CN111295446A - 引入高活性苹果酸脱氢酶用以生产琥珀酸的突变型微生物及使用其生产琥珀酸的方法 - Google Patents
引入高活性苹果酸脱氢酶用以生产琥珀酸的突变型微生物及使用其生产琥珀酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
公开了一种用于生产琥珀酸的突变型微生物以及使用其生产琥珀酸的方法，所述突变型微生物通过引入编码苹果酸脱氢酶的基因而展现出改进的将草酰乙酸向苹果酸转化的活性，其中通过苹果酸脱氢酶的主链的酰胺官能团与NADH的焦磷酸部分相互作用的氨基酸残基是谷氨酰胺(Gln)。当在有限培养基中培养时，与迄今为止报道的其他突变型微生物相比，根据本发明的产琥珀酸突变型微生物能够以最高的产率生产高浓度的琥珀酸。此外，通过进一步改进的发酵技术，所述突变型微生物能够以更高的产率和产物浓度生产琥珀酸。
Description
【技术领域】
本发明涉及引入高活性苹果酸脱氢酶用以生产琥珀酸的突变型微生物及使用其生产琥珀酸的方法。更特别地，本发明涉及通过引入编码苹果酸脱氢酶的基因而展现出改进的将草酰乙酸向苹果酸转化的活性的突变型微生物，以及使用其生产琥珀酸的方法，其中所述苹果酸脱氢酶的主链中包含通过酰胺官能团与NADH的焦磷酸部分相互作用的氨基酸残基谷氨酰胺(Gln)。
【背景技术】
随着近来环境问题的出现，已经进行了许多尝试来代替基于常规化石燃料的有用化合物的生产。为此，已经在全世界范围内进行了研究以从可再生生物质生产生物基琥珀酸。琥珀酸是具有四个碳原子的二羧酸，是一种有用的化合物，可以用作具有高工业价值的化合物(如1,4-丁二醇、γ-丁内酯、琥珀酸二乙酯、N-甲基-2-吡咯烷酮和四氢呋喃)的前体，以及用作各种聚合物的单体。琥珀酸的重要性已得到强调，并且正在使用多种微生物，诸如产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimia succiniciproducens)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，对生产琥珀酸作为生物基材料的多种方法进行大量研究。
已经通过改变生产琥珀酸的菌株的代谢途径对生产琥珀酸的菌株进行了修饰。该策略是加强碳代谢并消除或减少副产物的形成，从而改进生产琥珀酸的代谢途径。换言之，可以通过引入或加强参与琥珀酸代谢途径的基因，或者缺失或减弱抑制琥珀酸代谢途径的基因，来增加琥珀酸的产生。作为参与琥珀酸代谢途径的基因，苹果酸脱氢酶是为了增加琥珀酸的产生而引入的酶，并且已经进行了与之相关的研究，其目的是通过引入这种酶来改进琥珀酸的产量。例如，苹果酸脱氢酶(MDH)促进草酰乙酸向苹果酸的转化，并且这种酶在使代谢通量集中于琥珀酸生产上起关键作用，而且已经尝试通过将拟南芥(Arabidopsisthaliana)衍生的MDH(Kim等人,Biotechnology journal,12(2),1600701.)、酿酒酵母衍生的MDH(US 2011-0229945 A1、US 2012-0040422 A1、US 2015-0057425 A1、US 2013-0302866 A1)、戴尔根霉(Rhizopus delemar)衍生的MDH(US 2014-0363862 A1)和大肠杆菌衍生的MDH(Wang等人,Bioprocess.Biosyst.Eng.2009,32:737-745.；Liang等人,Biotechnology letters,33(12),2439-2444.)引入微生物中来增加琥珀酸的产生。然而，即使引入了微生物衍生的MDH，琥珀酸的产率也很低。由于这个原因，已经尝试进一步代谢工程化生琥珀酸菌株或优化发酵过程以加强琥珀酸的生产(Ahn等人,Curr.Opin.Biotechnol.42:54-66)，但仍需要进一步改进。
因此，诸位发明人寻求一种与常规方法相比显著改进琥珀酸产率的方法，并且基于尚未对参与琥珀酸生产的主要酶的动力学或结构进行深入研究的事实，对包括产琥珀酸曼氏杆菌和其他产琥珀酸的微生物在内的瘤胃细菌的主要酶进行结构分析。结果，诸位发明人首先发现谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)和产琥珀酸曼氏杆菌MDH的结构，以便通过引入具有降低的底物抑制作用的MDH来开发高产率产琥珀酸菌株，并且发现有可能开发具有最大化产率的产琥珀酸菌株。基于此发现，完成本发明。
【发明内容】
【技术问题】
因此，本发明的目的是提供一种展现出加强的琥珀酸产率的突变型微生物，以及使用该突变型微生物使琥珀酸产率最大化的方法。
【技术方案】
根据本发明，上述和其他目的可以通过提供一种突变型微生物来实现，该突变型微生物是通过将编码苹果酸脱氢酶的基因引入具有琥珀酸生产能力的微生物中而获得的，其中所述苹果酸脱氢酶包含通过酰胺官能团与NADH的焦磷酸部分相互作用的氨基酸残基谷氨酰胺(Gln)。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于生产琥珀酸的方法，该方法包括：(a)培养所述突变型微生物以生产琥珀酸，以及(b)回收所产生的琥珀酸。
【附图说明】
从以下详细描述结合附图将更清楚地理解本发明的上述和其他目的、特征和其他优点，其中：
图1是显示产生琥珀酸的代谢途径的示意图。
图2显示各MDH的NADH转化率的相对活性。
图3是显示取决于NADH底物浓度的CgMDH和MsMDH的NADH转化率的曲线图。
图4是显示取决于草酰乙酸底物浓度的CgMDH和MsMDH的NADH转化率的曲线图。
图5显示CgMDH和MsMDH的底物结合晶体结构，其中底物和多肽链以不同的颜色显示；
图6显示CgMDH和MsMDH的结构中的活性位点附近的氨基酸残基的比较，其中左图结构显示的是MsMDH，右图结构显示的是CgMDH，GOL表示甘油，MAL表示苹果酸离子。
图7显示CgMDH和MsMDH的结构中的NAD+/NADH结合部位附近的氨基酸残基的比较，其中在许多MDH中保守的包覆结构以不同的颜色表示；
图8显示CgMDH和MsMDH及其突变型酶的NADH转化率。
图9显示了分别取决于蓝色、红色和黄色的pH的CgMDH、MsMDH和MsMDHG11Q突变型酶的NADH转化率，其中使用BIS-Tris缓冲液的条件显示为正方形，使用Tris缓冲液的条件显示为圆圈，使用甘氨酸缓冲液的条件显示为三角形；
图10是显示取决于6.0、7.0和8.0的pH下的草酰乙酸底物浓度的CgMDH、MsMDH和MsMDHG11Q的NADH转化率的曲线图，其中已经在图3中提供的关于pH 7.0下CgMDH和MsMDH的活性的信息用虚线表示；
图11是通过使用葡萄糖作为单一碳源补料分批培养的产琥珀酸曼氏杆菌PALK(pMS3-msmdh)(A)、PALK(pMS3-cgmdh)(B)、PALK(pMS3-cgmdhQ20G)(C)和PALK(pMS3-msmdhG11Q)(D)菌株的生长和代谢产物生产曲线，以及通过使用葡萄糖和甘油的组合作为碳源补料分批培养的产琥珀酸曼氏杆菌PALK(pMS3-cgmdh)(E)菌株的生长和代谢产物生产曲线；
图12是通过使用葡萄糖作为单一碳源补料分批培养的产琥珀酸曼氏杆菌PALK(pMS3-scmdh2)(A)、PALK(pMS3-scmdh3)(B)、PALK(pMS3-ecmdh)(C)和PALK(pMS3-zrmdh)(D)菌株的生长和代谢产物生产曲线；
图13是显示使用葡萄糖作为单一碳源(A)和使用葡萄糖与甘油的组合作为碳源(B)的产琥珀酸曼氏杆菌PALKcgmdh菌株的补料分批培养结果的生长和代谢产物生产曲线，以及显示使用葡萄糖作为单一碳源(A)和使用葡萄糖与甘油的组合作为碳源(B)的产琥珀酸曼氏杆菌PALKmsmdhG11Q菌株的补料分批培养结果的生长和代谢产物生产曲线；并且
图14是增加了产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)菌株(A)和PALKcgmdh菌株(B)接种量的补料分批培养的生长和代谢产物生产曲线。
【具体实施方式】
除非另外定义，本文所用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所理解的意义相同的意义。通常，本文所用的命名法在本领域中为公知的并且为通常使用的。
在本发明中，从候选酶中选择MDH以加强产生琥珀酸的代谢途径，并因此过量生产琥珀酸。MDH由mdh基因编码，所述基因是一种使用草酰乙酸为底物的酶(图1)。为了研究来自各种菌株的MDH产生琥珀酸的效果，并找到最有效地转化草酸乙酸的MDH(草酸乙酸是MDH的底物)，选择了八种MDH，即产琥珀酸曼氏杆菌菌株的MDH(MsMDH)、谷氨酸棒状杆菌菌株的MDH(CgMDH)、大肠杆菌菌株的MDH(EcMDH)、产琥珀酸放线杆菌菌株的MDH(AsMDH)、酿酒酵母菌株的细胞质、线粒体和过氧化物酶体的MDH(分别为ScMDHc、ScMDHm和ScMDHp)以及解脂耶氏酵母菌株的MDH(YlMDH)，并且其中只有MsMDH、CgMDH、EcMDH和YlMDH在大肠杆菌中成功表达和纯化。分别使用100μM的草酰乙酸和100μM的NADH作为底物和辅因子，比较了四种MDH的活性。结果表明，CgMDH具有最高的草酰乙酸还原速率(图2)。该活性相当于MsMDH活性的5倍，其次按照活性顺序依次是YlMDH和EcMDH，并且它们也具有MsMDH活性的2倍或更多(图2)。有趣的是，尽管MsMDH是天然生产琥珀酸的产琥珀酸曼氏杆菌的MDH，但谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌衍生的CgMDH和EcMDH具有更好的活性，这两种细菌不是天然生产琥珀酸的细菌。这一结果表明，当将CgMDH或EcMDH而不是MsMDH引入产琥珀酸曼氏杆菌时，可以更有效地生产琥珀酸。
为了更详细地研究关于这些酶的活性的结果，对具有最高和最低活性的两种MDH进行了动力学分析。基于Michaelis-Menten模型，绘制了初始速度相对于NADH浓度的曲线图，其再次指示CgMDH优于MsMDH(图3)。然而，取决于草酰乙酸浓度的MDH反应速率的曲线图显示，两种MDH，特别是MsMDH，通常取决于草酰乙酸(底物)而受抑制而不是饱和(图4)。半个世纪前首次报道了几种脱氢酶的这种底物抑制现象(Raval等人,Biochemistry.,2(2):220-224,1963)。在各种脱氢酶中表明的底物抑制机制可能包括变构调节、共价键的形成、与酶的非生产性/吸附性复合物的产生等(Chen等人,Appl.Environ.Microb.,80:3992-4002.,2014)。例如，已知衍生自猪心脏的NAD+/NADH依赖性MDH与烯醇型草酰乙酸或衍生自布拉克须霉(Phycomyces blakesleeanus)的细胞质MDH形成非活性复合物，会抑制NADH与酶的结合，从而最终导致所述酶的功能障碍(De Arriaga等人,Biochim.Biophys.Acta.,784:158-163,1984)。已显示出对MsMDH的酶活性的抑制从30μM的相对较低的草酰乙酸浓度开始(图4)，并且发现这种底物抑制作用高于其他MDH的底物抑制作用(图4)。总之，这些结果指示，在这三种MDH中，MsMDH不利于生产琥珀酸，而CgMDH是最适合于生产琥珀酸的酶。
为了找到为什么CgMDH在分子水平上具有比MsMDH更好的酶活性，鉴定了所述两种酶的晶体结构并且还鉴定了与底物的复合物的结构(图5)。CgMDH和MsMDH形成同源二聚体，并且属于NAD+/NADH依赖性苹果酸和乳酸脱氢酶超家族(图5)。CgMDH和MsMDH的N端展现出罗斯曼折叠，其由沿α-螺旋并排排列的六股β-折叠链组成，而C-端形成α+β折叠(图5)。所述两种酶的活性位点存在于每个末端的特定折叠之间，而NAD+/NADH结合位点与所述罗斯曼折叠特别相关。但是，所述两种酶的结构比较结果显示，Cα骨架的R.M.S.D.的值相差高达约2.772。基于这种结构比较，诸位发明人发现了可能影响所述酶活性的结构差异，尤其是在活性位点附近(图6和7)。这种差异可能代表了胞质MDH和线粒体MDH之间的巨大差异。除相应的氨基酸残基之外，在活性位点附近的环的主链的长度是不同的，但是诸位发明人专注于一些不同的主要氨基酸残基。例如，对应于位于MsMDH的底物结合位点附近的Ala224、Leu101和Gly11的氨基酸残基分别对应于CgMDH的Ser242、Gln117和Gln20(图6和7)。这些结构差异预计将在CgMDH和MsMDH动力学活性差异上起到关键作用。
通常，可以通过将高活性蛋白的关键结构特性应用于靶标来加强酶的性能。因此，为了研究底物结合位点附近关键氨基酸残基的相互取代对活性的影响，制备了不同的突变型酶(MsMDHG11Q、CgMDHQ20G、MsMDHL101Q、CgMDHQ117L、MsMDHA224S、CgMDHS242A)。这些酶在大肠杆菌中表达，并且除表达为包涵体的MsMDHA224S外，所有突变型酶均已成功纯化。CgMDH的所有突变型酶(CgMDHQ20G、CgMDHQ117L、CgMDHS242A)将草酰乙酸转化率降低至野生型的少于一半(图8)。MsMDHL101Q的活性也低于MsMDH的活性，并且突变型酶MsMDHG11Q的活性比MsMDH的活性改进了三倍(图8)。为了研究位置11处氨基酸的取代如何参与酶活性，研究了CgMDH、MsMDH和MsMDHG11Q的三种酶。首先，测量其取决于pH的活性。结果，发现CgMDH的最佳pH为约7.0，并且MsMDH的活性与碱度成比例地增加，且其最佳pH为约9.0(图9)。用于琥珀酸生产的最佳pH是相对酸性的，为约6.5(Hong等人,Nat.Biotechnol.,22:1275-1281,2004)，并且该条件限制再次证明了MsMDH与CgMDH相比在琥珀酸的生产方面具有劣势这一事实。此外，在上述实验中发现，具有增加的活性的MsMDHG11Q的最佳pH约为8.0，并且发现该最佳pH因相应的突变而降低(图9)。为了比较额外的动力学活性，在每个pH下确定取决于底物浓度的反应速率(图10)。发现随着pH降低，底物抑制增加，从整体上MsMDH和MsMDHG11Q突变型酶的结果可以明显看出(图10)。结果，MsMDH在9.0的最佳pH下几乎没有底物抑制，并且最终在这些酶中具有最高的活性(图10)。然而，最值得注意的是，与MsMDH相比，在所有pH水平下，MsMDHG11Q突变型酶的底物抑制都显著降低(图10)。已经报道了几种脱氢酶中活性位点的单一突变可以缓解或消除底物抑制(Chen等人,Appl.Environ.Microb.,80:3992-4002,2014)。据报道，MDH的底物抑制影响NADH的结合，并且在相应位置11处的氨基酸残基也与NADH的结合直接相关(图7)。因此，与位置11相互作用的NADH的焦磷酸部分将被解释为与底物抑制密切相关。总之，体外研究表明，在低pH下，CgMDH的草酰乙酸还原活性显著高于MsMDH，并且预计将CgMDH而不是MsMDH引入产琥珀酸菌株中会进一步增加琥珀酸的产量。发现了通过单个氨基酸残基突变引起活性差异的那个结构差异。特别地，发现MsMDH的Gly11残基参与相应酶蛋白的严重底物抑制活性。可以预测，将突变型酶MsMDHG11Q而不是传统的MsMDH引入到产琥珀酸菌株中时，会引起琥珀酸的产生，因为其中MsMDH的Gly11被Gln取代的MsMDHG11Q突变型酶比常规产琥珀酸曼氏杆菌野生型酶具有更大的活性。可以通过在常规酶中仅取代一个氨基酸而不是引入外源基因来进行相应突变型酶的引入，从而不会有诸如GMO等的问题。
