WO2016088276A1 - 高効率エタノール発酵菌 - Google Patents

高効率エタノール発酵菌 Download PDF

Info

Publication number
WO2016088276A1
WO2016088276A1 PCT/JP2014/082333 JP2014082333W WO2016088276A1 WO 2016088276 A1 WO2016088276 A1 WO 2016088276A1 JP 2014082333 W JP2014082333 W JP 2014082333W WO 2016088276 A1 WO2016088276 A1 WO 2016088276A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ethanol
strain
fermentation
bacteria
xylose
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/082333
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
芳樹 土田
育美 栗原
友裕 今井
郁 小池
Original Assignee
本田技研工業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 本田技研工業株式会社 filed Critical 本田技研工業株式会社
Priority to CN201480083837.5A priority Critical patent/CN107429218B/zh
Priority to JP2016562192A priority patent/JP6180660B2/ja
Priority to US15/532,712 priority patent/US10125379B2/en
Priority to EP14907207.6A priority patent/EP3228696B1/en
Priority to BR112017011307A priority patent/BR112017011307A2/pt
Priority to PCT/JP2014/082333 priority patent/WO2016088276A1/ja
Publication of WO2016088276A1 publication Critical patent/WO2016088276A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/165—Yeast isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01001—Alcohol dehydrogenase (1.1.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y202/00—Transferases transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C12Y202/01—Transketolases and transaldolases (2.2.1)
    • C12Y202/01002—Transaldolase (2.2.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/72—Candida
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • This invention relates to a microorganism for fermenting a saccharified solution in bioethanol production using lignocellulosic biomass.
  • C5 pentose sugar
  • C6 hexose sugar
  • Bioethanol is expected as a non-depleting renewable resource produced from biomass.
  • carbon dioxide generated by burning bioethanol is carbon neutral, it is considered that the increase in carbon dioxide, which is a major cause of global warming, is suppressed by the use of bioethanol.
  • xylose is a sugar that is contained in the biomass next to glucose, and the efficient use of pentose sugar is a major issue in bioethanol production.
  • Patent Document 1 discloses an invention in which xylose (C5) is converted into xylulose by introducing a gene having xylose transporter activity into a host cell, incorporated into a glycolytic pentose phosphate pathway, and used for fermentation. ing.
  • Patent Document 2 discloses a technique for producing an alcohol using a yeast provided with an arabinose transporter.
  • arabinose (C5) is incorporated into a glycolytic pentose phosphate pathway via arabitol and xylulose and used for fermentation.
  • Non-Patent Document 1 discloses that xylose utilization ability is imparted by incorporating a xylose utilization gene derived from Escherichia coli into Zymomonas.
  • Non-Patent Document 2 describes that Pichia yeasts produce ethanol using xylose.
  • Patent Document 1 introduces a protein having a xylose transporter activity derived from Candida guilliermondii into Saccharomyces cerevisiae as a host. That is, a foreign gene is introduced.
  • Patent Document 2 is an invention in which different types of genes are introduced into the host, although the transporter genes are different.
  • Non-Patent Document 1 introduces a xylose-utilizing gene. Although the technical idea is different from that of Patent Documents 1 and 2, it is not different from introducing a foreign gene.
  • Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Document 1 need to take containment measures to implement the “Cartagena Protocol on Biosafety of the Convention on Biological Diversity” adopted by the United Nations. Therefore, since a facility for assuring biosafety is required, it is disadvantageous in terms of cost to produce ethanol using the cells.
  • An object of the present invention is to obtain a fermenting bacterium having high ethanol production efficiency without introducing a foreign gene.
  • the present invention is a fermentative bacterium that efficiently produces ethanol from pentose and hexose sugars, and transaldolase by self-cloning into the fermenter that has been deposited at the Patent Microorganism Depositary under the deposit number NITE BP-01964. An alcohol dehydrogenase gene is introduced.
  • Wild type Meyerozyma guilliermondi has the ability to assimilate xylose. However, it does not have sufficient xylose utilization for bioethanol production.
