KR101859276B1 - O-아세틸-호모세린을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 o-아세틸-호모세린을 생산하는 방법 - Google Patents

O-아세틸-호모세린을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 o-아세틸-호모세린을 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본원은 O-아세틸 호모세린을 배출할 수 있는 단백질 및 이의 신규 변이체, 상기 단백질의 발현이 강화된 O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용하여 O-아세틸 호모세린을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

O-아세틸-호모세린을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 O-아세틸-호모세린을 생산하는 방법{Microorganisms producing O-acetyl-homoserine and the method of producing O-Acetyl-homoserine using the same}
본원은 O-아세틸 호모세린을 배출할 수 있는 단백질 및 이의 신규 변이체, 상기 단백질의 발현이 강화된 O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용하여 O-아세틸 호모세린을 생산하는 방법에 관한 것이다.
화학 합성과 생물학적 합성을 통해 생산될 수 있는 메치오닌은 사료 및 식품 첨가제뿐만 아니라 수액제, 의약품의 합성 원료로 사용된다. 최근에는, 발효를 통해 생산한 L-메치오닌 전구체로부터 효소전환 반응에 의하여 L-메치오닌을 생산하는 이단계 공법이 공지된 바 있다(국제특허 공개번호 WO2008/013432). 상기의 이단계 공법에서는 메치오닌 전구체로 O-숙시닐 호모세린 (O-succinyl homoserine)과 O-아세틸 호모세린 (O-acetyl homoserine)이 사용될 수 있다고 개시하였으며, 메치오닌의 경제적인 대량 생산을 위하여 메치오닌 전구체를 고수율로 생산하는 것이 매우 중요하다.
LeuE는 류신 배출 단백질(leucine export protein)로 공지되었으며, 호모세린/호모세린 락톤 배출 단백질(Homoserine/homoserine lactone efflux protein, RhtB) 패밀리의 하나로 내막에 존재하는 단백질이며, Putative uncharacterized transport protein으로 류신과 이의 아날로그(analogue)를 배출하는 것으로 알려져 있다.
LeuE와 관련된 종래 기술에서는 leuE(yeaS) 유전자의 아미노산 서열 또는 이의 변이체 강화를 통해 퓨린 뉴클레오시드(purine nucleoside) 또는 퓨린 뉴클레오티드(purine nucleotide)를 생산할 수 있고, 아미노산 생산량이 향상될 수 있음이 공지되었다. 또한, 시스테인의 배출기능을 갖는 leuE 변이체가 알려져 있다.
이러한 배경 하에, 본원의 발명자들은 O-아세틸-호모세린의 생산을 증가시키기 위해 예의 노력한 결과, O-아세틸-호모세린을 배출하는 활성을 가지는 단백질 및 이의 변이체를 발굴함으로써 본원을 완성하였다.
본원의 하나의 목적은 O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
본원의 다른 목적은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본원의 또 다른 목적은 O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드가 포함되거나 과발현된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아(Escherichia) 속 미생물을 제공하는 것이다.
본원의 또 다른 목적은 상기 O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
상기 배양단계에서 배양된 미생물 또는 배지에서 O-아세틸 호모세린을 회수하는 단계를 포함하는, O-아세틸 호모세린 생산방법을 제공하는 것이다.
본원의 또 다른 목적은 상기 O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
상기 배양단계에서 배양된 미생물 또는 배지에, 또는 상기 배양단계에서 배양된 미생물 또는 배지에서 회수한 O-아세틸 호모세린에 메틸머캅탄과 메치오닌 전환 효소를 처리하여 O-아세틸 호모세린을 L-메치오닌으로 전환하는 단계를 포함하는, L-메치오닌의 생산방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한, 본원의 일 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째 아미노산 발린, 30번째 아미노산 페닐알라닌, 95번째 아미노산 류신 또는 165번째 아미노산 페닐알라닌으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어, "O-아세틸 호모세린"은 미생물의 메치오닌 생합성 경로상의 특이적 중간체 물질로, L-호모세린의 아세틸 유도체를 의미한다. 이는 호모세린과 아세틸-CoA가 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제에 의하여 반응이 촉매되어 생성되는 것으로 알려져 있으며, C6H11NO4의 화학식을 갖는다.
본원에서 사용되는 용어, "O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드"는 미생물 세포내의 O-아세틸 호모세린을 세포외로 배출하는 기능을 가지는 폴리펩티드를 의미한다. 구체적으로 O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 LeuE 단백질 및 이의 변이체를 의미할 수 있으며, O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 한 특별히 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어, "LeuE"는 아미노산 전달체(amino acid transporter)에 대한 호모세린/호모세린 락톤 배출 단백질(Homoserine/homoserine lactone efflux protein, RhtB) 패밀리의 하나로 내막에 존재하는 단백질로 알려져 있으나, 정확한 기능은 알려져 있지 않다. 이에 본원의 발명자들은 최초로 LeuE가 O-아세틸 호모세린을 특이적으로 배출하는 것을 확인하였다.
상기 LeuE는 에스케리키아 속 미생물로부터 유래한 것일 수 있으며, 구체적인 예로 대장균 유래 LeuE일 수 있으나, O-아세틸 호모세린을 배출할 수 있는 기능을 가지는 것이면 미생물 유래에 한정 없이 본원에 포함될 수 있다.
구체적으로, O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 또한 서열번호 1의 아미노산 서열과 70 % 이상, 구체적으로는 80 % 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성을 가지며, 실질적으로 서열번호 1의 아미노산 서열과 동일하거나 상응하게 O-아세틸 호모세린을 배출하는 활성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 또는 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 1의 아미노산 서열과 동일하거나 상응하게 O-아세틸 호모세린을 배출하는 활성을 갖는 아미노산 서열에서, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열일 수 있으며, 이의 경우도 본원의 범주에 포함됨은 자명하다.
본원에서 사용되는 용어, O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드의 “변이체”는 천연의 자연 상태 또는 비변이 상태에서의 폴리펩티드가 가지는 배출능에 비하여 O-아세틸 호모세린을 배출하는 능력이 향상된 폴리펩티드를 지칭한다. 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 변이로 인하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 보다 향상된 O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드이다.
그 예로, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 첫번째 아미노산 발린, 30번째 아미노산 페닐알라닌, 95번째 아미노산 류신 또는 165번째 아미노산 페닐알라닌으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드일 수 있다. 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째 아미노산 발린이 메치오닌 으로 치환되거나; 30번째 아미노산 페닐알라닌이 알라닌, 트립토판, 류신, 발린, 글리신, 세린, 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 이소류신, 프롤린, 타이로신, 글루타민, 라이신, 글루탐산, 시스테인, 쓰레오닌 및 알지닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환되거나; 95번째 아미노산 류신이 발린, 페닐알라닌, 알라닌, 글리신, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 이소류신, 세린, 프롤린, 타이로신, 글루타민, 라이신, 글루탐산, 시스테인, 트립토판 및 알지닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환되거나; 또는 165번째 아미노산 페닐알라닌이 알라닌, 트립토판, 류신, 발린, 글리신, 세린, 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 이소류신, 프롤린, 타이로신, 글루타민, 라이신, 글루탐산, 시스테인, 쓰레오닌 및 알지닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환된 것일 수 있다. 더욱 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째 아미노산 발린이 메치오닌으로 치환되거나; 30번째 아미노산 페닐알라닌이 알라닌, 트립토판, 류신, 발린, 글리신, 세린, 아스파라긴, 아스파르트산 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환되거나; 95번째 아미노산 류신이 발린, 페닐알라닌, 알라닌, 글리신, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환되거나; 또는 165번째 아미노산 페닐알라닌이 알라닌, 트립토판, 류신, 발린, 글리신, 세린, 아스파라긴, 아스파르트산 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환된 것일 수 있다. 보다 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째 아미노산 발린이 메치오닌으로 치환되고, 30번째 아미노산 페닐알라닌, 95번째 아미노산 류신 또는 165번째 아미노산 페닐알라닌이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 더욱 구체적으로 서열번호 2, 133, 134, 137, 138, 141, 또는 142의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 구체적으로, 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80 % 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성을 가지며, 실질적으로 상기 변이체의 아미노산 서열과 동일하거나 상응하게 O-아세틸 호모세린 배출능이 향상된 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 또는 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 변이체의 아미노산 서열과 동일하거나 상응하게 O-아세틸 호모세린 배출능이 향상된 아미노산 서열에서. 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 천연의 자연 상태 또는 비변이 상태에서의 폴리펩티드에 비하여 O-아세틸 호모세린을 배출하는 능력이 향상된 폴리펩티드의 변이체의 예이며, 이에 한정되는 것은 아니다. 본원에서 용어, "천연의 자연상태 또는 비변이 상태”는 본원에서의 해당 폴리펩티드의 도입이나 활성의 변이를 도입하지 않은 상태를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어, "상동성"이란, 단백질을 코딩하는 유전자의 아미노산 서열 또는 핵산 서열에 있어서, 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 정렬 (align)시킨 후 서열 간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 상동성이 충분히 높은 경우 해당 유전자의 발현 산물은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
본원의 일 양태는 상기 O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본원에서 상기 O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드는 앞서 설명한 바와 같다.
