TWI555842B - 釀酒酵母菌株轉殖株、其用途及應用其生產生質乙醇方法 - Google Patents

Description

釀酒酵母菌株轉殖株、其用途及應用 其生產生質乙醇方法

本發明是有關於一種釀酒酵母菌轉殖株及其用途，特別是有關於一種對含有醛基之呋喃衍生物具高耐受性和高乙醇耐受性之釀酒酵母菌轉殖株及其用途。

醣類物質經高溫或酸水解後，常會伴隨含有醛基之呋喃衍生物生成，所產生的含有醛基之呋喃衍生物主要為糠醛(2-furaldehyde；furfural)及5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethyl-furfural,HMF)。糠醛為一種黑色且易揮發之油狀液體，具刺激性芳香氣味，當食物中之五碳糖經酸水解或經加熱後皆會產生糠醛。而5-羥甲基糠醛為一種暗黃色液體或粉末且不易揮發之物質，其結構與糠醛相似，為梅納反應之中間產物，5-羥甲基糠醛在pH值小於4的酸性條件下，因六碳糖脫水而產生，也可能於低溫下產生，其形成之濃度會隨著熱處理時間增加而增加。

高碳水化合物食品中所含的5-羥甲基糠醛濃度常 與熱處理有關，而對於酒類例如葡萄酒加工而言，糠醛之含量會隨著葡萄酒之熟成過程而增加。在加工食品中如蜂蜜、酒類、果汁、葡萄醋、超高溫處理之牛奶、咖啡、穀類食品及嬰兒奶粉等，皆存在糠醛及5-羥甲基糠醛。在動物實驗中，發現糠醛和5-羥甲基糠醛會造成細胞毒性，糠醛和5-羥甲基糠醛的濃度過高會對人體有害。對釀酒菌株而言，糠醛和5-羥甲基糠醛的存在則是會造成菌株遲滯期延長、干擾微生物生長及後續發酵、降低酵素活性、破壞DNA、抑制蛋白質及RNA合成、破壞酵母菌細胞壁或降低酒精產品之乙醇產量及濃度。

另一方面，隨著石油資源的枯竭、石油價格的上 漲和環境的惡化，人們對可替換能源和環境友好型能源需求的提高，生質乙醇因原料的來源廣泛、可再生且具有汙染性小、容易運輸和貯藏的特點，為最有可能取代石油的新能源。生質乙醇的原料來源可為澱粉質、糖質或纖維質，其中纖維質如木質纖維素為來源，既不會造成糧食問題又可解決農作廢料的問題。但在生質乙醇生產過程中，為使木質纖維素高效的轉化為可發酵糖類，必須破壞木質纖維素的緻密結構，因此生產生質乙醇前一般需要進行前處理，最常使用的為以稀酸水解木質纖維素，木質纖維素中之半纖維素經水解而釋放出五碳糖和六碳糖，在高溫和酸性環境下，五碳糖和六碳糖會進一步分別降解為糠醛和5-羥甲基糠醛。而糠醛和5-羥甲基糠醛的存在對於發酵微生物具有非常強烈的抑制作用，嚴重影響纖維素水解液的乙醇發酵產率和速率。

因此，本發明為克服上述不足之處，提供一種具有高含有醛基之呋喃衍生物耐受性和高乙醇耐受性之釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)轉殖株SR2，並提供其在發酵含醛類物質之加工產品和生產生質乙醇的應用，及利用釀酒酵母菌轉殖株SR2生產生質乙醇的方法。

本發明之一態樣是在提供一種釀酒酵母菌轉殖株SR2，其係寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC920090。

根據本發明一態樣之一實施方式，其中釀酒酵母菌轉殖株SR2具有殖入之醛類還原酶基因，醛類還原酶基因之核苷酸序列如序列辨識編號1所示。

根據本發明一態樣之另一實施方式，其中釀酒酵母菌轉殖株SR2具有含有醛基之呋喃衍生物耐受性，前述之含有醛基之呋喃衍生物可為糠醛(2-furaldehyde；furfural)或5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural)，釀酒酵母菌轉殖株SR2之糠醛耐受性為糠醛之體積莫耳濃度為大於0mM且小於等於120mM，釀酒酵母菌轉殖株SR2之5-羥甲基糠醛耐受性為5-羥甲基糠醛之體積莫耳濃度為大於0mM且小於等於60mM。