  • Patent Microorganism Depositary Center National BP 292-0818, Japan Institute for Product Evaluation Technology, Patent Microorganism Depositary Center, Kazusa Kamazu, Kisarazu City, Chiba Prefecture
  • deposit number NITE BP-01964 as of November 19, 2014 (contract date) 2-5-8 (No. 122)
  • the bacteria deposited hereinafter sometimes referred to as BP-01964 strain
  • the strain of the present invention is a strain obtained by further introducing a transaldolase or alcohol dehydrogenase gene into the BP-01964 bacterium by self-cloning to improve ethanol production ability.
  • the bacterium of the present invention is deposited as a receipt number NITE ABP-01976 at the Patent Microorganism Depositary Center, which has a particularly high ethanol production ability, among the above-mentioned gene-transferred strains, and has been deposited as of December 4, 2014 (date of receipt). It is characterized by being a fungus (hereinafter sometimes referred to as ABP-01976 strain).
  • the strain deposited under the deposit number ABP-01976 has a high ethanol production ability.
  • the parent strain (N strain) of Meyerozyma guilliermondi was bred using a sugar solution derived from rice straw, and a strain having a high ethanol production ability was selected.
  • Rice straw from Kumagaya was soaked in an equal amount of 25% aqueous ammonia at 80 ° C. for 3 hours, and then ammonia was released.
  • the treated biomass was adjusted to pH 4 with 10% NaOH aqueous solution, added with Acremonium cellulase (manufactured by Meiji Seika Pharma), and subjected to enzymatic saccharification at 50 ° C. for 72 hours.
  • the prepared slurry was subjected to solid-liquid separation by a filter press method to recover the liquid.
  • acclimation culture was carried out for 19 months while adding a mutagen, and a strain with improved fermentation performance was selected. Fermentation performance improving strains were selected based on the amount of ethanol produced after a certain period of time.
  • a strain having a high fermentation performance was deposited with the Patent Microorganism Deposit Center, National Institute of Technology and Evaluation, under the accession number NITE BP-01964, dated November 19, 2014 (date of deposit).
  • the BP-01964 strain is a strain that produces ethanol more than twice that of the wild type (N strain), and further has the ability to assimilate not only C6 glucose but also C5 xylose. It has been confirmed that it has improved.
  • transaldolase and alcohol dehydrogenase genes were introduced into the BP-01964 strain by self-cloning to obtain a bacterium having a higher ethanol production ability.
  • Transaldolase is derived from cetoheptulose-7-phosphate (S7P) and glyceraldehyde 3-phosphate (GAP) in the pentose phosphate pathway branched from the glycolytic system to erythrose-4-phosphate (E4P) and fructose 6-phosphate (F6P). It is an enzyme that catalyzes the metabolism to). By introducing this enzyme, the effect of improving ethanol yield in the presence of acetic acid as an inhibitor has been confirmed.
  • the promoter of xylose reductase was connected upstream of transaldolase. This is because it is considered that transaldolase acts efficiently by using a promoter of xylose reductase that functions during xylose utilization.
  • Alcohol dehydrogenase is an enzyme that can produce ethanol from acetaldehyde. It converts aldehydes contained in rice sugar solution obtained by treating ammonia-treated rice straw with saccharifying enzyme into ethanol. It is an enzyme that can weaken toxicity. Alcohol dehydrogenase has an action of converting acetaldehyde into ethanol and produces NAD + when it is NADH-dependent, and therefore has an action of enhancing the action of NAD + -dependent xylitol dehydrogenase.
  • GAPDH promoter was connected upstream of the alcohol dehydrogenase.
  • Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) is a strong promoter that exists in glycolysis, and therefore, it can be efficiently used by using it as a promoter for alcohol dehydrogenase, a glycolytic enzyme. It is done.
  • the gene to be introduced and its terminator part are PCR amplified. Amplify the promoter part to be used for introduction. All of these are PCR-amplified from the chromosome of Meyerozyma guilliermondi, the strain used in the present invention.
  • the PCR-amplified DNA fragment is cloned into a commercially available vector for Escherichia coli using an infusion method so that the sequence is the promoter, gene + terminator part.
  • the cloned vector is transformed into E. coli and the vector is amplified.