예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드는 개시코돈이 ATG로 치환된 것일 수 있고, 서열번호 4, 135, 136, 139, 140 143, 또는 144의 염기 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 및 이의 변이체 또한 본원에 포함된다. 예를 들어, 사용되는 미생물에 따라 최적인 코돈을 갖도록 개변되어 있는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 염기 서열과 70 % 이상, 구체적으로는 80 % 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성을 가지며, 실질적으로 상기 염기서열과 동일하거나 상응하게 O-아세틸 호모세린을 배출하는 활성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있다. 또는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, O-아세틸 호모세린을 배출 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 서열이어도 좋다. 「엄격한 조건」이란, 소위 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 일례를 나타내면, 상동성이 높은 유전자끼리, 예를 들면, 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)).
상기 하이브리드화에 사용된 프로브는, 염기서열의 상보 서열의 일부이어도 좋다. 이러한 프로브는, 공지의 서열에 근거하여 작제된 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하여, 이러한 염기 서열을 포함하는 유전자 단편을 주형으로 하는 PCR에 의해 작제될 수 있다. 예를 들면, 프로브로서는, 300bp 정도 길이의 유전자 단편을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 프로브로서, 300bp 정도 길이의 유전자 단편을 사용하는 경우에는, 하이브리드화의 세척 조건으로서는, 50℃, 2×SSC 및 0.1% SDS가 열거된다.
본원에서 사용되는 유전자, 이들이 코딩하는 단백질 서열 및 프로모터 서열 등은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등에서 얻을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원의 일 양태는 상기 O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드 또는 이의 변이체 폴리펩티드가 포함되거나 과발현된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 또는 이의 변이체 폴리펩티드가 포함되거나 과발현된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물일 수 있다.
상기 O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드 및 변이체 폴리펩티드는 앞서 설명한 바와 같다.
본원에서 사용되는 용어, "O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물"이란 미생물이 배지에서 배양되는 경우, 생물체 내에서 O-아세틸 호모세린을 생산하고 배지내에 이를 분비하는 능력을 갖는 미생물을 의미한다. O-아세틸 호모세린 생산 능력은 천연 또는 인위적 돌연변이 또는 종 개량에 의해 부여되거나 증진될 수 있다. 구체적으로는, O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물은 O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 한 미생물 유래에 상관없이 모두 포함될 수 있다. 일 예로 에스케리키아(Escherichia) 속일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 대장균(Escherichia coli)일 수 있다.
한편, 본원에서 O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물은 상기 LeuE와 별개로 O-아세틸 호모세린 생산능을 증진시키기 위해 호모세린 생합성 관련 경로나 O-아세틸 호모세린 배출능력 관련 기작 등 관련 기작에 대해 기존 공지의 변이가 추가적으로 도입된 변이 미생물일 수 있다.
본원의 다른 구체적 일 양태는 상기 O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물에 추가적으로 시스타치오닌 신타아제(cystathionine synthase)의 활성이 불활성화된 것일 수 있다. 구체적으로는, 상기 시스타치오닌 신타아제를 코딩하는 유전자(metB)가 결손되거나 비변이 미생물에 비하여 발현이 약화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 metB의 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 시스타치오닌 신타아제 활성을 갖는 아미노산 서열은 제한 없이 포함될 수 있으나, 그 예로 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 상기 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 서열번호 6의 염기서열이 코딩하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본원의 다른 구체적 일 양태는 상기 O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물에 추가적으로 호모세린 키나아제(homoserine kinase)의 활성이 불활성화된 것일 수 있다. 구체적으로는, 상기 호모세린 키나아제의 활성이 비변이 미생물의 내재적 활성보다 감소 또는 제거되는 것일 수 있다. 예시적으로, 호모세린 키나아제를 코딩하는 유전자(thrB)가 천연 프로모터에 비하여 약한 프로모터에 연결되거나 약한 활성을 가지도록 변이되거나 결손된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 thrB의 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 호모세린 키나아제 활성을 갖는 아미노산 서열은 제한 없이 포함될 수 있으나, 그 예로 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 상기 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 서열번호 8의 염기서열이 코딩하는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 용어, 상기 단백질의 "불활성화"는 본래 미생물이 천연 또는 상기 단백질의 비변이 상태에서 가지고 있는 효소의 활성과 비교하였을 때, 그 활성이 감소되는 경우, 전혀 발현이 되지 않는 경우 및 발현이 되더라도 그 활성이 없는 경우를 의미한다. 상기 불활성화는 상기 효소를 코딩하는 유전자의 변이 등으로 효소 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 효소의 활성에 비해 감소하거나 제거된 경우와, 이를 코딩하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 천연형 균주에 비하여 낮거나 제거된 경우, 상기 유전자가 일부 또는 전체 결실된 경우, 및 이들의 조합 역시 포함하는 개념으로, 이에 한정되지는 않는다.
이러한 효소 활성의 불활성화는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 상기 효소의 활성이 제거된 경우를 포함하여 상기 효소의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 효소를 코딩하는 유전자를 대체하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나 없는 서열로 교체하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 효소로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)를 도입하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 법 및 해당 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE(Reverse transcription engineering) 방법 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 상기 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 발현 조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
아울러, 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 효소의 활성을 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 효소를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 세균 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이러한 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법의 일례로 상동 재조합에 의하여 유전자를 결실시키는 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기에서 "일부"란, 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 1 내지 300개, 더욱 구체적으로는 1 내지 100개, 보다 더욱 구체적으로는 1 내지 50개일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기에서 "상동 재조합(homologous recombination)"이란, 서로 상동성을 지닌 유전자 사슬의 좌위에서 연결 교환을 통해 일어나는 유전자 재조합을 의미한다.
아울러, 본원의 다른 구체적 일 양태는 상기 O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물에 추가적으로 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제(homoserine acetyltransferase)의 활성이 비변이 미생물에 비하여 강화된 것일 수 있다. 구체적으로는, 상기 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제의 활성이 비변이 미생물의 활성보다 증가되는 것일 수 있으며, 특히 활성이 강화된 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 변이형 metA 유전자가 도입된 것일 수 있다. 상기 변이형 metA 유전자는 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제의 111번 아미노산을 글루탐산으로 치환하고, 112번 아미노산을 히스티딘으로 치환한 것을 코딩하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 변이형 metA는 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제의 활성이 야생형보다 활성이 강화된 아미노산 서열은 제한 없이 포함될 수 있으나, 그 예로 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 이와 같은 변이형 metA 유전자의 제조 및 이의 활용, 상기 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 강화 균주 등에 대한 내용의 일 예는 한국등록특허 제10-1335841에 개시되어 있으며, 상기 특허의 명세서 전체는 본원의 참고자료로 포함될 수 있다.