实际上，为了使用展现出降低的底物抑制作用的MDH来改进琥珀酸的生产，基于体外研究，将显示出比常规MDH进一步降低的底物抑制作用的MDH引入了产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)菌株中。产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)菌株是通过从产琥珀酸曼氏杆菌的野生型菌株中缺失编码乳酸脱氢酶的基因、编码磷酸转乙酰酶的基因和编码乙酸激酶的基因而获得的菌株，是具有在厌氧条件下以高浓度生产近乎同型琥珀酸的特性的产琥珀酸突变型微生物。为了鉴定通过引入具有降低的底物抑制作用的MDH改进了琥珀酸的生产，在引入具有更好性能的MDH之前，开发出了过表达野生型MDH的产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)菌株。因此，已开发的PALK(pMS3-msmdh)菌株以1.23mol/mol葡萄糖的产量和3.26g/L/h的产率生产了79.07g/L的琥珀酸(图11；表1)。由于在活性测试中MsMDH的活性最低，过表达MsMDH的菌株显示出很小的菌株改进效果和仅略微增加的琥珀酸产量。已开发出了一种过表达CgMDH的菌株，因为在各MDH中，CgMDH在体外活性测试中显示出最高的活性和最低的底物抑制作用。已制备的PALK(pMS3-cgmdh)菌株以1.29mol/mol葡萄糖的产量和3.6g/L/h的产率生产了87.23g/L的琥珀酸(图11；表1)。PALK(pMS3)、PALK(pMS3-msmdh)和PALK(pMS3-cgmdh)的补料分批发酵的结果与体外MDH活性鉴定的结果一致。特别地，与产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)相比，PALK(pMS3-cgmdh)在所有琥珀酸生产指标(生产浓度、产量和产率)上的更大改进可能是由于草酰乙酸向苹果酸的转化率改进以及底物抑制作用的降低。
在体内证实了据文献报道对改进琥珀酸的产量最有效的几种MDH(衍生自大肠杆菌的EcMDH、衍生自鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)的ZrMDH和衍生自酿酒酵母的ScMDH2和ScMDH3)的效果，以确定CgMDH在用于改进琥珀酸产量的MDH候选物中是否是最好的。为此目的，构建了过表达各MDH的PALK(pMS3-ecmdh)、PALK(pMS3-zrmdh)、PALK(pMS3-scmdh2)和PALK(pMS3-scmdh3)。构建的四种MDH过表达菌株的补料分批发酵结果显示，分别以3.27、3.15、3.19和3.1g/L/h的产率和1.29、1.25、1.16和1.13mol/mol葡萄糖的产量生产了79.05、76.11、77.34和75.15g/L的琥珀酸。这些结果指示，琥珀酸产率比不过表达MDH的PALK(pMS3)菌株改进，但低于过表达CgMDH的PALK(pMS3-cgmdh)菌株。换言之，这指示在MDH候选物中，CgMDH对琥珀酸生产具有最大的实际影响。
构建PALK(pMS3-cgmdhQ20G)和PALK(pMS3-msmdhG11Q)菌株以在体内证实体外观察结果，即CgMDH和MsMDH之间底物抑制作用和活性的差异是由所述酶的结构差异造成。所构建的菌株PALK(pMS3-cgmdhQ20G)的补料分批发酵的结果显示，以1.00mol/mol的葡萄糖的产量和3.27g/L/h的产率产生了79.39g/L的琥珀酸(图11；表1)。与PALK(pMS3-cgmdh)菌株相比，琥珀酸的产率显著降低，这证实了体外结果，所述体外结果显示上述位于位置20处的谷氨酰胺是CgMDH活性的重要组成部分。
所构建的PALK(pMS3-msmdhG11Q)菌株的补料分批发酵的结果显示，以1.08mol/mol葡萄糖的产量和3.48g/L/h的产率产生了84.19g/L的琥珀酸(图11；表1)。发现与PALK(pMS3-msmdh)菌株相比，增加的琥珀酸生产浓度和产率与体外结果相似，指示将位置11处的甘氨酸改变为谷氨酰胺会导致增加的酶活性和降低的底物抑制作用。这些体内结果表明，基于结构分析的酶修饰最终可有助于琥珀酸产量的实际改进。
特别地，在本发明中，已知用于琥珀酸产量改进的酶MDH在大肠杆菌和棒状杆菌属物种(Corynebacterium sp.)以及作为瘤胃细菌的曼氏杆菌属物种(Mannheimia sp.)、Basfia菌属物种(Basfia sp.)、放线杆菌属物种(Actinobacillus sp.)和厌氧螺菌属物种(Anaerobiospirillum sp.)中的琥珀酸生产上起重要作用(Lee等人,WO 2012/030130A2；Liang等人,Biotechnol.Lett.,33(12):2439-2444.,2011；Chen等人,Process.Biochem.,47:1250-1255.,2012)。因此，诸如本发明中所示的那些的菌株遗传变异通常可用于构建过量生产琥珀酸的菌株。特别地，Basfia菌属物种(Basfia sp.)最初从牛瘤胃中与曼氏杆菌属物种(Mannheimia sp.)一起分离出来时被命名为曼氏杆菌属物种(Mannheimia sp.)，后来被归类为“Basfia菌属物种(Basfia sp.)”。曼氏杆菌(Mannheimia)和Basfia菌(Basfia)菌株的基因核苷酸序列大小基本相似，分别为2,314,078bp和2,340,000bp，并且两种菌株的碱基序列中G和C的比率相同(即，42.5mol％)。此外，它们在整个基因上具有95％的同源性，特别是在曼氏杆菌(Mannheimia)的2,380个ORF和Basfia菌(Basfia)的2,363个ORF中，有2,006个ORF是同源的。应该注意的是，同源的2,006个ORF被称为核心基因组。而且，这些菌株具有相当大的同一性，例如，16S rRNA序列同一性为99.8％，因此它们都被称为“曼氏杆菌属物种(Mannheimia sp.)”(Ahn等人,Curr.Opin.Biotech.,42:54-66,2016；Scholten等人,WO2009/024294A1；Kuhnert等人,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,60:44.,2010)。换言之，在本发明中，曼氏杆菌属物种意在包括Basfia菌属物种，其最近被发现是基本上相同的物种。
将在本发明中实际上显示出最佳效果的CgMDH引入到大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌中，它们是除瘤胃细菌外最具代表性的工业用产琥珀酸菌株。结果，各自过表达CgMDH的大肠杆菌W3110(p100pro99A-cgmdh)和谷氨酸棒状杆菌(pEKEx1-cgmdh)菌株的琥珀酸产率比常规的大肠杆菌W3110和不过表达CgMDH的野生型谷氨酸棒状杆菌菌株显著改进(表2)。这些结果表明，相同或相似的基于CgMDH过表达的工程化通常可以应用于所有通用的生物基产琥珀酸菌株，以改进琥珀酸产量。
最后，为了确定产琥珀酸曼氏杆菌PALK(pMS3-cgmdh)和PALK(pMS3-msmdhG11Q)菌株对琥珀酸产量的改进不是由天然存在于产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)中的MDH的作用造成的，使产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)菌株的基因组中编码MDH的基因缺失，并将编码CgMDH和MsMDHG11Q的基因插入其中，以分别构建PALKcgmdh和PALKmsmdhG11Q菌株(表1)。此外，已知质粒中表达的基因可能由于质粒的不稳定性而丢失其质粒，即使使用抗生素将它们保留(Alonso-Gutierrez等人,Biotechnol.Bioeng.,115(4):1000-1013.,2018)。考虑到这一点，将基因直接插入基因组可能有益于构建更稳定的菌株。该方法得到普遍使用，因为其具有消除了使用昂贵的抗生素来保留质粒的必要性这一优点。
分批补料发酵的结果是，构建的PALKcgmdh菌株以1.28mol/mol葡萄糖的产量和3.71g/L/h的产率生产了89.6g/L的琥珀酸(图13；表1)。分批补料发酵的结果是，所述PALKmsmdhG11Q菌株以1.13mol/mol葡萄糖的产量和3.42g/L/h的产率生产了82.76g/L的琥珀酸(图13；表1)。
PALKcgmdh菌株和PALKmsmdhG11Q菌株之间琥珀酸产率的比较结果显示，天然存在于产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)菌株中的MDH对PALK(pMS3-cgmdh)和PALK(pMS3-msmdhG11Q)菌株的琥珀酸过量生产没有太大影响。最终发现，产琥珀酸曼氏杆菌PALK(pMS3-cgmdh)菌株和PALK(pMS3-msmdhG11Q)菌株的改进琥珀酸产量的效果也来自显示出降低的底物抑制作用的CgMDH和MsMDHG11Q。
为了进一步改进所构建的PALKcgmdh和PALKmsmdhG11Q菌株的琥珀酸产量，在化学成分确定的培养基中使用葡萄糖和甘油作为双碳源，进行分批补料发酵。作为第二碳源的甘油可提供两倍于使用甘油作为单一碳源时的每摩尔还原当量。此外，需要1mol的NADH以通过MDH将草酰乙酸转化为苹果酸。从而，甘油的使用有助于琥珀酸的生产(Choi等人,Biotechnol.Bioeng.,113(10):2168-2177.,2016)。使用葡萄糖和甘油作为双碳源在限制性培养基中补料分批发酵PALKcgmdh菌株的结果显示，以1.37mol/mol葡萄糖的产量和4.18g/L/h的产率生产了101.18g/L的琥珀酸(当葡萄糖和甘油用作双重碳源时，考虑到两个碳源的碳原子数，为易于比较产量，基于葡萄糖表示产量，这种情况以下称为“mol/mol葡萄糖”)(图13；表1)。这些结果类似于在相同培养基中并且使用相同碳源进行的PALK(pMS3-cgmdh)菌株的分批补料发酵结果(图11；表2)。该结果显示出在不使用任何其他复杂的发酵方法(诸如双相发酵)进行发酵的结果中最高的琥珀酸产率。
使用葡萄糖和甘油作为双碳源，在限制性培养基中对PALKmsmdhG11Q菌株进行分批补料发酵。结果，分别以1.28mol/mol葡萄糖的产量和3.82g/L/h的产率生产了92.5g/L的琥珀酸(图13；表1)。尽管其琥珀酸产率不优于PALKcgmdh菌株，但该结果指示，与产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)菌株相比，PALKmsmdhG11Q菌株的琥珀酸产率可以通过降低MDH的底物抑制作用来改进，并且证实了体外结果(表1)。
因此，在一方面，本发明涉及通过将编码苹果酸脱氢酶的基因引入具有琥珀酸产生能力的微生物中而获得的突变型微生物，其中在所述苹果酸脱氢酶中，位于苹果酸脱氢酶的第一个α螺旋末端且通过酰胺官能团与NADH的焦磷酸部分相互作用的氨基酸残基是谷氨酰胺(Gln)。
术语“相互作用”是指苹果酸脱氢酶的主链的酰胺官能团通过电吸引作用与NADH的焦磷酸部分结合以稳定所述焦磷酸部分。在本发明中，苹果酸脱氢酶可以是：i)衍生自谷氨酸棒状杆菌的苹果酸脱氢酶，其由SEQ ID NO:40的氨基酸序列表示；或ii)苹果酸脱氢酶，其中由SEQ ID NO:42的氨基酸序列表示的衍生自产琥珀酸曼氏杆菌的苹果酸脱氢酶的第11个氨基酸被谷氨酰胺取代，但是本发明不限于此。
在本发明中，编码i)衍生自谷氨酸棒状杆菌的苹果酸脱氢酶的基因由SEQ ID NO:41的核苷酸序列表示，并且编码ii)衍生自产琥珀酸曼氏杆菌的苹果酸脱氢酶的基因由SEQID NO:43的核苷酸序列表示，但是本发明不限于此。
换言之，尽管在本发明中描述了特定的氨基酸序列和核苷酸序列，但是对本领域技术人员而言显而易见的是，与本发明中将要实施的酶基本相同的氨基酸序列和编码这些氨基酸的核苷酸序列落入本发明的范围内。术语“基本上相同”包括氨基酸或核苷酸序列高度同源的情况以及享有与序列的同源性无关的结构特征或具有与本发明中使用的相同功能的蛋白质的情况。本发明可以包括构成本发明核心的序列以外的序列的部分缺失的酶或编码这种酶的核苷酸序列的片段，并且可以包括具有与本发明所用的相同功能的所有氨基酸或核苷酸序列，不论片段的长度如何。
在本发明中，衍生自谷氨酸棒状杆菌的苹果酸脱氢酶可以由以下SEQ ID NO:40表示。
SEQ ID NO:40
MNSPQNVSTKKVTVTGAAGQISYSLLWRIANGEVFGTDTPVELKLLEIPQALGGAEGVAMELLDSAFPLLRNITITADANEAFDGANAAFLVGAKPRGKGEERADLLANNGKIFGPQGKA
INDNAADDIRVLVVGNPANTNALIASAAAPDVPASRFNAMMRLDHNRAISQLATKLGRGS
AEFNNIVVWGNHSATQFPDITYATVGGEKVTDLVDHDWYVEEFIPRVANRGAEIIEVRGK
SSAASAASSAIDHMRDWVQGTEAWSSAAIPSTGAYGIPEGIFVGLPTVSRNGEWEIVEGL
EISDFQRARIDANAQELQAEREAVRDLL
在本发明中，编码衍生自谷氨酸棒状杆菌的苹果酸脱氢酶的基因可以由以下SEQID NO:41表示。
SEQ ID NO:41