  • a DNA fragment for homologous recombination is obtained by excising the promoter and gene + terminator from the amplified vector with a restriction enzyme, or by PCR amplification from the amplified vector.
  • SEQ ID NO: 1 AAGGCTTGGGAACTTTCTTT
  • SEQ ID NO: 2 AGCAATTGATGATTAATTTT
  • SEQ ID NO: 3 ATGACCAATTCTCTTGAACA
  • SEQ ID NO: 4 AAATTGTGCCGGTCAAACT
  • the GAPDH promoter was specifically amplified using the primers of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, and the alcohol dehydrogenase gene and terminator part were amplified using the primers of SEQ ID NOs: 7 and 8 below.
  • Sequence number 5 GTTGTAGCGGAGGCTCAATT SEQ ID NO: 6: TGTATAATTTAAATGTGGGT Sequence number 7: ATGTCAATTCCAGAATCCAT SEQ ID NO: 8: CACTCTGGCTGGAAGTCTG
  • the obtained DNA fragment was homologously recombined with the strain to obtain the desired strain.
  • the electroporation method was used for homologous recombination.
  • the DNA fragments for homologous recombination are in the order of xylose reductase promoter, transaldolase + terminator, GAPDH promoter, alcohol dehydrogenase + terminator.
  • the strain obtained by this method has introduced a gene, since it is self-cloning, it belongs to the category of treating as a non-recombinant bacterium in the Cartagena method.
  • Bacteria with high ethanol-producing ability were isolated from the gene-introduced strain and deposited at the Patent Microorganism Depositary Center to obtain deposit number NITE ABP-01976. The gene expression and fermentation yield were confirmed in the recombinant bacteria into which the gene was introduced.
  • transaldolase gene was analyzed by real-time PCR.
  • a PCR device Applied Biosystems
  • SYBR Green Master Mix Applied Biosystems
  • the following SEQ ID NOs: 9 and 10 were used as primers.
  • ethanol production ability was analyzed using corn stover sugar solution.
  • a saccharified solution in which corn stover was treated with dilute sulfuric acid and adjusted to pH 5.2 a culture solution of the strain was added so that the OD 600 of the medium was 2.0.
  • the amount of ethanol in the culture solution after culturing at 30 ° C. for 96 hours is shown.
  • the glucose in the saccharified solution was 63.2 g / L, and xylose was 34.5 g / L.
  • GC-FID manufactured by GL Sciences Inc .: GC390B
  • the results are shown in FIG. 1B.
  • the ethanol production ability was also enhanced about 1.5 times that of the original strain.
  • the properties of the strain of the present invention were analyzed.
  • the parent strain N has a fermentation yield of about 48%
  • the high ethanol-producing strain BP-01964 obtained by breeding has a fermentation yield of 80%
  • the strain ABP-01976, a fermentation strain had a fermentation yield of 84% and a higher ethanol productivity.
  • delta in the figure is the fermentation yield of fermentation bacteria of other companies, it is clear that a high fermentation yield is also shown compared with these bacteria.
  • the slurry fermenter has a jacket structure, and the temperature was adjusted by circulating hot water through the jacket. Also, a vent was provided in the bottom, and a predetermined amount of air passed through the filter was continuously vented from the vent in the bottom, and fermentation was performed while stirring with a spatula linked to a motor.
  • the glucose that is C6 is consumed first, but then the xylose that is C5 is consumed with the decrease of glucose in the slurry, and ethanol is produced.
  • the obtained bacteria can efficiently produce ethanol because both C5 and C6 have the ability to assimilate. Therefore, it is a strain useful for industrial production.
  • the ABP-01976 strain has enhanced the xylose-utilizing ability of wild-type Meyerozyma guilliermondi by breeding, so that ethanol can be efficiently used regardless of whether rice straw or corn stover is used as biomass. Production can be performed.
  • the xylose utilization ability of wild-type Meyerozyma guilliermondi has been enhanced by breeding, and furthermore, a strain having a high ethanol production ability was obtained by genetic recombination. Furthermore, ethanol can be efficiently produced regardless of whether rice straw or corn stover is used as biomass.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　外来遺伝子を導入することなく、エタノール産生効率の高い発酵菌を得ることを課題とする。さらに、発酵菌の増殖を妨げる有機酸等の増殖阻害物質に耐性のある発酵菌を得ることを課題とする。　育種によって五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノール生産することができるMeyerozyma guilliermondiiに、セルフクローニングによりトランスアルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することによって、エタノール産生能を向上した菌を作成した。本菌株は受託番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０１９７６として、特許微生物寄託センターに寄託されている。

