간 배양 동안의 시노린 생산량(세포 추출물 및 배지에서의 titer(mg/L) 및 content(mg/gDCW))을 측정하여 도 9b 및 9c에 나타내었다.
그 결과, 배지의 자일로오스 비율이 증가함에 따라(즉, 글루코오스 비율이 감소함에 따라) 세포 성장률은 감소했다(도 9a의 B). 그러나, 배지의 자일로오스 농도가 8 g/L로 증가함에 따라 시노린 생산이 증가하였다. 글루코오스 12 g/L 및 자일로오스 8 g/L를 함유하는 배지 #5에서 균주 배양 시, 12 g/L의 글루코오스 및 5.4 g/L의 자일로오스를 소비하였고(도 9a의 C 및 D), 가장 많은 시노린이 생산되었다(31.0 mg/L(도 9b) 및 9.6 mg/gDCW(도 9c)). 또한, 시노린 함량은 10 g/L 글루코오스 및 10 g/L 자일로오스를 함유하는 배지 #6에서 배양시 가장 높았다(10.27mg/gDCW(도 9c)). 배지내의 자일로오스 농도가 14 g/L보다 높으면, 세포 생장이 저해되었고(도 9a의 A), 감소된 세포 성장은 시노린 생산에 부정적인 영향을 주었다(도 9b 및 9c).
또한, 상기 배양시 생산되는 부산물(자일리톨, 에탄올, 글리세롤, 및 아세테이트) 함량을 측정하여, 도 10에 나타내었다. 배지 내 자일리톨, 에탄올, 글리세롤 및 아세테이트의 농도를 측정하기 위해 500 μl의 배양 상층액을 수집하고 0.22-μm 시린지 필터로 여과 한 후 HPLC를 이용하여 분석을 수행하였다. Aminex HPX-87H 컬럼 (300 mm x 7.8 mm, 5 μm, Bio-Rad)이 장착된 UltiMate 3000 HPLC 시스템 (Thermo Fisher Scientific)에 60℃에서 0.6 mL/분의 유속으로 5mM H2SO4를 용매로 흘려주었고 refractive index (RI) 검출기 (35℃)를 통해 부산물의 농도를 측정하였다. 도 10에서 확인되는 바와 같이, 대부분의 배지 조건에서 에탄올은 주요 부산물이었지만 자일리톨은 자일로오스 동화 작용의 부산물로 축적되었으며, 자일리톨의 축적은 자일로오스의 소비속도가 떨어지는 중요한 요인이 될 수 있다.
이상, 본 명세서에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 다양한 요소들의 가능한 모든 조합이 본 명세서에서 제안되는 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 명세서의 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없으며, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 본 명세서에 기재된 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있는 한, 이러한 등가물은 본 명세서에서 제안되는 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
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<213> Artificial Sequence
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<223> NpR5600 F primer
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<220>
<223> NpR5598 qPCR F primer
<400> 44
ctagctgcac ctttggaacc 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NpR5598 qPCR R primer
<400> 45
gagcgaatcc cagtcaatcg 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NpR5597 qPCR F primer
<400> 46
aaactgacga tggcgacttg 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NpR5597 qPCR R primer
<400> 47
accaaggttg tccctttgga 20
<210> 48
<211> 318
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> xylose reductase
<400> 48
Met Pro Ser Ile Lys Leu Asn Ser Gly Tyr Asp Met Pro Ala Val Gly
1 5 10 15
Phe Gly Cys Trp Lys Val Asp Val Asp Thr Cys Ser Glu Gln Ile Tyr
20 25 30
Arg Ala Ile Lys Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Asp Gly Ala Glu Asp Tyr
35 40 45
Ala Asn Glu Lys Leu Val Gly Ala Gly Val Lys Lys Ala Ile Asp Glu
50 55 60
Gly Ile Val Lys Arg Glu Asp Leu Phe Leu Thr Ser Lys Leu Trp Asn
65 70 75 80
Asn Tyr His His Pro Asp Asn Val Glu Lys Ala Leu Asn Arg Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Leu Gln Val Asp Tyr Val Asp Leu Phe Leu Ile His Phe Pro
100 105 110
Val Thr Phe Lys Phe Val Pro Leu Glu Glu Lys Tyr Pro Pro Gly Phe
115 120 125
Tyr Cys Gly Lys Gly Asp Asn Phe Asp Tyr Glu Asp Val Pro Ile Leu
130 135 140
Glu Thr Trp Lys Ala Leu Glu Lys Leu Val Lys Ala Gly Lys Ile Arg
145 150 155 160
Ser Ile Gly Val Ser Asn Phe Pro Gly Ala Leu Leu Leu Asp Leu Leu
165 170 175
Arg Gly Ala Thr Ile Lys Pro Ser Val Leu Gln Val Glu His His Pro
180 185 190
Tyr Leu Gln Gln Pro Arg Leu Ile Glu Phe Ala Gln Ser Arg Gly Ile
195 200 205
Ala Val Thr Ala Tyr Ser Ser Phe Gly Pro Gln Ser Phe Val Glu Leu
210 215 220
Asn Gln Gly Arg Ala Leu Asn Thr Ser Pro Leu Phe Glu Asn Glu Thr
225 230 235 240
Ile Lys Ala Ile Ala Ala Lys His Gly Lys Ser Pro Ala Gln Val Leu
245 250 255
Leu Arg Trp Ser Ser Gln Arg Gly Ile Ala Ile Ile Pro Lys Ser Asn
260 265 270
Thr Val Pro Arg Leu Leu Glu Asn Lys Asp Val Asn Ser Phe Asp Leu
275 280 285
Asp Glu Gln Asp Phe Ala Asp Ile Ala Lys Leu Asp Ile Asn Leu Arg
290 295 300
Phe Asn Asp Pro Trp Asp Trp Asp Lys Ile Pro Ile Phe Val
305 310 315
<210> 49
<211> 957
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> xylose reductase coding gene
<400> 49
atgccttcta ttaagttgaa ctctggttac gacatgccag ccgtcggttt cggctgttgg 60
aaagtcgacg tcgacacctg ttctgaacag atctaccgtg ctatcaagac cggttacaga 120
ttgttcgacg gtgccgaaga ttacgccaac gaaaagttag ttggtgccgg tgtcaagaag 180
gccattgacg aaggtatcgt caagcgtgaa gacttgttcc ttacctccaa gttgtggaac 240
aactaccacc acccagacaa cgtcgaaaag gccttgaaca gaaccctttc tgacttgcaa 300
gttgactacg ttgacttgtt cttgatccac ttcccagtca ccttcaagtt cgttccatta 360
gaagaaaagt acccaccagg attctactgt ggtaagggtg acaacttcga ctacgaagat 420
gttccaattt tagagacctg gaaggctctt gaaaagttgg tcaaggccgg taagatcaga 480
tctatcggtg tttctaactt cccaggtgct ttgctcttgg acttgttgag aggtgctacc 540
atcaagccat ctgtcttgca agttgaacac cacccatact tgcaacaacc aagattgatc 600
gaattcgctc aatcccgtgg tattgctgtc accgcttact cttcgttcgg tcctcaatct 660
ttcgttgaat tgaaccaagg tagagctttg aacacttctc cattgttcga gaacgaaact 720
atcaaggcta tcgctgctaa gcacggtaag tctccagctc aagtcttgtt gagatggtct 780
tcccaaagag gcattgccat cattccaaag tccaacactg tcccaagatt gttggaaaac 840
aaggacgtca acagcttcga cttggacgaa caagatttcg ctgacattgc caagttggac 900
atcaacttga gattcaacga cccatgggac tgggacaaga ttcctatctt cgtctaa 957
<210> 50
<211> 363
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> xylitol dehydrogenase
<400> 50
Met Thr Ala Asn Pro Ser Leu Val Leu Asn Lys Ile Asp Asp Ile Ser
1 5 10 15
Phe Glu Thr Tyr Asp Ala Pro Glu Ile Ser Glu Pro Thr Asp Val Leu
20 25 30
Val Gln Val Lys Lys Thr Gly Ile Cys Gly Ser Asp Ile His Phe Tyr
35 40 45
Ala His Gly Arg Ile Gly Asn Phe Val Leu Thr Lys Pro Met Val Leu
50 55 60
Gly His Glu Ser Ala Gly Thr Val Val Gln Val Gly Lys Gly Val Thr
65 70 75 80
Ser Leu Lys Val Gly Asp Asn Val Ala Ile Glu Pro Gly Ile Pro Ser
85 90 95
Arg Phe Ser Asp Glu Tyr Lys Ser Gly His Tyr Asn Leu Cys Pro His
100 105 110
Met Ala Phe Ala Ala Thr Pro Asn Ser Lys Glu Gly Glu Pro Asn Pro
115 120 125
Pro Gly Thr Leu Cys Lys Tyr Phe Lys Ser Pro Glu Asp Phe Leu Val
130 135 140
Lys Leu Pro Asp His Val Ser Leu Glu Leu Gly Ala Leu Val Glu Pro
145 150 155 160
Leu Ser Val Gly Val His Ala Ser Lys Leu Gly Ser Val Ala Phe Gly
165 170 175
Asp Tyr Val Ala Val Phe Gly Ala Gly Pro Val Gly Leu Leu Ala Ala
180 185 190
Ala Val Ala Lys Thr Phe Gly Ala Lys Gly Val Ile Val Val Asp Ile
195 200 205
Phe Asp Asn Lys Leu Lys Met Ala Lys Asp Ile Gly Ala Ala Thr His
210 215 220
Thr Phe Asn Ser Lys Thr Gly Gly Ser Glu Glu Leu Ile Lys Ala Phe
225 230 235 240
Gly Gly Asn Val Pro Asn Val Val Leu Glu Cys Thr Gly Ala Glu Pro