ATGAATTCCCCGCAGAACGTCTCCACCAAGAAGGTCACCGTCACCGGCGCAGCTGGTCAAATCTCTTATTCACTGTTGTGGCGCATCGCCAACGGTGAAGTATTCGGCACCGACACCCCTGTAGAACTGAAACTTCTGGAGATCCCTCAGGCTCTTGGCGGGGCAGAGGGTGTGGCTATGGAACTTCTGGATTCTGCCTTCCCCCTCCTGCGAAACATCACCATCACCGCGGATGCCAATGAGGCATTCGACGGCGCTAATGCGGCGTTTTTGGTCGGTGCGAAGCCTCGCGGAAAAGGCGAAGAGCGCGCAGATTTGCTGGCTAACAACGGCAAGATTTTCGGACCTCAAGGTAAAGCTATCAATGACAACGCCGCAGATGACATTCGTGTCCTAGTTGTTGGAAACCCAGCGAACACCAACGCGTTGATTGCTTCAGCTGCGGCCCCAGATGTTCCAGCATCCCGCTTCAACGCAATGATGCGCCTTGATCACAACCGTGCGATCTCCCAGCTGGCCACCAAGCTTGGCCGTGGATCTGCGGAATTTAACAACATTGTGGTCTGGGGAAATCACTCCGCAACCCAGTTCCCAGACATCACCTACGCAACCGTTGGTGGAGAAAAGGTCACTGACCTGGTTGATCACGATTGGTATGTGGAGGAGTTCATTCCTCGCGTGGCTAACCGTGGCGCTGAAATCATTGAGGTCCGTGGAAAGTCTTCTGCAGCTTCTGCAGCATCCTCTGCGATTGATCACATGCGCGATTGGGTACAGGGCACCGAGGCGTGGTCCTCTGCGGCAATTCCTTCCACCGGTGCATACGGCATTCCTGAGGGCATTTTTGTCGGTCTGCCAACCGTATCCCGCAACGGTGAGTGGGAAATCGTTGAAGGCCTGGAGATTTCCGATTTCCAGCGCGCCCGCATCGACGCGAATGCTCAGGAATTGCAGGCCGAGCGCGAGGCAGTGCGCGACTTGCTCTAA
在本发明中，衍生自产琥珀酸曼氏杆菌的苹果酸脱氢酶可以由以下SEQ ID NO:42表示。在本发明中，通过在以下SEQ ID NO:42中将第11个氨基酸从Gly取代为Gln，改进了MDH将草酰乙酸转化为苹果酸的效率。
SEQ ID NO:42
MKVAVLGAAGGIGQALALLLKLQLPAGSSLSLYDVAPVTPGVAKDLSHIPTDVVVEGFAGTDPSEALKGADIVLISAGVARKPGMTRADLFGVNAGIIRSLTEKVAEQCPKACVGIITNPVNAMVAIAAEVLKKAGVYDKRKLFGITTLDILRAETFIAELKGLDPTRVTIPVIGGHSGVTILPLLSQVQNVEWSSEEEIIALTHRIQNAGTEVVEAKAGGGSATLSMAQAAARFALALVKASQGAKVVECAYVEGDGKYARFFAQPVRLGTEGVEEYLTLGKLSAFEEKALNAMLETLQGDIKSGEDFING
在本发明中，编码衍生自产琥珀酸曼氏杆菌的ii)苹果酸脱氢酶的基因可以由以下SEQ ID NO:43表示。
SEQ ID NO:43
atgaaagttgcagttctaggtgccgcaggcggcattggtcaagcgttggctttattattaaagttacaattaccggctggttcatctttatctctgtatgatgtcgcacccgtcaccccgggtgttgctaaagatcttagccatatcccaacagatgttgtggttgaaggttttgccggtacggatccttcagaagcattaaaaggggcggatattgtgttaatttctgcgggtgtggcacgtaaaccgggcatgacacgtgcggatttattcggtgttaatgcgggtattattcgtagtctgaccgaaaaagtggcggaacaatgcccgaaagcctgtgtgggtattatcaccaacccggttaatgcgatggttgccattgcggccgaagtattgaaaaaagcgggtgtttacgacaaacgtaaattattcggcattactaccttagatattcttcgagcggaaacctttatcgccgaattaaaaggcttagatcctactcgggttacaattcctgttatcggcggtcattcgggtgtaaccattcttccgttattgtctcaagttcaaaatgttgaatggagcagtgaagaggaaatcattgctttaacgcatcgtatccaaaatgcaggtacggaagtggttgaagcaaaagcgggcggcggttctgcaaccttatctatggcgcaggcggcggcacgttttgcattagcattagtgaaagcctcgcaaggtgcgaaagttgttgaatgcgcttatgtggaaggcgacggcaaatatgcccgtttctttgcacaaccggttcgtttaggtacagaaggtgttgaagaatacttaaccctgggtaaattaagtgcatttgaagaaaaagcgttaaatgctatgttagaaactttacaaggtgacattaagtcaggtgaagattttattaacggttaa
在本发明中，其中由SEQ ID NO:42的氨基酸序列表示的衍生自产琥珀酸曼氏杆菌的苹果酸脱氢酶的第11个氨基酸被谷氨酰胺取代的苹果酸脱氢酶可以由以下SEQ ID NO:44的氨基酸序列表示。
SEQ ID NO:44
MKVAVLGAAGQIGQALALLLKLQLPAGSSLSLYDVAPVTPGVAKDLSHIPTDVVVEGFAGTDPSEALKGADIVLISAGVARKPGMTRADLFGVNAGIIRSLTEKVAEQCPKACVGIITNPVNAMVAIAAEVLKKAGVYDKRKLFGITTLDILRAETFIAELKGLDPTRVTIPVIGGHSGVTILPLLSQVQNVEWSSEEEIIALTHRIQNAGTEVVEAKAGGGSATLSMAQAAARFALALVKASQGAKVVECAYVEGDGKYARFFAQPVRLGTEGVEEYLTLGKLSAFEEKALNAMLETLQGDIKSGEDFING
在本发明中，由SEQ ID NO:44的氨基酸序列表示的编码衍生自产琥珀酸曼氏杆菌的苹果酸脱氢酶的基因可以由以下SEQ ID NO:45的氨基酸序列表示。
SEQ ID NO:45
atgaaagttgcagttctaggtgccgcaggccagattggtcaagcgttggctttattattaaagttacaattaccggctggttcatctttatctctgtatgatgtcgcacccgtcaccccgggtgttgctaaagatcttagccatatcccaacagatgttgtggttgaaggttttgccggtacggatccttcagaagcattaaaaggggcggatattgtgttaatttctgcgggtgtggcacgtaaaccgggcatgacacgtgcggatttattcggtgttaatgcgggtattattcgtagtctgaccgaaaaagtggcggaacaatgcccgaaagcctgtgtgggtattatcaccaacccggttaatgcgatggttgccattgcggccgaagtattgaaaaaagcgggtgtttacgacaaacgtaaattattcggcattactaccttagatattcttcgagcggaaacctttatcgccgaattaaaaggcttagatcctactcgggttacaattcctgttatcggcggtcattcgggtgtaaccattcttccgttattgtctcaagttcaaaatgttgaatggagcagtgaagaggaaatcattgctttaacgcatcgtatccaaaatgcaggtacggaagtggttgaagcaaaagcgggcggcggttctgcaaccttatctatggcgcaggcggcggcacgttttgcattagcattagtgaaagcctcgcaaggtgcgaaagttgttgaatgcgcttatgtggaaggcgacggcaaatatgcccgtttctttgcacaaccggttcgtttaggtacagaaggtgttgaagaatacttaaccctgggtaaattaagtgcatttgaagaaaaagcgttaaatgctatgttagaaactttacaaggtgacattaagtcaggtgaagattttattaacggttaa
在本发明中，具有琥珀酸产生能力的微生物可以选自曼氏杆菌属物种、放线杆菌属物种、厌氧螺菌属物种、大肠杆菌和棒状杆菌属物种。
优选地，具有琥珀酸产生能力的微生物是产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)。同时，具有琥珀酸产生能力的微生物优选地是Basfia菌变体，其通过使与产琥珀酸曼氏杆菌非常相似的Basfia菌属(Basfia sp.)菌株中编码乳酸脱氢酶的基因、编码磷酸转乙酰酶的基因和编码乙酸激酶的基因缺失而获得。
为了进一步改进琥珀酸的产率，通过以高浓度接种所构建的PALKcgmdh菌株，在厌氧条件下以改进的产率生产琥珀酸。以8.7gDCW/L的初始高浓度接种细胞，然后使用葡萄糖和甘油作为双碳源在限制性培养基中进行分批补料发酵。结果，以1.32mol/mol葡萄糖的产量和10.32g/L/h的产率生产了134.25g/L的琥珀酸(图14；表1)。这些结果优于使用相似方法的大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌所展现出的琥珀酸产率。Litsanov等人显示使用葡萄糖和甲酸，通过使用经修饰的谷氨酸棒状杆菌接种12.5gDCW/L高浓度的细胞，以2.53g/L/h的产率获得了134g/L的琥珀酸。这显示，尽管使用较少量的8.7gDCW/L的细胞，但产琥珀酸曼氏杆菌PALKcgmdh菌株仍可以高产率和高浓度生产琥珀酸。同时，Vemuri等人证明，在大肠杆菌的情况下，通过分批补料发酵过程以每个细胞0.12g/gDCW/h的产率生产了99.2g/L的琥珀酸，在该发酵过程中在细胞处于高浓度时开始厌氧培养。这一产率与以每个细胞1.19g/gDCW/h的产率生产琥珀酸的产琥珀酸曼氏杆菌PALK(pMS3-cgmdh)菌株相比非常低(Litsanov等人,Appl.Environ.Microbiol.,78(9):3325-37.,2012；Vemuri等人,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.,28:325-332.,2002)。
另一方面，本发明涉及一种用于生产琥珀酸的方法，该方法包括：(a)培养突变型微生物以生产琥珀酸，和(b)回收所生产的琥珀酸。
在本发明中，可以使用i)葡萄糖、ii)蔗糖、iii)甘油、iv)葡萄糖和甘油或v)蔗糖和甘油作为碳源进行培养。培养可以在厌氧条件下进行，或者可以通过将突变型微生物的初始浓度以15至25的OD600浓缩来进行，但是本发明不限于此。以高初始浓度浓缩突变型微生物的方法可以包括如下的接种方法，其包括在接种后立即注入高浓度的突变型微生物(以下称为“接种方法”)，或膜式细胞循环生物反应器方法(以下称为“MCRB方法”)。
在本发明中，可以在pH为6.0至7.0的培养基中培养突变型微生物，但是本发明不限于此。
实施例
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明本发明，并且不应视为限制本发明的范围。
特别地，在以下实施例中，只有产琥珀酸的微生物曼氏杆菌属物种被用作用于取代或过表达根据本发明的基因的宿主细胞示例。然而，对本领域技术人员而言显而易见的是，尽管使用了其他类型的产琥珀酸的微生物，仍可获得琥珀酸产率与本发明相似的突变型微生物。
[实施例1]
MsMDH、CgMDH、EcMDH、ScMDHc、ScMDHm、ScMDHp和YlMDH过表达载体(pET30a:MsMDH，pET30a:CgMDH，pET30a:EcMDH，pET30a:ScMDHc，pET30a:ScMDHm，pET30a:ScMDHp，pET30a:YlMDH)的构建以及突变型酶过表达载体(pET30a:MsMDHG11Q，pET30a:CgMDHQ20G，pET30a:MsMDHL101Q，pET30a:CgMDHQ117L，pET30a:MsMDHA224S，pET30a:CgMDHS242A)的构建
各自构建过表达载体以在大肠杆菌中过表达产琥珀酸微生物的MDH，并从而获得蛋白质。使用SEQ ID NO:1和2、SEQ ID NO:3和4、SEQ ID NO:5和6以及SEQ ID NO:7和8的引物，并使用产琥珀酸曼氏杆菌、谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌K12和解脂耶氏酵母的基因组DNA作为模板进行PCR。用NdeI和XhoI限制酶切割所得的PCR产物，然后将其克隆到pET30a(Merck Millipore)的NdeI和XhoI位点，以构建过表达载体pET30a:MsMDH、pET30a:CgMDH、pET30a:EcMDH和pET30a:YlMDH。
SEQ ID NO:1:5'-GCGCCATATGAATTCCCCGCAGAACGTCTCCACC
SEQ ID NO:2:5'-GCGCCTCGAG GAGCAAGTCGCGCACTGCCTCGCGC
SEQ ID NO:3:5'-GCGCCATATGAAAGTTGCAGTTCTAGGTGCCGCA
SEQ ID NO:4:5'-GCGCCTCGAG ACCGTTAATAAAATCTTCACCTGAC
SEQ ID NO:5:5'-GCGCCATATGAAAGTCGCAGTCCTCGGCGCTGCT
SEQ ID NO:6:5'-GCGCCTCGAGCTTATTAACGAACTCTTCGCCCAG
SEQ ID NO:7:5'-GCGCCATATGGTTAAAGCTGTCGTTGCCGGAGCC
SEQ ID NO:8:5'-GCGCCTCGAGGTTGGCAGGAGGAGGGTTAACAAT
为了构建过表达衍生自酿酒酵母的三种MDH(ScMDHc、ScMDHm、ScMDHp)的载体，使用对应于SEQ ID NO:9和10、SEQ ID NO:11和12以及SEQ ID NO:13和14的引物并使用酿酒酵母的基因组作为模板进行PCR。用NdeI和XhoI限制酶切割所得的PCR产物，并将其克隆到pET30a的NdeI和XhoI位点，以构建过表达载体pET30a:ScMDHc、pET30a:ScMDHm和pET30a:ScMDHp。
SEQ ID NO:9:5'-GCGCCATATGCCTCACTCAGTTACACCATCCATA
SEQ ID NO:10:5'-GCGCCTCGAGAGATGATGCAGATCTCGATGCAAC
SEQ ID NO:11:5'-GCGCCATATGTTGTCAAGAGTAGCTAAACGTGCG
SEQ ID NO:12:5'-GCGCCTCGAGTTTACTAGCAACAAAGTTGACACC