또한, 본원의 다른 일 양태는 상기 O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물에 추가적으로 아스파테이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제 (aspartate semialdehyde dehydrogenase), 피리딘 뉴클레오티드 트랜스하이드로게나아제 (pyridine nucleotide transhydrogenase) 또는 이들의 조합의 활성이 비변이 미생물에 비하여 강화된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물일 수 있다.
또한, 본원의 다른 구체적 양태는 상기 O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물에 추가적으로 포스포에놀파이루베이트 카복실라아제(phosphoenolpyruvate carboxylase), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 또는 이들의 조합의 활성이 비변이 미생물에 비하여 강화된 것일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 단백질 활성의 "강화"는, 미생물이 보유하고 있는 단백질의 활성 상태를 향상시키는 것을 의미한다. 단백질의 활성의 강화는 목적 단백질의 활성의 강화와 같이 각 단백질의 활성을 천연의 자연상태 또는 당해 단백질의 비변이 상태보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 그 예로, i) 각 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, ii) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절 서열의 변형, iii) 각 단백질의 활성이 강화되도록 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 및 iv) 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 수행될 수 있다. 구체적으로는 각 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 염색체에 삽입하는 방법, 상기 폴리뉴클레오티드를 벡터 시스템에 도입하여 미생물에 도입하는 방법, 각 단백질을 코딩하는 염기서열의 상류에 개량된 활성을 나타내는 프로모터를 도입하거나 프로모터에 변이를 준 각 단백질을 도입하는 방법, 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시키는 방법 및 각 단백질을 코딩하는 염기서열의 변이체를 도입하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원의 일 양태는 상기 O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 O-아세틸 호모세린 생산방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양 단계에서 배양된 미생물 또는 배지에서 O-아세틸 호모세린을 회수하는 단계를 포함하는 생산방법에 관한 것이다.
본원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 본원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 에스케리키아속 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 구체적으로는 본원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스, 만니톨, 소르비톨 등과 같은 탄수화물; 당 알코올, 글리세롤, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 알코올; 유기산, 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본원에서, 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.
배양물의 온도는 27℃ 내지 37℃일 수 있으며, 보다 구체적으로는 30℃ 내지 35℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10 시간 내지 100 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 O-아세틸 호모세린을 회수하는 단계는 본원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 O-아세틸 호모세린을 회수할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 또한 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 조합하여 사용될 수 있다.
상기 회수 단계는 분리 공정 및/또는 정제 공정을 포함할 수 있다.
본원의 일 양태는 상기 본원의 O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양단계에서 배양된 미생물 또는 배지에, 또는 상기 배양단계에서 배양된 미생물 또는 배지에서 회수한 O-아세틸 호모세린에 메틸 머캅탄과 메치오닌 전환 효소를 처리하여 O-아세틸 호모세린을 L-메치오닌으로 전환하는 단계를 포함하는 L-메치오닌 생산방법에 관한 것이다.
예를 들어, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물을 배지에서 배양하여 회수된 O-아세틸 호모세린을 2단계 공법(대한민국 등록특허 제10-0905381호)을 사용하여 메치오닌을 생산할 수 있다.
상기 2단계 공법은 O-아세틸 호모세린과 메칠 머캅탄을 기질로 이용하여 O-아세틸 호모세린을 메치오닌으로 전환하는 활성을 갖는 효소 또는 상기 효소를 포함한 균주를 이용한 효소반응을 통하여 L-메치오닌 및 유기산을 생산하는 공정을 포함한다.
상기 메치오닌 전환 효소는 O-아세틸 호모세린을 메치오닌으로 전환하는 모든 효소를 포함하며, 특히 O-아세틸 호모세린 설피드릴라제(Oacetylhomoserine sulfhydrylase)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
구체적으로 상기 O-아세틸 호모세린 설피드릴라제는 렙토스피라속(Leptospira sp.), 크로모박테리움속(Chromobacterium sp.), 하이포모나스속(Hyphomonas sp.)에 속하는 미생물 균주, 보다 구체적으로는 렙토스피라 메에리(Leptospira meyeri), 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aurogenosa), 하이포모나스 넵튜니움(Hyphomonas Neptunium), 크로모박테리움 비오라슘 (Chromobacterium Violaceum)에 속하는 미생물 균주로부터 유래된 O-아세틸 호모세린 설피드릴라아제가 사용될 수 있다.
상기의 반응은 하기와 같다.
CH3SH + O-아세틸-L-호모세린 <=> 아세테이트 + 메치오닌
이와 같은 추가 메치오닌 생산 공정에 대해서는 대한민국 등록 특허 제10-0905381호에 개시되어 있으며, 상기 특허의 명세서 전체는 본원의 참고자료로서 포함될 수 있다.
본원의 내막 단백질 LeuE 또는 LeuE 변이체를 가지는 미생물은 O-아세틸 호모세린 배출능이 증진되어 O-아세틸 호모세린의 생산 효율이 향상되는 바, 본원의 미생물은 O-아세틸 호모세린을 생산하는데 효율적으로 사용될 수 있다. 또한 고효율로 생산된 O-아세틸 호모세린을 이용하면 L-메치오닌을 경제적으로 대량 생산할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본원을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본원의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
참고예 1: O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 균주의 제작
1-1. 야생형 대장균에서의 metB 유전자 결손
O-아세틸 호모세린 생산 균주를 제작하기 위하여 에스케리키아 속 미생물 중에서 대표적인 미생물인 대장균을 사용하였다. 이를 위해, 야생형 대장균인 E. coli K12 W3110(ATCC27325)을 미국생물자원센터(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수하여 사용하였다. 상기 대장균 W3110 균주에, 시스타치오닌 감마 신타아제를 코딩하는 유전자 metB(서열번호 6) 및 호모세린 키나아제를 코딩하는 유전자 thrB(서열번호 8)가 결손된 균주를 제작하였다. 이렇게 제작된 O-아세틸 호모세린 생산균주를 W3-BT로 명명하였다. 이와 같은 metB 및 thrB 유전자 결실 균주 등에 대한 내용의 일 예는 대한민국 등록특허 제10-0905381호 또는 국제공개 WO2008/013432호에 개시되어 있으며(특히, 대한민국 등록특허 제10-0905381호 실시예 1-1 및 1-2 참고), 상기 특허의 명세서 전체는 본원의 참고자료로서 포함될 수 있다.
1-2. 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 가지는 변이형 metA 유전자 도입 균주 제작
상기 참고예 1-1에서 수득한 균주에 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제(homoserine acetyltransferase) 활성을 강화하기 위하여, 균주에 강화된 활성을 가지는 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 변이형 metA 유전자(서열번호 10)를 도입하고자 하였다.
균주 제작은 대한민국 등록특허 제10-1335841호의 실시예 1 및 실시예 3에 개시된 방법으로 pCL_Pcj1_metA(EH) 플라스미드를 제작하였다.
다음으로, 상기 제작한 변이형 metA 유전자를 균주 내로 도입하여 치환하기 위한 방법으로 교체 카세트를 제작하기 위하여 pKD3 벡터를 주형으로, 서열번호 23 및 서열번호 24의 프라이머를 이용한 PCR을 통해 증폭 및 수득하였다. 구체적으로, 서열번호 23 및 24의 프라이머를 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30 회 반복 수행하는 PCR 반응을 진행하였다.