Description

高効率エタノール発酵菌
　リグノセルロース系バイオマスを用いたバイオエタノール生産において、糖化溶液を発酵するための微生物に関する。
　特に、リグノセルロース系バイオマスを用いたバイオエタノール生産において、五炭糖（以下、Ｃ５ということもある。）、及び六炭糖（以下、Ｃ６ということもある。）から効率的にエタノール生産することができる微生物に関する。
　バイオエタノールは、バイオマスから産生される枯渇することのない再生可能資源として期待されている。また、バイオエタノールを燃焼させて発生する二酸化炭素はカーボンニュートラルであることから、バイオエタノールの利用が進むことによって、地球温暖化の主な原因である二酸化炭素の上昇を抑制すると考えられている。
　バイオエタノールは、バイオマスを発酵させ、蒸留してエタノールを精製する。バイオエタノールの収率を高めるために糖化溶液から多くのアルコールを生成する必要がある。バイオエタノール生産の過程で一般的に用いられている酵母は、キシロース、アラビノースなどの五炭糖をアルコールに変換できないため、発酵原料としては六炭糖のみが用いられてきた。
　原料によって異なるものの典型的なバイオマスには、３５～４５％のセルロース、２５～４０％のヘミセルロース、１５～３０％のリグニンが含まれていると言われている。したがって、六炭糖が重合しているセルロースだけではなく、五炭糖であるキシロース等を主として含有するヘミセルロースを基質として利用することは効率的なエタノール産生につながることになる。
　キシロースはグルコースの次にバイオマス中に多く含まれている糖であると言われており、五炭糖を効率的に利用することはバイオエタノール生産において大きな課題となっている。
　これまでに、遺伝子組換えによるキシロース利用能の付与や、キシロースを利用してエタノールを産生する微生物の利用等により、キシロースを少しでも利用する技術が開示されている。
　特許文献１には、キシローストランスポーター活性を有する遺伝子を宿主細胞に導入することによって、キシロース（Ｃ５）をキシルロースに変換し、解糖系のペントースリン酸経路に組み入れ、発酵に利用する発明が開示されている。
　特許文献２には、アラビノーストランスポーターを付与した酵母によって、アルコールを生成する技術が開示されている。特許文献１と同様にアラビノース（Ｃ５）をアラビトール、キシルロースを経て解糖系のペントースリン酸経路に組み入れ、発酵に利用するものである。
　非特許文献１には、大腸菌由来のキシロース資化遺伝子をザイモモナスに組み込むことにより、キシロース資化能を付与することが開示されている。
　非特許文献２には、ピキア属酵母が、キシロースを利用してエタノールを生産することが記載されている。
特開2012-170422号公報 米国特許出願公開第2013/189788号明細書
Zhang, M., et al., Science, 1995. Vol. 267, pp. 240-243. Bicho, P.A., et al., Appl. Environ. Microbiol., 1988, Vol. 54, pp. 50-54.
　しかしながら、特許文献１の発明は、Candida guilliermondii由来のキシローストランスポーター活性のあるタンパク質を宿主としてSaccharomyces cerevisiaeに導入している。すなわち外来遺伝子を導入することになる。
　また、特許文献２の発明もトランスポーター遺伝子は異なるものの、宿主に対して異なる種の遺伝子を導入する発明である。
　また、非特許文献１に記載の技術は、キシロース資化遺伝子を導入するものであり、上記特許文献１及び２とは技術思想は異なるが、外来遺伝子を導入することに変わりない。
　そのため、上記特許文献１及び２、非特許文献１はいずれも国連で採択された「生物の多様性に関する条約のバイオセーフティに関するカルタヘナ議定書」を実施するための封じ込め策を講じる必要がある。したがって、バイオセーフティを保証するための施設を必要とすることから、当該菌体を利用してエタノールを生産することはコストの面で不利である。
　また、非特許文献２に記載の技術によって、ピキア属酵母を利用することは、野生型のピキア属酵母のキシロース利用性が低いため、エタノール産生効率はさほど高くならない。
　本発明は、外来遺伝子を導入することなく、エタノール産生効率の高い発酵菌を得ることを課題とする。
　本発明は、五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、特許微生物寄託センターに寄託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９６４として寄託されている発酵菌に、セルフクローニングによりトランスアルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したことを特徴とする。