SEQ ID NO:13:5'-GCGCCATATGGTCAAAGTCGCAATTCTTGGCGCT
SEQ ID NO:14:5'-GCGCCTCGAGTAGCTTGGAAGAGTCTAGGATGAA
为了制备能够过表达突变型酶MsMDH的载体(pET30a:MsMDHG11Q、pET30a:MsMDHL101Q、pET30a:MsMDHA224S)，分别使用SEQ ID NO:15和16、SEQ ID NO:17和18以及SEQID NO:19和20的引物并使用pET30a:MsMDH作为模板进行PCR。将得到的PCR产物转化到大肠杆菌中，使其在含有卡那霉素的LB(Luria-Bertani)固体培养基中选择性生长，并进行选择。类似地，为了制备能够过表达突变型酶CgMDH的载体(pET30a:CgMDHQ20G、pET30a:CgMDHQ117L、pET30a:CgMDHS242A)，使用SEQ ID NO:21和22、SEQ ID NO:23和24以及SEQ IDNO:25和26的引物并使用pET30a:CgMDH作为模板进行PCR。将得到的PCR产物转化到大肠杆菌中，使其在含有卡那霉素的LB(Luria-Bertani)固体培养基中选择性生长，并进行提取。最后，进行测序以确认突变成功。
SEQ ID NO:15:5'-CTAGGTGCCGCAGGCCAGATTGGTCAAGCGTTG
SEQ ID NO:16:5'-CAACGCTTGACCAATCTGGCCTGCGGCACCTAG
SEQ ID NO:17:5'-GGTATTATTCGTAGTCAGACCGAAAAAGTGGCG
SEQ ID NO:18:5'-CGCCACTTTTTCGGTCTGACTACGAATAATACC
SEQ ID NO:19:5'-GCGGGCGGCGGTTCTTCAACCTTATCTATGGCG
SEQ ID NO:20:5'-CGCCATAGATAAGGTTGAAGAACCGCCGCCCGC
SEQ ID NO:21:5'-ACCGGCGCAGCTGGTGGCATCTCTTATTCACTG
SEQ ID NO:22:5'-CAGTGAATAAGAGATGCCACCAGCTGCGCCGGT
SEQ ID NO:23:5'-AAGATTTTCGGACCTCTGGGTAAAGCTATCAATG
SEQ ID NO:24:5'-CATTGATAGCTTTACCCAGAGGTCCGAAAATCTT
SEQ ID NO:25:5'-GTCCGTGGAAAGTCTGCGGCAGCTTCTGCAGCA
SEQ ID NO:26:5'-TGCTGCAGAAGCTGCCGCAGACTTTCCACGGAC
[实施例2]
MsMDH、CgMDH、EcMDH、YlMDH及其突变型酶蛋白(MsMDHG11Q、CgMDHQ20G、MsMDHL101Q、CgMDHQ117L、CgMDHS242A)的表达和纯化
将实施例1中制备的过表达载体(PET30a:MsMDH、pET30a:CgMDH、pET30a:EcMDH和pET30a:YlMDH)转化到大肠杆菌BL21(DE3)-T1R中并在37℃在含有100μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养，当OD600为0.6时，通过IPTG诱导表达。诱导表达后，将细胞在18℃下进一步培养20小时，以表达相应的酶蛋白。将得到的培养液在4℃下以5,000g离心15分钟，然后收集细胞，并在放置于冰块上低温保存的缓冲液A(40mM Tris-HCl，pH 8.0)中进行超声裂解。通过以11,000g离心1小时从获得的细胞裂解液中除去细胞碎片。将最终的上清液施加到Ni-NTA琼脂糖珠上，并通过亲和色谱法选择性地纯化具有组氨酸标签的MDH蛋白。用含有20mM的低浓度咪唑的缓冲液A洗涤剩余的非特异性结合蛋白后，用含有300mM咪唑的缓冲液A洗脱靶蛋白。为了进一步纯化以获得高纯度的蛋白质，可以使用HiTrap Q通过离子交换色谱和尺寸排阻色谱获得具有95％高纯度或更高纯度的MDH蛋白。如实施例3中所述将纯化的MDH蛋白稀释至3nM的浓度，并将其用于活性测量。最后将CgMDH和MsMDH蛋白分别浓缩至54mg/mL和42mg/mL，并进行结晶。
[实施例3]
MsMDH、CgMDH、EcMDH、YlMDH、MsMDHG11Q、CgMDHQ20G、MsMDHL101Q、CgMDHQ117L和CgMDHS242A的草酰乙酸还原活性的测量
将NADH用作MDH草酰乙酸还原活性的辅因子。结果，产生了NAD+。MDH的活性可以基于NADH在340nm处的独特吸光度，通过分光光度法每小时测量一次。用于比较活性测量的最终反应溶液的组成如下：0.1M Tris-HCl(pH 8.0)，100μM NADH，100μM草酰乙酸，最后是3nM纯化的MDH(MsMDH、CgMDH、EcMDH、YlMDH)。用于测量突变型酶(MsMDHG11Q、CgMDHQ20G、MsMDHL101Q、CgMDHQ117L、CgMDHS242A)活性的最终反应溶液的组成与用于测量比较活性的组成相同。在上述条件下，在改变草酰乙酸的浓度和NADH的浓度的同时，用最终反应溶液测量动力学活性，在测量草酰乙酸的动力学活性时将NADH的浓度设定为200μM，并且在测量NADH的动力学活性时将草酰乙酸的浓度设定为100μM。在绘制曲线图时，通过计算添加酶后初始反应时间内NADH的减少量，将每分钟转化的草酰乙酸的浓度(μM)表示为初始速率，作为消光系数。为了比较取决于pH的活性，使用了最终反应溶液的组成(0.1M缓冲液、200μM NADH、100μM草酰乙酸、3nM MDH)。使用BIS-tris缓冲液、Tris-HCl缓冲液和甘氨酸缓冲液，其pH分别为5.0至6.0、7.0至9.0和10.0。
[实施例4]
CgMDH和MsMDH的结晶和结构分析
使用筛选试剂盒(Hampton Research，CA，USA)，通过坐滴式蒸汽扩散法(sitting-drop vapor-diffusion)在20℃下进行纯化蛋白的初始结晶。通过相对于0.5mL储液平衡1.0μL的CgMDH或MsMDH蛋白和1.0μL的储液的混合物进行每项实验。在几种结晶筛选条件下发现了CgMDH晶体，并在通过悬滴式蒸汽扩散法(hanging-drop vapor-diffusion)进行了数次优化循环后，在18％PEG 3350、0.2M MgC12六水合物和0.1M HEPES的条件下发现了具有最佳质量的晶体。为了确定底物结合结构，以苹果酸和NAD+为底物进行结晶，以在相同条件下获得晶体。在MsMDH的情况下，在pH 6.0的16％PEG3350和8％的Tacsimate中获得了尺寸为0.3x 0.3x 0.1mm的高质量晶体，并对其进行了X射线衍射实验。为了确定底物结合结构，用底物NAD+进行结晶，以在相同条件下获得MsMDH底物结合的晶体。使用储液中所含的30％甘油使晶体在低温下保存，并通过QUANTUM 270CCD检测器在浦项加速器实验室(Pohang Accelerator Laboratory)的
光束线上收集了
波长的X射线衍射图像。经确认，与CgMDH和NAD+、苹果酸结合的CgMDH晶体、MsMDH和与NAD+结合的MsMDH晶体分别衍射至
和
的分辨率。使用HKL2000程序对这些数据进行索引、整合和缩放。CgMDH和MsMDH数据各通过分子替代方案即结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)MDH(PDB代码4TVO)和流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)MDH(PDB代码6AOO)的结构来定相。使用WinCoot进行模型构建，并使用REFMAC5进行完善。
[实施例5]
MsMDH、CgMDH、CgMDHQ20G和MsMDHG11Q过表达载体(pMS3-msmdh、pMS3-cgmdh、pMS3-cgmdhQ20G、pMS3-msmdhG11Q)的构建和PALK(pMS3-msmdh)、PALK(pMS3-cgmdh)、PALK(pMS3-cgmdhQ20G)和PALK(pMS3-msmdhG11Q)菌株的构建
为了过表达各产琥珀酸微生物的MDH并确定其效果，以及为过表达基于结构分析修饰的MDH并确定其效果，构建了对应的过表达载体。首先，为了获得MsMDH过表达载体pMS3-msmdh，使用SEQ ID NO:27和28的引物和产琥珀酸曼氏杆菌的基因组作为模板进行PCR。将所得的PCR产物克隆到pMS3中的EcoRI和KpnI位点(Jang等人,Appl.Environ.Microb.73(17):5411-5420.,2007)，以完成pMS3-msmdh载体。为了获得CgMDH过表达载体pMS3-cgmdh，使用SEQ ID NO:29和30的引物并使用谷氨酸棒状杆菌的基因组作为模板进行PCR。将所得的PCR产物克隆到pMS3中的EcoRI和KpnI位点，以完成pMS3-cgmdh载体。使用SEQ ID NO:29和30的引物和CgMDHQ20G基因片段作为模板进行PCR，以获得CgMDHQ20G过表达载体pMS3-cgmdhQ20G。将由此获得的PCR产物克隆到pMS3中的EcoRI和KpnI位点，以完成pMS3-cgmdhQ20G载体。使用SEQ ID NO:27和28的引物并使用MsMDHG11Q基因片段作为模板进行PCR，以获得MsMDHG11Q过表达载体pMS3-msmdhG11Q。将所得的PCR产物克隆到pMS3中的EcoRI和KpnI位点，以完成pMS3-msmdhG11Q载体。
SEQ ID NO:27:5'-TATCAACTCTACTGGGGAGGAATTCATGAAAGTTGCAGTTCTAG
SEQ ID NO:28:5'-TCTAGAGGATCCCCGGGTACCTTAACCGTTAATAAAATCTTCAC
SEQ ID NO:29:5'-TATCAACTCTACTGGGGAGGATGAATTCCCCGCAGAAC
SEQ ID NO:30:5'-GGATCCCCGGGTACCGAGCTTTAGAGCAAGTCGCGCAC
最后，通过将按上述生产的pMS3-msmdh、pMS3-cgmdh、pMS3-cgmdhQ20G和pMS3-msmdhG11Q引入到产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)中，各自构建PALK(pMS3-msmdh)、PALK(pMS3-cgmdh)、PALK(pMS3-cgmdhQ20G)和PALK(pMS3-msmdhG11Q)菌株。为了引入上述过表达载体，将产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)铺板在BHI(Brain-Heart Infusion)固体培养基上，在39℃下培养36小时，然后将菌落接种到10mL的BHI液体中培养基中并培养12小时。将1mL完全生长的细胞培养液再次接种在100mL的BHI液体培养基中，然后在39℃的培养箱中培养。约4至5小时后，当细胞生长达到约0.3至0.5的OD600时，将细菌细胞培养液保持在0至4℃下20分钟，以防止细胞进一步生长，然后在4℃和4,500rpm下离心15分钟以获得细胞。然后，将细胞重悬于200mL的4℃、10％甘油溶液中，然后在与上述相同的条件下再次离心。以这种方式进行总共三次重悬和离心，同时将使用的10％甘油溶液的量减半。将得到的细胞重悬于相同体积的10％甘油溶液中，等分并在-80℃下保存。将获得的浓缩细胞悬液和在该实施例中制备的四种类型的过表达载体混合，并在2.5kV、25μF和200Ω的条件下进行电穿孔，以用所述载体诱导产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)的转化。将由此电穿孔的细胞在39℃培养箱中的BHI液体培养基中回收培养1小时，然后将培养液铺板在含有2.5μg/mL抗生素氨苄青霉素的BHI固体培养基上，并在39℃的培养箱中培养48小时或更长时间。将在所述培养基中形成的突变型菌株在含有抗生素的BHI液体培养基中培养，并对使用载体mini-prep获得的载体进行电泳，以确认过表达载体的引入。
[实施例6]
EcMDH、ZrMDH、ScMDH2和ScMDH3过表达载体(pMS3-ecmdh、pMS3-zrmdh、pMS3-scmdh2、pMS3-scmdh3)的构建以及PALK(pMS3-ecmdh)、PALK(pMS3-zrmdh)、PALK(pMS3-scmdh2)和PALK(pMS3-scmdh3)菌株的构建。
构建对应的过表达载体以过表达现有技术中报道的MDH并鉴定其效果。首先，使用SEQ ID NO:46和47的引物并以大肠杆菌的基因组为模板进行PCR，以获得EcMDH过表达载体pMS3-ecmdh。将得到的PCR产物克隆到pMS3中的EcoRI和KpnI位点，以构建pMS3-msmdh载体。使用合成的Zrmdh基因片段作为模板并使用SEQ ID NO:48和49的引物进行PCR，以获得ZrMDH过表达载体pMS3-zrmdh。将得到的PCR产物克隆到pMS3中的EcoRI和KpnI位点，以构建pMS3-cgmdh载体。使用SEQ ID NO:50和51的引物并使用合成的ScMDH2基因片段作为模板进行PCR，以获得ScMDH2过表达载体pMS3-scmdh2。将所得的PCR产物克隆到pMS3中的EcoRI和KpnI位点，以完成pMS3-scmdh2载体。使用SEQ ID NO:52和53的引物并使用合成的ScMDH3基因片段作为模板进行PCR，以获得ScMDH3过表达载体pMS3-scmdh3。将所得的PCR产物克隆到pMS3中的EcoRI和KpnI位点，以完成pMS3-scmdh3载体。
SEQ ID NO:46:5'-TATCAACTCTACTGGGGAGGATGAAAGTCGCAGTCCTC
SEQ ID NO:47:5'-TCTAGAGGATCCCCGGGTACTTACTTATTAACGAACTCTTCGC
SEQ ID NO:48:5'-TATCAACTCTACTGGGGAGGATGAAAGTTGCAATAGTCG
SEQ ID NO:49:5'-TCTAGAGGATCCCCGGGTACCTACAATTTAGCACCGAG
SEQ ID NO:50:5'-TATCAACTCTACTGGGGAGGATGCCTCACTCAGTTACAC
SEQ ID NO:51:5'-TCTAGAGGATCCCCGGGTACTTAAGATGATGCAGATCTCG
SEQ ID NO:52:5'-TATCAACTCTACTGGGGAGGATGGTCAAAGTCGCAATTC
SEQ ID NO:53:5'-TCTAGAGGATCCCCGGGTACTCATAGCTTGGAAGAGTC