교체 카세트의 metA(EH) 부분은 pCL-Pcj1-metA(EH)를 주형으로 서열번호 19 및 서열번호 20 프라이머를 이용하였고, metA 야생형 부분은 서열번호 21 및 서열번호 22 프라이머를 이용하여 각각의 PCR 산물을 얻었다. 3개의 PCR 산물을 서열번호 19 및 서열번호 22 프라이머를 이용하여 클로람페니콜 마커 부분을 포함하는 metA(EH) 교체 카세트를 제작하여, pKD46 벡터로 미리 형질 전환시킨 상기 참고예 1-1에서 제작된 W3-BT 균주에 전기천공을 이용하여 도입하였다.
상기 과정을 통해 도입이 확인된 균주는 다시 pCP20 벡터로 형질전환시켜 LB 배지에서 배양하였으며 클로람페니콜 마커가 제거되고 metA 유전자가 metA(EH)로 교체된 균주를 W3-BTA라 명명하였다.
이와 같은 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 강화 균주 등에 대한 내용의 일 예는 대한민국 등록특허 제10-1335841호 또는 국제공개 WO2012/087039호에 개시되어 있으며, 상기 특허의 명세서 전체는 본원의 참고자료로서 포함될 수 있다.
1-3. ppc , aspC 및 asd 유전자를 2 copy 포함하는 균주의 제작
상기 참고예 1-2에서 제작한 W3-BTA 균주의 O-아세틴 호모세린 생산능을 증가시키기 위하여, 기존에 알려진 생합성 경로 강화 전략을 도입하였다. 포스포에놀파이루베이트로부터 옥살로아세테이트의 생합성에 관여하는 포스포에놀파이루베이트 카복실라아제(phosphoenolpyruvate carboxylase), 옥살로아세테이트로부터 아스파테이트의 생합성에 관여하는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 및 β-아스파틸 포스페이트로부터 호모세린의 생합성에 관여하는 아스파테이트 세미할데히드 디히드로게나아제(aspartate-semialdehyde dehydrogenase), 즉, ppc 유전자, aspC 유전자 및 asd 유전자를 2 copy로 증폭시킨 균주를 제작하고자 하였다.
균주 제작은 대한민국 특허 등록번호 제10-1117012호의 실시예 1-1 내지 1-3에 개시된 방법으로 pSG-2ppc, pSG-2aspC, pSG-2asd 플라스미드를 제작하고, W3-BTA 균주에 상기의 플라스미드를 도입하고 상기 특허의 실시예 1-5의 방법으로 상기의 3가지 유전자를 순차적으로 2copy 증폭된 균주를 제작하였다. 이렇게 제작된 균주를 W3-BTA2PCD(=WCJM)라 명명하였다.
이와 같은 포스포에놀파이루베이트 카복실라아제, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 및 아스파테이트 세미할데히드 디히드로게나아제 강화 균주 등에 대한 내용의 일 예는 대한민국 등록특허 제 10-0905381호 또는 국제공개 WO2008/013432호에 개시되어 있으며, 상기 특허의 명세서 전체는 본원의 참고자료로서 포함될 수 있다.
1-4. 플라스크 배양 실험
상기 참고예 1-2 및 1-3에서 제작된 균주의 O-아세틸 호모세린 생산량을 실험하기 위하여 삼각플라스트 배양을 실시하였다. LB 배지에 W3110, W3-BTA, WCJM 균주를 접종하여 33 ℃에서 하룻밤 배양한 후, 단일 콜로니를 3 mL LB 배지에 접종한 후 33 ℃에서 5시간 배양하고, 다시 25 mL O-아세틸 호모세린 생산 배지를 포함한 250 mL 삼각플라스크에 200배 희석하여 33 ℃ 200 rpm에서 30 시간 배양하여 HPLC 분석을 통하여 O-아세틸 호모세린 생산량을 확인하였다. 이에 사용한 배지조성은 하기 표 1에 정리하였다.
O-아세틸 호모세린 생산 플라스크 배지 조성
조성 농도(리터당)
포도당 40 g
황산암모늄 17 g
KH2PO4 1.0 g
MgSO4·7H2O 0.5 g
FeSO4·7H2O 5 mg
MnSO4·8H2O 5 mg
ZnSO4 5 mg
탄산칼슘 30 g
효모 엑기스 2 g
메치오닌 0.15 g
쓰레오닌 0.15 g
상기 배지를 이용하여 30 시간 배양한 HPLC 분석을 통하여 O-아세틸 호모세린 생산량을 확인한 결과는 하기 표 2에 정리하였다.
플라스크 배양을 통한 O-아세틸 호모세린 생산
OD
(562 nm)		 포도당 소모
(g/L)		 O-AH
(g/L)
W3110 14.2 40 0
W3-BTA 8.4 36 0.9
WCJM 9.6 35 1.2
상기 표 2에서 확인할 수 있듯이, 야생형 W3110에서는 O-아세틸 호모세린이 전혀 생성되지 않지만, W3-BTA 균주에서 O-아세틸 호모세린(O-AH)이 0.9 g/L 생성되었고, 생합성 경로가 강화된 WCJM 균주에서는 1.2 g/L가 생성되었다.
실시예 1 : O-아세틸 호모세린 생산능을 증가시키는 막 단백질의 선별
본원의 발명자들은 막단백질로 개시되었으나 O-아세틸 호모세린 배출능 및 O-아세틸 호모세린 생산능과의 연관성이 개시된 바 없는 대장균 유래 leuE(서열번호 1)를 O-아세틸 호모세린 생산에 적용해보았다.
균주에서 leuE 유전자를 강화하기 위하여 leuE 유전자를 pCL 벡터의 smaⅠ 제한효소 자리를 이용하여 클로닝을 진행하였다.
우선, leuE 유전자를 얻기 위하여 서열번호 11 및 12의 프라이머를 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 68℃에서 1분 동안 실시하고, 이를 30회 수행하는 PCR 반응을 진행하였다. 그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 800bp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA를 제한효소 smaⅠ로 밤새 37℃에서 처리해 준 후, 한 번 더 정제 후, T4 리가아제(ligase)를 이용하여 leuE 와 pCL 벡터를 클로닝하였다. 클로닝된 플라스미드를 이용하여 대장균 DH5α를 형질전환 한 후, 스펙티노마이신 (spectinomycin) 50 ㎍/mL를 포함하는 LB 평판 배지에서 형질전환된 대장균 DH5α를 선별하여 플라스미드를 획득하였다. 제작된 플라스미드를 O-아세틸 호모세린 생산주인 W3-BTA 및 WCJM에 균주를 도입하여, 각각 W3-BTA/pCL-leuE 및 WCJM/pCL-leuE라 명명하였고, O-아세틸 호모세린의 생산능에 대한 플라스크 평가를 진행하였다.
또한 대조군으로, W3-BTA 및 WCJM에 균주에 상기와 같은 방법으로 공벡터 pCL1920을 도입하여 각각 W3-BTA/pCL1920 및 WCJM/pCL1920로 명명하였고, 상기 O-아세틸 호모세린의 생산능에 대한 플라스크 평가를 진행하였다.
구체적으로, 각각의 균주를 LB 고체 배지에 도말 한 후 33 ℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 평판 배지에 밤새 배양한 균주의 단일 콜로니를 3 ml LB 배지에 접종한 후, 이를 33 ℃에서 5시간 배양하고, 다시 25 ml O-아세틸 호모세린 생산배지를 포함한 250 ml 삼각 플라스크에서 200배 희석하여 33 ℃, 200 rpm의 배양기에서 30시간 배양하였으며, HPLC 분석을 통하여 O-아세틸 호모세린 생산량을 확인하였다. 이의 결과를 정리하면 하기 표 3과 같다.