245 250 255
Cys Ile Lys Leu Gly Val Asp Ala Ile Ala Pro Gly Gly Arg Phe Val
260 265 270
Gln Val Gly Asn Ala Ala Gly Pro Val Ser Phe Pro Ile Thr Val Phe
275 280 285
Ala Met Lys Glu Leu Thr Leu Phe Gly Ser Phe Arg Tyr Gly Phe Asn
290 295 300
Asp Tyr Lys Thr Ala Val Gly Ile Phe Asp Thr Asn Tyr Gln Asn Gly
305 310 315 320
Arg Glu Asn Ala Pro Ile Asp Phe Glu Gln Leu Ile Thr His Arg Tyr
325 330 335
Lys Phe Lys Asp Ala Ile Glu Ala Tyr Asp Leu Val Arg Ala Gly Lys
340 345 350
Gly Ala Val Lys Cys Leu Ile Asp Gly Pro Glu
355 360
<210> 51
<211> 1092
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> xylitol dehydrogenase coding gene
<400> 51
atgactgcta acccttcctt ggtgttgaac aagatcgacg acatttcgtt cgaaacttac 60
gatgccccag aaatctctga acctaccgat gtcctcgtcc aggtcaagaa aaccggtatc 120
tgtggttccg acatccactt ctacgcccat ggtagaatcg gtaacttcgt tttgaccaag 180
ccaatggtct tgggtcacga atccgccggt actgttgtcc aggttggtaa gggtgtcacc 240
tctcttaagg ttggtgacaa cgtcgctatc gaaccaggta ttccatccag attctccgac 300
gaatacaaga gcggtcacta caacttgtgt cctcacatgg ccttcgccgc tactcctaac 360
tccaaggaag gcgaaccaaa cccaccaggt accttatgta agtacttcaa gtcgccagaa 420
gacttcttgg tcaagttgcc agaccacgtc agcttggaac tcggtgctct tgttgagcca 480
ttgtctgttg gtgtccacgc ctctaagttg ggttccgttg ctttcggcga ctacgttgcc 540
gtctttggtg ctggtcctgt tggtcttttg gctgctgctg tcgccaagac cttcggtgct 600
aagggtgtca tcgtcgttga cattttcgac aacaagttga agatggccaa ggacattggt 660
gctgctactc acaccttcaa ctccaagacc ggtggttctg aagaattgat caaggctttc 720
ggtggtaacg tgccaaacgt cgttttggaa tgtactggtg ctgaaccttg tatcaagttg 780
ggtgttgacg ccattgcccc aggtggtcgt ttcgttcaag tcggtaacgc tgctggtcca 840
gtcagcttcc caatcaccgt tttcgccatg aaggaattga ctttgttcgg ttctttcaga 900
tacggattca acgactacaa gactgctgtt ggaatctttg acactaacta ccaaaacggt 960
agagaaaatg ctccaattga ctttgaacaa ttgatcaccc acagatacaa gttcaaggac 1020
gctattgaag cctacgactt ggtcagagcc ggtaagggtg ctgtcaagtg tctcattgac 1080
ggccctgagt aa 1092
<210> 52
<211> 623
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> xylulokinase
<400> 52
Met Thr Thr Thr Pro Phe Asp Ala Pro Asp Lys Leu Phe Leu Gly Phe
1 5 10 15
Asp Leu Ser Thr Gln Gln Leu Lys Ile Ile Val Thr Asp Glu Asn Leu
20 25 30
Ala Ala Leu Lys Thr Tyr Asn Val Glu Phe Asp Ser Ile Asn Ser Ser
35 40 45
Val Gln Lys Gly Val Ile Ala Ile Asn Asp Glu Ile Ser Lys Gly Ala
50 55 60
Ile Ile Ser Pro Val Tyr Met Trp Leu Asp Ala Leu Asp His Val Phe
65 70 75 80
Glu Asp Met Lys Lys Asp Gly Phe Pro Phe Asn Lys Val Val Gly Ile
85 90 95
Ser Gly Ser Cys Gln Gln His Gly Ser Val Tyr Trp Ser Arg Thr Ala
100 105 110
Glu Lys Val Leu Ser Glu Leu Asp Ala Glu Ser Ser Leu Ser Ser Gln
115 120 125
Met Arg Ser Ala Phe Thr Phe Lys His Ala Pro Asn Trp Gln Asp His
130 135 140
Ser Thr Gly Lys Glu Leu Glu Glu Phe Glu Arg Val Ile Gly Ala Asp
145 150 155 160
Ala Leu Ala Asp Ile Ser Gly Ser Arg Ala His Tyr Arg Phe Thr Gly
165 170 175
Leu Gln Ile Arg Lys Leu Ser Thr Arg Phe Lys Pro Glu Lys Tyr Asn
180 185 190
Arg Thr Ala Arg Ile Ser Leu Val Ser Ser Phe Val Ala Ser Val Leu
195 200 205
Leu Gly Arg Ile Thr Ser Ile Glu Glu Ala Asp Ala Cys Gly Met Asn
210 215 220
Leu Tyr Asp Ile Glu Lys Arg Glu Phe Asn Glu Glu Leu Leu Ala Ile
225 230 235 240
Ala Ala Gly Val His Pro Glu Leu Asp Gly Val Glu Gln Asp Gly Glu
245 250 255
Ile Tyr Arg Ala Gly Ile Asn Glu Leu Lys Arg Lys Leu Gly Pro Val
260 265 270
Lys Pro Ile Thr Tyr Glu Ser Glu Gly Asp Ile Ala Ser Tyr Phe Val
275 280 285
Thr Arg Tyr Gly Phe Asn Pro Asp Cys Lys Ile Tyr Ser Phe Thr Gly
290 295 300
Asp Asn Leu Ala Thr Ile Ile Ser Leu Pro Leu Ala Pro Asn Asp Ala
305 310 315 320
Leu Ile Ser Leu Gly Thr Ser Thr Thr Val Leu Ile Ile Thr Lys Asn
325 330 335
Tyr Ala Pro Ser Ser Gln Tyr His Leu Phe Lys His Pro Thr Met Pro
340 345 350
Asp His Tyr Met Gly Met Ile Cys Tyr Cys Asn Gly Ser Leu Ala Arg
355 360 365
Glu Lys Val Arg Asp Glu Val Asn Glu Lys Phe Asn Val Glu Asp Lys
370 375 380
Lys Ser Trp Asp Lys Phe Asn Glu Ile Leu Asp Lys Ser Thr Asp Phe
385 390 395 400
Asn Asn Lys Leu Gly Ile Tyr Phe Pro Leu Gly Glu Ile Val Pro Asn
405 410 415
Ala Ala Ala Gln Ile Lys Arg Ser Val Leu Asn Ser Lys Asn Glu Ile
420 425 430
Val Asp Val Glu Leu Gly Asp Lys Asn Trp Gln Pro Glu Asp Asp Val
435 440 445
Ser Ser Ile Val Glu Ser Gln Thr Leu Ser Cys Arg Leu Arg Thr Gly
450 455 460
Pro Met Leu Ser Lys Ser Gly Asp Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ala Ser
465 470 475 480
Pro Gln Pro Glu Gly Asp Gly Thr Asp Leu His Lys Val Tyr Gln Asp
485 490 495
Leu Val Lys Lys Phe Gly Asp Leu Tyr Thr Asp Gly Lys Lys Gln Thr
500 505 510
Phe Glu Ser Leu Thr Ala Arg Pro Asn Arg Cys Tyr Tyr Val Gly Gly
515 520 525
Ala Ser Asn Asn Gly Ser Ile Ile Arg Lys Met Gly Ser Ile Leu Ala
530 535 540
Pro Val Asn Gly Asn Tyr Lys Val Asp Ile Pro Asn Ala Cys Ala Leu
545 550 555 560
Gly Gly Ala Tyr Lys Ala Ser Trp Ser Tyr Glu Cys Glu Ala Lys Lys
565 570 575
Glu Trp Ile Gly Tyr Asp Gln Tyr Ile Asn Arg Leu Phe Glu Val Ser
580 585 590
Asp Glu Met Asn Leu Phe Glu Val Lys Asp Lys Trp Leu Glu Tyr Ala
595 600 605
Asn Gly Val Gly Met Leu Ala Lys Met Glu Ser Glu Leu Lys His
610 615 620
<210> 53
<211> 1872
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> xylulokinase coding gene
<400> 53
atgaccacta ccccatttga tgctccagat aagctcttcc tcgggttcga tctttcgact 60
cagcagttga agatcatcgt caccgatgaa aacctcgctg ctctcaaaac ctacaatgtc 120
gagttcgata gcatcaacag ctctgtccag aagggtgtca ttgctatcaa cgacgaaatc 180
agcaagggtg ccattatttc ccccgtttac atgtggttgg atgcccttga ccatgttttt 240
gaagacatga agaaggacgg attccccttc aacaaggttg ttggtatttc cggttcttgt 300
caacagcacg gttcggtata ctggtctaga acggccgaga aggtcttgtc cgaattggac 360
gctgaatctt cgttatcgag ccagatgaga tctgctttca ccttcaagca cgctccaaac 420
tggcaggatc actctaccgg taaagagctt gaagagttcg aaagagtgat tggtgctgat 480
gccttggctg atatctctgg ttccagagcc cattacagat tcacagggct ccagattaga 540
aagttgtcta ccagattcaa gcccgaaaag tacaacagaa ctgctcgtat ctctttagtt 600
tcgtcatttg ttgccagtgt gttgcttggt agaatcacct ccattgaaga ggccgatgct 660
tgtggaatga acttgtacga tatcgaaaag cgcgagttca acgaagagct cttggccatc 720
gctgctggtg tccaccctga gttggatggt gtagaacaag acggtgaaat ttacagagct 780
ggtatcaatg agttgaagag aaagttgggt cctgtcaaac ctataacata cgaaagcgaa 840
ggtgacattg cctcttactt tgtcaccaga tacggcttca accccgactg taaaatctac 900
tcgttcaccg gagacaattt ggccacgatt atctcgttgc ctttggctcc aaatgatgct 960