根據本發明一態樣之再一實施方式，其中釀酒酵母菌轉殖株SR2具有乙醇耐受性，釀酒酵母菌轉殖株SR2乙醇耐受性之重量百分比介於0至13之間。

本發明之另一態樣是在提供釀酒酵母菌轉殖株SR2之用途，係應用於生產生質乙醇。

本發明之再一態樣是在提供釀酒酵母菌轉殖株SR2之用途，係應用於發酵一含醛類物質之加工產品。

根據本發明再一態樣之一實施方式，其中含醛類物質之加工產品可為糖蜜發酵液、糖蜜酒、啤酒或咖啡。

本發明之又一態樣是在提供一種生產生質乙醇的方法，包含以下步驟：提供含木質纖維素之基質。先加入重量百分比0.1至重量百分比0.4之酸於基質中進行一熱處理步驟以獲得水解基質。再加入釀酒酵母菌轉殖株SR2於水解基質中進行發酵步驟。最後自發酵基質回收生質乙醇。

根據本發明又一態樣之一實施方式，其中該熱處理步驟之熱處理溫度可為100℃至140℃，熱處理時間可為30分鐘至2小時。

根據本發明又一態樣之另一實施方式，其中發酵步驟可於20℃至40℃發酵24至168小時。

藉此，本發明之釀酒酵母菌轉殖株SR2對於發酵環境之壓力具有高耐受性，不會因發酵環境中含有高濃度的糠醛、5-羥甲基糠醛和乙醇，而導致遲滯期延長影響後續發酵，可應用於發酵含醛類物質之加工產品及生產生質乙醇。而利用本發明之釀酒酵母菌轉殖株SR2生產生質乙醇的方法，因釀酒酵母菌轉殖株SR2具有高糠醛耐受性、高5-羥甲基糠醛耐受性和高乙醇耐受性，故可提高生質乙醇的生產效率和生質乙醇的產量。

上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要， 以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

100‧‧‧生產生質乙醇的方法之方法

110、120、130、140‧‧‧步驟

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖係依照本發明又一態樣之生產生質乙醇的方法的步驟流程圖；第2圖係本發明增幅之ari1基因之瓊脂醣膠體電泳分析圖；第3圖為本發明之釀酒酵母轉殖株SR2以colony PCR確認轉殖入之基因之瓊脂醣膠體電泳分析圖；第4圖為本發明之釀酒酵母轉殖株SR2和野生株SC於不同時間ari1 RNA表現量之瓊脂醣膠體電泳分析圖；第5圖為本發明之釀酒酵母轉殖株SR2和野生株SC於不同時間ari1 RNA表現量之量化圖；第6圖為本發明之釀酒酵母轉殖株SR2和野生株SC之糠醛耐受性分析圖；第7圖為本發明之釀酒酵母轉殖株SR2和野生株SC之5-羥甲基糠醛耐受性分析圖；第8圖為本發明之釀酒酵母轉殖株SR2和野生株SC之乙醇耐受性分析圖；以及 第9圖為本發明之釀酒酵母轉殖株SR2和野生株SC之醣醇轉換分析圖。

本說明書揭露內容提出一種釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)轉殖株SR2、釀酒酵母菌轉殖株SR2之用途以及利用釀酒酵母菌轉殖株SR2生產生質乙醇之方法。其係以習知之釀酒酵母菌株經基因重組轉殖入醛類還原酶基因，並篩選具有高含醛基之呋喃衍生物耐受性和高乙醇耐受性之釀酒酵母轉殖株SR2，此釀酒酵母菌轉殖株SR2可應用於發酵含醛類物質之加工產品和生產生質乙醇，以提高發酵物的生產效率和產量。

本發明之釀酒酵母菌轉殖株SR2，其係寄存於財團法人食品工業發展研究所，其寄存編號為BCRC920090。前述釀酒酵母菌轉殖株SR2具有殖入一醛類還原酶基因(ari1)，醛類還原酶基因之核苷酸序列如序列辨識編號1所示，且釀酒酵母菌轉殖株SR2具有高糠醛耐受性、高5-羥甲基糠醛耐受性和高乙醇耐受性，其糠醛耐受性為糠醛之體積莫耳濃度為大於0mM且小於等於120mM，5-羥甲基糠醛耐受性為5-羥甲基糠醛之體積莫耳濃度為大於0mM且小於等於60mM，乙醇耐受性為乙醇介於重量百分比0至重量百分比13之間，釀酒酵母菌轉殖株SR2之乙醇耐受性係不包含重量百分比0和重量百分比13此兩端點。