플라스크 배양을 통한 O-아세틸 호모세린 생산 측정
OD
(562nm)		 포도당 소모
(g/L)		 O-AH
(g/L)
W3-BTA/pCL1920 9.5 35 0.9
W3-BTA/pCL-leuE 8.2 36 1.0
WCJM/pCL1920 9.6 35 1.2
WCJM/pCL-leuE 8.4 36 1.5
상기 표 3에서 확인할 수 있듯이, WCJM에 leuE 플라스미드의 도입은 공벡터가 들어간 대조군 균주보다 OD가 더 낮았고, 포도당 소모도 향상하였다. 하지만 O-아세틸 호모세린은 1.5 g/L가 생산되어 leuE의 야생형 도입으로써 O-아세틸 호모세린은 생산능이 향상되었다는 결과는 얻기 힘들었으나, OD가 제어되고 당소모 속도가 향상됨으로 보아 배출능의 가능성을 확인하였고, 구조 모델링을 통해 야생형 보다 O-아세틸 호모세린의 배출능이 강화될 수 있는 변이를 선별하고자 하였다.
실시예 2 : leuE 개시코돈 변경 플라스미드 제작 및 0-아세틸 호모세린 생산능 평가
야생형의 leuE의 개시코돈은 gtg 로 발린 아미노산 코딩으로 알려져 있다. leuE 단백질의 강화효과를 확인하기 위하여 개시코돈을 atg 로 메치오닌 아미노산 코돈으로 변경하고자 실시예 1에서 제작한 플라스미드를 기본으로 하여 개시코돈을 변경하는 실험을 진행하였다. 구체적으로는, 0-아세틸 호모세린 배출능을 강화시키기 위해 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째 아미노산을 메치오닌으로 치환하였다.
더욱 구체적으로는 leuE(ATG) 변이를 제작하였다. leuE(ATG) 변이를 제작하기 위해 서열번호 145 및 서열번호 146 프라이머를 이용하였고 위치-특이적 돌연변이 키트(site-directed mutagenesis kit, stratagene, 미국)을 이용하여 변이형 leuE(ATG) 유전자를 제조하였다. 기존 야생형 플라스미드를 WT, 개시코돈 변이형 플라스미드는 WT_ATG 로 명명하고 제작된 플라스미드를 WCJM에 도입하여 플라스크에서 O-아세틸 호모세린의 생산능을 평가하였다.
구체적으로, 각각의 균주를 LB 평판 배지에 도말한 후 33 ℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체 배지에 밤새 배양한 균주를 상기에서 나타낸 25 ㎖ 역가 배지에 접종한 다음, 이를 33 ℃, 200 rpm의 배양기에서 40 시간 배양하였으며, 이의 결과를 표 4에 나타내었다.
플라스크 배양을 통한 O-아세틸 호모세린 생산 측정
OD
(562 nm)		 포도당 소모
(g/L)		 O-AH
(g/L)
WCJM/pCL-leuE WT 8.4 36 1.5
WCJM/pCL-leuE WT(ATG) 7.6 39 2.6
상기 표 4에서 확인할 수 있듯이, pCL-leuE WT(ATG) 개시코돈 변이 플라스미드가 도입된 균주가 야생형보다 OD가 감소하였으나, 빠른 당 소모 속도를 보였고, O-아세틸 호모세린이 2.6 g/L 생산되어 야생형 대비 무려 173% 생산능이 증가되었다.
실시예 3 : leuE 변이 플라스미드 제작 및 O-아세틸 호모세린 생산능 평가
3-1. leuE 변이 플라스미드 제작
실시예 1과 2에서 제작한 플라스미드pCL-leuE WT 과 pCL-leuE WT(ATG) 2종을 기본으로 하여 leuE 야생형보다 배출능이 강할 것이라고 예상하는 3개의 변이를 각각 제작하는 실험을 진행하였다. 구체적으로는, O-아세틸 호모세린 배출능을 강화시키기 위해 구조 모델링을 통해 leuE 변이위치를 선별하였으며, 서열번호 1과 2의 아미노산 서열에서 30번째 아미노산, 95번째 아미노산, 165번째 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하였다.
더욱 구체적으로는, L95V, F30A 또는 F165A 변이를 제작하였다. L95V 변이를 제작하기 위해 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머를 이용하였으며, F30A는 서열번호 25 및 서열번호 26 프라이머, F165A는 서열번호 27 및 서열번호 28 프라이머를 이용하였다. 상기 각각의 프라이머와 함께 위치-특이적 돌연변이 키트(site-directed mutagenesis kit, stratagene, 미국)을 이용하여 변이형 leuE 유전자를 제조하였다. 기존 야생형 플라스미드 WT를 기반으로한 변이형 플라스미드 L95V는 WT_M3, F30A는 WT_M4, F165A는 WT_M6으로 명명하였다. 또한 개시코돈이 변경된 플라스미드 WT(ATG)를 기반으로 한 변이형 플라스미드 L95V는 WT(ATG)_M3, F30A는 WT(ATG)_M4, F165A는 WT(ATG)_M6으로 명명하였다. 제작된 변이형 플라스미드를 WCJM에 도입하여 플라스크에서 O-아세틸 호모세린의 생산능을 평가하였다.
구체적으로, 각각의 균주를 LB 평판 배지에 도말한 후 33 ℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체 배지에 밤새 배양한 균주를 상기에서 나타낸 25 ㎖ 역가 배지에 접종한 다음, 이를 33 ℃, 200 rpm의 배양기에서 40 시간 배양하였으며, 이의 결과를 표 5에 나타내었다.
플라스크 배양을 통한 O-아세틸 호모세린 생산 측정
OD
(562 nm)		 포도당 소모
(g/L)		 O-AH
(g/L)
WCJM/pCL1920 9.6 35 1.3
WCJM/pCL-leuE WT 8.4 36 1.5
WCJM/pCL-leuE WT_M3 8.2 38 2.3
WCJM/pCL-leuE WT_M4 7.9 38 3.7
WCJM/pCL-leuE WT_M6 8.0 39 4.8
WCJM/pCL-leuE WT(ATG) 7.6 39 2.6
WCJM/pCL-leuE WT(ATG)_M3 7.5 40 3.1
WCJM/pCL-leuE WT(ATG)_M4 7.3 39 3.6
WCJM/pCL-leuE WT(ATG)_M6 7.5 40 4.9
상기 표 5에서 확인할 수 있듯이, leuE 변이 플라스미드가 도입된 균주의 경우 3개 변이 모두 야생형보다 OD가 감소하였으나, 빠른 당 소모 속도를 보였고, 특히 leuE WT(ATG)_M6의 경우 O-아세틸 호모세린이 4.9 g/L 생산되어 생산능이 가장 높았다. 따라서 상기 본원의 변이형 3종 모두 O-아세틸 호모세린의 생산능이 증가됨을 확인하였고, 또한 leuE 개시코돈을 변경하여 단백질 발현량을 증가시켰을 시에 0-아세틸 호모세린 생산능이 더욱 증가될 수 있음을 확인하었다.
3-2. 생합성 경로 유전자 및 변이형 플라스미드 제작
O-아세틸 호모세린의 생산능을 극대화시키기 위해 호모세린까지의 생합성 경로를 강화시키는 플라스미드를 제작하였다. 아스파테이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제 (aspartate semialdehyde dehydrogenase)와 피리딘 뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나아제 (pyridine nucleotide transhydrogenase)와 LeuE 야생형 및 변이체를 pCL 벡터에 클로닝하기 위해 우선 pCL벡터에 유전자 asd와 pntAB를 도입하였다.
먼저, asd와 pntAB 유전자를 수득하기 위하여, asd에 대해서는 서열번호 15 및 서열번호 16 프라이머, pntAB에 대해서는 서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머를 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 68℃에서 3분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 진행하였다. 그 결과 얻어진 각각의 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 1.4kb(asd)와 3kb(pntAB) 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다.