ttgatctcat tgggtacttc tactacagtt ttaattatca ccaagaacta cgctccttct 1020
tctcaatacc atttgtttaa acatccaacc atgcctgacc actacatggg catgatctgc 1080
tactgtaacg gttccttggc cagagaaaag gttagagacg aagtcaacga aaagttcaat 1140
gtagaagaca agaagtcgtg ggacaagttc aatgaaatct tggacaaatc cacagacttc 1200
aacaacaagt tgggtattta cttcccactt ggcgaaattg tccctaatgc cgctgctcag 1260
atcaagagat cggtgttgaa cagcaagaac gaaattgtag acgttgagtt gggcgacaag 1320
aactggcaac ctgaagatga tgtttcttca attgtagaat cacagacttt gtcttgtaga 1380
ttgagaactg gtccaatgtt gagcaagagt ggagattctt ctgcttccag ctctgcctca 1440
cctcaaccag aaggtgatgg tacagatttg cacaaggtct accaagactt ggttaaaaag 1500
tttggtgact tgtacactga tggaaagaag caaacctttg agtctttgac cgccagacct 1560
aaccgttgtt actacgtcgg tggtgcttcc aacaacggca gcattatccg caagatgggt 1620
tccatcttgg ctcccgtcaa cggaaactac aaggttgaca ttcctaacgc ctgtgcattg 1680
ggtggtgctt acaaggccag ttggagttac gagtgtgaag ccaagaagga atggatcgga 1740
tacgatcagt atatcaacag attgtttgaa gtaagtgacg agatgaatct gttcgaagtc 1800
aaggataaat ggctcgaata tgccaacggg gttggaatgt tggccaagat ggaaagtgaa 1860
ttgaaacact aa 1872
<210> 54
<211> 680
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TKL1
<400> 54
Met Thr Gln Phe Thr Asp Ile Asp Lys Leu Ala Val Ser Thr Ile Arg
1 5 10 15
Ile Leu Ala Val Asp Thr Val Ser Lys Ala Asn Ser Gly His Pro Gly
20 25 30
Ala Pro Leu Gly Met Ala Pro Ala Ala His Val Leu Trp Ser Gln Met
35 40 45
Arg Met Asn Pro Thr Asn Pro Asp Trp Ile Asn Arg Asp Arg Phe Val
50 55 60
Leu Ser Asn Gly His Ala Val Ala Leu Leu Tyr Ser Met Leu His Leu
65 70 75 80
Thr Gly Tyr Asp Leu Ser Ile Glu Asp Leu Lys Gln Phe Arg Gln Leu
85 90 95
Gly Ser Arg Thr Pro Gly His Pro Glu Phe Glu Leu Pro Gly Val Glu
100 105 110
Val Thr Thr Gly Pro Leu Gly Gln Gly Ile Ser Asn Ala Val Gly Met
115 120 125
Ala Met Ala Gln Ala Asn Leu Ala Ala Thr Tyr Asn Lys Pro Gly Phe
130 135 140
Thr Leu Ser Asp Asn Tyr Thr Tyr Val Phe Leu Gly Asp Gly Cys Leu
145 150 155 160
Gln Glu Gly Ile Ser Ser Glu Ala Ser Ser Leu Ala Gly His Leu Lys
165 170 175
Leu Gly Asn Leu Ile Ala Ile Tyr Asp Asp Asn Lys Ile Thr Ile Asp
180 185 190
Gly Ala Thr Ser Ile Ser Phe Asp Glu Asp Val Ala Lys Arg Tyr Glu
195 200 205
Ala Tyr Gly Trp Glu Val Leu Tyr Val Glu Asn Gly Asn Glu Asp Leu
210 215 220
Ala Gly Ile Ala Lys Ala Ile Ala Gln Ala Lys Leu Ser Lys Asp Lys
225 230 235 240
Pro Thr Leu Ile Lys Met Thr Thr Thr Ile Gly Tyr Gly Ser Leu His
245 250 255
Ala Gly Ser His Ser Val His Gly Ala Pro Leu Lys Ala Asp Asp Val
260 265 270
Lys Gln Leu Lys Ser Lys Phe Gly Phe Asn Pro Asp Lys Ser Phe Val
275 280 285
Val Pro Gln Glu Val Tyr Asp His Tyr Gln Lys Thr Ile Leu Lys Pro
290 295 300
Gly Val Glu Ala Asn Asn Lys Trp Asn Lys Leu Phe Ser Glu Tyr Gln
305 310 315 320
Lys Lys Phe Pro Glu Leu Gly Ala Glu Leu Ala Arg Arg Leu Ser Gly
325 330 335
Gln Leu Pro Ala Asn Trp Glu Ser Lys Leu Pro Thr Tyr Thr Ala Lys
340 345 350
Asp Ser Ala Val Ala Thr Arg Lys Leu Ser Glu Thr Val Leu Glu Asp
355 360 365
Val Tyr Asn Gln Leu Pro Glu Leu Ile Gly Gly Ser Ala Asp Leu Thr
370 375 380
Pro Ser Asn Leu Thr Arg Trp Lys Glu Ala Leu Asp Phe Gln Pro Pro
385 390 395 400
Ser Ser Gly Ser Gly Asn Tyr Ser Gly Arg Tyr Ile Arg Tyr Gly Ile
405 410 415
Arg Glu His Ala Met Gly Ala Ile Met Asn Gly Ile Ser Ala Phe Gly
420 425 430
Ala Asn Tyr Lys Pro Tyr Gly Gly Thr Phe Leu Asn Phe Val Ser Tyr
435 440 445
Ala Ala Gly Ala Val Arg Leu Ser Ala Leu Ser Gly His Pro Val Ile
450 455 460
Trp Val Ala Thr His Asp Ser Ile Gly Val Gly Glu Asp Gly Pro Thr
465 470 475 480
His Gln Pro Ile Glu Thr Leu Ala His Phe Arg Ser Leu Pro Asn Ile
485 490 495
Gln Val Trp Arg Pro Ala Asp Gly Asn Glu Val Ser Ala Ala Tyr Lys
500 505 510
Asn Ser Leu Glu Ser Lys His Thr Pro Ser Ile Ile Ala Leu Ser Arg
515 520 525
Gln Asn Leu Pro Gln Leu Glu Gly Ser Ser Ile Glu Ser Ala Ser Lys
530 535 540
Gly Gly Tyr Val Leu Gln Asp Val Ala Asn Pro Asp Ile Ile Leu Val
545 550 555 560
Ala Thr Gly Ser Glu Val Ser Leu Ser Val Glu Ala Ala Lys Thr Leu
565 570 575
Ala Ala Lys Asn Ile Lys Ala Arg Val Val Ser Leu Pro Asp Phe Phe
580 585 590
Thr Phe Asp Lys Gln Pro Leu Glu Tyr Arg Leu Ser Val Leu Pro Asp
595 600 605
Asn Val Pro Ile Met Ser Val Glu Val Leu Ala Thr Thr Cys Trp Gly
610 615 620
Lys Tyr Ala His Gln Ser Phe Gly Ile Asp Arg Phe Gly Ala Ser Gly
625 630 635 640
Lys Ala Pro Glu Val Phe Lys Phe Phe Gly Phe Thr Pro Glu Gly Val
645 650 655
Ala Glu Arg Ala Gln Lys Thr Ile Ala Phe Tyr Lys Gly Asp Lys Leu
660 665 670
Ile Ser Pro Leu Lys Lys Ala Phe
675 680
<210> 55
<211> 2043
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TKL1 coding gene
<400> 55
atgactcaat tcactgacat tgataagcta gccgtctcca ccataagaat tttggctgtg 60
gacaccgtat ccaaggccaa ctcaggtcac ccaggtgctc cattgggtat ggcaccagct 120
gcacacgttc tatggagtca aatgcgcatg aacccaacca acccagactg gatcaacaga 180
gatagatttg tcttgtctaa cggtcacgcg gtcgctttgt tgtattctat gctacatttg 240
actggttacg atctgtctat tgaagacttg aaacagttca gacagttggg ttccagaaca 300
ccaggtcatc ctgaatttga gttgccaggt gttgaagtta ctaccggtcc attaggtcaa 360
ggtatctcca acgctgttgg tatggccatg gctcaagcta acctggctgc cacttacaac 420
aagccgggct ttaccttgtc tgacaactac acctatgttt tcttgggtga cggttgtttg 480
caagaaggta tttcttcaga agcttcctcc ttggctggtc atttgaaatt gggtaacttg 540
attgccatct acgatgacaa caagatcact atcgatggtg ctaccagtat ctcattcgat 600
gaagatgttg ctaagagata cgaagcctac ggttgggaag ttttgtacgt agaaaatggt 660
aacgaagatc tagccggtat tgccaaggct attgctcaag ctaagttatc caaggacaaa 720
ccaactttga tcaaaatgac cacaaccatt ggttacggtt ccttgcatgc cggctctcac 780
tctgtgcacg gtgccccatt gaaagcagat gatgttaaac aactaaagag caaattcggt 840
ttcaacccag acaagtcctt tgttgttcca caagaagttt acgaccacta ccaaaagaca 900
attttaaagc caggtgtcga agccaacaac aagtggaaca agttgttcag cgaataccaa 960
aagaaattcc cagaattagg tgctgaattg gctagaagat tgagcggcca actacccgca 1020
aattgggaat ctaagttgcc aacttacacc gccaaggact ctgccgtggc cactagaaaa 1080
ttatcagaaa ctgttcttga ggatgtttac aatcaattgc cagagttgat tggtggttct 1140
gccgatttaa caccttctaa cttgaccaga tggaaggaag cccttgactt ccaacctcct 1200
tcttccggtt caggtaacta ctctggtaga tacattaggt acggtattag agaacacgct 1260
atgggtgcca taatgaacgg tatttcagct ttcggtgcca actacaaacc atacggtggt 1320
actttcttga acttcgtttc ttatgctgct ggtgccgtta gattgtccgc tttgtctggc 1380
cacccagtta tttgggttgc tacacatgac tctatcggtg tcggtgaaga tggtccaaca 1440
catcaaccta ttgaaacttt agcacacttc agatccctac caaacattca agtttggaga 1500
