JP6249391B2 - キシロースを高温で発酵する方法 - Google Patents
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Classifications
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Landscapes
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Description
本明細書において、必要に応じて、以下の略語を用いる。
S. cerevisiae: Saccharomyces cerevisiae
C. : Candida
C. glabrata: Candida glabrata
XR: キシロースレダクターゼ(Xylose Reductase)
XDH: キシリトールデヒドロゲナーゼ(Xylitol Dehydrogenase)
XK: キシルロキナーゼ(Xylulokinase)
PGK1p: Phoshoglycerate kinase 1遺伝子プロモーター
CYC1t: Iso−1−cytochrome c遺伝子ターミネーター
PCR: ポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase Chain Reaction)
HPLC: 高速液体クロマトグラフィー
U: Unit(単位)
以下に本明細書において用いられる各用語の意味を説明する。各用語は本明細書中、統一した意味で使用し、単独で用いられる場合も、または他の用語と組み合わされて用いられる場合も、同一の意味で用いられる。
fragilis、またはHansenula polymorphaなどが挙げられ、以下の微生物学的特徴を有する菌株をいう。
・糖を代謝しエタノール発酵を行うものであること。
・好ましくは、糖が代謝される際に、乳酸発酵よりもエタノール発酵が優先されるものであること。
cerevisiae由来のキシルロキナーゼ遺伝子を導入することができる。別の実施形態では、他の生物種由来の遺伝子であっても、機能的に発現すれば同様の効果があると考えられることから、同様に導入することができる。必要に応じて、単にキシルロキナーゼ遺伝子だけではなく、酵母細胞内で発現に必要なプロモーターも付加することにより発現を増強することができる。従って、キシルロキナーゼについて、高発現は、好ましい実施形態では、同種または異種のキシルロキナーゼが、酵母細胞内で発現するように遺伝子組換えにより導入されたものということができる。
本発明の好ましい実施形態を、以下に掲げる。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
1つの局面において、本発明は、高キシロース同時異性化発酵収率酵母を提供する。特に、本発明は、キシルロキナーゼを組換え導入しおよび/またはアルドースレダクターゼを欠損させた酵母であって、該酵母の40℃におけるキシロース同時異性化発酵収率が少なくとも25%である、酵母を提供する。好ましくは、本発明の酵母は、キシルロキナーゼを高発現させ、かつ、アルドースレダクターゼを欠損させたものである。リグノセルロースからエタノールを生産するためには、リグノセルロースを化学的あるいは酵素的に分解し酵母が利用できる糖を生成することが必要である。酵素糖化法は、化学的な糖化法と比べ、穏和な圧力・温度で糖化できること、硫酸等の化学薬品を大量に使用する必要が無く環境負荷が低いこと、生成糖の過分解が起こらず収率が高いなどの利点がある。さらに酵素による糖化反応と酵母等の微生物による発酵を同時に行う並行複発酵は、生成糖による酵素反応の阻害(生成物阻害)の問題を回避できることから、糖化効率の向上が期待され、リグノセルロースからエタノールを生産するための優れた方法の1つと考えられる。しかしながら、糖化酵素の反応に最適な温度(50℃程度)と酵母の発酵に最適な温度(30℃程度)の間の差が大きいことが課題であり、両者の温度差を少なくすることが、並行複発酵の効率化に重要であると考えられる。したがって、40℃以上でのキシロース同時異性化発酵収率が高いことは本発明にとって極めて重要である。
別の局面において、本発明は、キシロースおよび/またはキシロースを含む糖からエタノールを生産する方法であって、該方法は、該キシロースおよび/またはキシロースを含む糖を含む原料に、本発明の酵母を接触させる工程を包含する、方法を提供する。ここで使用されうる酵母としては、本発明の酵母であればどのようなものを用いてもよく、上記(高キシロース同時異性化発酵収率酵母)の項目において例示される任意の実施形態を使用することができることが理解される。
1つの局面において、本発明は、Candida glabrataに相同組換えを起こして相同組換えCandida glabrataを生産する方法であって、該方法は、相同組換えの対象となる遺伝子の約45%以上の長さの相同部分を両端に有する相同組換え用遺伝子構築物と、Candida glabrataとを、相同組換えを起こす条件下に供する工程を包含する、方法を提供する。
約1400株の酵母株から、キシルロース資化能に基づいて一次スクリーニングを行い、キシルロース資化能の高い株を選抜し、さらにこれらのキシルロース資化株よりキシルロース発酵能の高い株を二次スクリーニングにより選抜した。得られたキシルロース高発酵酵母株について、高温耐性やエタノール耐性を確認し、40℃においてキシルロースからのエタノール生産能が高い株であるCandida glabrata NFRI3163(NITE受託番号 P−02496)を取得した。
スクリーニングに必要となるD−キシルロース(以下、キシルロースと略す)は、Olssonらの方法(Olsson, L., Enzyme and Microbial Technology, vo1.16,pp.388−394(1994))に基づき調製した。以下に概略を示す。140gのキシロースを200mLの水に溶かし、8gの固定化グルコースイソメラーゼ(Novozymes、Sweetzyme IT Extra、350U/g)を加え、60℃で1日反応させた。ここで、グルコースイソメラーゼの酵素活性1U(Unit)とは、標準的な分析条件下で、初速度1μmol/分でグルコ-スをフルクト-スへと変換する酵素量を表す。濾過によりグルコースイソメラーゼを除いた後、ロータリーエバポレーター(岩城硝子、モデルREN−1)により、液量が約120mLになるまで50℃で濃縮した。この濃縮液に120mLの無水エタノールを加え、4℃で1週間静置し、未反応のキシロースを析出させた。析出したキシロースを濾過により取り除いた後、ロータリーエバポレーターにより濾液からエタノールを50℃で留去させた。