　野生型Meyerozyma guilliermondiはキシロース資化能を備えている。しかしながら、バイオエタノール生産に十分なキシロース利用能を備えているわけではない。受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９６４として、２０１４年１１月１９日（受託日）付けで特許微生物寄託センター（日本国　〒２９２－０８１８　独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター　千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8　122号室）に寄託されている菌（以下、ＢＰ－０１９６４株ということもある。）は、Meyerozyma guilliermondiを菌株育種により五炭糖の利用効率の高い菌を選択して得たものである。その結果、親株に対して約２倍のエタノール生産性を備えた菌を選択することができた。
　本発明の菌株はＢＰ－０１９６４の菌にさらにセルフクローニングによりトランスアルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入して、エタノール産生能を向上させたものである。
　Meyerozyma guilliermondii自身の酵素遺伝子を導入することはカルタヘナ法に則した封じ込め策を必要としない。したがって、バイオセーフティのための特別な施設を必要とせず、従来の設備を使用することができる。
　さらに、本発明の菌は上記遺伝子導入菌株のうち、特にエタノール産生能の高い、特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０１９７６として、２０１４年１２月４日（受領日）付けで寄託されている菌（以下、ＡＢＰ－０１９７６株ということもある）であることを特徴とする。
　ＢＰ－０１９６４菌株に、セルフクローニングによりトランスアルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した組換え菌株の中でも、特に寄託番号ＡＢＰ－０１９７６として寄託された菌株はエタノール産生能が高い。
遺伝子組換えにより導入した菌株において、トランスアルドラーゼの発現増強、発酵収率の向上を示す図。 親株（N株）、育種によりエタノール産生を向上させたＢＰ－０１９６４株、本発明のＡＢＰ－０１９７６株の発酵収率を示す図。 スラリー発酵でのグルコース、キシロース資化能を示す図。 スラリー発酵、清澄液発酵での発酵収率を示す図。
　以下、本件発明の菌株について以下に説明する。
１．菌株の単離
　Meyerozyma guilliermondiの親株（Ｎ株）を稲わら由来の糖液を用い育種を行い、エタノール産生能の高い株を選択した。熊谷産の稲わらを、等量の２５％アンモニア水に８０℃３時間漬け込んだ後、アンモニアを放散させた。処理したバイオマスは、ｐＨを１０％ＮａＯＨ水溶液で４に調整後、アクレモニウムセルラーゼ（Meiji Seika ファルマ社製）を添加して、５０℃７２時間酵素糖化を行った。作成したスラリーはフィルタープレス法にて固液分離を行い液体を回収した。この液体（以下、清澄液ともいう。）を用いて、変異剤を加えながら１９ヶ月馴化培養を行い、発酵性能向上株を選抜した。発酵性能向上株は、一定時間後の生成エタノール量を基準に選抜した。発酵性能の高い菌株を独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９６４として、２０１４年１１月１９日（受託日）付けで寄託した。
　ここでは示さないが、ＢＰ－０１９６４菌株は、野生型（N株）に対して２倍以上エタノールを産生する株であり、さらにＣ６であるグルコースだけではなく、Ｃ５であるキシロースの資化能が向上していることを確認している。
　次に、ＢＰ－０１９６４菌株にセルフクローニングによりトランスアルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入して、さらにエタノール産生能の高い菌を得た。
　アンモニア処理稲わら液を用い、糖化酵素で処理して糖液を得る際に、副産物として有機酸、アルデヒド、フェノール等の発酵阻害物質が産生する。特に酢酸は約１０００ｍｇ／Ｌと非常に多量に存在し、発酵収率を低下させる。したがって、酢酸による発酵菌の増殖阻害を抑制することができれば、さらにエタノール産生効率を向上させることができる。