ccagctgatg gtaacgaagt ttctgccgcc tacaagaact ctttagaatc caagcatact 1560
ccaagtatca ttgctttgtc cagacaaaac ttgccacaat tggaaggtag ctctattgaa 1620
agcgcttcta agggtggtta cgtactacaa gatgttgcta acccagatat tattttagtg 1680
gctactggtt ccgaagtgtc tttgagtgtt gaagctgcta agactttggc cgcaaagaac 1740
atcaaggctc gtgttgtttc tctaccagat ttcttcactt ttgacaaaca acccctagaa 1800
tacagactat cagtcttacc agacaacgtt ccaatcatgt ctgttgaagt tttggctacc 1860
acatgttggg gcaaatacgc tcatcaatcc ttcggtattg acagatttgg tgcctccggt 1920
aaggcaccag aagtcttcaa gttcttcggt ttcaccccag aaggtgttgc tgaaagagct 1980
caaaagacca ttgcattcta taagggtgac aagctaattt ctcctttgaa aaaagctttc 2040
taa 2043
<210> 56
<211> 743
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Stb5
<400> 56
Met Asp Gly Pro Asn Phe Ala His Gln Gly Gly Arg Ser Gln Arg Thr
1 5 10 15
Thr Glu Leu Tyr Ser Cys Ala Arg Cys Arg Lys Leu Lys Lys Lys Cys
20 25 30
Gly Lys Gln Ile Pro Thr Cys Ala Asn Cys Asp Lys Asn Gly Ala His
35 40 45
Cys Ser Tyr Pro Gly Arg Ala Pro Arg Arg Thr Lys Lys Glu Leu Ala
50 55 60
Asp Ala Met Leu Arg Gly Glu Tyr Val Pro Val Lys Arg Asn Lys Lys
65 70 75 80
Val Gly Lys Ser Pro Leu Ser Thr Lys Ser Met Pro Asn Ser Ser Ser
85 90 95
Pro Leu Ser Ala Asn Gly Ala Ile Thr Pro Gly Phe Ser Pro Tyr Glu
100 105 110
Asn Asp Asp Ala His Lys Met Lys Gln Leu Lys Pro Ser Asp Pro Ile
115 120 125
Asn Leu Val Met Gly Ala Ser Pro Asn Ser Ser Glu Gly Val Ser Ser
130 135 140
Leu Ile Ser Val Leu Thr Ser Leu Asn Asp Asn Ser Asn Pro Ser Ser
145 150 155 160
His Leu Ser Ser Asn Glu Asn Ser Met Ile Pro Ser Arg Ser Leu Pro
165 170 175
Ala Ser Val Gln Gln Ser Ser Thr Thr Ser Ser Phe Gly Gly Tyr Asn
180 185 190
Thr Pro Ser Pro Leu Ile Ser Ser His Val Pro Ala Asn Ala Gln Ala
195 200 205
Val Pro Leu Gln Asn Asn Asn Arg Asn Thr Ser Asn Gly Asp Asn Gly
210 215 220
Ser Asn Val Asn His Asp Asn Asn Asn Gly Ser Thr Asn Thr Pro Gln
225 230 235 240
Leu Ser Leu Thr Pro Tyr Ala Asn Asn Ser Ala Pro Asn Gly Lys Phe
245 250 255
Asp Ser Val Pro Val Asp Ala Ser Ser Ile Glu Phe Glu Thr Met Ser
260 265 270
Cys Cys Phe Lys Gly Gly Arg Thr Thr Ser Trp Val Arg Glu Asp Gly
275 280 285
Ser Phe Lys Ser Ile Asp Arg Ser Leu Leu Asp Arg Phe Ile Ala Ala
290 295 300
Tyr Phe Lys His Asn His Arg Leu Phe Pro Met Ile Asp Lys Ile Ala
305 310 315 320
Phe Leu Asn Asp Ala Ala Thr Ile Thr Asp Phe Glu Arg Leu Tyr Asp
325 330 335
Asn Lys Asn Tyr Pro Asp Ser Phe Val Phe Lys Val Tyr Met Ile Met
340 345 350
Ala Ile Gly Cys Thr Thr Leu Gln Arg Ala Gly Met Val Ser Gln Asp
355 360 365
Glu Glu Cys Leu Ser Glu His Leu Ala Phe Leu Ala Met Lys Lys Phe
370 375 380
Arg Ser Val Ile Ile Leu Gln Asp Ile Glu Thr Val Arg Cys Leu Leu
385 390 395 400
Leu Leu Gly Ile Tyr Ser Phe Phe Glu Pro Lys Gly Ser Ser Ser Trp
405 410 415
Thr Ile Ser Gly Ile Ile Met Arg Leu Thr Ile Gly Leu Gly Leu Asn
420 425 430
Arg Glu Leu Thr Ala Lys Lys Leu Lys Ser Met Ser Ala Leu Glu Ala
435 440 445
Glu Ala Arg Tyr Arg Val Phe Trp Ser Ala Tyr Cys Phe Glu Arg Leu
450 455 460
Val Cys Thr Ser Leu Gly Arg Ile Ser Gly Ile Asp Asp Glu Asp Ile
465 470 475 480
Thr Val Pro Leu Pro Arg Ala Leu Tyr Val Asp Glu Arg Asp Asp Leu
485 490 495
Glu Met Thr Lys Leu Met Ile Ser Leu Arg Lys Met Gly Gly Arg Ile
500 505 510
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530 535 540
Ile Tyr Ser Arg Glu Ser Glu Arg Arg Lys Leu Lys Lys Ser Gln Met
545 550 555 560
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565 570 575
His Ser Ser Glu Ile Trp Leu Ala Met Arg Tyr Ser Gln Leu Gln Ile
580 585 590
Leu Leu Tyr Arg Pro Ser Ala Leu Met Pro Lys Pro Pro Ile Asp Ser
595 600 605
Leu Ser Thr Leu Gly Glu Phe Cys Leu Gln Ala Trp Lys His Thr Tyr
610 615 620
Thr Leu Tyr Lys Lys Arg Leu Leu Pro Leu Asn Trp Ile Thr Leu Phe
625 630 635 640
Arg Thr Leu Thr Ile Cys Asn Thr Ile Leu Tyr Cys Leu Cys Gln Trp
645 650 655
Ser Ile Asp Leu Ile Glu Ser Lys Ile Glu Ile Gln Gln Cys Val Glu
660 665 670
Ile Leu Arg His Phe Gly Glu Arg Trp Ile Phe Ala Met Arg Cys Ala
675 680 685
Asp Val Phe Gln Asn Ile Ser Asn Thr Ile Leu Asp Ile Ser Leu Ser
690 695 700
His Gly Lys Val Pro Asn Met Asp Gln Leu Thr Arg Glu Leu Phe Gly
705 710 715 720
Ala Ser Asp Ser Tyr Gln Asp Ile Leu Asp Glu Asn Asn Val Asp Val
725 730 735
Ser Trp Val Asp Lys Leu Val
740
<210> 57
<211> 2232
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Stb5 gene
<400> 57
atggatggtc ccaattttgc acatcaaggc gggagatcac aacgtactac tgaattgtat 60
tcgtgcgcac gatgcagaaa attaaagaag aagtgtggta aacaaatacc gacatgtgca 120
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atgaaaaaat ttcgtagtgt tataatttta caagatatcg aaactgtacg atgcctattg 1200
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atttggctag caatgagata ctcccagttg caaatcttac tatacagacc atctgcattg 1800
atgccaaaac cgcccattga ctcactatcc actctaggag agttttgctt gcaagcctgg 1860
aaacatactt atacactgta caagaagcgg ttattaccct tgaactggat aacccttttc 1920
agaacattaa ccatttgtaa cactatctta tactgtcttt gccagtggag catcgacctc 1980
attgaaagta aaatcgaaat tcaacagtgt gtggaaatac taagacattt cggtgaaaga 2040
tggatttttg ctatgagatg cgcggatgtt ttccaaaaca ttagcaacac aattctcgat 2100
attagtttaa gccatggtaa agttcctaat atggaccaat taacaagaga gttatttggc 2160
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aaacttgtat ga 2232
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<211> 335
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TAL1
<400> 58
Met Ser Glu Pro Ala Gln Lys Lys Gln Lys Val Ala Asn Asn Ser Leu
1 5 10 15
Glu Gln Leu Lys Ala Ser Gly Thr Val Val Val Ala Asp Thr Gly Asp
20 25 30
Phe Gly Ser Ile Ala Lys Phe Gln Pro Gln Asp Ser Thr Thr Asn Pro
35 40 45
Ser Leu Ile Leu Ala Ala Ala Lys Gln Pro Thr Tyr Ala Lys Leu Ile
50 55 60
Asp Val Ala Val Glu Tyr Gly Lys Lys His Gly Lys Thr Thr Glu Glu
65 70 75 80
Gln Val Glu Asn Ala Val Asp Arg Leu Leu Val Glu Phe Gly Lys Glu
85 90 95
Ile Leu Lys Ile Val Pro Gly Arg Val Ser Thr Glu Val Asp Ala Arg
100 105 110
Leu Ser Phe Asp Thr Gln Ala Thr Ile Glu Lys Ala Arg His Ile Ile
115 120 125
Lys Leu Phe Glu Gln Glu Gly Val Ser Lys Glu Arg Val Leu Ile Lys
130 135 140
Ile Ala Ser Thr Trp Glu Gly Ile Gln Ala Ala Lys Glu Leu Glu Glu
145 150 155 160
Lys Asp Gly Ile His Cys Asn Leu Thr Leu Leu Phe Ser Phe Val Gln
165 170 175
Ala Val Ala Cys Ala Glu Ala Gln Val Thr Leu Ile Ser Pro Phe Val
180 185 190
Gly Arg Ile Leu Asp Trp Tyr Lys Ser Ser Thr Gly Lys Asp Tyr Lys