상기 정제된 두 개의 유전자를 sewing PCR(첫 단계에서는 프라이머 없이 두 유전자의 overlap 부분을 이용하여 연결 후, 양 끝의 프라이머를 이용해 증폭하는 PCR 기법)을 통해 연결하였다. Sewing PCR 조건은 첫 단계에서 상기에서 설명한 PCR 반응을 10회 수행하고, 이후 서열번호 15 및 서열번호 18의 프라이머를 첨가한 후 PCR 반응 20회를 수행하였다. 이를 통해 asd-pntAB 유전자 조합 단편을 제작하였고, 이를 전기영동에서 정제 후, pCL 벡터와 함께 제한 효소 samI을 밤새 37 ℃에서 처리해 준 후, 한 번 더 정제 후, T4 리가아제(ligase)를 이용하여 pCL-asd-pntAB 플라스미드를 제작하였다.
이렇게 제작된 플라스미드에 leuE 유전자를 클로닝하였다. 상기 클로닝은 구체적으로, leuE 유전자를 얻기 위해서 서열번호 29 및 서열번호 30 프라이머를 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 68℃에서 1분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 진행하였다.
그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 800bp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA와 플라스미드를 제한효소 kpnI으로 밤새 37 ℃에서 처리해 준 후, 한 번 더 정제 후, T4 리가아제(ligase)를 이용하여 leuE와 pCL-asd-pntAB 벡터를 클로닝 하였다. 클로닝된 플라스미드를 이용하여 대장균 DH5α에 형질전환 한 후, 스펙티노마이신 (spectinomycin) 50㎍/mL를 포함하는 LB 평판 배지에서 형질전환 된 대장균 DH5α를 선별하여 플라스미드를 획득하였다. 제작된 플라스미드를 O-아세틸 호모세린 생산주인 WCJM 에 도입하여 O-아세틸 호모세린의 생산능에 대한 플라스크 평가를 진행하였다. 제작된 플라스미드는 모두 4종으로 실시예 2-1에서 제작된 야생형 및 변이 3종을 이용하였다. 4종 플라스미드는 WCJM 균주에 전기천공법을 이용하여 도입하였고, 실시예 3-1과 동일한 방법으로 플라스크 평가를 진행하였고, 그 결과는 다음 표 6과 같다.
플라스크 배양을 통한 O-아세틸 호모세린 생산 측정
OD
(562 nm)		 포도당 소모
(g/L)		 O-AH
(g/L)
WCJM/pCL-asd-pntAB 9.8 36 1.8
WCJM/pCL-asd-pntAB-leuE WT 9.5 37 2.0
WCJM/pCL-asd-pntAB-leuE WT_M3 8.2 38 3.0
WCJM/pCL-asd-pntAB-leuE WT_M4 7.5 38 4.2
WCJM/pCL-asd-pntAB-leuE WT_M6 7.8 38 5.9
상기 표 6에서 확인할 수 있듯이, 생합성 경로와 leuE 변이를 동시에 강화시켜준 결과, O-아세틸 호모세린의 생산능이 더욱 향상되었다. 특히 pCL-asd-pntAB-leuE WT_M6 플라스미드가 도입된 균주의 경우, 야생형보다 OD가 감소하였으나, 빠른 당소모 속도를 보였고, O-아세틸 호모세린이 5.9 g/L 생산되어 생산능이 가장 높았다.
실시예 4 : saturated mutagenesis를 통한 leuE 변이 제작 및 O-아세틸 호모세린 생산능 평가
4-1. saturated mutagenesis를 통한 leuE 변이 균주 제작 및 평가
O-아세틸 호모세린 생산능이 높았던 leuE 변이 3종의 다른 아미노산 치환형을 제작하기 위해 saturated mutagenesis를 통해 변이를 제작하였다. 치환되는 아미노산은 M3 변이, M4 변이, 및 M6 변이 각각 17종을 실시예 2에서 제작된 플라스미드를 주형으로 하여 제작하였다. 그 목록은 다음 표 7와 같다.
변이 플라스미드 치환 아미노산 프라이머 서열번호
M3 L95F 서열번호 31, 32
L95A 서열번호 33, 34
L95G 서열번호 35, 36
L95T 서열번호 37, 38
L95N 서열번호 39, 40
L95D 서열번호 41, 42
L95H 서열번호 43, 44
L95I 서열번호 45, 46
L95S 서열번호 47, 48
L95P 서열번호 49, 50
L95Y 서열번호 51, 52
L95Q 서열번호 53, 54
L95K 서열번호 55, 56
L95E 서열번호 57, 58
L95C 서열번호 59, 60
L95W 서열번호 61, 62
L95R 서열번호 63, 64
M4 F30W 서열번호 65, 66
F30L 서열번호 67, 68
F30V 서열번호 69, 70
F30G 서열번호 71, 72
F30S 서열번호 73, 74
F30N 서열번호 75, 76
F30D 서열번호 77, 78
F30H 서열번호 79, 80
F30I 서열번호 81, 82
F30P 서열번호 83, 84
F30Y 서열번호 85, 86
F30Q 서열번호 87, 88
F30K 서열번호 89, 90
F30E 서열번호 91, 92
F30C 서열번호 93, 94
F30T 서열번호 95, 96
F30R 서열번호 97, 98
M6 F165W 서열번호 99, 100
F165L 서열번호 101, 102
F165V 서열번호 103, 104
F165G 서열번호 105, 106
F165S 서열번호 107, 108
F165N 서열번호 109, 110
F165D 서열번호 111, 112
F165H 서열번호 113, 114
F165I 서열번호 115, 116
F165P 서열번호 117, 118
F165Y 서열번호 119, 120
F165Q 서열번호 121, 122
F165K 서열번호 123, 124
F165E 서열번호 125, 126
F165C 서열번호 127, 128
F165T 서열번호 129, 130
F165R 서열번호 131, 132
구체적으로, 상기 표 7에서 제시한 프라이머를 이용하여 위치-특이적 돌연변이 키트(site-directed mutagenesis kit, Stratagene, 미국)을 실시하여 변이형 leuE 유전자를 제조하였다. 제작된 변이를 플라스미드는 WCJM 균주에 도입하고 실시예 3-1과 동일한 방법으로 플라스크 평가를 진행하였다. 그 결과는 다음 표 8과 같다.
플라스크 배양을 통한 O-아세틸 호모세린 생산 측정
균주 플라스미드 변이위치 OD
(562 nm)		 포도당 소모
(g/L)		 O-AH
(g/L)
WCJM pCL1920 9.6 35 1.3
pCL-leuE WT 8.4 36 1.5
pCL-leuE WT_M3 L95V 8.2 38 2.3
pCL-leuE WT_M4 F30A 7.9 38 3.7
pCL-leuE WT_M6 F165A 8.0 39 4.8
M3 변이 L95F 8.6 38 2.3
L95A 8.3 38 2.2
L95G 9.2 37 2.1
L95T 9.4 37.5 2.3
L95N 8.8 38 2.4
L95D 8.7 36 2.2
L95H 9.5 35 2.3
L95I 9.5 37.5 2.2
L95S 9.3 37 2.5
L95P 9.2 36 2.5
L95Y 8.9 35 2.2
L95Q 9.4 38 3.1
L95K 9.2 38.5 2.2
L95E 8.6 37 2.6
L95C 8.9 37.5 2.4
L95W 9.9 38 2.1
L95R 9.3 38 2.3
M4 변이 F30W 7.5 38 3.2
F30L 7.2 36 3.1
F30V 7.3 35 2.6
F30G 8.3 36 3.4
F30S 7.9 35 3.6
F30N 8.2 37 3.5
F30D 8.6 38 3.0
F30H 8.8 34 2.9
F30I 8.3 35 3.5
F30P 8.6 35.5 3.1
F30Y 7.9 34 2.9
F30Q 8.6 34 2.8
F30K 8.8 35 3.1
F30E 7.6 35.5 2.5
F30C 7.9 35 2.4
F30T 8.9 36 3.0
F30R 8.6 38.5 2.9
M6 변이 F165W 8.2 39 4.2
F165L 8.3 38 4.5
F165V 8.4 38 4.1
F165G 8.0 39 4.6
F165S 7.9 37 4.7
F165N 8.8 39 4.7
F165D 7.8 38 4.5
F165H 7.9 38 4.5
F165I 7.8 37 4.1
F165P 7.7 37.5 4.2
F165Y 8.2 38 4.6
F165Q 8.4 38 3.9
F165K 7.6 39 4.0
F165E 7.7 36.5 4.2
F165C 7.6 36.5 4.3
F165T 8.5 34 3.7
F165R 8.3 38 3.9
상기 표 8에서 알 수 있듯이 각각 변이체들을 평가 한 결과, OD나 당소모 속도에서 미세하게 차이를 보이긴 하였으나, 상기 모든 변이체는 대조군으로 사용된 균주 WCJM/pCL1920 및 WCJM/pCL-leuE WT보다 O-아세틸 호모세린의 생산량이 향상되었음을 확인하였다.