最后，通过将按上述生产的pMS3-ecmdh、pMS3-zrmdh、pMS3-scmdh2和pMS3-scmdh3引入到产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)中，各自构建PALK(pMS3-ecmdh)、PALK(pMS3-zrmdh)、PALK(pMS3-scmdh2)和PALK(pMS3-scmdh3)菌株。为了引入上述过表达载体，以与实施例5类似的方式，将产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)铺板在BHI固体培养基上并在39℃下培养36小时，然后将菌落接种到10mL的BHI液体培养基中并培养12小时。将1mL完全生长的细胞培养液再次接种在100mL的BHI液体培养基中，然后在39℃的培养箱中培养。约4至5小时后，当细胞生长达到约0.3至0.5的OD600时，将细菌细胞培养液保持在0至4℃下20分钟，以防止细胞进一步生长，然后在4℃和4,500rpm下离心15分钟以获得细胞。然后，将细胞重悬于200mL的4℃、10％甘油溶液中，然后在与上述相同的条件下再次离心。以这种方式进行总共三次重悬和离心，同时将使用的10％甘油溶液的量减半。将得到的细胞重悬于相同体积的10％甘油溶液中，等分并在-80℃下保存。将获得的浓缩细胞悬液和在该实施例中制备的四种类型的过表达载体混合，并在2.5kV、25μF和200Ω的条件下进行电穿孔，以用所述载体诱导产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)的转化。将由此电穿孔的细胞在39℃培养箱中的BHI液体培养基中回收培养1小时，然后将培养液铺板在含有2.5μg/mL抗生素氨苄青霉素的BHI固体培养基上，并在39℃的培养箱中培养48小时或更长时间。将在所述培养基中形成的突变型菌株在含有抗生素的BHI液体培养基中培养，并对使用载体mini-prep获得的载体进行电泳，以确认过表达载体的引入。
[实施例7]
大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌的CgMDH过表达载体(p100pro99A-cgmdh、pEKEx1-cgmdh)的构建和大肠杆菌W3110(p100pro99A-cgmdh)菌株和谷氨酸棒状杆菌(pEKEx1-cgmdh)菌株的构建
为了研究CgMDH在大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌中的过表达效果，构建了代表性的产琥珀酸菌株和每种菌株的CgMDH过表达载体。首先，使用谷氨酸棒状杆菌的基因组作为模板，使用SEQ ID NO:54和55的引物进行PCR，以获得大肠杆菌的过表达载体p100pro99A-cgmdh。将得到的PCR产物克隆到p100pro99A的EcoRI和PstI位点(Bang等人,ProcNat.Acad.Sci.,115(40):E9271-E9279.,2018)，以构建p100pro99A-cgmdh载体。使用SEQID NO:56和57的引物并以谷氨酸棒状杆菌的基因组作为模板进行PCR，以获得谷氨酸棒状杆菌的过表达载体pEKEx1-cgmdh。将所得的PCR产物克隆到pEKEx1的EcoRI和PstI位点(Cho等人,Metab.Eng.42:157-167,2017)，以完成pEKEx1-cgmdh载体。
SEQ ID NO:54:5'-TCCTAGGTACAGTGCTAGCGATGAATTCCCCGCAGAAC
SEQ ID NO:55:5'-GCCAAGCTTGCATGCCTGCATTAGAGCAAGTCGCGCAC
SEQ ID NO:56:5'-CAATTTCACACAGGAAACAGATGAATTCCCCGCAGAAC
SEQ ID NO:57:5'-AACAGCCAAGCTTGGCTGCATTAGAGCAAGTCGCGCAC
最后，通过将如上所述构建的p100pro99A-cgmdh和pEKEx1-cgmdh载体引入大肠杆菌W3110和野生型谷氨酸棒状杆菌中，各自开发出大肠杆菌W3110(p100pro99A-cgmdh)和谷氨酸棒状杆菌(pEKEx1-cgmdh)菌株。为了引入上述过表达载体，将大肠杆菌W3110铺板在LB固体培养基上并在37℃下培养24小时，然后将菌落接种到10mL的LB液体培养基中并培养12小时。将1mL完全生长的细胞培养液再次接种在100mL的LB液体培养基中，然后在37℃的培养箱中培养。约4至5小时后，当细胞生长达到约0.3至0.5的OD600时，将细菌细胞培养液保持在0至4℃下20分钟，以防止细胞进一步生长，然后在4℃和4,500rpm下离心15分钟以获得细胞。然后，将细胞重悬于200mL的4℃、10％甘油溶液中，然后在与上述相同的条件下再次离心。以这种方式进行总共三次重悬和离心，同时将使用的10％甘油溶液的量减半。将得到的细胞重悬于相同体积的10％甘油溶液中，等分并在-80℃下保存。将获得的浓缩细胞悬液和在该实施例中制备的过表达载体p100pro99A-cgmdh混合，并在1.8kV、25μF和200Ω的条件下进行电穿孔，以用所述载体诱导大肠杆菌W3110的转化。将由此电穿孔的细胞在37℃培养箱中的LB液体培养基中回收培养1小时，然后将培养液铺板在含有25μg/mL抗生素氨苄青霉素的LB固体培养基上，并在37℃的培养箱中培养24小时或更长时间。将在所述培养基中形成的突变型菌株在含有抗生素的LB液体培养基中培养，并对使用载体mini-prep获得的载体进行电泳，以确认过表达载体的引入。以与上述类似的方式，将谷氨酸棒状杆菌铺板在BHIS(37g BHI，D-山梨糖醇91g/升)固体培养基上，并在30℃下培养24小时，然后将菌落接种到10mL的BHIS液体培养基中并培养18小时。将1mL完全生长的细胞培养液再次接种在100mL的BHIS液体培养基中，然后在30℃的培养箱中培养。约4至5小时后，当细胞生长达到约0.3至0.5的OD600时，以与大肠杆菌W3110的情况相同的方式制备浓缩的细胞悬液，并将其储存在-80℃下。将获得的浓缩细胞悬液和在该实施例中制备的过表达载体pEKEx1-cgmdh混合，并在1.8kV、25μF和200Ω的条件下进行电穿孔，以用所述载体诱导谷氨酸棒状杆菌的转化。将由此电穿孔的细胞在30℃培养箱中的BHIS液体培养基中回收培养2小时，然后将培养液铺板在含有25μg/mL抗生素卡那霉素的BHIS固体培养基上，并在30℃的培养箱中培养24小时或更长时间。将在所述培养基中形成的突变型菌株在含有抗生素的BHIS液体培养基中培养，并对使用载体mini-prep获得的载体进行电泳，以确认过表达载体的引入。
[实施例8]
CgMDH和MsMDHG11Q取代载体(pINcgMDH，pINmsMDHG11Q)的构建以及PALKcgmdh和PALKmsmdhG11Q菌株的构建
为了研究产琥珀酸菌株中天然存在的MDH对PALK(pMS3-cgmdh)和PALK(pMS3-msmdh)菌株的琥珀酸产量的改进的影响，使产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)菌株的基因组中存在的编码MDH的基因缺失，并构建CgMDH和MsMDHG11Q取代载体pINcgMDH和pINmsMDHG11Q，将编码CgMDH和MsMDHG11Q的基因插入缺失位点。为了构建pINcgMDH，用XhoI和SacI切割含有sacB基因的pSacHR06。然后，分别使用SEQ ID NO:31和32以及SEQ ID NO:38和39的引物，以产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)菌株的基因组为模板进行PCR，以获得所述基因组中存在的MDH编码基因的前后序列。使用SEQ ID NO:36和37的引物，以含有氯霉素耐药基因的载体为模板进行PCR，以获得lox66-cat-lox77盒。使用SEQ ID NO:33和35的引物，以实施例5中制备的pMS3-cgmdh载体为模板进行PCR，以获得CgMDH基因。将所获得的线性pSacHR06、MDH编码基因的前后序列各1kb、lox66-cat-lox77盒和CgMDH基因片段通过Gibson组装(Gibson等人,Nat.Methods.,6(5):343.,2009)进行组合，以获得pINcgMDH。通过使用SEQ ID NO:33和34的引物，以pMS3-msmdhG11Q为模板进行PCR，获得pINmsMDHG11Q所需的MsMDHG11Q基因片段。将所获得的线性pSacHR06、MDH编码基因的前后序列各1kb、lox66-cat-lox77盒和MsMDHG11Q基因片段通过Gibson组装进行组合，以获得pINmsMDHG11Q。将由此获得的pINcgMDH和pINmsMDHG11Q引入到产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)中，以最终分别构建PALKcgmdh和PALKmsmdhG11Q菌株。
SEQ ID NO:31:5'-TTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGCCTTATGTGGACCGAGAAGA
SEQ ID NO:32:5'-GGCATTAGCCAACAGAATAGCTGACCGAAAAAGTGGCGGA
SEQ ID NO:33:5'-CTATTCTGTTGGCTAATGCC
SEQ ID NO:34:5'-TGTAGCCGCGTTCTAACGACTACGAATAATACCCGCAT
SEQ ID NO:35:5'-TGTAGCCGCGTTCTAACGTCGACTCTAGAGGATCCCCG
SEQ ID NO:36:5'-CGTTAGAACGCGGCTACA
SEQ ID NO:37:5'-ATAGGGAGACCGGCAGATC
SEQ ID NO:38:5'-GATCTGCCGGTCTCCCTATTTAAGACTCCTTAATGTGGA
SEQ ID NO:39:5'-GCCGCCACCGCGGTGGAGCTCGCGTTAGTTGTTGAGTTAAT
换言之，以与实施例5类似的方式，将产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)铺板在BHI固体培养基上并在39℃下培养3小时，然后将菌落接种到10mL的BHI液体培养基中并培养1小时。将1mL完全生长的细胞培养液再次接种在100mL的BHI液体培养基中，然后在39℃的培养箱中培养。4至5小时后，当细胞生长达到约0.3至0.5的OD600时，将细菌细胞培养液保持在0至4℃下2分钟，以防止细胞进一步生长，然后在4℃和4,500rpm下离心15分钟以获得细胞。然后，将细胞重悬于200mL的4℃、10％甘油溶液中，然后在与上述相同的条件下再次离心。以这种方式进行总共三次重悬和离心，同时将使用的10％甘油溶液的量减半。将得到的细胞重悬于相同体积的10％甘油溶液中，等分并在-80℃下保存。
将获得的浓缩细胞悬液和在该实施例中制备的基因缺失载体pINcgMDH或pINmsMDHG11Q混合，并在2.5kV、25μF和200Ω的条件下进行电穿孔，以用所述载体诱导产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)的转化。将由此电穿孔的细胞在39℃培养箱中的BHI液体培养基中回收培养1小时，然后将培养液铺板在含有6.8μg/mL氯霉素的BHI固体培养基上，并在39℃的培养箱中培养48小时或更长时间。将形成的菌落铺板于含有氯霉素(6.8μg/mL)和蔗糖(100g/L)的BHI固体培养基上，培养24小时，然后再次铺板于相同的固体培养基中，以筛选双交换菌落。
将在所述培养基中形成的突变型菌株在含有抗生素的BHI液体培养基中培养，并分析所培养菌株的基因组DNA。使用分离的突变型菌株的基因组DNA为模板进行PCR，对获得的PCR产物进行电泳，以确认CgMDH或MsMDHG11Q的引入和基因组DNA中mdh基因的缺失。
[实施例9]
使用产琥珀酸曼氏杆菌PALK(pMS3-msmdh)、PALK(pMS3-cgmdh)、PALK(pMS3-cgmdhQ20G)和PALK(pMS3-msmdhG11Q)菌株生产琥珀酸将实施例5中制备的产琥珀酸曼氏杆菌PALK(pMS3-msmdh)、PALK(pMS3-cgmdh)、PALK(pMS3-cgmdhQ20G)和PALK(pMS3-msmdhG11Q)菌株在20mL的MH5培养基(每升2.5g酵母提取物、2.5g多聚蛋白胨、1g NaCl、0.02g CaCl2·2H2O、0.2g MgCl2·6H2O和8.709g K2HPO4)中于厌氧条件下在39℃培养8小时，接种单独灭菌的10g/L浓度的葡萄糖或甘油作为碳源，然后在270mL相同培养基中培养。如下进行发酵：通过在含有2.5L合成培养基(每升1g NaCl、2g(NH4)2HPO4、0.02g CaCl2·2H2O、0.2g MgCl2·6H2O、8.709g K2HPO4、0.5g半胱氨酸、0.5g蛋氨酸、0.5g天冬酰胺、0.5g天冬氨酸、0.5g脯氨酸、0.5g丝氨酸，0.005g烟酸、0.005g泛酸钙、0.005g盐酸吡哆醇、0.005g硫胺素、0.005g抗坏血酸和0.005g生物素)的微生物反应器(Bioflo 3000,New Brunswick Scientific Co.,NJ,USA)中接种培养液，并通过在39℃的温度和200rpm，以18.2g/L(100mM)的初始葡萄糖浓度或分别为18.2g/L(100mM)和4.6g/L(50mM)的初始葡萄糖和甘油浓度，以0.2vvm(二氧化碳的体积/反应器中的工作容积/分钟)的速率补料纯二氧化碳。在发酵过程中，使用1.57M氨溶液和6.84M氢氧化镁溶液将pH调节至6.5，并添加25μg/mL卡那霉素和25μg/mL氨苄青霉素作为抗生素。为了生产高浓度的琥珀酸，当碳源被完全消耗时，根据需要半连续地添加900g/L的葡萄糖溶液或葡萄糖和甘油溶液。使用分光光度计测量培养基中的细胞浓度，并使用先前测量的分光光度计的吸光度和干细胞(dry cell)的重量校准线计算细胞浓度。在发酵过程中，定期从生物反应器中收集样品。将收集的样品以13,000rpm离心10分钟，然后通过液相色谱分析上清液中各种代谢物、琥珀酸、葡萄糖和甘油的浓度。
结果，如图11和表1所示，当仅使用葡萄糖作为碳源时，PALK(pMS3-msmdh)菌株以1.23mol/mol葡萄糖的产量和3.26g/L/h的产率生产了79.07g/L的琥珀酸。PALK(pMS3-cgmdh)菌株以1.29mol/mol葡萄糖的产量和3.6g/L/h的产率生产了87.23g/L的琥珀酸。PALK(pMS3-cgmdhQ20G)菌株以1.00mol/mol葡萄糖的产量和3.27g/L/h的产率生产了79.39g/L的琥珀酸。最后，PALK(pMS3-msmdhG11Q)菌株的补料分批发酵结果显示，分别以1.08mol/mol葡萄糖的产量和3.48g/L/h的产率生产了84.19g/L的琥珀酸。结果，PALK(pMS3-cgmdh)菌株显示出最佳的琥珀酸生产能力，而基于蛋白质结构分析构建的经修饰的蛋白质过表达菌株PALK(pMS3-msmdhG11Q)菌株与产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)菌株相比，琥珀酸产率也有所改进。