195 200 205
Gly Glu Ala Asp Pro Gly Val Ile Ser Val Lys Lys Ile Tyr Asn Tyr
210 215 220
Tyr Lys Lys Tyr Gly Tyr Lys Thr Ile Val Met Gly Ala Ser Phe Arg
225 230 235 240
Ser Thr Asp Glu Ile Lys Asn Leu Ala Gly Val Asp Tyr Leu Thr Ile
245 250 255
Ser Pro Ala Leu Leu Asp Lys Leu Met Asn Ser Thr Glu Pro Phe Pro
260 265 270
Arg Val Leu Asp Pro Val Ser Ala Lys Lys Glu Ala Gly Asp Lys Ile
275 280 285
Ser Tyr Ile Ser Asp Glu Ser Lys Phe Arg Phe Asp Leu Asn Glu Asp
290 295 300
Ala Met Ala Thr Glu Lys Leu Ser Glu Gly Ile Arg Lys Phe Ser Ala
305 310 315 320
Asp Ile Val Thr Leu Phe Asp Leu Ile Glu Lys Lys Val Thr Ala
325 330 335
<210> 59
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TAL1 coding gene
<400> 59
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<210> 60
<211> 410
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DDGS
<400> 60
Met Ser Asn Val Gln Ala Ser Phe Glu Ala Thr Glu Ala Glu Phe Arg
1 5 10 15
Val Glu Gly Tyr Glu Lys Ile Glu Phe Ser Leu Val Tyr Val Asn Gly
20 25 30
Ala Phe Asp Ile Ser Asn Arg Glu Ile Ala Asp Ser Tyr Glu Lys Phe
35 40 45
Gly Arg Cys Leu Thr Val Ile Asp Ala Asn Val Asn Arg Leu Tyr Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Val Pro Ile Val Ile Thr Glu Pro Thr Lys Thr Leu Ala Thr Phe Glu
85 90 95
Lys Ile Val Asp Ala Phe Ser Asp Phe Gly Leu Ile Arg Lys Glu Pro
100 105 110
Val Leu Val Val Gly Gly Gly Leu Thr Thr Asp Val Ala Gly Phe Ala
115 120 125
Cys Ala Ala Tyr Arg Arg Lys Ser Asn Tyr Ile Arg Val Pro Thr Thr
130 135 140
Leu Ile Gly Leu Ile Asp Ala Gly Val Ala Ile Lys Val Ala Val Asn
145 150 155 160
His Arg Lys Leu Lys Asn Arg Leu Gly Ala Tyr His Ala Pro Leu Lys
165 170 175
Val Ile Leu Asp Phe Ser Phe Leu Gln Thr Leu Pro Thr Ala Gln Val
180 185 190
Arg Asn Gly Met Ala Glu Leu Val Lys Ile Ala Val Val Ala Asn Ser
195 200 205
Glu Val Phe Glu Leu Leu Tyr Glu Tyr Gly Glu Glu Leu Leu Ser Thr
210 215 220
His Phe Gly Tyr Val Asn Gly Thr Lys Glu Leu Lys Ala Ile Ala His
225 230 235 240
Lys Leu Asn Tyr Glu Ala Ile Lys Thr Met Leu Glu Leu Glu Thr Pro
245 250 255
Asn Leu His Glu Leu Asp Leu Asp Arg Val Ile Ala Tyr Gly His Thr
260 265 270
Trp Ser Pro Thr Leu Glu Leu Ala Pro Met Ile Pro Leu Phe His Gly
275 280 285
His Ala Val Asn Ile Asp Met Ala Leu Ser Ala Thr Ile Ala Ala Arg
290 295 300
Arg Gly Tyr Ile Thr Ser Gly Glu Arg Asp Arg Ile Leu Ser Leu Met
305 310 315 320
Ser Arg Ile Gly Leu Ser Ile Asp His Pro Leu Leu Asp Gly Asp Leu
325 330 335
Leu Trp Tyr Ala Thr Gln Ser Ile Ser Leu Thr Arg Asp Gly Lys Gln
340 345 350
Arg Ala Ala Met Pro Lys Pro Ile Gly Glu Cys Phe Phe Val Asn Asp
355 360 365
Phe Thr Arg Glu Glu Leu Asp Ala Ala Leu Ala Glu His Lys Arg Leu
370 375 380
Cys Ala Thr Tyr Pro Arg Gly Gly Asp Gly Ile Asp Ala Tyr Ile Glu
385 390 395 400
Thr Gln Glu Glu Ser Lys Leu Leu Gly Val
405 410
<210> 61
<211> 1233
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DDGS coding gene
<400> 61
atgagtaatg ttcaagcatc gtttgaagca acggaagctg aattccgcgt ggaaggttac 60
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gttcccattg tgattactga gcctactaaa acccttgcaa cctttgagaa aattgttgat 300
gctttttctg actttggttt aatccgcaag gaaccagtat tagtagtggg tggtggttta 360
accactgatg tagctgggtt tgcgtgtgct gcttaccgtc gtaagagtaa ctatattcgg 420
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catcgcaagt taaaaaatcg cttgggtgca tatcatgctc ctttgaaagt catcctcgat 540
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ttagacctcg atcgcgtcat tgcctacggt cacacttgga gtccgacctt agaattagct 840
ccgatgatac cgttgtttca cggtcatgcc gtcaatatag acatggcttt gtctgcaact 900
attgcggcaa gacgtggcta cattacatca ggagaacgcg atcgcatttt gagcttgatg 960
agtcgtatag gtttatcaat cgatcatcct ctactagatg gcgatttgct ctggtatgct 1020
acccaatcta ttagcttgac gcgagacggg aaacaacgcg cagctatgcc taaacccatt 1080
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actcaagaag aatccaaact attgggagtg tga 1233
<210> 62
<211> 277
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> O-MT
<400> 62
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1 5 10 15
Ser Ile Leu Val Ala Gln Leu Gln Lys Thr Leu Arg Met Ala Glu Glu
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Ser Asn Ile Pro Ser Glu Ile Leu Thr Ser Leu Arg Gln Gly Leu Gln
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Leu Ala Ala Gly Leu Asp Pro Tyr Leu Asp Asp Cys Thr Thr Pro Glu
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Ser Thr Ala Leu Thr Ala Leu Ala Gln Lys Thr Ser Ile Glu Asp Trp
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Ser Lys Arg Phe Ser Asp Gly Glu Thr Val Arg Gln Leu Glu Gln Glu
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Met Leu Ser Gly His Leu Glu Gly Gln Thr Leu Lys Met Phe Val His
100 105 110
Ile Thr Lys Ala Lys Ser Ile Leu Glu Val Gly Met Phe Thr Gly Tyr
115 120 125
Ser Ala Leu Ala Met Ala Glu Ala Leu Pro Asp Asp Gly Arg Leu Ile
130 135 140
Ala Cys Glu Val Asp Ser Tyr Val Ala Glu Phe Ala Gln Thr Cys Phe
145 150 155 160
Gln Glu Ser Pro His Gly Arg Lys Ile Val Val Glu Val Ala Pro Ala
165 170 175
Leu Glu Thr Leu His Lys Leu Val Ala Lys Lys Glu Ser Phe Asp Leu
180 185 190
Ile Phe Ile Asp Ala Asp Lys Lys Glu Tyr Ile Glu Tyr Phe Gln Ile
195 200 205
Ile Leu Asp Ser His Leu Leu Ala Pro Asp Gly Leu Ile Cys Val Asp
210 215 220
Asn Thr Leu Leu Gln Gly Gln Val Tyr Leu Pro Ser Glu Gln Arg Thr
225 230 235 240
Ala Asn Gly Glu Ala Ile Ala Gln Phe Asn Arg Ile Val Ala Ala Asp
245 250 255
Pro Arg Val Glu Gln Val Leu Leu Pro Ile Arg Asp Gly Ile Thr Leu
260 265 270
Ile Arg Arg Leu Val
275
<210> 63
<211> 834
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> O-MT coding gene
<400> 63
atgaccagta ttttaggacg agataccgca agaccaataa cgccacatag cattctggta 60
gcacagctac aaaaaaccct cagaatggca gaggaaagta atattccttc agagatactg 120
acttctctgc gccaagggtt gcaattagca gcaggtttag atccctatct ggatgattgc 180
actacccctg aatcgaccgc attgacagca ctagcgcaga agacaagcat tgaagactgg 240
agtaaacgct tcagtgatgg tgaaacagtg cgtcaattag agcaagaaat gctctcagga 300
catcttgaag gacaaacact aaagatgttt gtgcatatca ctaaggctaa aagcatccta 360
gaagtgggaa tgttcacagg atattcagct ttggcaatgg cagaggcgtt accagatgat 420
gggcgactga ttgcttgtga agtagactcc tatgtggccg agtttgctca aacttgcttt 480
caagagtctc cccacggccg caagattgtt gtagaagtgg cacctgcact agagacgctg 540
cacaagctgg tggctaaaaa agaatccttt gatctgatct tcattgatgc ggataaaaag 600