本發明所稱之「醛類還原酶」為可將醛類物質進 行還原代謝成毒性較低物質的酵素，而此還原作用由多個醛類還原酶所調控，且須在輔因子NADH或NADPH存在下進行還原作用，微生物細胞中主要的醛類還原酶有乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase)、醛類脫氫酶(aldehyde dehydrogenase)和丙酮醛還原酶(methylglyoxal reductase)。根據本發明，醛類還原酶基因係為aldehyde reductase(ari1)，此醛類還原酶基因所編碼出的醛類還原酶(ARI1)之酵素活性最適溫度為25℃，最適pH為7.0，蛋白質分子量為38kDa，至少對14種醛類具有還原活性。其可透過轉殖方式由適當的菌株中取得，或是可以人工合成DNA方式來獲得此序列。適於本發明可用以獲取ari1基因的菌株，包含但不僅限於酵母屬(Saccharomyces)之菌株。酵母屬之菌株例如可為釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)。

本發明所稱之「含有醛基之呋喃衍生物」係指其 中至少有一個氫原子被含有醛基的取代基取代的呋喃衍生物。更進一步地說，本發明所指的含有醛基之呋喃衍生物可為糠醛或5-羥甲基糠醛。

本發明之釀酒酵母菌轉殖株SR2可應用於發酵含 醛類物質之加工產品和生產生質乙醇，其中含醛類物質之加工產品包含糖蜜發酵液、糖蜜酒、啤酒或咖啡。

本發明所稱之「生質乙醇」係指利用微生物發酵 把生質(biomass)中的醣分轉化所得到的乙醇。生質乙醇的原料主要為含高碳水化合物的生物質發酵而成的乙醇，生質乙醇 的來源主要為糖質、澱粉質和纖維質。由糖質和澱粉質製造乙醇的技術屬於第1代的生質乙醇，由纖維質製造生質乙醇的技術屬於第2代的生質乙醇。

請參照第1圖，其係繪示本發明又一態樣之生產 生質乙醇的方法的步驟流程圖，如圖所示，生產生質乙醇的方法100包含步驟110、步驟120、步驟130和步驟140。

步驟110為提供含有木質纖維素的基質，根據本 發明，木質纖維素的來源可為穀類農作物廢棄物(如麥稈、稻稈或玉米稈等)、農業、都市或建築廢棄物(如蔗渣、舊報紙、木屑、廢木材等)或成長快速的纖維質作物(如芒草、狼尾草、柳枝稷、海藻等)。

步驟120為加入重量百分比0.1至重量百分比 0.4之酸於基質中進行一熱處理步驟，熱處理步驟之熱處理溫度為100℃至140℃，熱處理時間為30分鐘至2小時，較佳地，熱處理步驟係為將基質加熱至121℃ 1小時。熱處理步驟可以破壞木質纖維素的結構，以獲得水解基質。

步驟130為將本發明之釀酒酵母菌轉殖株SR2加 入水解基質中，進行發酵步驟以產生發酵基質。發酵步驟係以調節pH值、溫度、通氣量等條件，使微生物可產生所需之含碳產物。更進一步的說，生質乙醇之發酵步驟係於20℃至40℃發酵24至168小時。

步驟140為自發酵基質中回收生質乙醇。本發明 之釀酒酵母菌轉殖株SR2可使包含木質纖維素之碳源發酵轉化為乙醇，故可經發酵基質經由蒸餾和脫水後得到生質乙醇。

茲以下列具體試驗例進一步示範說明本發明，用 以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些試驗例視為對本發明範圍的限制，但用於說明如何實施本發明的材料及方法。

第一部分：本發明之釀酒酵母菌轉殖株SR2之轉殖 試驗例1-1：釀酒酵母菌之醛類還原酶基因選殖和表現載體之構築

在本試驗例中，係以Saccharomyces cerevisiae BCRC21685為模板(購自食品工業發展研究所)，利用序列辨識編號2所示序列之正向引子和序列辨識編號3所示序列之反向引子增幅ari1基因，得到如序列辨識編號1所示之序列。其中正向引子中包含一BstBI限制酵素切位和一Saccharomyces cerevisiae的Kozak序列，而反向引子則包含一XhoI限制酵素切位。將序列辨識編號1所示之核酸片段，再與經由同樣限制酶BstBI/XhoI剪切的pGEM-T Easy選殖載體(PROMEGA)中，利用T₄接合酶(T₄ DNA ligase)以適當比例進行接合，得到pGEM-ari1質體，經由DNA定序確認序列正確無誤後，再分別以限制酶BstBI/XhoI剪切pGEM-ari1質體和pGAPZC表現載體(INVITROGEN)，利用T₄接合酶以適當比例進行接合，得到構築完成的pGAPZC-ari1質體。