[实施例10]
使用产琥珀酸曼氏杆菌PALK(pMS3-ecmdh)、PALK(pMS3-zrmdh)、PALK(pMS3-scmdh2)和PALK(pMS3-scmdh3)菌株生产琥珀酸
将实施例6中制备的产琥珀酸曼氏杆菌PALK(pMS3-ecmdh)、PALK(pMS3-zrmdh)、PALK(pMS3-scmdh2)和PALK(pMS3-scmdh3)菌株在20mL的MH5培养基中于厌氧条件下在39℃培养8小时，以与实施例9相同的方式接种单独灭菌的10g/L浓度的葡萄糖作为碳源，然后在270mL相同培养基中培养。如下进行发酵：通过在含有2.5L合成培养基的微生物反应器中接种培养液，并且通过在39℃的温度和200rpm，以18.2g/L(100mM)的初始葡萄糖浓度，以0.2vvm的速率补料纯二氧化碳。在发酵过程中，使用1.57M氨溶液和6.84M氢氧化镁溶液将pH调节至6.5，并添加25μg/mL卡那霉素和25μg/mL氨苄青霉素作为抗生素。为了生产高浓度的琥珀酸，当碳源被完全消耗时，根据需要半连续地添加900g/L的葡萄糖溶液。使用分光光度计测量培养基中的细胞浓度，并使用先前测量的分光光度计的吸光度和干细胞的重量校准线计算细胞浓度。在发酵过程中，定期从生物反应器中收集样品。将收集的样品以13,000rpm离心10分钟，然后通过液相色谱分析上清液中各种代谢物、琥珀酸、葡萄糖和甘油的浓度。
结果，如图12和表1所示，PALK(pMS3-msmdh)菌株以1.29mol/mol葡萄糖的产量和3.27g/L/h的产率生产了79.05g/L的琥珀酸。PALK(pMS3-zrmdh)菌株以1.25mol/mol葡萄糖的产量和3.15g/L/h的产率生产了76.11g/L的琥珀酸，PALK(pMS3-scmdh2)菌株以1.16mol/mol葡萄糖的产量和3.19g/L/h的产率生产了77.34g/L的琥珀酸。最后，PALK(pMS3-scmdh3)菌株的补料分批发酵结果显示，分别以1.13mol/mol葡萄糖的产量和3.1g/L/h的产率生产了75.15g/L的琥珀酸。这些结果显示，如实施例9所示，与不过表达MDH的产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)菌株相比，本发明具有改进的琥珀酸生产性能，但是其琥珀酸生产性能比PALK(pMS3-cgmdh)菌株低。换言之，这证明与文献中报道的其他MDH相比，CgMDH在琥珀酸的生产中起着最重要的作用。
[实施例11]
使用大肠杆菌W3110、谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)以及各自过表达CgMDH的大肠杆菌W3110(p100pro99A-cgmdh)菌株和谷氨酸棒状杆菌(pEKEx1-cgmdh)菌株生产琥珀酸
将实施例7中制备的大肠杆菌W3110(p100pro99A-cgmdh)菌株和大肠杆菌W3110菌株在接种有3g/L单独灭菌的葡萄糖作为碳源的10mL LB培养基中于37℃下培养16小时，然后在100mL相同培养基中培养。将接种的初始细胞浓度调节至0.2至0.25的OD600，并将烧瓶的顶部空间充满二氧化碳并在37℃厌氧条件下孵育16小时。添加25μg/mL的氨苄青霉素作为抗生素。结果，如表2所示，与产生0.14g/L琥珀酸的常规大肠杆菌W3110菌株相比，过表达CgMDH的大肠杆菌W3110(p100pro99A-cgmdh)菌株展现出显著改进的琥珀酸产量，达到0.431g/L。
将制备的谷氨酸棒状杆菌(pEKEx1-cgmdh)和野生型谷氨酸棒状杆菌菌株接种在10mL BHIS液体培养基中，在30℃下培养18小时，然后在100mL相同培养基中培养。将接种的初始细胞浓度调节至0.2至0.25的OD600。为了细胞生长，最初的6小时将细胞在有氧环境中培养，然后将烧瓶的顶部空间充满二氧化碳，并将细胞在30℃厌氧条件下培养10小时。添加25μg/mL的卡那霉素作为抗生素。添加终浓度为0.5mM的异丙基-β-d-硫代半乳糖吡喃糖苷进行诱导。结果，如表2所示，与显示产生0.08g/L琥珀酸的常规谷氨酸棒状杆菌菌株相比，过表达CgMDH的谷氨酸棒状杆菌(pEKEx1-cgmdh)菌株展现出显著更高的琥珀酸产量，达到0.69g/L。这些结果指示，即使在常见的产琥珀酸菌株中过表达，CgMDH也可对琥珀酸生产性能的改进具有积极的作用。
[实施例12]
使用产琥珀酸曼氏杆菌PALKcgmdh和PALKmsmdhG11Q菌株生产琥珀酸
将实施例8中制备的产琥珀酸曼氏杆菌PALKcgmdh和PALKmsmdhG11Q在厌氧条件下在20mL的MH5培养基中于厌氧条件下在39℃培养8小时，接种单独灭菌的10g/L浓度的葡萄糖或葡萄糖和甘油作为碳源，然后在270mL相同培养基中培养。如下进行发酵：以与实施例9相同的方式，通过在含有2.5L合成培养基的微生物反应器中接种培养液，并且通过在39℃的温度和200rpm，在使用葡萄糖和甘油作为双碳源的情况下，以18.2g/L(100mM)的初始葡萄糖浓度和4.6g/L(50mM)的初始甘油浓度，以0.2vvm的速率补料纯二氧化碳。在发酵过程中，使用1.57M氨溶液和6.84M氢氧化镁溶液将pH调节至6.5，并添加25μg/mL卡那霉素和6.8μg/mL氯霉素作为抗生素。为了生产高浓度的琥珀酸，当碳源被完全消耗时，根据需要半连续地添加900g/L的葡萄糖溶液或葡萄糖和甘油溶液。使用分光光度计测量培养基中的细胞浓度，并使用先前测量的分光光度计的吸光度和干细胞的重量校准线计算细胞浓度。在发酵过程中，定期从生物反应器中收集样品。将收集的样品以13,000rpm离心10分钟，然后通过液相色谱分析上清液中各种代谢物、琥珀酸、葡萄糖和甘油的浓度。
结果，如图13和表1所示，当仅使用葡萄糖作为碳源时，PALKcgmdh菌株以1.28mol/mol葡萄糖的产量和3.71g/L/h的产率生产了89.6g/L的琥珀酸，而PALKmsmdhG11Q菌株以1.13mol/mol葡萄糖的产量和3.42g/L/h的产率生产了82.76g/L的琥珀酸。
当使用葡萄糖和甘油作为双碳源时，PALKcgmdh菌株以1.37mol/mol葡萄糖的产量和4.18g/L/h的产率生产了101.18g/L的琥珀酸，而PALKmsmdhG11Q菌株以1.28mol/mol葡萄糖的产量和3.82g/L/h的产率生产了92.5g/L的琥珀酸。
[实施例13]
使用产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)菌株和PALKcgmdh菌株改进琥珀酸的产率
在本实施例中，研究了使用产琥珀酸曼氏杆菌PALKcgmdh菌株改进琥珀酸产率的方法。
从图13C可以看出，PALKcgmdh菌株在接种后11至13小时展现出最大产率，并且此时细胞浓度增加最大。因此，为了使产率最大化，首先，研究了细胞浓度高于当前水平时的产率变化。
为了研究当PALKcgmdh菌株的初始细胞浓度增加到19.3的OD600(8.7gDCW/L)时琥珀酸的产率如何变化，以与实施例9相同的方式将PALKcgmdh菌株接种在含有2.5L合成培养基的微生物反应器中。如下进行接种后的发酵：在39℃的温度和200rpm，以18.2g/L(100mM)的初始葡萄糖浓度或(在使用葡萄糖和甘油作为双碳源的情况下)分别为18.2g/L(100mM)和4.6g/L(50mM)的初始葡萄糖和甘油浓度，以0.2vvm的速率补料纯二氧化碳。在发酵过程中，使用1.57M氨溶液和6.84M氢氧化镁溶液将pH调节至6.5，并添加25μg/mL卡那霉素和6.8μg/mL氯霉素作为抗生素。为了生产高浓度的琥珀酸，当碳源被完全消耗时，根据需要半连续地添加900g/L的葡萄糖和甘油溶液。当将PALKcgmdh培养11小时以使细胞浓度达到峰值时，结束培养。将得到的培养液在4℃、6,000rpm下离心10分钟，以获得细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于200mL的相同合成培养基中以获得高浓度的接种物。将接种物用于接种并且在与实施例9相同的条件下培养细胞沉淀，但是将初始葡萄糖和甘油浓度加倍。结果，琥珀酸产率为10.32g/L/h，最大产率为15.72g/L/h，比原始发酵条件下高至少两倍，如图14和表1所示。为了再次确认产率的改进归因于菌株修饰的作用，当将产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)菌株的初始细胞浓度也增加至21.1的OD600(9.52gDCW/L)时，观察到琥珀酸产率为8.93g/L/h，并且观察到最大产率为12.4g/L/h。这指示接种高浓度细胞的发酵方法大幅增加了产率，但是产琥珀酸曼氏杆菌PALKcgmdh菌株显示出更好的琥珀酸产率和产量。
[表1]
[表2]
尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但是本领域技术人员应理解，出于说明性目的，将本说明书作为优选实施方案提供，并且不应解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由提交的所附权利要求及其等同物定义。
【实用性】
根据本发明的产琥珀酸突变型微生物的特征在于，其表达苹果酸脱氢酶，所述苹果酸脱氢酶包含通过主链的酰胺官能团与NADH的焦磷酸部分相互作用的氨基酸残基谷氨酰胺(Gln)，并因此大大增加草酰乙酸向苹果酸转化的活性，从而当在限制性培养基中培养所述微生物时，能够以迄今报道的最高产率生产高浓度的琥珀酸。此外，所述产琥珀酸的突变型微生物能够通过更先进的发酵技术以更高的产率和产物浓度生产琥珀酸。
【文本文件】
参见所附序列表。
序列表
<110> 韩国科学技术院
<120> 引入高活性苹果酸脱氢酶用以生产琥珀酸的突变型微生物及使用其生产琥珀酸的方法
<130> PF-B2228
<140> PCT/KR2019/005247
<141> 2019-05-02
<150> KR 10-2018-0120696
<151> 2018-10-10
<160> 57
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
gcgccatatg aattccccgc agaacgtctc cacc 34
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
gcgcctcgag gagcaagtcg cgcactgcct cgcgc 35
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
gcgccatatg aaagttgcag ttctaggtgc cgca 34
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
gcgcctcgag accgttaata aaatcttcac ctgac 35
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
gcgccatatg aaagtcgcag tcctcggcgc tgct 34
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
gcgcctcgag cttattaacg aactcttcgc ccag 34
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
gcgccatatg gttaaagctg tcgttgccgg agcc 34
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
gcgcctcgag gttggcagga ggagggttaa caat 34
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
gcgccatatg cctcactcag ttacaccatc cata 34
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
gcgcctcgag agatgatgca gatctcgatg caac 34
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
gcgccatatg ttgtcaagag tagctaaacg tgcg 34
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
gcgcctcgag tttactagca acaaagttga cacc 34
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
gcgccatatg gtcaaagtcg caattcttgg cgct 34
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
gcgcctcgag tagcttggaa gagtctagga tgaa 34
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
ctaggtgccg caggccagat tggtcaagcg ttg 33
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
caacgcttga ccaatctggc ctgcggcacc tag 33
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
ggtattattc gtagtcagac cgaaaaagtg gcg 33
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
cgccactttt tcggtctgac tacgaataat acc 33
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
gcgggcggcg gttcttcaac cttatctatg gcg 33
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