gagtatatag aatacttcca aattatcttg gatagccatt tactagctcc cgacggatta 660
atctgtgtag ataatacttt gttgcaagga caagtttacc tgccatcaga acagcgtaca 720
gccaatggtg aagcgatcgc tcaattcaac cgcattgtcg ccgcagatcc tcgtgtagag 780
caagttctgt tacccatacg agatggtata accctgatta gacgcttggt ataa 834
<210> 64
<211> 467
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATP-grasp ligase
<400> 64
Met Ala Gln Ser Ile Ser Leu Ser Leu Pro Gln Ser Thr Thr Pro Ser
1 5 10 15
Lys Gly Val Arg Leu Lys Ile Ala Ala Leu Leu Lys Thr Ile Gly Thr
20 25 30
Leu Ile Leu Leu Leu Ile Ala Leu Pro Leu Asn Ala Leu Ile Val Leu
35 40 45
Ile Ser Leu Met Cys Arg Pro Phe Thr Lys Lys Pro Ala Val Ala Thr
50 55 60
His Pro Gln Asn Ile Leu Val Ser Gly Gly Lys Met Thr Lys Ala Leu
65 70 75 80
Gln Leu Ala Arg Ser Phe His Ala Ala Gly His Arg Val Ile Leu Ile
85 90 95
Glu Gly His Lys Tyr Trp Leu Ser Gly His Arg Phe Ser Asn Ser Val
100 105 110
Ser Arg Phe Tyr Thr Val Pro Ala Pro Gln Asp Asp Pro Glu Gly Tyr
115 120 125
Thr Gln Ala Leu Leu Glu Ile Val Lys Arg Glu Lys Ile Asp Val Tyr
130 135 140
Val Pro Val Cys Ser Pro Val Ala Ser Tyr Tyr Asp Ser Leu Ala Lys
145 150 155 160
Ser Ala Leu Ser Glu Tyr Cys Glu Val Phe His Phe Asp Ala Asp Ile
165 170 175
Thr Lys Met Leu Asp Asp Lys Phe Ala Phe Thr Asp Arg Ala Arg Ser
180 185 190
Leu Gly Leu Ser Ala Pro Lys Ser Phe Lys Ile Thr Asp Pro Glu Gln
195 200 205
Val Ile Asn Phe Asp Phe Ser Lys Glu Thr Arg Lys Tyr Ile Leu Lys
210 215 220
Ser Ile Ser Tyr Asp Ser Val Arg Arg Leu Asn Leu Thr Lys Leu Pro
225 230 235 240
Cys Asp Thr Pro Glu Glu Thr Ala Ala Phe Val Lys Ser Leu Pro Ile
245 250 255
Ser Pro Glu Lys Pro Trp Ile Met Gln Glu Phe Ile Pro Gly Lys Glu
260 265 270
Leu Cys Thr His Ser Thr Val Arg Asp Gly Glu Leu Arg Leu His Cys
275 280 285
Cys Ser Asn Ser Ser Ala Phe Gln Ile Asn Tyr Glu Asn Val Glu Asn
290 295 300
Pro Gln Ile Gln Glu Trp Val Gln His Phe Val Lys Ser Leu Arg Leu
305 310 315 320
Thr Gly Gln Ile Ser Leu Asp Phe Ile Gln Ala Glu Asp Gly Thr Ala
325 330 335
Tyr Ala Ile Glu Cys Asn Pro Arg Thr His Ser Ala Ile Thr Met Phe
340 345 350
Tyr Asn His Pro Gly Val Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Lys Thr Pro Leu
355 360 365
Ala Ala Pro Leu Glu Pro Leu Ala Asp Ser Lys Pro Thr Tyr Trp Ile
370 375 380
Tyr His Glu Ile Trp Arg Leu Thr Gly Ile Arg Ser Gly Gln Gln Leu
385 390 395 400
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Leu Leu Leu Leu Gln Asn Leu Gln Arg Leu Lys Gly Trp Val Lys Ile
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Asp Phe Asn Ile Gly Lys Leu Val Glu Leu Gly Gly Asp Tyr Ser Arg
450 455 460
Ser Glu Glu
465
<210> 65
<211> 1404
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ATP-grasp ligase coding gene
<400> 65
atggcacaat caatctcttt atctcttcct caatccacaa cgccatcaaa gggtgtgagg 60
ctaaaaatag cagctctact gaagactatc gggactctaa tactactgct gatagccttg 120
ccgcttaatg ctttgatagt attgatatct ctgatgtgta ggccgtttac aaaaaaacct 180
gccgtagcca ctcatcccca gaatatcttg gtcagtggcg gcaaaatgac caaagcattg 240
caacttgccc gctccttcca tgcagccgga cacagagtta ttctgattga aggtcataaa 300
tactggttat cagggcatag attctcaaat tctgtgagtc gtttttatac agttcctgca 360
ccacaagacg acccagaagg ctatacccaa gcgctattgg aaattgtcaa acgagagaag 420
attgacgttt atgtacccgt atgcagccct gtagctagtt attacgactc tttggcaaag 480
tctgcactat cagaatattg tgaggttttt cactttgatg ctgatataac caagatgctg 540
gatgataaat ttgcctttac cgatcgggcg cgatcgcttg gtttatcagc cccgaaatct 600
tttaaaatta ccgatcctga acaagttatc aacttcgatt ttagtaaaga gacgcgcaaa 660
tatattctta agagtatttc ttacgactca gttcgccgct taaatttaac caaacttcct 720
tgtgataccc cagaagagac agcagcgttt gtcaagagtt tacccatcag cccagaaaaa 780
ccttggatta tgcaagaatt tattcctggg aaagaattat gcacccatag cacagtccga 840
gacggcgaat taaggttgca ttgctgttca aattcttcag cgtttcagat taactatgaa 900
aatgtcgaaa atccccaaat tcaagaatgg gtacaacatt tcgtcaaaag tttacggctg 960
actggacaaa tatctcttga ctttatccaa gctgaagatg gtacagctta tgccattgaa 1020
tgtaatcctc gcacccattc ggcgatcaca atgttctaca atcacccagg tgttgcagaa 1080
gcctatcttg gtaaaactcc tctagctgca cctttggaac ctcttgcaga tagcaagccc 1140
acttactgga tatatcacga aatctggcga ttgactggga ttcgctctgg acaacaatta 1200
caaacttggt ttgggagatt agtcagaggt acagatgcca tttatcgcct ggacgatccg 1260
ataccatttt taactttgca ccattggcag attactttac ttttgctaca aaatttgcaa 1320
cgactcaaag gttgggtaaa gatcgatttt aatatcggta aactcgtgga attagggggc 1380
gactactcga ggtctgaaga atga 1404
<210> 66
<211> 348
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> D-ala-D-ala ligase
<400> 66
Met Pro Val Leu Asn Ile Leu His Leu Val Gly Ser Ala His Asp Lys
1 5 10 15
Phe Tyr Cys Asp Leu Ser Arg Leu Tyr Ala Gln Asp Cys Leu Ala Ala
20 25 30
Thr Ala Asp Pro Ser Leu Tyr Asn Phe Gln Ile Ala Tyr Ile Thr Pro
35 40 45
Asp Arg Gln Trp Arg Phe Pro Asp Ser Leu Ser Arg Glu Asp Ile Ala
50 55 60
Leu Thr Lys Pro Ile Pro Val Phe Asp Ala Ile Gln Phe Leu Thr Gly
65 70 75 80
Gln Asn Ile Asp Met Met Leu Pro Gln Met Phe Cys Ile Pro Gly Met
85 90 95
Thr Gln Tyr Arg Ala Leu Phe Asp Leu Leu Lys Ile Pro Tyr Ile Gly
100 105 110
Asn Thr Pro Asp Ile Met Ala Ile Ala Ala His Lys Ala Arg Ala Lys
115 120 125
Ala Ile Val Glu Ala Ala Gly Val Lys Val Pro Arg Gly Glu Leu Leu
130 135 140
Arg Gln Gly Asp Ile Pro Thr Ile Thr Pro Pro Ala Val Val Lys Pro
145 150 155 160
Val Ser Ser Asp Asn Ser Leu Gly Val Val Leu Val Lys Asp Val Thr
165 170 175
Glu Tyr Asp Ala Ala Leu Lys Lys Ala Phe Glu Tyr Ala Ser Glu Val
180 185 190
Ile Val Glu Ala Phe Ile Glu Leu Gly Arg Glu Val Arg Cys Gly Ile
195 200 205
Ile Val Lys Asp Gly Glu Leu Ile Gly Leu Pro Leu Glu Glu Tyr Leu
210 215 220
Val Asp Pro His Asp Lys Pro Ile Arg Asn Tyr Ala Asp Lys Leu Gln
225 230 235 240
Gln Thr Asp Asp Gly Asp Leu His Leu Thr Ala Lys Asp Asn Ile Lys
245 250 255
Ala Trp Ile Leu Asp Pro Asn Asp Pro Ile Thr Gln Lys Val Gln Gln
260 265 270
Val Ala Lys Arg Cys His Gln Ala Leu Gly Cys Arg His Tyr Ser Leu
275 280 285
Phe Asp Phe Arg Ile Asp Pro Lys Gly Gln Pro Trp Phe Leu Glu Ala
290 295 300
Gly Leu Tyr Cys Ser Phe Ala Pro Lys Ser Val Ile Ser Ser Met Ala
305 310 315 320
Lys Ala Ala Gly Ile Pro Leu Asn Asp Leu Leu Ile Thr Ala Ile Asn
325 330 335
Glu Thr Leu Gly Ser Asn Lys Lys Val Leu Gln Asn
340 345
<210> 67
<211> 1047
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> D-ala-D-ala ligase coding gene
<400> 67
atgccagtac ttaatatcct tcatttagtt gggtctgcac acgataagtt ttactgtgat 60