　トランスアルドラーゼは、解糖系から分岐したペントースリン酸経路のセドヘプツロース－７－リン酸（Ｓ７Ｐ）及びグリセルアルデヒド３リン酸（ＧＡＰ）からエリトロース－４－リン酸（Ｅ４Ｐ）及びフルクトース６リン酸（Ｆ６Ｐ）への代謝を触媒する酵素である。この酵素を導入することによって、阻害物質である酢酸存在下でのエタノール収率向上効果が確認されている。
　トランスアルドラーゼの上流にはキシロースレダクターゼのプロモーターをつなげた。キシロース資化の際に機能するキシロースレダクターゼのプロモーターを用いることによって、トランスアルドラーゼが効率良く作用すると考えられるからである。
　また、アルコールデヒドロゲナーゼはアセトアルデヒドからエタノールを産生させることができる酵素であり、アンモニア処理稲わら液を糖化酵素で処理して得られた稲藁糖液に阻害物質として含まれるアルデヒド類をエタノールに変換して毒性を弱めることができる酵素である。アルコールデヒドロゲナーゼはアセトアルデヒドをエタノールに変換する作用を持つとともに、ＮＡＤＨ依存の場合にはＮＡＤ＋を生産するため、ＮＡＤ＋依存のキシリトールデヒドロゲナーゼの作用を強化する作用がある。
　アルコールデヒドロゲナーゼの上流にはＧＡＰＤＨのプロモーターをつなげた。グリセロアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）は解糖系に存在する強力なプロモーターであることから、解糖系の酵素であるアルコールデヒドロゲナーゼのプロモーターとして使用することにより、効率よく作用すると考えられる。
　したがって、２つの酵素を遺伝子導入により導入した組換え発酵菌を作成することができれば、よりエタノール産生能の高い菌を得ることが期待できる。
　遺伝子導入は、次の手順を取った。導入したい遺伝子及びそのターミネーター部（以下、遺伝子+ターミネーター部という。）をＰＣＲ増幅する。導入に用いたいプロモーター部をＰＣＲ増幅する。これらは何れも本発明で用いた菌株であるMeyerozyma guilliermondiの染色体からＰＣＲ増幅する。
　ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片をプロモーター、遺伝子+ターミネーター部の順になるよう、インフュージョン法を用いて、大腸菌用の市販ベクターにクローニングする。クローニングされたベクターを大腸菌に形質転換し、ベクターを増幅する。増幅したベクターからプロモーター及び遺伝子＋ターミネーター部を制限酵素で切出す、あるいは増幅したベクターからＰＣＲ増幅することにより、相同組換用のＤＮＡ断片を得る。
　キシロースレダクターゼのプロモーターは下記配列番号１及び配列番号２のプライマー、トランスアルドラーゼ遺伝子及びターミネーター部分は下記配列番号３及び４のプライマーを用いて増幅した。
配列番号１：ＡＡＧＧＣＴＴＧＧＧＡＡＣＴＴＴＣＴＴＴ
配列番号２：ＡＧＣＡＡＴＴＧＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＴＴ
配列番号３：ＡＴＧＡＣＣＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＣＡ
配列番号４：ＡＡＡＴＴＧＴＧＣＣＧＴＧＴＣＡＡＡＣＴ
　また、ＧＡＰＤＨのプロモーターは具体的には下記配列番号５及び配列番号６のプライマー、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びターミネーター部分は下記配列番号７及び８のプライマーを用いて増幅した。
配列番号５：ＧＴＴＧＴＡＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＡＡＴＴ
配列番号６：ＴＧＴＡＴＡＡＴＴＴＡＡＡＴＧＴＧＧＧＴ
配列番号７：ＡＴＧＴＣＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＴＣＣＡＴ
配列番号８：ＣＡＣＣＴＴＧＧＣＴＧＧＡＡＧＴＧＣＴＧ
　得られたＤＮＡ断片を菌株に相同組換えし、所望の菌株を得た。相同組換にはエレクトロポレーション法を用いた。相同組換用ＤＮＡ断片は、キシロースレダクターゼのプロモーター、トランスアルドラーゼ＋ターミネーター、ＧＡＰＤＨのプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ＋ターミネーターの順となっている。また、この方法により得られた菌株は、遺伝子を導入しているが、セルフクローニングであるため、カルタヘナ法上、非組換菌扱いになる範疇に属するものとなっている。