4-2. O-아세틸 호모세린 고수율 균주에서의 leuE 변이 강화 균주 제작 및 O-아세틸 호모세린 생산능 평가
기존에 야생형 W3110 유래의 NTG mutation을 통하여 쓰레오닌을 생산하는 능력을 가지는 균주를 이용하여 O-아세틸 호모세린을 생산하는 균주를 제작하는 방법이 알려져 있다(국제특허 공개번호 WO2012/087039). 이때 제작된 고수율의 O-아세틸 호모세린을 생산하는 균주는 한국 미생물 보존센터에 수탁번호 KCCM11146P로 기탁되어 있다.
상기 균주를 바탕으로 본원의 leuE 유전자와 그 변이들을 도입하여 O-아세틸 호모세린 생산능을 더욱 증진시킬 수 있을지 확인해보았다.
구체적으로, leuE 유전자와 변이체 3종을 플라스미드 형태로 전기천공법을 이용하여 도입하였다. 도입된 균주는 KCCM11146P/pCL1920, KCCM11146P/pCL-leuE WT, KCCM11146P- pCL-leuE M3, KCCM11146P- pCL-leuE M4 또는 KCCM11146P/pCL-leuE M6라고 명명하였다. 상기 leuE 유전자와 변이체의 O-아세틸 호모세린 생산능을 측정하기 위하여 플라스크 배양 평가를 진행하였다. 구체적으로는, LB 배지에 상기 균주 4종을 접종하여 33 ℃에서 하룻밤 배양한 후, 단일 콜로니를 3 ml LB 배지에 접종한 후 33 ℃에서 5 시간 배양하고, 다시 25 ml O-아세틸 호모세린 생산 배지가 첨가된 250 ml 삼각플라스크에 200배 희석하여 33 ℃ 200 rpm에서 30시간 배양하여 HPLC 분석을 통하여 O-아세틸 호모세린 생산량을 확인하였다. 상기 실험한 결과를 정리하면 하기 표 9와 같다.
플라스크 배양을 통한 O-아세틸 호모세린 생산 측정
OD
(562nm)		 포도당 소모
(g/L)		 O-AH
(g/L)
KCCM11146P/pCL1920 18.3 40 14.2
KCCM11146P/pCL-leuE WT 17.9 40 16.3
KCCM11146P/pCL-leuE M3 17.5 40 16.9
KCCM11146P/pCL-leuE M4 16.8 40 19.2
KCCM11146P/pCL-leuE M6 17.2 40 18.8
상기 표 9에서 확인할 수 있듯이, KCCM11146P 균주에 pCL1920만이 도입된 균주에서 O-아세틸 호모세린이 14.2 g/L 생성되었고, leuE WT의 경우도 본래 균주보다도 O-아세틸 호모세린의 생산량이 증가하였다. 또한 변이 3종은 모두 OD가 감소하였고, M4의 경우에는 19.2 g/L로 O-아세틸 호모세린의 생산량이 가장 높았으며, 나머지 M3, M6 변이의 경우에도 O-아세틸 호모세린의 생산량이 증가한 것을 확인하였다.
본원의 발명자들은 KCCM11146P 균주 기반 leuE 3종 변이 M3, M4, M6변이 강화 균주 'KCCM11146P/pCL-leuE M3, M4, M6' 에서 O-아세틸호모세린 생산이 증가함을 확인하고, 상기 균주를 'CA05-4009, 'CA05-4010, 'CA05-4011'으로 명명한 후 부다페스트 조약 하에 2014년 12월 15일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM11645P, KCCM11646P, KCCM11647P를 부여받았다.
실시예 5 : 생산된 O- 아세틸호모세린 배양액과 전환효소를 이용한 L-메치오닌 생산
상기 실시예 4에서 수득한 O-아세틸 호모세린의 배양액과 이를 메치오닌으로 전환하는 활성을 가진 효소인 O-아세틸 호모세린 설피드릴라제를 이용하여 L-메치오닌 생산하는 실험을 진행하였다.
대한민국 등록특허 제10-1250651호의 실시예 1-2에 제시된 방법으로 전환효소 O-아세틸 호모세린 설피드릴라제를 제작하였으며, 상기 특허의 실시예 3에 제시된 방법으로 전환반응을 실시하여 생성된 L-메치오닌을 측정하였다. 기질로 사용한 O-아세틸 호모세린은 본원의 상기 실시예 4에서 수득한 KCCM11146P- pCL-leuE M4의 배양액(O-AH 농도 19.2 g/L)로 진행하였으며, 생성된 L-메치오닌의 농도는 하기 표 10과 같다.