上述質體的選殖操作，可以包含但不限定以下列步驟完成。

在本試驗例中，Saccharomyces cerevisiae BCRC21685之菌液培養於YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose)培養液中培養24-48小時後抽取基因體DNA，並將活化兩天之後的取1mL。基因體DNA之抽取步驟如下：將活化兩天之Saccharomyces cerevisiae BCRC21685取1mL以離心力5000 x g離心10分鐘，去除上清液並以無菌水清洗沉澱物後，再以同樣條件離心，所得之沉澱物加入200μL的裂解緩衝溶液及0.1g玻璃珠後，利用高效樣品研磨系統，以速度6M/S進行40秒的細胞破碎，置於冰上冰浴1分鐘後，再以同樣條件破碎細胞。將破碎後的細胞加入20μl的蛋白酶K後，於56℃熱水浴中作用2小時，並於熱水浴過程中每15分鐘震盪5-10秒。將不含玻璃珠的懸浮液取至離心管並加入4μl核糖核酸酶A於室溫下反應5分鐘。再利用基因體DNA純化套組(BIOKIT)抽取基因體DNA，並將抽取完的基因體DNA保存於-20℃儲存備用。

聚合酶連鎖反應之反應物及試劑依下述比例進 行：0.5μL的基因體DNA、1μL的dNTP溶液(2.5mM)、5μL的10倍濃縮緩衝液、2μL的正向引子、2μL的反向引子、1μL的MgCl₂溶液(25mM)及0.5μL的Taq-聚合酶(Taq DNA polymerase)，以DEPC水調整總體積為50μL，置於聚合酶連鎖反應儀(GeneAmp PCR system 2400；PERKIN ELMER)進行聚合酶連鎖反應。反應條件為94℃反應2分鐘，接著進行35個周期之熱循環，包括變性95℃反應45秒、黏合58℃反應30 秒、延長72℃反應2分鐘30秒，反應結束後持續於72℃反應10分鐘，然後降溫至4℃，並以瓊脂醣膠體電泳觀察PCR之結果。

請參照第2圖，為本發明增幅之ari1基因之瓊脂 醣膠體電泳分析圖。結果顯示，以Saccharomyces cerevisiae BCRC21685基因體DNA為模板，利用序列辨識編號2所示序列之正向引子和序列辨識編號3所示序列之反向引子，可增幅出一個單一DNA片段，於本試驗例中將此單一DNA片段命名為ari1，其片段大小約為1kbp符合預期。

將PCR產物ari1先以瓊脂醣膠體電泳進行分離， 再將含有ari1片段之膠體切下，並利用本技術領域中常用回收DNA的方法或商品化套組進行回收。回收後的產物即可進行後續之剪切及接合反應。pGEM-T Easy選殖載體之剪切依照限制酶廠商提供之流程進行。取適量DNA樣品與滅菌去離子水、限制酶緩衝液混合均勻後，再加入適量限制酶BstBI/XhoI混合均勻，於酵素最適反應溫度下反應。

DNA接合反應切依照T₄接合酶廠商提供之流程 進行。取經BstBI/XhoI剪切後的pGEM-T Easy選殖載體，與ari1片段以適當比例混合後與滅菌去離子水、T₄接合酶緩衝液混合均勻後，再加入適量接合酶混合均勻，於酵素最適反應溫度下反應一段時間再終止反應。將接合後所得到的pGEM-ari1質體經由DNA定序，確認以上述步驟增幅出的ari1基因之核苷酸序列如序列辨識編號1所示後，再分別以限制酶BstBI/XhoI剪切pGEM-ari1質體和pGAPZC表現載體，並利用T₄接合酶以適當比例進行接合，得到構築完成的pGAPZC-ari1質體。