ttatcacgtc tttatgccca agactgttta gctgcaacag cagatccatc gctttataac 120
tttcaaattg catatatcac acccgatcgg cagtggcgat ttcctgactc tctcagtcga 180
gaagatattg ctcttaccaa accgattcct gtgtttgatg ccatacaatt tctaacaggc 240
caaaacattg acatgatgtt accacaaatg ttttgtattc ctggaatgac tcagtaccgt 300
gccctattcg atctgctcaa gatcccttat ataggaaata ccccagatat tatggcgatc 360
gcggcccaca aagccagagc caaagcaatt gtcgaagcag caggggtaaa agtgcctcgt 420
ggagaattgc ttcgccaagg agatattcca acaattacac ctccagcagt cgtcaaacct 480
gtaagttctg acaactcttt aggagtagtc ttagttaaag atgtgactga atatgatgct 540
gccttaaaga aagcatttga atatgcttcg gaggtcatcg tagaagcatt catcgaactt 600
ggtcgagaag tcagatgcgg catcattgta aaagacggtg agctaatagg tttacccctt 660
gaagagtatc tggtagaccc acacgataaa cctatccgta actatgctga taaactccaa 720
caaactgacg atggcgactt gcatttgact gctaaagata atatcaaggc ttggatttta 780
gaccctaacg acccaatcac ccaaaaggtt cagcaagtgg ctaaaaggtg tcatcaggct 840
ttgggttgtc gccactacag tttatttgac ttccgaatcg atccaaaggg acaaccttgg 900
ttcttagaag ctggattata ttgttctttt gcccccaaaa gtgtgatttc ttctatggcg 960
aaagcagccg gaatccctct aaatgattta ttaataaccg ctattaatga aacattgggt 1020
agtaataaaa aggtgttaca aaattga 1047
<210> 68
<211> 888
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NRPS
<400> 68
Met Gln Thr Ile Asp Phe Asn Ile Arg Lys Leu Leu Val Glu Trp Asn
1 5 10 15
Ala Thr His Arg Asp Tyr Asp Leu Ser Gln Ser Leu His Glu Leu Ile
20 25 30
Val Ala Gln Val Glu Arg Thr Pro Glu Ala Ile Ala Val Thr Phe Asp
35 40 45
Lys Gln Gln Leu Thr Tyr Gln Glu Leu Asn His Lys Ala Asn Gln Leu
50 55 60
Gly His Tyr Leu Gln Thr Leu Gly Val Gln Pro Glu Thr Leu Val Gly
65 70 75 80
Val Cys Leu Glu Arg Ser Leu Glu Met Val Ile Cys Leu Leu Gly Ile
85 90 95
Leu Lys Ala Gly Gly Ala Tyr Val Pro Ile Asp Pro Glu Tyr Pro Gln
100 105 110
Glu Arg Ile Ala Tyr Met Leu Glu Asp Ser Gln Val Lys Val Leu Leu
115 120 125
Thr Gln Glu Lys Leu Leu Asn Gln Ile Pro His His Gln Ala Gln Thr
130 135 140
Ile Cys Val Asp Arg Glu Trp Glu Lys Ile Ser Thr Gln Ala Asn Thr
145 150 155 160
Asn Pro Lys Ser Asn Ile Lys Thr Asp Asn Leu Ala Tyr Val Ile Tyr
165 170 175
Thr Ser Gly Ser Thr Gly Lys Pro Lys Gly Ala Met Asn Thr His Lys
180 185 190
Gly Ile Cys Asn Arg Leu Leu Trp Met Gln Glu Ala Tyr Gln Ile Asp
195 200 205
Ser Thr Asp Ser Ile Leu Gln Lys Thr Pro Phe Ser Phe Asp Val Ser
210 215 220
Val Trp Glu Phe Phe Trp Thr Leu Leu Thr Gly Ala Arg Leu Val Ile
225 230 235 240
Ala Lys Pro Gly Gly His Lys Asp Ser Ala Tyr Leu Ile Asp Leu Ile
245 250 255
Thr Gln Glu Gln Ile Thr Thr Leu His Phe Val Pro Ser Met Leu Gln
260 265 270
Val Phe Leu Gln Asn Arg His Val Ser Lys Cys Ser Ser Leu Lys Arg
275 280 285
Val Ile Cys Ser Gly Glu Ala Leu Ser Ile Asp Leu Gln Asn Arg Phe
290 295 300
Phe Gln His Leu Gln Cys Glu Leu His Asn Leu Tyr Gly Pro Thr Glu
305 310 315 320
Ala Ala Ile Asp Val Thr Phe Trp Gln Cys Arg Lys Asp Ser Asn Leu
325 330 335
Lys Ser Val Pro Ile Gly Arg Pro Ile Ala Asn Thr Gln Ile Tyr Ile
340 345 350
Leu Asp Ala Asp Leu Gln Pro Val Asn Ile Gly Val Thr Gly Glu Ile
355 360 365
Tyr Ile Gly Gly Val Gly Val Ala Arg Gly Tyr Leu Asn Lys Glu Glu
370 375 380
Leu Thr Lys Glu Lys Phe Ile Ile Asn Pro Phe Pro Asn Ser Glu Phe
385 390 395 400
Lys Arg Leu Tyr Lys Thr Gly Asp Leu Ala Arg Tyr Leu Pro Asp Gly
405 410 415
Asn Ile Glu Tyr Leu Gly Arg Thr Asp Tyr Gln Val Lys Ile Arg Gly
420 425 430
Tyr Arg Ile Glu Ile Gly Glu Ile Glu Asn Val Leu Ser Ser His Pro
435 440 445
Gln Val Arg Glu Ala Val Val Ile Ala Arg Asp Asp Asn Ala Gln Glu
450 455 460
Lys Gln Ile Ile Ala Tyr Ile Thr Tyr Asn Ser Ile Lys Pro Gln Leu
465 470 475 480
Asp Asn Leu Arg Asp Phe Leu Lys Ala Arg Leu Pro Asp Phe Met Ile
485 490 495
Pro Ala Ala Phe Val Met Leu Glu His Leu Pro Leu Thr Pro Ser Gly
500 505 510
Lys Val Asp Arg Lys Ala Leu Pro Lys Pro Asp Leu Phe Asn Tyr Ser
515 520 525
Glu His Asn Ser Tyr Val Ala Pro Arg Asn Glu Val Glu Glu Lys Leu
530 535 540
Val Gln Ile Trp Ser Asn Ile Leu His Leu Pro Lys Val Gly Val Thr
545 550 555 560
Glu Asn Phe Phe Ala Ile Gly Gly Asn Ser Leu Lys Ala Leu His Leu
565 570 575
Ile Ser Gln Ile Glu Glu Leu Phe Ala Lys Glu Ile Ser Leu Ala Thr
580 585 590
Leu Leu Thr Asn Pro Val Ile Ala Asp Leu Ala Lys Val Ile Gln Ala
595 600 605
Asn Asn Gln Ile His Asn Ser Pro Leu Val Pro Ile Gln Pro Gln Gly
610 615 620
Lys Gln Gln Pro Phe Phe Cys Ile His Pro Ala Gly Gly His Val Leu
625 630 635 640
Cys Tyr Phe Lys Leu Ala Gln Tyr Ile Gly Thr Asp Gln Pro Phe Tyr
645 650 655
Gly Leu Gln Ala Gln Gly Phe Tyr Gly Asp Glu Ala Pro Leu Thr Arg
660 665 670
Val Glu Asp Met Ala Ser Leu Tyr Val Lys Thr Ile Arg Glu Phe Gln
675 680 685
Pro Gln Gly Pro Tyr Arg Val Gly Gly Trp Ser Phe Gly Gly Val Val
690 695 700
Ala Tyr Glu Val Ala Gln Gln Leu His Arg Gln Gly Gln Glu Val Ser
705 710 715 720
Leu Leu Ala Ile Leu Asp Ser Tyr Val Pro Ile Leu Leu Asp Lys Gln
725 730 735
Lys Pro Ile Asp Asp Val Tyr Leu Val Gly Val Leu Ser Arg Val Phe
740 745 750
Gly Gly Met Phe Gly Gln Asp Asn Leu Val Thr Pro Glu Glu Ile Glu
755 760 765
Asn Leu Thr Val Glu Glu Lys Ile Asn Tyr Ile Ile Asp Lys Ala Arg
770 775 780
Ser Ala Arg Ile Phe Pro Pro Gly Val Glu Arg Gln Asn Asn Arg Arg
785 790 795 800
Ile Leu Asp Val Leu Val Gly Thr Leu Lys Ala Thr Tyr Ser Tyr Ile
805 810 815
Arg Gln Pro Tyr Pro Gly Lys Val Thr Val Phe Arg Ala Arg Glu Lys
820 825 830
His Ile Met Ala Pro Asp Pro Thr Leu Val Trp Val Glu Leu Phe Ser
835 840 845
Val Met Ala Ala Gln Glu Ile Lys Ile Ile Asp Val Pro Gly Asn His
850 855 860
Tyr Ser Phe Val Leu Glu Pro His Val Gln Val Leu Ala Gln Arg Leu
865 870 875 880
Gln Asp Cys Leu Glu Asn Asn Ser
885
<210> 69
<211> 2667
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NRPS coding gene
<400> 69
atgcagacta tagattttaa tattcgtaag ttacttgtag agtggaacgc gacccacaga 60
gattatgatc tttcccagag tttacatgaa ctaattgtag ctcaagtaga acgaacacct 120
gaggcgatcg ctgtcacctt tgacaagcaa caactaactt atcaagaact aaatcataaa 180
gcaaaccagc taggacatta tttacaaaca ttaggagtcc agccagaaac cctggtaggc 240
gtttgtttag aacgttcctt agaaatggtt atctgtcttt taggaatcct caaagctggg 300
ggtgcttatg ttcctattga ccctgaatat cctcaagaac gcatagctta tatgctagaa 360
gattctcagg tgaaggtact actaactcaa gaaaaattac tcaatcaaat tccccaccat 420
caagcacaaa ctatctgtgt agatagggaa tgggagaaaa tttccacaca agctaatacc 480
aatcccaaaa gtaatataaa aacggataat cttgcttatg taatttacac ctctggttcc 540