96穴の丸底型マイクロタイタープレート(CORNING、モデル3799)の各ウエルに100μLのYPD培地(10g/L Yeast Extract(Difco)、20g/L Polypepton(日本製薬)、20g/L グルコース)を添加し、滅菌した爪楊枝を用いて、各ウエルに酵母株を植菌した。各マイクロタイタープレートには、農業・食品産業技術総合研究機構 食品総合研究所が保有する酵母(1枚のプレートに95株ずつ)と、コントロールとしてS. cerevisiae ATCC24860株を植菌した。30℃で24時間静置培養した後、この培養液の一部(約1.2μL)を48ピン・コピープレートレプリケーター(トッケン)を用いて、1%(w/v)キシロース及び1%(w/v)キシルロースを含むYNB培地(6.7g/L Yeast Nitrogen Base without amino acids(Difco))100μLを各ウエルに入れた96穴の丸底型マイクロタイタープレート(CORNING、モデル3799)に植菌した。30℃で24時間、静置培養後、マイクロプレートリーダー(BioTek、モデルElx800)を用いて、630nmの波長の吸光度を測定し、培養液中の菌体濃度を求めた。コントロール株であるATCC24860よりも菌体濃度が高いものをキシルロース資化能の高い株として選抜した。
96穴の丸底型マイクロタイタープレート(CORNING、モデル3799)の各ウエルに100μLのYPD培地を添加し、滅菌した爪楊枝を用いて、各ウエルに酵母株を植菌した。各マイクロタイタープレートには、前項の方法によって選抜したキシルロース資化能の高い酵母株と、コントロールとしてS. cerevisiae ATCC24860株を植菌した。30℃で24時間静置培養した後、この培養液の一部(30μL)を2%(w/v)キシルロースを含むYNB培地400μLを各ウエルに添加した96穴の深型マイクロタイタープレート(Matrix、Screenmates DeepWell plate)に植菌した。ウエルをシリコン製マット(Matrix、Screenmates CapMat)で覆い、ビニールテープを用いてマイクロタイタープレートとマットを強固に密着させた。30℃で72時間、振とう培養(毎分200回転)した後、遠心分離機(トミー精工、モデルSUPREMA25、スイングローターTS−36N)を用いて3,100xgで10分間遠心することにより、菌体と培養上清を分離した。290μLの培養上清を96穴のマイクロタイタープレート(Nunc、モデル267245)に移し、シリコン製マット(Axygen、Axymat AM−2ML−RD)で覆った後、HPLCにより、糖およびエタノール濃度を定量解析した。先に記載のHPLC装置にイオン排除クロマトグラフィー用カラム(BioRad、Aminex Fermentation Monitoring Column)を接続し、移動相に0.005M 硫酸を用いて、流速0.6ml/分、カラム温度50℃で分析を行った。また、カラムの保護のためにCation−H Cartridge(BioRad)も接続した。コントロール株であるS. cerevisiae ATCC24860と同程度のエタノールが検出された株をキシルロース発酵能の高い株として選抜した。
NL−4:5’−ggtccgtgtttcaagacgg−3’(配列番号2)
PCRはKOD FX polymerase(東洋紡ライフサインス)を使用し、94℃4分+[98℃10秒、52℃30秒、68℃1分]×30サイクルの条件で行った。得られた0.6kbのDNA断片をシリカメンブレンカラム(GEヘルスケア、illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit)を用いて精製した後、BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)を使用したサイクルシークエンス法によりシークエンス反応を行い、ABI PRISM310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)を用いて塩基配列を解読した。解読した塩基配列の相同性をBLAST(Basic Local Alignment Search Tool(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi))プログラムを用いて解析し、種の同定を行った。なお、本明細書中の実施例におけるPCRおよびサイクルシークエンスはすべてVeritiサーマルサイクラー装置(Applied Biosystems)を用いて行った。
96穴の丸底型マイクロタイタープレート(CORNING、モデル3799)の各ウエルに100μLのYPD培地を添加し、滅菌した爪楊枝を用いて、各ウエルに酵母株を植菌した。このマイクロタイタープレートには、前述の方法によって選抜したキシルロース発酵能の高い酵母株と、コントロール株であるS. cerevisiae ATCC24860を植菌した。30℃で24時間静置培養した後、この培養液の一部(30μL)を2%(w/v)キシルロースを含むYNB培地400μLを各ウエルに添加した96穴の深型マイクロタイタープレート(Matrix、Screenmates DeepWell plate)に植菌した。ウエルをシリコン製マット(Matrix、Screenmates CapMat)で覆い、ビニールテープを用いてマイクロタイタープレートとマットを強固に密着させた。40℃で72時間、振とう培養(毎分200回転)した後、遠心分離機(トミー精工、モデルSUPREMA25、スイングローターTS−36N)を用いて3,100xgで10分間遠心することにより、菌体と培養上清を分離した。290μLの培養上清を96穴のマイクロタイタープレート(Nunc、モデル267245)に移し、シリコン製マット(Axygen、Axymat AM−2ML−RD)で覆った後、HPLCにより、前述の条件で糖及びエタノール濃度を定量解析した。最も高い濃度のエタノールが検出されたCandida glabrata NFRI3163をキシルロースの高温発酵能を有している株として選抜した。
本実施例において、実施例1において得られたC. glabrata NFRI3163及びコントロール株であるS. cerevisiae ATCC24860について、以下の条件で培養を行った。10の8乗、10の7乗、10の6乗、10の5乗、10の4乗CFU(Colony Forming Unit)の菌体を含む菌体懸濁液5μLをそれぞれエタノール濃度の異なる3種類(0、5%(w/v)、7.5%(w/v)エタノール)のYPD寒天培地(10g/L Yeast Extract(Difco)、20g/L Polypepton(日本製薬)、20g/L グルコース、20g/L BactoAgar(Difco))に滴下し、40℃で3日間静置培養を行った。寒天培地上のコロニーの大きさを目視で確認し、エタノール耐性を比較した。
公知の方法と同様に、XR遺伝子、XDH遺伝子およびXK遺伝子を導入することによって作製したキシロース発酵能を有する遺伝子組換え酵母を5%(w/v)グルコースおよび2%(w/v)キシロースを含むYP培地(10g/L Yeast Extract(Difco)、20g/L Polypepton(日本製薬))で培養し、エタノール発酵を行った。以下に、XR遺伝子、XDH遺伝子およびXK遺伝子の導入手順を示すとともに、図3に導入のためのベクターの構築法の概略を図示した。なお、本明細書で使用した制限酵素は、タカラバイオ、東洋紡ライフサイエンス、New England Biolabs、いずれかの製品である。