cgccatagat aaggttgaag aaccgccgcc cgc 33
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
accggcgcag ctggtggcat ctcttattca ctg 33
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
cagtgaataa gagatgccac cagctgcgcc ggt 33
<210> 23
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
aagattttcg gacctctggg taaagctatc aatg 34
<210> 24
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
cattgatagc tttacccaga ggtccgaaaa tctt 34
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
gtccgtggaa agtctgcggc agcttctgca gca 33
<210> 26
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
tgctgcagaa gctgccgcag actttccacg gac 33
<210> 27
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
tatcaactct actggggagg aattcatgaa agttgcagtt ctag 44
<210> 28
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
tctagaggat ccccgggtac cttaaccgtt aataaaatct tcac 44
<210> 29
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
tatcaactct actggggagg atgaattccc cgcagaac 38
<210> 30
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
ggatccccgg gtaccgagct ttagagcaag tcgcgcac 38
<210> 31
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
ttcaacggga aacgtcttgc tcgagcctta tgtggaccga gaaga 45
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
ggcattagcc aacagaatag ctgaccgaaa aagtggcgga 40
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
ctattctgtt ggctaatgcc 20
<210> 34
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
tgtagccgcg ttctaacgac tacgaataat acccgcat 38
<210> 35
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
tgtagccgcg ttctaacgtc gactctagag gatccccg 38
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
cgttagaacg cggctaca 18
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
atagggagac cggcagatc 19
<210> 38
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
gatctgccgg tctccctatt taagactcct taatgtgga 39
<210> 39
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 gccgccaccgcggtggagctcgcgttagttgttgagttaat 39
<400> 39
gccgccaccg cggtggagct cgcgttagtt gttgagttaa t 41
<210> 40
<211> 328
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 40
Met Asn Ser Pro Gln Asn Val Ser Thr Lys Lys Val Thr Val Thr Gly
1 5 10 15
Ala Ala Gly Gln Ile Ser Tyr Ser Leu Leu Trp Arg Ile Ala Asn Gly
20 25 30
Glu Val Phe Gly Thr Asp Thr Pro Val Glu Leu Lys Leu Leu Glu Ile
35 40 45
Pro Gln Ala Leu Gly Gly Ala Glu Gly Val Ala Met Glu Leu Leu Asp
50 55 60
Ser Ala Phe Pro Leu Leu Arg Asn Ile Thr Ile Thr Ala Asp Ala Asn
65 70 75 80
Glu Ala Phe Asp Gly Ala Asn Ala Ala Phe Leu Val Gly Ala Lys Pro
85 90 95
Arg Gly Lys Gly Glu Glu Arg Ala Asp Leu Leu Ala Asn Asn Gly Lys
100 105 110
Ile Phe Gly Pro Gln Gly Lys Ala Ile Asn Asp Asn Ala Ala Asp Asp
115 120 125
Ile Arg Val Leu Val Val Gly Asn Pro Ala Asn Thr Asn Ala Leu Ile
130 135 140
Ala Ser Ala Ala Ala Pro Asp Val Pro Ala Ser Arg Phe Asn Ala Met
145 150 155 160
Met Arg Leu Asp His Asn Arg Ala Ile Ser Gln Leu Ala Thr Lys Leu
165 170 175
Gly Arg Gly Ser Ala Glu Phe Asn Asn Ile Val Val Trp Gly Asn His
180 185 190
Ser Ala Thr Gln Phe Pro Asp Ile Thr Tyr Ala Thr Val Gly Gly Glu
195 200 205
Lys Val Thr Asp Leu Val Asp His Asp Trp Tyr Val Glu Glu Phe Ile
210 215 220
Pro Arg Val Ala Asn Arg Gly Ala Glu Ile Ile Glu Val Arg Gly Lys
225 230 235 240
Ser Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ser Ser Ala Ile Asp His Met Arg Asp
245 250 255
Trp Val Gln Gly Thr Glu Ala Trp Ser Ser Ala Ala Ile Pro Ser Thr
260 265 270
Gly Ala Tyr Gly Ile Pro Glu Gly Ile Phe Val Gly Leu Pro Thr Val
275 280 285
Ser Arg Asn Gly Glu Trp Glu Ile Val Glu Gly Leu Glu Ile Ser Asp
290 295 300
Phe Gln Arg Ala Arg Ile Asp Ala Asn Ala Gln Glu Leu Gln Ala Glu
305 310 315 320
Arg Glu Ala Val Arg Asp Leu Leu
325
<210> 41
<211> 987
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）
<400> 41
atgaattccc cgcagaacgt ctccaccaag aaggtcaccg tcaccggcgc agctggtcaa 60
atctcttatt cactgttgtg gcgcatcgcc aacggtgaag tattcggcac cgacacccct 120
gtagaactga aacttctgga gatccctcag gctcttggcg gggcagaggg tgtggctatg 180
gaacttctgg attctgcctt ccccctcctg cgaaacatca ccatcaccgc ggatgccaat 240
gaggcattcg acggcgctaa tgcggcgttt ttggtcggtg cgaagcctcg cggaaaaggc 300
gaagagcgcg cagatttgct ggctaacaac ggcaagattt tcggacctca aggtaaagct 360
atcaatgaca acgccgcaga tgacattcgt gtcctagttg ttggaaaccc agcgaacacc 420
aacgcgttga ttgcttcagc tgcggcccca gatgttccag catcccgctt caacgcaatg 480
atgcgccttg atcacaaccg tgcgatctcc cagctggcca ccaagcttgg ccgtggatct 540
gcggaattta acaacattgt ggtctgggga aatcactccg caacccagtt cccagacatc 600
acctacgcaa ccgttggtgg agaaaaggtc actgacctgg ttgatcacga ttggtatgtg 660
gaggagttca ttcctcgcgt ggctaaccgt ggcgctgaaa tcattgaggt ccgtggaaag 720
tcttctgcag cttctgcagc atcctctgcg attgatcaca tgcgcgattg ggtacagggc 780
accgaggcgt ggtcctctgc ggcaattcct tccaccggtg catacggcat tcctgagggc 840
atttttgtcg gtctgccaac cgtatcccgc aacggtgagt gggaaatcgt tgaaggcctg 900
gagatttccg atttccagcg cgcccgcatc gacgcgaatg ctcaggaatt gcaggccgag 960
cgcgaggcag tgcgcgactt gctctaa 987
<210> 42
<211> 312
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> 产琥珀酸曼氏杆菌（Mannheimia succiniciproducens）
<400> 42
Met Lys Val Ala Val Leu Gly Ala Ala Gly Gly Ile Gly Gln Ala Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Leu Lys Leu Gln Leu Pro Ala Gly Ser Ser Leu Ser Leu
20 25 30
Tyr Asp Val Ala Pro Val Thr Pro Gly Val Ala Lys Asp Leu Ser His
35 40 45
Ile Pro Thr Asp Val Val Val Glu Gly Phe Ala Gly Thr Asp Pro Ser
50 55 60
Glu Ala Leu Lys Gly Ala Asp Ile Val Leu Ile Ser Ala Gly Val Ala
65 70 75 80
Arg Lys Pro Gly Met Thr Arg Ala Asp Leu Phe Gly Val Asn Ala Gly
85 90 95
Ile Ile Arg Ser Leu Thr Glu Lys Val Ala Glu Gln Cys Pro Lys Ala
100 105 110
Cys Val Gly Ile Ile Thr Asn Pro Val Asn Ala Met Val Ala Ile Ala
115 120 125
Ala Glu Val Leu Lys Lys Ala Gly Val Tyr Asp Lys Arg Lys Leu Phe
130 135 140
Gly Ile Thr Thr Leu Asp Ile Leu Arg Ala Glu Thr Phe Ile Ala Glu
145 150 155 160
Leu Lys Gly Leu Asp Pro Thr Arg Val Thr Ile Pro Val Ile Gly Gly
165 170 175
His Ser Gly Val Thr Ile Leu Pro Leu Leu Ser Gln Val Gln Asn Val
180 185 190
Glu Trp Ser Ser Glu Glu Glu Ile Ile Ala Leu Thr His Arg Ile Gln
195 200 205
Asn Ala Gly Thr Glu Val Val Glu Ala Lys Ala Gly Gly Gly Ser Ala
210 215 220
Thr Leu Ser Met Ala Gln Ala Ala Ala Arg Phe Ala Leu Ala Leu Val
225 230 235 240
Lys Ala Ser Gln Gly Ala Lys Val Val Glu Cys Ala Tyr Val Glu Gly
245 250 255
Asp Gly Lys Tyr Ala Arg Phe Phe Ala Gln Pro Val Arg Leu Gly Thr
260 265 270
Glu Gly Val Glu Glu Tyr Leu Thr Leu Gly Lys Leu Ser Ala Phe Glu
275 280 285