　遺伝子導入した菌株からエタノール産生能の高い菌を単離し、特許微生物寄託センターに寄託し寄託番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０１９７６を得た。遺伝子導入を行った組換え菌での遺伝子発現、発酵収率を確認した。
　リアルタイムＰＣＲによってトランスアルドラーゼ遺伝子の発現を解析した。リアルタイムＰＣＲにあたってはＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。プライマーは下記配列番号９及び１０を用いた。
配列番号９：ＧＧＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＴ
配列番号１０：ＣＡＴＴＧＧＣＣＣＴＴＴＣＣＡＣＣＡＴ
　図１Ａに示すように、トランスアルドラーゼ遺伝子を導入した組換え菌では、２倍の発現増加が見られる。
　また、コーンストーバー糖液を用いてエタノール産生能を解析した。コーンストーバーを希硫酸処理しｐＨを５．２に調整した糖化液を用い、菌株の培養液を培地のＯＤ６００が２．０となるように添加した。３０℃、９６時間培養した後の培養液中のエタノール量を示す。糖化溶液のグルコースは、６３．２ｇ／Ｌ、キシロースは３４．５ｇ／Ｌであった。エタノール測定はＧＣ－ＦＩＤ（ジーエルサイエンス社製：ＧＣ３９０Ｂ）を用いた。結果を図１Ｂに示す。エタノール産生能も元の菌株に対して約１．５倍程度増強していた。次に、本発明の菌株の性質を解析した。
２．菌株の性質
２．１　発酵収率
　親株、本発明の株の発酵試験を行った。糖濃度の異なる希硫酸処理コーンストーバー由来酵素糖化溶液をｐＨ６に調整した溶液を複数用い、菌株の培養液を培地のＯＤ６００が２．０となるように添加し３０℃、９６時間培養して得られたエタノール濃度と投入糖化溶液の糖濃度から計算した発酵収率をプロットした。結果を図２に示す。
　図２に示すように親株であるＮ株は発酵収率が約４８％であるのに対し、育種によって得られた高エタノール産生株ＢＰ－０１９６４株は発酵収率が８０％であり、本発明の株であるＡＢＰ－０１９７６株は発酵収率が８４％とさらにエタノール産生能が高くなっていた。また、図中△で示しているのは他社の発酵菌の発酵収率であるが、これらの菌に比べても高い発酵収率を示すことは明らかである。
２．２　キシロース資化能の検討
　次に、稲わらをアンモニア水で前記アンモニア処理と同様に処理した後、アクレモニウムセルラーゼを添加して、５０℃７２時間酵素糖化を行い、作成したスラリーを用いて発酵を行った。
　スラリー発酵槽はジャケット構造になっており、温度はジャケット部に温水を循環させて調節を行った。また、底部には通気口を設けてあり、底部の通気口からは、フィルタを通した空気を所定量通気し続け、モータに連動したヘラで撹拌を行いながら発酵を行った。
　スラリー中に含まれるグルコース、キシロース、エタノールの量の経時的な変化の解析を行った。グルコース、キシロースはスラリーをサンプリングし、遠心により得た上清をＨＰＬＣ測定にかけて測定した。エタノールは上記と同様にＧＣ－ＦＩＤ（ジーエルサイエンス社製：ＧＣ３９０Ｂ）を用いた。結果を図３に示す。
　Ｃ６であるグルコースが先に消費されるが、その後、スラリー中のグルコースの減少とともにＣ５であるキシロースが消費され、エタノールが産生される。得られた菌は、Ｃ５、Ｃ６ともに資化能を備えていることから、効率よくエタノールを産生することができる。したがって、工業生産的にも有用な菌株である。
２．３　スラリー発酵能、清澄液発酵能
　バイオエタノール産生を行うときに、スラリー、清澄液、どちらを用いた場合であっても効率よく発酵する菌であることが望ましい。そこで、スラリー、清澄液を用いて発酵収率を比較した。発酵収率は以下の式により計算される。
発酵収率＝得られたエタノール量（ｇ／Ｌ）／発酵開始時の糖液に含まれていたグルコース＋キシロース量（ｇ／Ｌ）／０．５１１４
　図４に示すように、スラリー発酵であっても、清澄液発酵であっても、同等の性能を発揮することのできる菌株を得ることができた。
　ＡＢＰ－０１９７６菌株は、以上示してきたように、野生型Meyerozyma guilliermondiのキシロース資化能が育種によって強化されており、バイオマスとして稲わら、コーンストーバーどちらを用いた場合であっても効率的にエタノール産生を行うことができる。
　以上示してきたように、野生型Meyerozyma guilliermondiのキシロース資化能が育種によって強化されており、さらに遺伝子組換えによってエタノール産生能が高い菌株を得ることができた。さらに、バイオマスとして稲わら、コーンストーバーどちらを用いた場合であっても効率的にエタノール産生を行うことができる。
[規則26に基づく補充 08.01.2015]　
Figure WO-DOC-FIGURE-RO134