酵母の発現用ベクターpYPGE15の遺伝子発現能力を向上させるため、当該ベクターに含まれる0.27kb長のホスホグリセリン酸キナーゼ1遺伝子プロモーター(PGK1p)をより上流領域を含む0.75kb長のPGK1pに置換した。まず、pYPGE15を制限酵素BstXIで消化し、生じた粘着末端をT4 DNA Polymerase(タカラバイオ DNA Blunting Kit)を用いて平滑化した。その後、制限酵素XbaIで消化し、元々pYPGE15に存在した0.27kb長のPGK1pの大部分の領域を除去した。次に、Saccharomyces cerevisiae InvSc1(Invitrogen)のゲノムDNAを鋳型に、PGKp−SmaIプライマー及びPGKp−XbaI−asプライマーを用いてPCRにより、0.75kb長のPGK1pを増幅した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
PGKp−XbaI−as:5’−gccgccgtctagatgttttatatttgttgtaaaaagtag−3’(配列番号4)
PCRはPfuUltra II fusion HS DNA Polymerase(Stratagene)を使用して、95℃2分+[95℃20秒、55℃20秒、72℃15秒]×30サイクル+72℃3分の条件で行った。得られた0.75kbのDNA断片を制限酵素XbaIおよびSmaIで消化し、上述の処理を行ったpYPGE15とQuick Ligation Kit(New England Biolabs)を用いて連結し、大腸菌DH5αコンピテントセル(東洋紡ライフサイエンス)を形質転換し、アンピシリン耐性を獲得した大腸菌よりillustra plasmidPrep Mini Spin Kit(GEヘルスケア)を用いて0.75kb長のPGK1pを含有するベクターを調製し、pYPGE15Lと命名した。
まず、Pichia stipitis NBRC10063のゲノムDNAを鋳型にして、XR−XbaIプライマーおよびXR−KpnIプライマーを用いてXR遺伝子(0.96kb)をPCR増幅により単離した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
XR−KpnI:5’−ggggtaccttagacgaagataggaatcttgtc−3’(配列番号6)
PCRはPfuUltra II fusion HS DNA Polymeraseを使用して、95℃2分+[95℃20秒、55℃20秒、72℃15秒]×30サイクル+72℃3分の条件で行った。得られたDNA断片を制限酵素XbaIおよびKpnIで消化した後、XbaIおよびKpnIで消化したpYPGE15LにQuick Ligation Kitを用いて連結した。連結物で大腸菌DH5αコンピテントセルを形質転換し、アンピシリン耐性を獲得した大腸菌よりillustra plasmidPrep Mini Spin Kitを用いてXRがクローニングされたpYPGE15L−XRを調製した。
XDH−XhoI:5’−ccgctcgagttactcagggccgtcaatgag−3’(配列番号8)
PCRはPfuUltra II fusion HS DNA Polymeraseを使用して、95℃2分+[95℃20秒、58℃20秒、72℃15秒]×30サイクル+72℃3分の条件で行った。得られたDNA断片を制限酵素XbaIおよびXhoIで消化し、XbaIおよびXhoIで消化したpYPGE15LにQuick Ligation Kitを用いて連結した。連結物で大腸菌DH5αコンピテントセルを形質転換し、アンピシリン耐性を獲得した大腸菌よりillustra plasmidPrep Mini Spin Kitを用いてXDHがクローニングされたpYPGE15L−XDHを調製した。
XK−XhoI:5’−ccgctcgagttagatgagagtcttttccag−3’(配列番号10)
PCRはPfuUltra II fusion HS DNA Polymeraseを使用して、95℃2分+[95℃20秒、55℃20秒、72℃30秒]×30サイクル+72℃3分の条件で行った。得られたDNA断片を制限酵素XbaIおよびXhoIで消化し、XbaIおよびXhoIで消化したpYPGE15LにQuick Ligation Kitを用いて連結した。連結物で大腸菌DH5αコンピテントセルを形質転換し、アンピシリン耐性を獲得した大腸菌よりillustra plasmidPrep Mini Spin Kitを用いてXKがクローニングされたpYPGE15L−XKを調製した。
まず、pYPGE15L−XKを鋳型にして、PGKp−SphIプライマーおよびCYCt−SbfIプライマーを用いてPGK1プロモーター、XK遺伝子、CYC1ターミネーターから成るPGK1p−XK−CYC1t遺伝子カセット(2.9kb)をPCR増幅により単離した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
CYCt−SbfI:5’−agcccctgcaggaagctttgcaaattaaagccttcg−3’(配列番号12)
PCRはPfuUltra II fusion HS DNA Polymeraseを使用して、95℃2分+[95℃20秒、56℃20秒、72℃45秒]×30サイクル+72℃3分の条件で行った。得られたDNA断片を制限酵素SphIおよびSbfIで消化し、SphIおよびSbfIで消化したpAUR101(タカラバイオ;配列番号38)にQuick Ligation Kitを用いて連結した。連結物で大腸菌DH5αコンピテントセルを形質転換し、アンピシリン耐性を獲得した大腸菌よりillustra plasmidPrep Mini Spin Kitを用いてXK発現用ベクターであるpAUR−XK(配列番号39)を調製した。
CYCt−SalI:5’−agccgtcgacaagctttgcaaattaaagccttcg−3’(配列番号14)
PCRはPfuUltra II fusion HS DNA Polymeraseを使用して、95℃2分+[95℃20秒、55℃20秒、72℃45秒]×30サイクル+72℃3分の条件で行った。得られたDNA断片を制限酵素SbfIおよびSalIで消化し、SbfIおよびSalIで消化したpAUR―XKにQuick Ligation Kitを用いて連結した。連結物で大腸菌DH5αコンピテントセルを形質転換し、アンピシリン耐性を獲得した大腸菌よりillustra plasmidPrep Mini Spin Kitを用いてXDH及びXK共発現用ベクターであるpAUR−XDHXKを調製した。
PCRはPfuUltra II fusion HS DNA Polymeraseを使用して、95℃2分+[95℃20秒、55℃20秒、72℃45秒]×30サイクル+72℃3分の条件で行った。得られたDNA断片を制限酵素SmaIおよびSacIで消化した。pAUR―XDHXKをSmaIで消化後、SacIで部分消化し、11.8kbのDNA断片を調製した。これとPGK1p−XR−CYC1tをQuick Ligation Kitを用いて連結し、大腸菌DH5αコンピテントセルを形質転換し、アンピシリン耐性を獲得した大腸菌よりillustra plasmidPrep
Mini Spin Kitを用いてXR、XDH及びXK共発現用ベクターであるpAUR−XRXDHXKを調製した。