Glu Lys Ala Leu Asn Ala Met Leu Glu Thr Leu Gln Gly Asp Ile Lys
290 295 300
Ser Gly Glu Asp Phe Ile Asn Gly
305 310
<210> 43
<211> 939
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 产琥珀酸曼氏杆菌（Mannheimia succiniciproducens）
<400> 43
atgaaagttg cagttctagg tgccgcaggc ggcattggtc aagcgttggc tttattatta 60
aagttacaat taccggctgg ttcatcttta tctctgtatg atgtcgcacc cgtcaccccg 120
ggtgttgcta aagatcttag ccatatccca acagatgttg tggttgaagg ttttgccggt 180
acggatcctt cagaagcatt aaaaggggcg gatattgtgt taatttctgc gggtgtggca 240
cgtaaaccgg gcatgacacg tgcggattta ttcggtgtta atgcgggtat tattcgtagt 300
ctgaccgaaa aagtggcgga acaatgcccg aaagcctgtg tgggtattat caccaacccg 360
gttaatgcga tggttgccat tgcggccgaa gtattgaaaa aagcgggtgt ttacgacaaa 420
cgtaaattat tcggcattac taccttagat attcttcgag cggaaacctt tatcgccgaa 480
ttaaaaggct tagatcctac tcgggttaca attcctgtta tcggcggtca ttcgggtgta 540
accattcttc cgttattgtc tcaagttcaa aatgttgaat ggagcagtga agaggaaatc 600
attgctttaa cgcatcgtat ccaaaatgca ggtacggaag tggttgaagc aaaagcgggc 660
ggcggttctg caaccttatc tatggcgcag gcggcggcac gttttgcatt agcattagtg 720
aaagcctcgc aaggtgcgaa agttgttgaa tgcgcttatg tggaaggcga cggcaaatat 780
gcccgtttct ttgcacaacc ggttcgttta ggtacagaag gtgttgaaga atacttaacc 840
ctgggtaaat taagtgcatt tgaagaaaaa gcgttaaatg ctatgttaga aactttacaa 900
ggtgacatta agtcaggtga agattttatt aacggttaa 939
<210> 44
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G11Q from 产琥珀酸曼氏杆菌（Mannheimia succiniciproducens） MDH
<400> 44
Met Lys Val Ala Val Leu Gly Ala Ala Gly Gln Ile Gly Gln Ala Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Leu Lys Leu Gln Leu Pro Ala Gly Ser Ser Leu Ser Leu
20 25 30
Tyr Asp Val Ala Pro Val Thr Pro Gly Val Ala Lys Asp Leu Ser His
35 40 45
Ile Pro Thr Asp Val Val Val Glu Gly Phe Ala Gly Thr Asp Pro Ser
50 55 60
Glu Ala Leu Lys Gly Ala Asp Ile Val Leu Ile Ser Ala Gly Val Ala
65 70 75 80
Arg Lys Pro Gly Met Thr Arg Ala Asp Leu Phe Gly Val Asn Ala Gly
85 90 95
Ile Ile Arg Ser Leu Thr Glu Lys Val Ala Glu Gln Cys Pro Lys Ala
100 105 110
Cys Val Gly Ile Ile Thr Asn Pro Val Asn Ala Met Val Ala Ile Ala
115 120 125
Ala Glu Val Leu Lys Lys Ala Gly Val Tyr Asp Lys Arg Lys Leu Phe
130 135 140
Gly Ile Thr Thr Leu Asp Ile Leu Arg Ala Glu Thr Phe Ile Ala Glu
145 150 155 160
Leu Lys Gly Leu Asp Pro Thr Arg Val Thr Ile Pro Val Ile Gly Gly
165 170 175
His Ser Gly Val Thr Ile Leu Pro Leu Leu Ser Gln Val Gln Asn Val
180 185 190
Glu Trp Ser Ser Glu Glu Glu Ile Ile Ala Leu Thr His Arg Ile Gln
195 200 205
Asn Ala Gly Thr Glu Val Val Glu Ala Lys Ala Gly Gly Gly Ser Ala
210 215 220
Thr Leu Ser Met Ala Gln Ala Ala Ala Arg Phe Ala Leu Ala Leu Val
225 230 235 240
Lys Ala Ser Gln Gly Ala Lys Val Val Glu Cys Ala Tyr Val Glu Gly
245 250 255
Asp Gly Lys Tyr Ala Arg Phe Phe Ala Gln Pro Val Arg Leu Gly Thr
260 265 270
Glu Gly Val Glu Glu Tyr Leu Thr Leu Gly Lys Leu Ser Ala Phe Glu
275 280 285
Glu Lys Ala Leu Asn Ala Met Leu Glu Thr Leu Gln Gly Asp Ile Lys
290 295 300
Ser Gly Glu Asp Phe Ile Asn Gly
305 310
<210> 45
<211> 939
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> G11Q from 产琥珀酸曼氏杆菌（Mannheimia succiniciproducens） MDH
<400> 45
atgaaagttg cagttctagg tgccgcaggc cagattggtc aagcgttggc tttattatta 60
aagttacaat taccggctgg ttcatcttta tctctgtatg atgtcgcacc cgtcaccccg 120
ggtgttgcta aagatcttag ccatatccca acagatgttg tggttgaagg ttttgccggt 180
acggatcctt cagaagcatt aaaaggggcg gatattgtgt taatttctgc gggtgtggca 240
cgtaaaccgg gcatgacacg tgcggattta ttcggtgtta atgcgggtat tattcgtagt 300
ctgaccgaaa aagtggcgga acaatgcccg aaagcctgtg tgggtattat caccaacccg 360
gttaatgcga tggttgccat tgcggccgaa gtattgaaaa aagcgggtgt ttacgacaaa 420
cgtaaattat tcggcattac taccttagat attcttcgag cggaaacctt tatcgccgaa 480
ttaaaaggct tagatcctac tcgggttaca attcctgtta tcggcggtca ttcgggtgta 540
accattcttc cgttattgtc tcaagttcaa aatgttgaat ggagcagtga agaggaaatc 600
attgctttaa cgcatcgtat ccaaaatgca ggtacggaag tggttgaagc aaaagcgggc 660
ggcggttctg caaccttatc tatggcgcag gcggcggcac gttttgcatt agcattagtg 720
aaagcctcgc aaggtgcgaa agttgttgaa tgcgcttatg tggaaggcga cggcaaatat 780
gcccgtttct ttgcacaacc ggttcgttta ggtacagaag gtgttgaaga atacttaacc 840
ctgggtaaat taagtgcatt tgaagaaaaa gcgttaaatg ctatgttaga aactttacaa 900
ggtgacatta agtcaggtga agattttatt aacggttaa 939
<210> 46
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 46
tatcaactct actggggagg atgaaagtcg cagtcctc 38
<210> 47
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 47
tctagaggat ccccgggtac ttacttatta acgaactctt cgc 43
<210> 48
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
tatcaactct actggggagg atgaaagttg caatagtcg 39
<210> 49
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 49
tctagaggat ccccgggtac ctacaattta gcaccgag 38
<210> 50
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 50
tatcaactct actggggagg atgcctcact cagttacac 39
<210> 51
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 51
tctagaggat ccccgggtac ttaagatgat gcagatctcg 40
<210> 52
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 52
tatcaactct actggggagg atggtcaaag tcgcaattc 39
<210> 53
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 53
tctagaggat ccccgggtac tcatagcttg gaagagtc 38
<210> 54
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 54
tcctaggtac agtgctagcg atgaattccc cgcagaac 38
<210> 55
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 55
gccaagcttg catgcctgca ttagagcaag tcgcgcac 38
<210> 56
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 56
caatttcaca caggaaacag atgaattccc cgcagaac 38
<210> 57
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 57
aacagccaag cttggctgca ttagagcaag tcgcgcac 38
Claims (8)
1.一种通过将编码苹果酸脱氢酶的基因引入具有琥珀酸生产能力的微生物中而获得的突变型微生物，
其中所述苹果酸脱氢酶包含通过主链的酰胺官能团与NADH的焦磷酸部分相互作用的氨基酸残基谷氨酰胺(Gln)。
2.根据权利要求1的突变型微生物，其中所述苹果酸脱氢酶是：i)衍生自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的苹果酸脱氢酶，其由SEQ ID NO:40的氨基酸序列表示；或ii)苹果酸脱氢酶，其中由SEQ IDNO:42的氨基酸序列表示的衍生自产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimiasucciniciproducens)的苹果酸脱氢酶的第11个氨基酸被谷氨酰胺取代。
3.根据权利要求1的突变型微生物，其中i)编码衍生自谷氨酸棒状杆菌的苹果酸脱氢酶的基因由SEQ ID NO:41的核苷酸序列表示，并且ii)编码衍生自产琥珀酸曼氏杆菌的苹果酸脱氢酶的基因由SEQ ID NO:43的核苷酸序列表示。
4.根据权利要求1的突变型微生物，其中所述具有琥珀酸生产能力的微生物选自曼氏杆菌属物种(Mannheimia sp.)、放线杆菌属物种(Actinobacillus sp.)、厌氧螺菌属物种(Anaerobiospirillum sp.)、大肠杆菌和棒状杆菌属物种(Corynebacterium sp.)。
5.根据权利要求4的突变型微生物，其中所述具有琥珀酸生产能力的微生物是产琥珀酸曼氏杆菌PALK(KCTC10973BP)。
6.一种用于生产琥珀酸的方法，其包括：
(a)培养根据权利要求1-5中任一项的突变型微生物以生产琥珀酸；以及
(b)回收所生产的琥珀酸。
7.根据权利要求6的方法，其中使用i)葡萄糖、ii)蔗糖、iii)甘油、iv)葡萄糖和甘油或v)蔗糖和甘油作为碳源进行所述培养。
8.根据权利要求6的方法，其中所述培养在厌氧条件下进行。
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