試驗例1-2：醛類還原酶基因於釀酒酵母轉殖株SR2之表現

於本試驗例中，係將經由試驗例1-1構築完成的pGAPZC-ari1質體利用電穿孔方式轉殖入釀酒酵母通透性細胞中，以獲得釀酒酵母轉殖株SR2。

上述釀酒酵母轉殖株SR2操作，可以包含但不限定以下列步驟完成。首先製備釀酒酵母通透性細胞，取5mL之Saccharomyces cerevisiae BCRC21685於50mL的YPD培養液中於30℃培養過夜。再取0.1~0.5mL的Saccharomyces cerevisiae BCRC21685於50mL的YPD培養液中再次於30℃培養過夜，當OD值達1.3~1.5時，以離心力1500 x g於4℃離心5分鐘。倒除上清液後加入500mL冰浴之無菌水使沉澱物懸浮。再以離心力1500 x g於4℃離心5分鐘，倒除上清液後加入250mL冰浴之無菌水使沉澱物再次懸浮。再以離心力1500 x g於4℃離心5分鐘，倒除上清液後加入20mL冰浴之1M山梨醇使沉澱物再次懸浮。最後再以離心力1500 x g於4℃離心5分鐘，倒除上清液後加入1mL冰浴之1M山梨醇使沉澱物再次懸浮，得到釀酒酵母通透性細胞。將釀酒酵母通透性細胞置於冰上，後續進行電穿孔將pGAPZC-ari1質體轉殖入釀酒酵母通透性細胞中。

電穿孔的步驟如下：將pGAPZC-ari1質體經AvrII限制酶作用，以膠上純化方式取得線狀之pGAPZC-ari1質體。取5-10μg之線狀之pGAPZC-ari1質體與80μl之釀酒酵母通透性細胞混合後，並加入已冰浴之0.2cm電穿孔樣品管中冰浴5分鐘後，進行電穿孔。電穿孔步驟結束後，於電穿孔 樣品管中加入1mL已冰浴之山梨醇，並將樣品移至新的離心管中，於30℃培養1-2小時。取10~200μl之菌液塗抹於含100μg/ml Zeocin的YPDS固態培養基於30℃培養2-3天直到菌落形成。再挑取10~20個菌落於含100μg/ml Zeocin的YPD固態培養基進行劃線培養，再挑單一菌落於含100μg/ml Zeocin的YPD培養液中培養，得到本發明之釀酒酵母轉殖株SR2。並將經Zeocin篩選到之釀酒酵母轉殖株SR2以colony PCR確認其轉殖入之基因為ari1。

請參照第3圖，為本發明之釀酒酵母轉殖株SR2 以colony PCR確認轉殖入之基因之瓊脂醣膠體電泳分析圖。結果顯示，當以釀酒酵母轉殖株SR2為模板，利用序列辨識編號2所示序列之正向引子和序列辨識編號3所示序列之反向引子，可增幅出一個單一DNA片段，其片段大小約為1kbp與預期符合。挑選一株經colony PCR鑑定後轉殖成功的釀酒酵母轉殖株SR2，將之培養於YPD培養液中，分別在培養的第12、24、48、72、96、120和144小時，以RT-PCR測定釀酒酵母轉殖株SR2細胞內ari1 RNA的表現量。

請參照第4圖和第5圖，分別為本發明之釀酒酵 母轉殖株SR2和野生株SC於不同時間ari1 RNA表現量之瓊脂醣膠體電泳分析圖和量化圖。其中第4圖電泳泳道之內容物請同時參考下列表一。

如圖所示，釀酒酵母轉殖株SR2於培養第24小時 後達到最高表現量，而野生株SC則是在培養第48小時後，才有明顯的ari1 RNA表現，且在培養第120小時後才達到最高表現量。於培養第144小時後，野生株SC表現量開始下降，但釀酒酵母轉殖株SR2仍維持高表現量。此外，釀酒酵母轉殖株SR2於培養第12小時、第24小時、第48小時和第72小時之ari1 RNA表現量明顯高於野生株SC。

因此，本發明之釀酒酵母轉殖株SR2之ari1 RNA表現量確實較野生株SC高，預期在於含有糠醛或5-羥甲基糠醛之環境中，釀酒酵母轉殖株SR2較野生株SC有更佳之能力將糠醛還原成糠醇(2-furanmethanol)或將5-羥甲基糠醛還原成2,5-呋喃二甲醇(furan-2,5-diyldimethanol)。

第二部分：本發明之釀酒酵母菌轉殖株SR2之耐受性分析

於此部分的試驗例中，將測試本發明之釀酒酵母轉殖株SR2與野生株SC對於含醛類物質和乙醇之耐受性分析，係先進行耐受性菌株之初步篩選，再分別進行糠醛、5-羥甲基糠醛和乙醇耐受性之分析。耐受性菌株初步篩選的步驟，係將成功轉殖入pGAPZC-ari1質體之釀酒酵母轉殖株SR2培養於含10mM的5-羥甲基糠醛的YPD固態培養基中，培養24小時後，挑單一菌落進行劃線純化，再將純化後之釀酒酵母轉殖株SR2培養於YPD培養液中，並保存之以進行後續試驗。