酵母の形質転換はElbleによる酢酸リチウム法(Elble R, BioTechniques, Vol.13, pp.18−20 (1992))に基づいて行った。以下に手順を示す。YPD培地で1日培養したS. cerevisiae NBRC0224およびC. glabrata NFRI3163をそれぞれ1mLの培養液から遠心分離により集菌し、各々1mLの滅菌水で洗浄後、再度集菌した。S. cerevisiaeの形質転換用には、1μgのpAUR−XRXDHXKを制限酵素BsiWIで消化し、C. glabrataの形質転換用には、5μgのpAUR−XRXDHXKを制限酵素SphIで消化した。これらの直鎖状ベクターをシリカメンブレンカラム(GEヘルスケア illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit)を用いて精製した後、10μLの滅菌水で溶出し、10μLのキャリアーDNA(ニシン精子DNA、100μg)と混合した。これに500μLのPLATE溶液[40%(w/v)ポリエチレングリコール#4000(ナカライテスク)、0.1M 酢酸リチウム、10mM Tris−HCl(pH 7.5),1mM EDTA]を加え混合した溶液で、前述の酵母菌体を懸濁した。室温で1日静置後、遠心分離により集菌し、200μLの滅菌水で菌体を懸濁した。この菌体懸濁液を100μLずつ、2枚のYPD−AbA寒天培地(10g/L Yeast Extract(Difco)、20g/L Polypepton(日本製薬)、20g/L グルコース、0.5μg/mL オーレオバシジンA(タカラバイオ)、20g/L バクトアガー(Difco))に塗布した。30℃で3日間静置培養し、オーレオバシジンA耐性を示したコロニーを単離することにより、XR−XDH−XK系を導入したS. cerevisiaeおよびC. glabrataを取得し、 それぞれS. cerevisiae XR−XDH−XKおよびC. glabrata XR−XDH−XKと命名した。
上記により製造した遺伝子組換え酵母のエタノール発酵収率を以下の手順により測定した。S. cerevisiae XR−XDH−XKおよびC. glabrata XR−XDH−XKをそれぞれ、30℃でYPD培地を用いて好気的に一晩種培養した後、波長600nmにおける吸光度(OD600)を測定し、種培養液の菌体濃度を求めた。菌体濃度は、OD600=1の場合、0.3g(乾燥重量)/Lに相当するものとして計算した。種培養液を遠心分離により集菌し、菌体を滅菌水で洗浄した後、容量10mLのガラスバイアル(日電理化硝子、SVG−10)に入った5%(w/v)グルコースおよび2%(w/v)キシロースを含有する7mLのYP培地に、初発菌体濃度0.3g(乾燥重量)/Lとなるように添加した。バイアルをゴム栓(日電理化硝子、液状用ブチルゴム(大))および穴あきキャップ(日電理化硝子)にて密封した。恒温回転式浸とう培養器(タイテック、モデルBR−22FP・MR)を用いて、30℃、35℃、37℃および40℃の各温度で、200rpmで振とう培養を行った。注射針(テルモ、20G×70)を用いて経時的にサンプリングを行い、採取した発酵液から遠心分離によって酵母菌体を除いた後、HPLCによって、発酵液に含まれるエタノール及び糖類の定量分析を行った。HPLCには、前述の島津製作所製装置に配位子交換クロマトグラフィー用カラム(Shodex SP0810)を接続して使用した。移動相に水を用いて、流速0.6ml/分、カラム温度80℃で分析を行った。また、カラムの保護のために脱塩カートリッジ(BioRad)とガードカラム(Shodex SP−G)をSP0810カラムの前に連結した。得られたクロマトグラムについてLC Solution解析ソフトウエア(島津製作所)を使用してサンプルと標準品の保持時間およびピーク面積を比較することにより発酵液中のエタノールおよび糖類の定性および定量分析を行った。
2%(w/v)キシロースを含むYP培地にグルコースイソメラーゼ(Novozymes、Sweetzyme IT Extra,35U)を加えた培地を用いて、Candida glabrataおよびSaccharomyces cerevisiaeの非遺伝子組換え体について、同時異性化発酵能を解析した。以下に簡単な手順を示す。
C. glabrata NFRI3163およびS. cerevisiae InvSc1をそれぞれ、30℃でYPD培地を用いて好気的に一晩種培養した後、OD600を測定し、種培養液の菌体濃度を求めた。菌体濃度は、OD600=1の場合、0.3g(乾燥重量)/Lに相当するものとして計算した。種培養液を遠心分離により集菌し、菌体を滅菌水で洗浄した後、容量10mLのガラスバイアル(日電理化硝子、SVG−10)に入った2%(w/v)キシロースを含有する5mLのYP培地に、初発菌体濃度が0.3g(乾燥重量)/Lとなるように添加した。さらに35Uのグルコースイソメラーゼ(Novozymes、Sweetzyme IT Extra)を加えた後、バイアルをゴム栓(日電理化硝子、液状用ブチルゴム(大))および穴あきキャップ(日電理化硝子)にて密封した。恒温回転式浸とう培養器(タイテック、モデルBR−22FP・MR)を用いて、30℃および40℃で、200rpmで振とう培養を行った。注射針(テルモ、20G×70)を用いてサンプリングを行い、採取した発酵液から遠心分離によって酵母菌体を除いた後、HPLCによって、発酵液に含まれるエタノール及び糖類の定量分析を行った。HPLCには、前述の島津製作所製装置に、配位子交換クロマトグラフィー用カラム(Shodex SP0810)を接続して使用した。移動相に水を用いて、流速0.6ml/分、カラム温度80℃で分析を行った。また、カラムの保護のために脱塩カートリッジ(BioRad)とガードカラム(Shodex SP−G)をSP0810カラムの前に連結した。得られたクロマトグラムについてLC Solution解析ソフトウエアを使用して発酵液中のエタノールおよび糖類の定性および定量分析を行った。
本実施例では、同時異性化発酵によるキシロース発酵能のさらなる改善を目的として、C. glabrataのキシルロキナーゼ遺伝子を遺伝子組換えにより上記C. glabrata NFRI3163株に導入し、キシルロキナーゼの高発現により同時異性化発酵の収率を向上させた。以下にそのプロトコールを示す。
まず、S. cerevisiae由来のPGK1pプロモーターとCYC1tターミネーターおよびウラシル要求性マーカー遺伝子(URA3)を含有する酵母発現用ベクターを以下の手順で構築した。PGK1pを得るために、前出のpAUR−XKプラスミド(配列番号39)を鋳型にしてPGKp−1SプライマーとPGKp−1Aプライマーを用いてPCRを行った。プライマーの配列を以下に示す。
PGKp−1A:5’−gccgccgtctagatgttttatatttgttgtaaaaagtag−3’(配列番号17)
PCRはPfuUltra II fusion HS DNA Polymeraseを使用して、95℃2分+[95℃20秒、55℃20秒、72℃15秒]×30サイクル+72℃3分の条件で行った。得られたDNA断片を制限酵素SacIおよびXbaIで消化し、pRS406ベクターのSacIおよびXbaIサイトにクローニングした。CYC1t(0.2kb)は、p424GPDベクターをKpnIおよびXhoIで消化することにより得た。このDNA断片を、PGK1pをクローニングしたpRS406のKpnIおよびXhoIサイトにクローニングし、pRS406−PGKpCYCtを作製した。製造したベクターpRS406−PGKpCYCtの概略図を図5に示す。
