JPWO2016088276A1 - 高効率エタノール発酵菌 - Google Patents
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Abstract
Description
Meyerozyma guilliermondiの親株(N株)を稲わら由来の糖液を用い育種を行い、エタノール産生能の高い株を選択した。熊谷産の稲わらを、等量の25%アンモニア水に80℃3時間漬け込んだ後、アンモニアを放散させた。処理したバイオマスは、pHを10%NaOH水溶液で4に調整後、アクレモニウムセルラーゼ(Meiji Seika ファルマ社製)を添加して、50℃72時間酵素糖化を行った。作成したスラリーはフィルタープレス法にて固液分離を行い液体を回収した。この液体(以下、清澄液ともいう。)を用いて、変異剤を加えながら19ヶ月馴化培養を行い、発酵性能向上株を選抜した。発酵性能向上株は、一定時間後の生成エタノール量を基準に選抜した。発酵性能の高い菌株を独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに、受託番号NITE BP−01964として、2014年11月19日(受託日)付けで寄託した。
配列番号1:AAGGCTTGGGAACTTTCTTT
配列番号2:AGCAATTGATGATTAATTTT
配列番号3:ATGACCAATTCTCTTGAACA
配列番号4:AAATTGTGCCGTGTCAAACT
配列番号5:GTTGTAGCGGAGGCTCAATT
配列番号6:TGTATAATTTAAATGTGGGT
配列番号7:ATGTCAATTCCAGAATCCAT
配列番号8:CACCTTGGCTGGAAGTGCTG
配列番号9:GGCGAGAAACACCCTCCAT
配列番号10:CATTGGCCCTTTCCACCAT
2.1 発酵収率
親株、本発明の株の発酵試験を行った。糖濃度の異なる希硫酸処理コーンストーバー由来酵素糖化溶液をpH6に調整した溶液を複数用い、菌株の培養液を培地のOD600が2.0となるように添加し30℃、96時間培養して得られたエタノール濃度と投入糖化溶液の糖濃度から計算した発酵収率をプロットした。結果を図2に示す。
次に、稲わらをアンモニア水で前記アンモニア処理と同様に処理した後、アクレモニウムセルラーゼを添加して、50℃72時間酵素糖化を行い、作成したスラリーを用いて発酵を行った。
バイオエタノール産生を行うときに、スラリー、清澄液、どちらを用いた場合であっても効率よく発酵する菌であることが望ましい。そこで、スラリー、清澄液を用いて発酵収率を比較した。発酵収率は以下の式により計算される。
発酵収率=得られたエタノール量(g/L)/発酵開始時の糖液に含まれていたグルコース+キシロース量(g/L)/0.5114
ローストランスポーター活性のあるタンパク質を宿主としてSaccharomycescerevisiaeに導入している。すなわち外来遺伝子を導入することになる。
[0015]
また、特許文献2の発明もトランスポーター遺伝子は異なるものの、宿主に対して異なる種の遺伝子を導入する発明である。
[0016]
また、非特許文献1に記載の技術は、キシロース資化遺伝子を導入するものであり、上記特許文献1及び2とは技術思想は異なるが、外来遺伝子を導入することに変わりない。
[0017]
そのため、上記特許文献1及び2、非特許文献1はいずれも国連で採択された「生物の多様性に関する条約のバイオセーフティに関するカルタヘナ議定書」を実施するための封じ込め策を講じる必要がある。したがって、バイオセーフティを保証するための施設を必要とすることから、当該菌体を利用してエタノールを生産することはコストの面で不利である。
[0018]
また、非特許文献2に記載の技術によって、ピキア属酵母を利用することは、野生型のピキア属酵母のキシロース利用性が低いため、エタノール産生効率はさほど高くならない。
[0019]
本発明は、外来遺伝子を導入することなく、エタノール産生効率の高い発酵菌を得ることを課題とする。
課題を解決するための手段
[0020]
本発明の高効率エタノール発酵菌は、五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、特許微生物寄託センターに受託番号NITE BP−01964として寄託されている発酵菌に、セルフクローニングによりトランスアルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した菌であり、スラリーと清澄液とのどちらを用いても、同等のエタノール産生能を発揮することができ、バイオマスとして稲わら又はコーンストーバーを用いてエタノール産生を行うことができ、特許微生物寄託センターに受託番号NITE ABP−01976として寄託されていることを特徴とする。
[0021]
野生型Meyerozyma guilliermondiはキシロース資化能を備えている。しかしながら、バイオエタノール生産に十分なキシロース利用能を備えているわけではない。受託番号NITE BP−01964として、2014年11月19日(受託日)付けで特許微生物寄託センター(日本国 〒292−0818 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター 千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 122号室)に寄託されている菌(以下、BP
−01964株ということもある。)は、Meyerozyma guilliermondiを菌株育種により五炭糖の利用効率の高い菌を選択して得たものである。その結果、親株に対して約2倍のエタノール生産性を備えた菌を選択することができた。
[0022]
本発明の菌株はBP−01964の菌にさらにセルフクローニングによりトランスアルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入して、エタノール産生能を向上させた遺伝子導入菌株のうち、特にエタノール産生能の高い、特許微生物寄託センターに受託番号NITE ABP−01976として、2014年12月4日(受託日)付けで寄託されている菌(以下、ABP−01976株ということもある)である。
[0023]
Meyerozyma guilliermondii自身の酵素遺伝子を導入することはカルタヘナ法に則した封じ込め策を必要としない。したがって、バイオセーフティのための特別な施設を必要とせず、従来の設備を使用することができる。
[0024]
[0025]
BP−01964菌株に、セルフクローニングによりトランスアルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した組換え菌株の中でも、特に寄託番号ABP−01976として寄託された菌株はエタノール産生能が高い。
図面の簡単な説明
[0026]
[図1]遺伝子組換えにより導入した菌株において、トランスアルドラーゼの発現増強、発酵収率の向上を示す図。
[図2]親株(N株)、育種によりエタノール産生を向上させたBP−01964株、本発明のABP−01976株の発酵収率を示す図。
[図3]スラリー発酵でのグルコース、キシロース資化能を示す図。
[図4]スラリー発酵、清澄液発酵での発酵収率を示す図。
発明を実施するための形態
[0027]
以下、本件発明の菌株について以下に説明する。
実施例
Claims (2)
- 五炭糖及び六炭糖から効率的にエタノールを産生する発酵菌であって、
特許微生物寄託センターに受託番号NITE BP−01964として寄託されている発酵菌に、セルフクローニングによりトランスアルドラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入したことを特徴とする高効率エタノール発酵菌。 - 請求項1記載の高効率エタノール発酵菌において、
特許微生物寄託センターに受領番号NITE ABP−01976として寄託されていることを特徴とする高効率エタノール発酵菌。
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