Claims (2)

  1. 　五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、
    　特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０１９６４として寄託されている発酵菌に、セルフクローニングによりトランスアルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したことを特徴とする高効率エタノール発酵菌。
  2. 　請求項１記載の高効率エタノール発酵菌において、
    　特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０１９７６として寄託されていることを特徴とする高効率エタノール発酵菌。
     
PCT/JP2014/082333 2014-12-05 2014-12-05 高効率エタノール発酵菌 WO2016088276A1 (ja)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201480083837.5A CN107429218B (zh) 2014-12-05 2014-12-05 高效乙醇发酵菌
JP2016562192A JP6180660B2 (ja) 2014-12-05 2014-12-05 高効率エタノール発酵菌
US15/532,712 US10125379B2 (en) 2014-12-05 2014-12-05 Highly efficient ethanol-fermentative yeast
EP14907207.6A EP3228696B1 (en) 2014-12-05 2014-12-05 Highly efficient ethanol-fermentative bacteria
BR112017011307A BR112017011307A2 (pt) 2014-12-05 2014-12-05 leveduras fermentativas de etanol altamente eficientes
PCT/JP2014/082333 WO2016088276A1 (ja) 2014-12-05 2014-12-05 高効率エタノール発酵菌

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2014/082333 WO2016088276A1 (ja) 2014-12-05 2014-12-05 高効率エタノール発酵菌

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016088276A1 true WO2016088276A1 (ja) 2016-06-09

Family

ID=56091247

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2014/082333 WO2016088276A1 (ja) 2014-12-05 2014-12-05 高効率エタノール発酵菌

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10125379B2 (ja)
EP (1) EP3228696B1 (ja)
JP (1) JP6180660B2 (ja)
CN (1) CN107429218B (ja)
BR (1) BR112017011307A2 (ja)
WO (1) WO2016088276A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10131917B2 (en) * 2014-12-05 2018-11-20 Honda Motor Co., Ltd. Highly efficient ethanol-fermentative yeast

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011024500A (ja) * 2009-07-27 2011-02-10 Toyota Central R&D Labs Inc 発酵能力が向上された酵母及びその利用
WO2011065539A1 (ja) * 2009-11-30 2011-06-03 国立大学法人神戸大学 バイオマスからのエタノールの生産方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7846712B2 (en) 2006-06-01 2010-12-07 Alliance For Sustainable Energy, Llc L-arabinose fermenting yeast
BR112012026370B8 (pt) * 2010-04-14 2020-05-19 Lesaffre & Cie levedura industrial capaz de produzir etanol a partir de pelo menos uma pentose
JP2012170422A (ja) 2011-02-23 2012-09-10 Kyoto Institute Of Technology キシローストランスポーター活性を有する新規タンパク質および当該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びにそれらの利用
US10131917B2 (en) * 2014-12-05 2018-11-20 Honda Motor Co., Ltd. Highly efficient ethanol-fermentative yeast

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011024500A (ja) * 2009-07-27 2011-02-10 Toyota Central R&D Labs Inc 発酵能力が向上された酵母及びその利用
WO2011065539A1 (ja) * 2009-11-30 2011-06-03 国立大学法人神戸大学 バイオマスからのエタノールの生産方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CESAR FONSECA ET AL.: "L-Arabinose metabolism in Candida arabinofermentans PYCC 5603T and Pichia guilliermondii PYCC 3012: influence of sugar and oxygen on product formation", APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 75, 2007, pages 303 - 310, XP019513655, DOI: doi:10.1007/s00253-006-0830-7 *
HAN LI-LI ET AL.: "Breeding of Higher Ethanol Fermentation of Xylose Strain with Protoplast Fusion and Mutagenisis", LIQUOR MAKING, vol. 35, no. 2, 2008, pages 38 - 41, XP008185458 *
See also references of EP3228696A4 *
T.GRANSTRÖM ET AL.: "Chemostat study of xylitol production by Candida guilliermondii", APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 55, 2001, pages 36 - 42, XP055373626 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3228696B1 (en) 2019-05-15
EP3228696A1 (en) 2017-10-11
CN107429218B (zh) 2020-08-11
US20170349917A1 (en) 2017-12-07
JPWO2016088276A1 (ja) 2017-05-25
BR112017011307A2 (pt) 2018-07-31
US10125379B2 (en) 2018-11-13
CN107429218A (zh) 2017-12-01
EP3228696A4 (en) 2018-04-25
JP6180660B2 (ja) 2017-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6087854B2 (ja) 組換え酵母を用いたエタノールの製造方法
JP2011167096A (ja) バイオマスからのエタノールの生産方法
CN111712576B (zh) 微生物菌株及其用途
JP6228323B2 (ja) 高効率エタノール発酵菌
JP6180660B2 (ja) 高効率エタノール発酵菌
JP6240344B2 (ja) 高効率エタノール発酵菌
JP6145583B2 (ja) 高効率エタノール発酵菌
US10017788B2 (en) Recombinant yeast and method for producing ethanol using the same
JP6249391B2 (ja) キシロースを高温で発酵する方法
JP2014064484A (ja) キシロオリゴ糖を資化し得る遺伝子組み換え酵母、該遺伝子組み換え酵母の選別方法、及び該遺伝子組み換え酵母を用いるエタノール製造方法
TWI555842B (zh) 釀酒酵母菌株轉殖株、其用途及應用其生產生質乙醇方法
CN107429221B (zh) 高效乙醇发酵菌
WO2015044101A1 (en) Process for conversion of pentose containing substrate

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14907207

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016562192

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2014907207

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15532712

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112017011307

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112017011307

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20170529