CBS138の染色体DNA塩基配列(アクセス番号:CR380953)の中から、S. cerevisiaeのキシルロキナーゼ遺伝子と相同性を示す遺伝子(CgXK)を見出した。この配列情報を基にCgXK−1SプライマーとCgXK−2Aプライマーを合成し、C. glabrata NFRI3163のゲノムDNAを鋳型に用いてPCR増幅によりCgXKを単離した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
CgXK−2A:5’−ccgctcgagttactttaactcttcttctaatttgctc−3’(配列番号19)
PCRはPfuUltra II fusion HS DNA Polymeraseを使用して、95℃2分+[95℃20秒、55℃20秒、72℃30秒]×30サイクル+72℃3分の条件で行った。得られた1.8kbのDNA断片を制限酵素EcoRIおよびXhoIで消化した後、pRS406−PGKpCYCtのEcoRIおよびXhoIサイトにクローニングし、pRS406−CgXKを作製した。製造したベクターpRS406−CgXKの概略図を図6に示す(CgXKの核酸配列は配列番号28でありアミノ酸配列は配列番号29である。pRS406ベクターの配列は配列番号30である。pRS406−CgXKベクターの配列は配列番号31である。)。
C. glabrata NFRI3163の抗生物質の添加を必要としない形質転換を行うために、ウラシル要求性変異株の単離を行った。ウラシル要求性変異株の単離はBoekeらの方法(Boeke JD,et al., Molecular and General Genetics,Vol.197, pp.345−346)に基づいて行った。以下に簡単な手順を示す。
5μgのpRS406−CgXKを制限酵素SacIで直鎖状にした後、3163 ura012株をElbleによる酢酸リチウム法により形質転換した。SC−Ura寒天培地上で生育してきたコロニーを単離し、得られた形質転換株をCandida glabrata 3163−CgXK<NITE受託番号:P−02494>と命名し、以下の実施例で用いた。
2%(w/v)キシロースを含む5mLのYP培地にグルコースイソメラーゼ(Novozymes、Sweetzyme IT Extra、35U)を加え、実施例5で作製したキシルロキナーゼを高発現させたC. glabrata 3163−CgXKを初発菌体濃度が0.3g(乾燥重量)/Lとなるよう添加し、72時間同時異性化発酵を行った。発酵液に含まれるエタノールおよび糖類をHPLCにより測定し、キシロース消費量、エタノール収率およびキシリトール蓄積量を求めた。同時異性化発酵およびHPLCによる解析は、実施例4と同様に行った。結果を以下の表に示す。表中のエタノール収率は、添加基質量に対する収率であり、2%(w/v)キシロースを基質として初発菌体濃度0.3g(乾燥重量)/Lを用いて72時間発酵したときのエタノール収率を理論収率(0.51g/g)に対する百分率で示す。
また、S. cerevisiae InvSc1(Invitrogenから入手可能)にキシルロキナーゼを高発現させた株(InvSc1−ScXK6)を作製し、これについても同時異性化発酵のデータを取得した。以下に手順を示す。
pAUR−XK(配列番号39)を鋳型にして、SXK−1SプライマーおよびSXK−1Aプライマーを用いてXK遺伝子をPCR増幅した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
ScXK−1A:5’−ccgctcgagttagatgagagtcttttcc−3’(配列番号21)
PCRはPfuUltra II fusion HS DNA Polymeraseを使用して、95℃2分+[95℃20秒、55℃20秒、72℃30秒]×30サイクル+72℃3分の条件で行った。得られた1.8kbのDNA断片を制限酵素ClaIおよびXhoIで消化した後、pRS406−PGKpCYCtのClaIおよびXhoIサイトにクローニングし、pRS406−XKを作製した。製造したベクターpRS406−XKの概略図を図7に示す。
2%(w/v)キシロースを含む5mLのYP培地にグルコースイソメラーゼ(Novozymes、Sweetzyme IT Extra、35U)を加え、S. cerevisiae InvSc1−ScXKを初発菌体濃度が0.3g(乾燥重量)/Lとなるよう添加し、72時間および150時間同時異性化発酵を行った。発酵液に含まれるエタノールおよび糖類をHPLCにより測定し、キシロース消費量、エタノール収率およびキシリトール蓄積量を求めた。同時異性化発酵およびHPLCによる解析は、実施例4と同様に行った。結果を以下の表に示す。表中のエタノール収率は、添加基質量に対する収率であり、2%(w/v)キシロースを基質として初発菌体濃度0.3g(乾燥重量)/Lを用いて、表4は72時間発酵したときの、表5は150時間発酵したときの、エタノール収率を理論収率(0.51g/g)に対する百分率で示す。
C. glabrataはS. cerevisiaeと異なり、通常、非相同末端結合により外来遺伝子の染色体への挿入が起こるが、相同部分を0.45塩基対と長くとることにより、相同組換えを起こすことができた。具体的には以下のとおりに行った。その模式図は、図8上パネルに示している。図8上パネルでは、相同組換えのスキームおよび非相同末端結合の模式図を示している。以下に行った手順の概要を示す。
GenBank DNAデータベースに登録されていたC. glabrata CBS138の染色体DNA塩基配列(アクセス番号:CR380955)の中から、S. cerevisiaeのアルドースレダクターゼ遺伝子(GRE3)と相同性を示す遺伝子(CgGRE3)を見出した。この配列情報を基にCgGRE3−1SプライマーとCgGRE3−1Aプライマーを合成し、C. glabrata NFRI3163のゲノムDNAを鋳型に用いてPCR増幅によりCgGRE3をコードするDNA断片(1.0kb)を単離した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
CgGRE3−1A:5’−CCGCTCGAGTTAAGCAAAGATTGGGAACTTACCATC−3’(配列番号23)
PCRはPfuUltra II fusion HS DNA Polymeraseを使用して、95℃2分+[95℃20秒、58℃20秒、72℃15秒]×30サイクル+72℃3分の条件で行った。得られたDNA断片を制限酵素BamHIおよびXhoIで消化した後、BamHIとXhoIで消化したpBluescript II KS(+)ベクター(Stratagene)にクローニングし、pBS−CgGRE3と命名した。図9に模式図を示す。
ScURA3−1A:5’−CCATCGATTAATTAGTTTTGCTGGCCGCATCTTC−3’(配列番号25)
PCRはPfuUltra II fusion HS DNA Polymeraseを使用して、95℃2分+[95℃20秒、56℃20秒、72℃15秒]×30サイクル+72℃3分の条件で行った。得られたDNA断片を制限酵素ClaIで消化した。pBS−CgGRE3をClaIで消化し、セルフライゲーションを防ぐためにAntarctic Phospahtase(New England Biolabs)を使用して脱リン酸化処理を行った後、URA3およびURA3プロモーターを挿入し、pBS−CgGRE3−URA3を作製した。図10に模式図を示す。pBS−CgGRE3−URA3を鋳型に、CgGRE3−2SプライマーとCgGRE3−2Aプライマーを用いてPCRを行い、CgGRE3の5’−末端から0.45kbの位置にURA3およびURA3プロモーターが挿入されたDNA断片(2.0kb)を増幅した。使用したプライマーの配列を以下に示す。