試驗例2-1：糠醛耐受性分析

將初步篩選後之釀酒酵母轉殖株SR2進行活化後，當OD₆₀₀吸光值為0.3時分別取1mL菌液加至含濃度為0mM、10mM、30mM、60mM和120mM糠醛的YPD培養液中進行培養，測0至144小時之OD₆₀₀吸光值。

請參照第6圖和下表二，第6圖為本發明之釀酒酵母轉殖株SR2和野生株SC之糠醛耐受性分析圖，(A)部分至(E)部分分別為釀酒酵母轉殖株SR2和野生株SC在含有濃度為0mM、10mM、30mM、60mM和120mM糠醛的YPD培養液中0至144小時之OD₆₀₀吸光值，下表二為計算釀酒酵母轉殖株SR2和野生株SC於不同的糠醛濃度下，由lag phase進入log phase所需時間(遲滯期)。

結果顯示，糠醛對於釀酒酵母轉殖株SR2和野生 株SC測試皆會延長其遲滯期，野生株SC在糠醛濃度達60mM或120mM時，其遲滯期明顯延長，生長速度亦明顯下降。而在高濃度糠醛(120mM)存在時，釀酒酵母轉殖株SR2之遲滯期較野生株SC縮短24小時，顯示釀酒酵母轉殖株SR2對於糠醛具有高耐受性。

再將本試驗例之糠醛耐受性結果，對照試驗例 1-2中ari1 RNA於不同時間之表現量分析結果，可得知釀酒酵母轉殖株SR2之ari1 RNA表現量在12及24小時明顯高於野生株SC，在10mM及30mM糠醛耐受性分析中也可看出轉釀酒酵母轉殖株SR2之由lag phase進入log phase的時間在0-24小時之間，且在第24小時後菌株進入穩定期，ari1 RNA表現量在24小時後也維持一定的量。而當糠醛濃度提高至120mM時，釀酒酵母轉殖株SR2在培養的第72小時後開始大量生長，表示醛類還原酶ari1進行還原作用，使菌株可耐受此濃度，同樣地，在ari1 RNA表現量分析中也可看到在培養的第72小時ari1 RNA之表現量仍維持在一定量。顯示本發明之釀酒酵母轉殖株SR2確實因轉殖入ari1基因後，提高其對於糠醛的耐受性。

試驗例2-2：5-羥甲基糠醛耐受性分析

將初步篩選後之釀酒酵母轉殖株SR2進行活化 後，當OD₆₀₀吸光值為0.3時分別取1mL菌液加至含濃度為0mM、30mM和60mM5-羥甲基糠醛的YPD培養液中進行培養，測0至144小時之OD₆₀₀吸光值。

請參照第7圖和下表三，第7圖為本發明之釀酒酵 母轉殖株SR2和野生株SC之5-羥甲基糠醛耐受性分析圖，(A)部分至(C)部分分別為釀酒酵母轉殖株SR2和野生株SC在含有濃度為0mM、30mM和60mM5-羥甲基糠醛的YPD培養液中0至144小時之OD₆₀₀吸光值，下表三為計算釀酒酵母轉殖株SR2和野生株SC於不同的5-羥甲基糠醛濃度下，由lag phase進入log phase所需時間(遲滯期)。

結果顯示，5-羥甲基糠醛對於釀酒酵母轉殖株 SR2和野生株SC測試皆會延長其遲滯期，但不論在含有濃度為0mM、30mM、60mM的5-羥甲基糠醛環境下，釀酒酵母轉殖株SR2的遲滯期皆較野生株SC的遲滯期短，在未添加5-羥甲基糠醛時，野生株SC生長較快，且在培養144小時之細胞量高於釀酒酵母轉殖株SR2，但5-羥甲基糠醛存在時，釀酒酵母轉殖株SR2具有較高的5-羥甲基糠醛耐受性，因此釀酒酵母轉殖株SR2的總菌量較野生株SC顯著提高。在高濃度5-羥甲基糠醛(60mM)存在時，釀酒酵母轉殖株SR2能夠適 應此種環境壓力，且於培養的第120小時後呈現對數生長，其最終菌量與未添加5-羥甲基糠醛之條件下所得之菌量並無明顯差異。