actggtaaac caaaaggtgc aatgaacacc cacaaaggta tctgtaatcg cttattgtgg 600
atgcaggaag cttatcaaat cgattccaca gatagcattt tacaaaaaac cccctttagt 660
tttgatgttt ccgtttggga gttcttttgg actttattaa ctggcgcacg tttggtaata 720
gccaaaccag gcggacataa agatagtgct tacctcatcg atttaattac tcaagaacaa 780
atcactacgt tgcattttgt cccctcaatg ctgcaagtgt ttttacaaaa tcgccatgta 840
agcaaatgca gctctctaaa aagagttatt tgtagcggtg aagctttatc tatagattta 900
caaaatagat ttttccagca tttgcaatgt gaattacata acctctatgg cccgacagaa 960
gcagcaattg atgtcacatt ttggcaatgt agaaaagata gtaatttaaa gagtgtacct 1020
attggtcgtc ccattgctaa tactcaaatt tatattcttg atgccgattt acaaccagta 1080
aatattggtg tcactggtga aatttatatt ggtggtgtag gggttgctcg tggttatttg 1140
aataaagaag aattgaccaa agaaaaattt attattaatc cctttcccaa ttctgagttt 1200
aagcgacttt ataaaacagg tgatttagct cgttatttac ccgatggaaa tattgaatat 1260
cttggtagaa cagattatca agtaaaaatt cggggttata gaattgaaat tggcgagatt 1320
gaaaatgttt tatcttcaca cccacaagtc agagaagctg tagtcatagc gcgggatgat 1380
aacgctcaag aaaaacaaat catcgcttat attacctata actccatcaa acctcagctt 1440
gataatctgc gtgatttcct aaaagcaagg ctacctgatt ttatgattcc agccgctttt 1500
gtgatgctgg agcatcttcc tttaactccc agtggtaaag tagaccgtaa ggcattacct 1560
aagcctgatt tatttaatta tagtgaacat aattcctatg tagcgcctcg gaatgaagtt 1620
gaagaaaaat tagtacaaat ctggtcgaat attctgcatt tacctaaagt aggtgtgaca 1680
gaaaactttt tcgctattgg tggtaattcc ctcaaagctc tacatttaat ttctcaaatt 1740
gaagagttat ttgctaaaga gatatcctta gcaacacttt taacaaatcc agtaattgca 1800
gatttagcca aggttattca agcaaacaac caaatccata attcacccct agttccaatt 1860
caaccacaag gtaagcagca gcctttcttt tgtatacatc ctgctggtgg tcatgtttta 1920
tgctatttta aactcgcaca atatatagga actgaccaac cattttatgg cttacaagct 1980
caaggatttt atggagatga agcacccttg acgcgagttg aagatatggc tagtctctac 2040
gtcaaaacta ttagagaatt tcaaccccaa gggccttatc gtgtcggggg gtggtcattt 2100
ggtggagtcg tagcttatga agtagcacag cagttacata gacaaggaca agaagtatct 2160
ttactagcaa tattagattc ttacgtaccg attctgctgg ataaacaaaa acccattgat 2220
gacgtttatt tagttggtgt tctctccaga gtttttggcg gtatgtttgg tcaagataat 2280
ctagtcacac ctgaagaaat agaaaattta actgtagaag aaaaaattaa ttacatcatt 2340
gataaagcac ggagcgctag aatattcccg cctggtgtag aacgtcaaaa taatcgccgt 2400
attcttgatg ttttggtggg aactttaaaa gcaacttatt cctatataag acaaccatat 2460
ccaggaaaag tcactgtatt tcgagccagg gaaaaacata ttatggctcc tgacccgacc 2520
ttagtttggg tagaattatt ttctgtaatg gcggctcaag aaattaagat tattgatgtc 2580
cctggaaacc attattcgtt tgttctagaa ccccatgtac aggttttagc acagcgttta 2640
caagattgtc tggaaaataa ttcataa 2667
Claims (13)
- (a) 자일로오스 동화 효소; 및
(b) 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 효소
를 포함하고,
상기 자일로오스 동화 효소는 피키아 스티피티스(Pichia stipitis) 유래의 자일로오스 리덕타아제(xylose reductase; XR), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis) 유래의 자일리톨 디하이드로게나아제(xylitol dehydrogenase; XDH), 및 피키아 스티피티스(Pichia stipitis) 유래의 자일룰로키나아제 (XK)를 포함하고,
상기 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 효소는
2-디메틸 4-데옥시가두솔 합성 효소(DDGS),
O-메틸 전이 효소(O-MT),
C-N 리가아제, ATP-grasp 리가아제, 또는 이들의 조합, 및
비리보좀 펩타이드 합성효소(non-ribosomal peptide synthetase), 비리보좀 펩타이드 합성효소 유사 효소(non-ribosomal peptide synthetase-like enzyme: NRPS-like enzyme), D-알라닌 D-알라닌 리가아제, 또는 이들의 조합
으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하고,
상기 자일로오스 동화 효소, 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 효소, 또는 이들 모두는 외래 단백질이고,
자일로오스로부터 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는,
미생물. - 제1항에 있어서,
상기 자일로오스 동화 효소는 자일로오스 이소머라아제(xylose isomerase; XI)를 추가로 포함하는 것인, 미생물. - 제2항에 있어서,
상기 자일로오스 이소머라아제는 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 파라부르크홀데리아 사카리(Paraburkholderia sacchari), 악티노마이세스 올리보시네레우스(Actinomyces olivocinereus), 악티노플라네스 미소우리엔시스(Actinoplanes missouriensis), 아에로박터 레바니쿰(Aerobacter levanicum), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 속(Bacillus sp.), 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis), 박테로이데스 레타이오타오미크론(Bacteroides thetaiotaomicron), 클로스트리움 셀룰로보란스(Clostridium cellulovorans), 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스(Clostridium phytofermentans), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 오르피노마이세스 속(Orpinomyces sp.), 피로마이세스 속(Piromyces sp.), 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophiles), 및 비브리오 속(Vibrio sp.)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래하는 것인, 미생물. - 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 오탄당인산경로가 강화된 것인, 미생물.
- 제4항에 있어서,
상기 오탄당인산경로의 강화는,
오탄당인산경로에서 세도헵툴로스 7-포스페이트를 생성하는 트랜스케톨라아제 활성 증가,
NADPH 생성을 조절하는 단백질 활성 증가, 및
세도헵툴로스 7-포스페이트 및 글리세르알데하이드 3-포스페이트 간의 전환 반응에 관여하는 트랜스알돌라아제(transaldolase) 활성 감소
중에서 선택된 하나 이상으로 달성되는 것인,
미생물. - 제5항에 있어서,
상기 오탄당인산경로의 강화는 세도헵툴로스 7-포스페이트 및 글리세르알데하이드 3-포스페이트 간의 전환 반응에 관여하는 트랜스알돌라아제(transaldolase)를 암호화하는 유전자의 결실에 의한 것인,
미생물. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 효모, 코리네박테리움 속 미생물, 또는 에스케리키아 속 미생물인, 미생물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 자일로오스로부터 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는데 사용하기 위한, 미생물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 미생물을 포함하는, 마이코스포린 유사 아미노산 생산용 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 미생물은 효모, 코리네박테리움 속 미생물, 또는 에스케리키아 속 미생물인, 마이코스포린 유사 아미노산 생산용 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 미생물은 자일로오스로부터 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 것인, 마이코스포린 유사 아미노산 생산용 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 마이코스포린 유사 아미노산은 마이코스포린-2-글라이신 (Mycosporine-2-glycine), 팰라이티놀 (Palythinol), 팰라이텐산 (Palythenic acid), 데옥시가두솔(deoxygadusol), 마이코스포린-메틸아민-트레오닌 (Mycosporine-methylaminethreonine), 마이코스포린-글라이신-발린 (Mycosporine-glycine-valine), 팰라이틴(Palythine), 아스테리나-330 (Asterina-330), 시노린(Shinorine), 포르피라-334(Porphyra-334), 유하로테스-362(Euhalothece-362), 마이코스포린-글라이신(Mycosporine-glycine), 마이코스포린-오르니틴 (Mycosporine-ornithine), 마이코스포린-라이신 (Mycosporine-lysine), 마이코스포린-글루탐산-글라이신(Mycosporine-glutamic acid-glycine), 마이코스포린-메틸아민-세린(Mycosporine-methylamine-serine), 마이코스포린-타우린(Mycosporine-taurine), 팰라이텐(Palythene), 팰라이텐-세린(Palythine-serine), 팰라이텐-세린-설페이트(Palythine-serine-sulfate), 팰라이티놀(Palythinol), 및 우수지렌(Usujirene)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 마이코스포린 유사 아미노산 생산용 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 미생물을 자일로오스를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 마이코스포린 유사 아미노산 생산 방법.
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