CgGRE3−2A:5’−TTAAGCAAAGATTGGGAACTTACCATC−3’(配列番号27)
PCRはPfuUltra II fusion HS DNA Polymeraseを使用して、95℃2分+[95℃20秒、50℃20秒、72℃30秒]×30サイクル+72℃3分の条件で行った。
前項で得られた2.0kbのDNA断片を用いて、C. glabrata 3163 ura012株をElbleによる酢酸リチウム法により形質転換した。SC−Ura寒天培地上で生育してきたコロニーの中から、相同組換えを起こした組換え体をコロニーPCRにより選抜し、C. glabrataのアルドースレダクターゼ(CgGRE3)破壊株を取得した。コロニーPCRは、以下の条件で行った。
2%(w/v)キシロースを含む5mLのYP培地にグルコースイソメラーゼ(Novozymes、Sweetzyme IT Extra、35U)を加え、実施例8で作製したアルドースレダクターゼ遺伝子を破壊したCandida glabrata 3163 Δgre3−35を用いて、72時間同時異性化発酵を行った。
本実施例では、キシルロキナーゼを高発現させ、アルドースレダクターゼを欠損させたCandida glabrata 3163 dgXK1<NITE受託番号 P−02493>を用いてキシロースの同時異性化発酵を行った。C. glabrata 3163 dgXK1の作製は以下のとおりに行った。
実施例5に記載の方法と同様に5−フルオロオロト酸耐性を利用したスクリーニング方法により、C. glabrata 3163 Δgre3−35株についてウラシル要求性変異株を取得し、3163 Δgre3−35 ura05と命名した。実施例5で作製したpRS−CgXKを制限酵素SacIで消化した後、Elbleの酢酸リチウム法により、3163 Δgre3−35 ura05を形質転換した。SC−Ura寒天培地上で生育したコロニーを単離し、C. glabrata 3163 dgXK1を取得した。
稲わらのグルコースおよびキシロースの含有比を模して5%(w/v)グルコースおよび2%(w/v)キシロースを加えた5mLのYP培地に、グルコースイソメラーゼ(Novozymes、Sweetzyme IT Extra、 35U)を添加し、初発菌体濃度0.3g(乾燥重量)/LとなるようにCandida glabrata 3163 dgXK1を植菌して、同時異性化発酵を行った。
ノール生産)
本実施例では、作製したCandida glabrata 3163 dgXK1の有するバイオマス原料からのエタノール発酵能を示すために、稲わらを用いて30℃および40℃において同時異性化発酵を組み合わせた並行複発酵によるエタノール生産を行った。以下に実験方法を示す。
徳安らの方法(特許文献5)に従い行った。乾燥稲わら(2010年度茨城県産コシヒカリ)をコーワカッター(新興和産業、モデルSU−16)で約13mmに切断後、ハンマーミル刃を装填したマルチミル(グローエンジニアリング、モデルRD−15)で約0.5mmに粉砕した。その後、グラインダー(ウエスト、モデルMPW−G008)をクリアランス0.5mmに設定して更に粉砕した。この粉砕稲わら(500mg)と水酸化カルシウム(100mg)を容量10mLのガラスバイアル(日電理化硝子、SVG−10)に入れよく混合した後、3.33mLの蒸留水を加え、ガラスバイアルをゴム栓(日電理化硝子、液状用ブチルゴム(大))および穴あきキャップ(日電理化硝子)にて密封し、120℃で1時間加熱処理を行った。室温まで冷却した後、注射針(テルモ、20G×70)を使用してバイアル内の空気を二酸化炭素ガスに置換し、さらに、二酸化炭素ガスを1.5気圧に加圧しながら約5mL注入した。一晩、室温に放置し、稲わら前処理物を完成させた。
稲わら前処理物の入ったバイアルを一旦開封し、グルコースイソメラーゼ(Novozymes、Sweetzyme IT Extra、35U)を添加した後、バイアルを再び密封し、二酸化炭素ガスを1.5気圧に加圧しながら約5mL注入した。セルラーゼ製剤(Novozymes、Cellclast 1.5L、1.1mg)、β−グルコシダーゼ製剤(Novozymes、Novozyme 188、0.28mg)およびヘミセルラーゼ製剤(Novozymes、Ultraflo L、0.45mg)を注射針(テルモ、20G×70)で添加した。YPD培地で一晩好気的に培養したC. glabrata 3163 dgXK1を遠心分離で集菌し、滅菌水で洗浄した後、初発菌体濃度が1.5g(乾燥重量)/Lとなるよう、稲わら前処理物および酵素の入ったバイアルに注射針(テルモ、20G×70)で添加した。酵母を加えたバイアルを30℃および40℃に設定した恒温器内に設置した転倒回転型撹拌器(ATR、Rotamix)に取り付け、50RPMで回転させながら発酵を行った。注射針(テルモ、20G×70)を用いて経時的にサンプリングを行い、採取した発酵液から遠心分離によって酵母菌体および稲わら残渣を除き、続いて限外ろ過(ポール、ナノセップ遠心ろ過デバイス、10K)により上清から糖化酵素を除去した後、HPLCによって発酵液に含まれるエタノール及び糖類の定量分析を行った。HPLCによる解析は、実施例4に記載の方法により行った。
本実施例では、基質キシロース濃度および初発菌体濃度を変更したときの影響を確認する実験を行った。実験手順は以下のとおりである。
実施例1に記載の方法で、農業・食品産業技術総合研究機構 食品総合研究所が保有する酵母株の中から40℃においてキシルロース発酵能が高いSaccharomyces cerevisiae株としてSt10−1−1<受託番号 NITE P−01620>を単離した。S. cerevisiae St10−1−1の同時異性化発酵能について、2%(w/v)キシロースを含むYP培地にグルコースイソメラーゼ(Novozymes、Sweetzyme IT Extra,35U)を加えた培地を用いて解析した。以下に手順を示す。
S. cerevisiae St10−1−1を、30℃でYPD培地を用いて好気的に一晩種培養した後、OD600を測定し、種培養液の菌体濃度を求めた。菌体濃度は、OD600=1の場合、0.4g(乾燥重量)/Lに相当するものとして計算した。種培養液を遠心分離により集菌し、菌体を滅菌水で洗浄した後、容量10mLのガラスバイアル(日電理化硝子、SVG−10)に入った2%(w/v)キシロースを含有する5mLのYP培地に、初発菌体濃度が0.3g(乾燥重量)/Lとなるように添加した。さらに35Uのグルコースイソメラーゼ(Novozymes、Sweetzyme IT Extra)を加えた後、バイアルをゴム栓(日電理化硝子、液状用ブチルゴム(大))および穴あきキャップ(日電理化硝子)にて密封した。恒温回転式浸とう培養器(タイテック、モデルBR−22FP・MR)を用いて、30℃および40℃で、200rpmで振とう培養を行った。注射針(テルモ、20G×70)を用いてサンプリングを行い、採取した発酵液から遠心分離によって酵母菌体を除いた後、HPLCによって、発酵液に含まれるエタノール及び糖類の定量分析を行った。HPLCには、前述の島津製作所製装置に、配位子交換クロマトグラフィー用カラム(バイオラッド、Aminex HPX−87H)を接続して使用した。移動相に水を用いて、流速0.6ml/分、カラム温度50℃で分析を行った。また、カラムの保護のためにガードカラム(Shodex SH−G)をHPX−87Hカラムの前に連結した。得られたクロマトグラムについてLC Solution解析ソフトウエアを使用して発酵液中のエタノールおよび糖類の定性および定量分析を行った。