再將本試驗例之5-羥甲基糠醛耐受性結果，對照 試驗例1-2中ari1 RNA於不同時間之表現量分析結果，可得知釀酒酵母轉殖株SR2之ari1 RNA表現量在12及24小時明顯高於野生株SC，在濃度為30mM的5-羥甲基糠醛耐受性分析中也可看出釀酒酵母轉殖株SR2由lag phase進入log phase的時間在培養的第24小時。且在48小時後菌株進入穩定期，ari1 RNA表現量在此時間也維持一定的量。而當5-羥甲基糠醛濃度提高至60mM時，釀酒酵母轉殖株SR2在培養的第120小時後開始大量生長，表示醛類還原酶ari1進行還原作用，使菌株可耐受此濃度，同樣地在ari1 RNA表現量分析中也可看到在培養的第120小時之表現量仍維持在一定量。顯示本發明之釀酒酵母轉殖株SR2確實因轉殖入ari1基因後，提高其對於5-羥甲基糠醛的耐受性。

試驗例2-3：乙醇耐受性分析

將初步篩選後之釀酒酵母轉殖株SR2進行活化後，當OD₆₀₀吸光值為0.3時分別取1mL菌液加至含0%、5%、7%、9%、11%和13%乙醇的YPD培養液中進行培養，測0至144小時之OD₆₀₀吸光值。

請參照第8圖和下表四，第8圖為本發明之釀酒酵母轉殖株SR2和野生株SC之乙醇耐受性分析圖，(A)部分至(F)部分分別為釀酒酵母轉殖株SR2和野生株SC在含有濃度 為0%、5%、7%、9%、11%、13%乙醇的YPD培養液中0至144小時之OD₆₀₀吸光值，下表四為計算釀酒酵母轉殖株SR2和野生株SC於不同的乙醇濃度下，由lag phase進入log phase所需時間(遲滯期)。

結果顯示，乙醇對於釀酒酵母轉殖株SR2和野生 株SC測試皆會延長其遲滯期。與野生株SC比較，釀酒酵母轉殖株SR2在含有乙醇之培養液中大量表現醛類還原酶ari1並不會縮短其生長之遲滯期，但對生長速率也無幫助，但在乙醇濃度達11%時，釀酒酵母轉殖株SR2於培養期間持續生長，因此培養的第144小時後之菌量明顯高於野生株SC。因此推測轉殖入ari1基因的釀酒酵母轉殖株SR2具有提升乙醇耐受性的效果。

再將本試驗例之乙醇耐受性結果，對照試驗例 1-2中ari1 RNA於不同時間之表現量分析結果，可得知釀酒酵母轉殖株SR2之ari1 RNA表現量在12及24小時明顯高於野生株SC，乙醇耐受性分析中釀酒酵母轉殖株SR2及野生株SC皆在培養的第24小時後進入生長穩定期，且釀酒酵母轉殖株SR2之乙醇耐受性皆較野生株SC，此結果與ari1 RNA表現量之結果相似。

第三部分：本發明之釀酒酵母菌轉殖株SR2之醣醇轉換分析

於此部分的試驗例中，將測試本發明之釀酒酵母 轉殖株SR2與野生株SC對於醣醇轉換的能力分析。先將冷凍保存之菌株(釀酒酵母轉殖株SR2和野生株SC)經解凍後，加至10ml YPD培養基，以28℃，120rpm振盪培養。 菌種活化後，將菌株培養至含有10%葡萄糖之YPD培養基中，進行培養至48小時，並於0、12、24、48小時取1ml樣品以氣相層析儀(GC-FID)測菌株所產生之乙醇含量。

請參照第9圖、下表五和下表六，第9圖為本發明 之釀酒酵母轉殖株SR2和野生株SC之醣醇轉換分析圖，其中第9(A)圖部分和表五為本發明之釀酒酵母轉殖株SR2和野生株SC在不同時間點於含有10%葡萄糖之YPD培養基中之乙醇含量，第9(B)圖和表六為本發明之釀酒酵母轉殖株SR2和野生株SC在不同時間點於含有10%葡萄糖之YPD培養基中之乙醇轉換率。