本実施例では、S. cerevisiaeのキシルロキナーゼ遺伝子を遺伝子組換えにより上記S. cerevisiae St10−1−1株に導入し、キシルロキナーゼの高発現により同時異性化発酵の収率を向上させた。以下にそのプロトコールを示す。
実施例3で作成したpAUR−XK(配列番号39)を制限酵素BsiWIで直鎖状にした後、S. cerevisiae St10−1−1をElbleによる酢酸リチウム法により形質転換した。YPD−AbA寒天培地上で生育してきたコロニーを単離し、得られた形質転換株をS. cerevisiae St10−ScXK<受託番号 NITE P−01618>と命名した。
2%(w/v)キシロースを含む5mLのYP培地にグルコースイソメラーゼ(Novozymes、Sweetzyme IT Extra、35U)を加え、S. cerevisiae St10−ScXK(受託番号 NITE P−01618)を初発菌体濃度が0.3g(乾燥重量)/Lとなるよう添加し、72時間同時異性化発酵を行った。発酵液に含まれるエタノールおよび糖類をHPLCにより測定し、キシロース消費量、エタノール収率およびキシリトール蓄積量を求めた。同時異性化発酵およびHPLCによる解析は、実施例14と同様に行った。結果を以下の表に示す。表中のエタノール収率は、添加基質量に対する収率であり、2%(w/v)キシロースを基質として初発菌体濃度0.3g(乾燥重量)/Lを用いて、72時間発酵したときのエタノール収率を理論収率(0.51g/g)に対する百分率で示す。
相同組換えに基づく外来遺伝子の染色体への挿入によって、Saccharomyces cerevisiaeの内在性アルドースレダクターゼ遺伝子(GRE3)の破壊を行った。S. cerevisiae St10−1−1は二倍体であるため、図13に示したように、2種類の抗生物質耐性遺伝子を利用して、2本の相同染色体上のGRE3遺伝子を両方とも破壊した。以下に行った手順の概要を示す。
GenBank DNAデータベースに登録されていたS. cerevisiae S288cの染色体DNA塩基配列(アクセス番号:BK006934)の中から、アルドースレダクターゼ遺伝子(GRE3)およびその近傍の配列情報を得た。GRE3遺伝子5’―上流領域の40塩基に対する相同配列とpPICZ Bプラスミド(インビトロジェン)上のTEF1プロモーターの20塩基に対する相同配列とを連結したGRE3ZEOR−1Sプライマー、およびGRE3遺伝子3’―下流領域の40塩基に対する相同配列とpPICZ Bプラスミド上のCYC1ターミネーターの20塩基に対する相同配列とを連結したGRE3ZEOR−1Aプライマーを合成した。これらのプライマーを用いてpPICZ Bプラスミドを鋳型にPCR増幅することにより、ゼオシン耐性遺伝子(ZEO)発現カセット(TEF1プロモーター―ZEO―CYC1ターミネーターの融合遺伝子)の両端に、GRE3遺伝子の5’―および3’―近傍領域の相同配列が40塩基ずつ付加されたDNA断片を得た。使用したプライマーの配列を以下に示す。下線部分がGRE3遺伝子の近傍領域に対する相同配列である。
GRE3ZEOR−1A:5’−ATGTAAAAATTTATACACATATACAGCATCGGAATGAGGGATTAAAGCCTTCGAGCGTCC−3’(配列番号33)
PCRはPfuUltra II fusion HS DNA Polymeraseを使用して、95℃2分+[95℃20秒、55℃20秒、72℃30秒]×10サイクル+[95℃20秒、65℃20秒、72℃30秒]×20サイクル+72℃3分の条件で行った。
次に、GRE3遺伝子5’―上流領域の40塩基に対する相同配列とp427―TEFプラスミド(デュアルシステムズ・バイオテック)上のTEF1プロモーターの20塩基に対する相同配列とを連結したGRE3KANR−1Sプライマーおよび、GRE3遺伝子3’―下流領域の40塩基に対する相同配列とp427―TEFプラスミド上のTEF1ターミネーターの20塩基に対する相同配列とを連結したGRE3KANR−1Aプライマーを合成した。これらのプライマーを用いてp427―TEFプラスミドを鋳型にPCR増幅することにより、G418耐性遺伝子(KAN)発現カセット(TEF1プロモーター―KAN―TEF1ターミネーターの融合遺伝子)の両端に、GRE3遺伝子の5’―および3’―近傍領域の相同配列が40塩基ずつ付加されたDNA断片を得た。使用したプライマーの配列を以下に示す。下線部分がGRE3遺伝子の近傍領域に対する相同配列である。なお、KAN遺伝子がすでにZEO遺伝子が挿入されている側の染色体と相同組換えを起こさないようにするため、KAN発現カセットの両端には、ZEO発現カセットの両端に付加したものよりも内側のGRE3近傍領域に対する相同配列を付加した。
(配列番号34)
GRE3KANR−1A:5’−TTGTTCATATCGTCGTTGAGTATGGATTTTACTGGCTGGAGGATGGCGGCGTTAGTATCG−3’(配列番号35)
PCRはPfuUltra II fusion HS DNA Polymeraseを使用して、95℃2分+[95℃20秒、55℃20秒、72℃30秒]×10サイクル+[95℃20秒、65℃20秒、72℃30秒]×20サイクル+72℃3分の条件で行った。
2%(w/v)キシロースを含む5mLのYP培地にグルコースイソメラーゼ(Novozymes、Sweetzyme IT Extra、35U)を加え、実施例16で作製したアルドースレダクターゼ遺伝子を破壊したSaccharomyces cerevisiae St10 Δgre3−2を用いて、72時間同時異性化発酵を行った。
本実施例では、キシルロキナーゼを高発現させ、アルドースレダクターゼを欠損させたSaccharomyces cerevisiae St10 dgXK1<NITE受託番号 P−01617>を用いてキシロースの同時異性化発酵を行った。S. cerevisiae St10 dgXK1の作製は以下のとおりに行った。
実施例15に記載の方法と同様にpAUR−XK(配列番号39)を制限酵素BsiWIで直鎖状にした後、S. cerevisiae St10 Δgre3−2(受託番号 NITE P−01619)をElbleによる酢酸リチウム法により形質転換した。YPD−AbA寒天培地上で生育してきたコロニーを単離し、得られた形質転換株をS. cerevisiae St10 dgXK1(受託番号 NITE P−01617)と命名した。
2%(w/v)キシロースを含む5mLのYP培地にグルコースイソメラーゼ(Novozymes、Sweetzyme IT Extra、35U)を加え、72時間同時異性化発酵を行った。その結果を表14に示す。S. cerevisiae St10 dgXK1は、30℃、40℃ともに高いエタノール収率と低いキシリトール蓄積を示した。特にエタノール収率は、40℃でも80%以上と非常に高い値を維持していた。親株であるSt10−1−1との比較では、エタノール収率は、30℃において2.5倍、40℃において2.0倍に向上した。また、キシリトール/エタノール比は、30℃において5.3分の1、40℃において3.3分の1であった。表中のエタノール収率は、添加基質量に対する収率であり、2%(w/v)キシロースを基質として初発菌体濃度0.3g(乾燥重量)/Lを用いて72時間発酵したときのエタノール収率を理論収率(0.51g/g)に対する百分率で示す。
稲わらのグルコースおよびキシロースの含有比を模して5%(w/v)グルコースおよび2%(w/v)キシロースを加えた5mLのYP培地に、グルコースイソメラーゼ(Novozymes、Sweetzyme IT Extra、 35U)を添加し、初発菌体濃度0.3g(乾燥重量)/LとなるようにSaccharomyces cerevisiae St10−1−1あるいはSt10 dgXK1を植菌して、同時異性化発酵を行った。
本実施例では、作製したSaccharomyces cerevisiae St10 dgXK1の有するバイオマス原料からのエタノール発酵能を示すために、稲わらを用いて30℃および40℃において同時異性化発酵を組み合わせた並行複発酵によるエタノール生産を行った。稲わらの前処理方法および同時異性化発酵を組み合わせた並行複発酵方法は、使用菌株を除き実施例12に記載した通りである。また、HPLCによる発酵液に含まれるエタノール及び糖類の定量分析は、実施例14に記載の方法により行った。
本実施例では、基質キシロース濃度および初発菌体濃度を変更したときの影響を確認する実験を行った。実験手順は以下のとおりである。
配列番号2:NL−4プライマーの核酸配列
配列番号3:PGKp−SmaIプライマーの核酸配列
配列番号4:PGKp−XbaI−asプライマーの核酸配列
配列番号5:XR−XbaIプライマーの核酸配列
配列番号6:XR−KpnIプライマーの核酸配列
配列番号7:XDH−XbaIプライマーの核酸配列
配列番号8:XDH−XhoIプライマーの核酸配列
配列番号9:XK−XbaIプライマーの核酸配列
配列番号10:XK−XhoIプライマーの核酸配列
配列番号11:PGKp−SphIプライマーの核酸配列
配列番号12:CYCt−SbfIプライマーの核酸配列
配列番号13:PGKp−SbfIプライマーの核酸配列
配列番号14:CYCt−SalIプライマーの核酸配列
配列番号15:CYCt−SacIプライマーの核酸配列
配列番号16:PGKp−1Sプライマーの核酸配列
配列番号17:PGKp−1Aプライマーの核酸配列
配列番号18:CgXK−1Sプライマーの核酸配列
配列番号19:CgXK−2Aプライマーの核酸配列
配列番号20:ScXK−1Sプライマーの核酸配列
配列番号21:ScXK−1Aプライマーの核酸配列
配列番号22:CgGRE3−1Sプライマーの核酸配列
配列番号23:CgGRE3−1Aプライマーの核酸配列
配列番号24:ScURA3−1Sプライマーの核酸配列
配列番号25:ScURA3−1Aプライマーの核酸配列
配列番号26:CgGRE3−2Sプライマーの核酸配列
配列番号27:CgGRE3−2Aプライマーの核酸配列
配列番号28:CgXKの核酸配列
配列番号29:CgXKのアミノ酸配列
配列番号30:pRS406ベクターの核酸配列
配列番号31:pRS406−CgXKベクターの核酸配列
配列番号32 GRE3ZEOR−1Sの核酸配列
配列番号33 GRE3ZEOR−1Aの核酸配列
配列番号34 GRE3KANR−1Sの核酸配列
配列番号35 GRE3KANR−1Aの核酸配列
配列番号36:ScXKの核酸配列
配列番号37:ScXKのアミノ酸配列
配列番号38:pAUR101ベクターの核酸配列
配列番号39:pAUR−XKベクターの核酸配列
NITE P−02494
NITE P−02495
NITE P−02496
NITE P−01617
NITE P−01618
NITE P−01619
NITE P−01620
Claims (18)
- キシルロキナーゼを組換え導入しおよび/またはアルドースレダクターゼを欠損させた、Candida glabrataである酵母。
- キシルロース資化能を有する、請求項1に記載の酵母。
- リグノセルロース利用能を有する、請求項1または2に記載の酵母。
- 前記リグノセルロース利用能は、リグノセルロースを原料としてエタノールを生成する能力である、請求項3に記載の酵母。
- キシルロキナーゼを高発現させ、かつ、アルドースレダクターゼを欠損させた、請求項1〜4のいずれか1項に記載の酵母。
- 前記アルドースレダクターゼは相同組換えにより破壊されている、請求項1〜5のいずれか1項に記載の酵母。
- 前記キシルロキナーゼは前記酵母と同種または異種である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の酵母。
- 前記キシルロキナーゼはCgXK(配列番号29)である、請求項7に記載の酵母。
- 前記キシルロキナーゼはCgXK(配列番号29)であり、前記アルドースレダクターゼは破壊されている、請求項7または8に記載の酵母。
- Candida glabrata 3163 dgXK1(受託番号 NITE P−02493)、Candida glabrata 3163−CgXK(受託番号 NITE P−02494)、Candida glabrata 3163 Δgre3−35(受託番号 NITE P−02495)またはC. glabrata NFRI 3163(受託番号 NITE P−02496)で寄託された系統である酵母。
- Saccharomyces cerevisiae St10 dgXK1(受託番号
NITE P−01617)、Saccharomyces cerevisiae St10−ScXK(受託番号 NITE P−01618)、またはSaccharomyces cerevisiae St10 Δgre3−2(受託番号 NITE P−01619)で寄託された系統である酵母。 - キシロースおよび/またはキシロースを含む糖からエタノールを生産する方法であって、該方法は、該キシロースおよび/またはキシロースを含む糖を含む原料に、請求項1〜11のいずれか1項に記載の酵母を接触させる工程を包含する、方法。
- 前記接触は、キシロースイソメラーゼ(グルコースイソメラーゼ)の存在下で行われる、請求項12に記載の方法。
- 前記原料はリグノセルロースを含み、前記接触は40℃以上で行われる、請求項12に記載の方法。
- 前記接触は、キシロースイソメラーゼ(グルコースイソメラーゼ)の存在下で行われる、請求項14に記載の方法。
- 前記原料は稲わらを含み、前記接触は40℃以上で行われる、請求項12〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記接触工程の前に、前記原料をアルカリ処理する工程をさらに包含する、請求項12〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アルカリ処理は水酸化カルシウムによる、請求項17に記載の方法。
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