由表五和表六的結果顯示，野生株SC及釀酒酵母轉殖株SR2於培養至48小時之乙醇含量達到最高，分別為 40.21±0.96mg/ml及43.03±1.09mg/ml，其乙醇轉換率分別為78.69±1.88%及84.21±2.13%，而釀酒酵母轉殖株SR2於48小時之乙醇含量及乙醇轉換率皆高於野生株SC，由第9(A)圖和第9(B)圖中也顯示釀酒酵母轉殖株SR2於發酵12小時後，其乙醇含量及轉換率皆高於野生株SC。結果表示，釀酒酵母轉殖株SR2於10%葡萄糖之培養下，因具有84.21±2.13%之乙醇轉換率，更適合作為乙醇生產之發酵菌酛。

綜合上述，本發明之釀酒酵母菌轉殖株SR2對於 發酵環境之壓力具有高耐受性，不會因發酵環境中含有高濃度的糠醛、5-羥甲基糠醛和乙醇，而導致遲滯期延長影響後續發酵，故可應用於發酵含醛類物質之加工產品及生產生質乙醇。 而利用本發明之釀酒酵母菌轉殖株SR2生產生質乙醇的方法，因釀酒酵母菌轉殖株SR2具有高糠醛耐受性、高5-羥甲基糠醛耐受性和高乙醇耐受性，故可提高生質乙醇的生產效率和生質乙醇的產量。

然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

<110> 靜宜大學

<120> 釀酒酵母菌株轉殖株、其用途及應用其生產乙醇方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<21> 1062

<212> DNA

<213> 釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221> CDS

<223> ari1基因之核苷酸序列

<400> 1

<210> 2

<21> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> primer

<223> 進行PCR增幅ari1基因的引子(forward)

<400> 2

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> primer

<223> 進行PCR增幅ari1基因的引子(reverse)

<400> 3

Claims (14)

1. 一種釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)轉殖株SR2，其係寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC920090。
2. 如申請專利範圍第1項所述之釀酒酵母菌轉殖株SR2，其中該釀酒酵母菌轉殖株SR2具有一醛類還原酶基因，該醛類還原酶基因之核苷酸序列如序列辨識編號1所示。
3. 如申請專利範圍第1項所述之釀酒酵母菌轉殖株SR2，其中該釀酒酵母菌轉殖株SR2具有含有醛基之呋喃衍生物耐受性。
4. 如申請專利範圍第3項所述之釀酒酵母菌轉殖株SR2，其中該含有醛基之呋喃衍生物為糠醛(2-furaldehyde；furfural)或5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural)。
5. 如申請專利範圍第4項所述之釀酒酵母菌轉殖株SR2，其中該釀酒酵母菌轉殖株SR2之糠醛耐受性為糠醛之體積莫耳濃度為大於0mM且小於等於120mM。
6. 如申請專利範圍第4項所述之釀酒酵母菌轉殖株SR2，其中該釀酒酵母菌轉殖株SR2之5-羥甲基糠醛耐受性為5-羥甲基糠醛之體積莫耳濃度為大於0mM且小於等於60mM。
7. 如申請專利範圍第1項所述之釀酒酵母菌轉殖株SR2，其中該釀酒酵母菌轉殖株SR2具有乙醇耐受性。
8. 如申請專利範圍第7項所述之釀酒酵母菌轉殖株SR2，其中該釀酒酵母菌轉殖株SR2之乙醇耐受性為乙醇介於重量百分比0至重量百分比13之間。
9. 一種如申請專利範圍第1項之釀酒酵母菌轉殖株SR2之用途，係應用於生產生質乙醇。
10. 一種如申請專利範圍第1項之釀酒酵母菌轉殖株SR2之用途，係應用於發酵一含醛類物質之加工產品。
11. 如申請專利範圍第10項所述之釀酒酵母菌轉殖株SR2之用途，其中該含醛類物質之加工產品包含糖蜜發酵液、糖蜜酒、啤酒或咖啡。
12. 一種生產生質乙醇的方法，包含： 提供含一木質纖維素之一基質；加入重量百分比0.1至重量百分比0.4之酸於該基質中進行一熱處理步驟以獲得一水解基質；加入如申請專利範圍第1項所述之釀酒酵母菌轉殖株SR2於該水解基質中進行一發酵步驟以產生一發酵基質；以及自該發酵基質回收該生質乙醇。
13. 如申請專利範圍第12項所述之生產生質乙醇的方法，其中該熱處理步驟之熱處理溫度為100℃至140℃，熱處理時間為30分鐘至2小時。
14. 如申請專利範圍第12項所述之生產生質乙醇的方法，其中該發酵步驟係於20℃至40℃發酵24至168小時。