시간 (min)
2 4 6 8 10
MetZ-rsp 메치오닌
(g/L)		 3.21 4.34 4.52 4.78 5.04
전환율
(%)		 50 % 68 % 71 % 75 % 79 %
상기 표 10에서 확인할 수 있듯이, 상기 실시예 4에서 수득한 KCCM11146P-pCL-leuE M4 균주의 배양액에 포함된 O-아세틸 호모세린이 10분 동안 79 %의 전환율로 메치오닌으로 전환되는 것을 확인하였다. 이를 통해, 본원의 균주를 이용하여 메치오닌을 성공적으로 생산할 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본원이 속하는 기술분야의 당업자는 본원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11645P 20141215 한국미생물보존센터(국외) KCCM11646P 20141215 한국미생물보존센터(국외) KCCM11647P 20141215
<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION <120> Microorganisms producing O-acetyl-homoserine and the method of producing O-Acetyl-homoserine using the same <130> KPA141412-KR-P1 <150> KR 10-2015-0079358 <151> 2015-06-04 <160> 146 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 212 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Val Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly 1 5 10 15 Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Phe Val Leu 20 25 30 Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys 35 40 45 Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly 50 55 60 Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg 65 70 75 80 Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Leu Tyr 85 90 95 Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln 100 105 110 Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro 115 120 125 Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val 130 135 140 Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu 145 150 155 160 Glu Leu Val Ser Phe Cys Tyr Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly Ala 165 170 175 Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly 180 185 190 Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala 195 200 205 Thr Leu Gln Ser 210 <210> 2 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LeuE variant <400> 2 Met Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly 1 5 10 15 Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Phe Val Leu 20 25 30 Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys 35 40 45 Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly 50 55 60 Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg 65 70 75 80 Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Leu Tyr 85 90 95 Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln 100 105 110 Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro 115 120 125 Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val 130 135 140 Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu 145 150 155 160 Glu Leu Val Ser Phe Cys Tyr Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly Ala 165 170 175 Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly 180 185 190 Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala 195 200 205 Thr Leu Gln Ser 210 <210> 3 <211> 639 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 gtgttcgctg aatacggggt tctgaattac tggacctatc tggttggggc catttttatt 60 gtgttggtgc cagggccaaa taccctgttt gtactcaaaa atagcgtcag tagcggtatg 120 aaaggcggtt atcttgcggc ctgcggtgta tttattggcg atgcggtatt gatgtttctg 180 gcatgggctg gagtggcgac attaattaag accaccccga tattattcaa cattgtacgt 240 tatcttggtg cgttttattt gctctatctg gggagtaaaa ttctttacgc gaccctgaag 300 ggtaaaaata gcgaggccaa atccgatgag ccccaatacg gtgctatttt taaacgcgcg 360 ttaattttga gcctgactaa tccgaaagcc attttgttct atgtgtcgtt tttcgtacag 420 tttatcgatg ttaatgcccc acatacggga atttcattct ttattctggc ggcgacgctg 480 gaactggtga gtttctgcta tttgagcttc ctgattatat ctggtgcttt tgtcacgcag 540 tacatacgta ccaaaaagaa actggctaaa gttggcaact cactgattgg tttgatgttc 600 gtgggtttcg ctgcccgact ggcgacgctg caatcctga 639 <210> 4 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> LeuE variant <400> 4 atgttcgctg aatacggggt tctgaattac tggacctatc tggttggggc catttttatt 60 gtgttggtgc cagggccaaa taccctgttt gtactcaaaa atagcgtcag tagcggtatg 120 aaaggcggtt atcttgcggc ctgcggtgta tttattggcg atgcggtatt gatgtttctg 180 gcatgggctg gagtggcgac attaattaag accaccccga tattattcaa cattgtacgt 240 tatcttggtg cgttttattt gctctatctg gggagtaaaa ttctttacgc gaccctgaag 300 ggtaaaaata gcgaggccaa atccgatgag ccccaatacg gtgctatttt taaacgcgcg 360 ttaattttga gcctgactaa tccgaaagcc attttgttct atgtgtcgtt tttcgtacag 420 tttatcgatg ttaatgcccc acatacggga atttcattct ttattctggc ggcgacgctg 480 gaactggtga gtttctgcta tttgagcttc ctgattatat ctggtgcttt tgtcacgcag 540 tacatacgta ccaaaaagaa actggctaaa gttggcaact cactgattgg tttgatgttc 600 gtgggtttcg ctgcccgact ggcgacgctg caatcctga 639 <210> 5 <211> 386 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 5 Met Thr Arg Lys Gln Ala Thr Ile Ala Val Arg Ser Gly Leu Asn Asp 1 5 10 15 Asp Glu Gln Tyr Gly Cys Val Val Pro Pro Ile His Leu Ser Ser Thr 20 25 30 Tyr Asn Phe Thr Gly Phe Asn Glu Pro Arg Ala His Asp Tyr Ser Arg 35 40 45 Arg Gly Asn Pro Thr Arg Asp Val Val Gln Arg Ala Leu Ala Glu Leu 50 55 60 Glu Gly Gly Ala Gly Ala Val Leu Thr Asn Thr Gly Met Ser Ala Ile 65 70 75 80 His Leu Val Thr Thr Val Phe Leu Lys Pro Gly Asp Leu Leu Val Ala 85 90 95 Pro His Asp Cys Tyr Gly Gly Ser Tyr Arg Leu Phe Asp Ser Leu Ala 100 105 110 Lys Arg Gly Cys Tyr Arg Val Leu Phe Val Asp Gln Gly Asp Glu Gln 115 120 125 Ala Leu Arg Ala Ala Leu Ala Glu Lys Pro Lys Leu Val Leu Val Glu 130 135 140 Ser Pro Ser Asn Pro Leu Leu Arg Val Val Asp Ile Ala Lys Ile Cys 145 150 155 160 His Leu Ala Arg Glu Val Gly Ala Val Ser Val Val Asp Asn Thr Phe 165 170 175 Leu Ser Pro Ala Leu Gln Asn Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Leu Val 180 185 190 Leu His Ser 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aacaggccac catcgcagtg cgtagcgggt taaatgacga cgaacagtat 60 ggttgcgttg tcccaccgat ccatctttcc agcacctata actttaccgg atttaatgaa 120 ccgcgcgcgc atgattactc gcgtcgcggc aacccaacgc gcgatgtggt tcagcgtgcg 180 ctggcagaac tggaaggtgg tgctggtgca gtacttacta ataccggcat gtccgcgatt 240 cacctggtaa cgaccgtctt tttgaaacct ggcgatctgc tggttgcgcc gcacgactgc 300 tacggcggta gctatcgcct gttcgacagt ctggcgaaac gcggttgcta tcgcgtgttg 360 tttgttgatc aaggcgatga acaggcatta cgggcagcgc tggcagaaaa acccaaactg 420 gtactggtag aaagcccaag taatccattg ttacgcgtcg tggatattgc gaaaatctgc 480 catctggcaa gggaagtcgg ggcggtgagc gtggtggata acaccttctt aagcccggca 540 ttacaaaatc cgctggcatt aggtgccgat ctggtgttgc attcatgcac gaaatatctg 600 aacggtcact cagacgtagt ggccggcgtg gtgattgcta aagacccgga cgttgtcact 660 gaactggcct ggtgggcaaa caatattggc gtgacgggcg gcgcgtttga cagctatctg 720 ctgctacgtg ggttgcgaac gctggtgccg cgtatggagc tggcgcagcg caacgcgcag 780 gcgattgtga aatacctgca aacccagccg ttggtgaaaa aactgtatca cccgtcgttg 840 ccggaaaatc aggggcatga aattgccgcg cgccagcaaa aaggctttgg cgcaatgttg 900 agttttgaac tggatggcga tgagcagacg ctgcgtcgtt tcctgggcgg gctgtcgttg 960 tttacgctgg cggaatcatt agggggagtg gaaagtttaa tctctcacgc cgcaaccatg 1020 acacatgcag gcatggcacc agaagcgcgt gctgccgccg ggatctccga gacgctgctg 1080 cgtatctcca ccggtattga agatggcgaa gatttaattg ccgacctgga aaatggcttc 1140 cgggctgcaa acaaggggta a 1161 <210> 7 <211> 310 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 7 Met Val Lys Val Tyr Ala Pro Ala Ser Ser Ala Asn Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Phe Asp Val Leu Gly Ala Ala Val Thr Pro Val Asp Gly Ala Leu Leu 20 25 30 Gly Asp Val Val Thr Val Glu Ala Ala Glu Thr Phe Ser Leu Asn Asn 35 40 45 Leu Gly Arg Phe Ala Asp Lys Leu Pro Ser Glu Pro Arg Glu Asn Ile 50 55 60 Val Tyr Gln Cys Trp Glu Arg Phe Cys Gln Glu Leu Gly Lys Gln Ile 65 70 75 80 Pro Val Ala Met Thr Leu Glu Lys Asn Met Pro Ile Gly Ser Gly Leu 85 90 95 Gly Ser Ser Ala Cys Ser Val Val Ala Ala Leu Met Ala Met Asn Glu 100 105 110 His Cys Gly Lys Pro Leu Asn Asp Thr Arg Leu Leu Ala Leu Met Gly 115 120 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Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro His Ser 180 185 190 Arg Tyr Ala Asp Phe Pro Ala Ala Leu Ile Arg Asp Tyr Thr Asp Leu 195 200 205 Glu Ile Leu Ala Glu Thr Glu Glu Gly Asp Ala Tyr Leu Phe Ala Ser 210 215 220 Lys Asp Lys Arg Ile Ala Phe Val Thr Gly His Pro Glu Tyr Asp Ala 225 230 235 240 Gln Thr Leu Ala Gln Glu Phe Phe Arg Asp Val Glu Ala Gly Leu Asp 245 250 255 Pro Asp Val Pro Tyr Asn Tyr Phe Pro His Asn Asp Pro Gln Asn Thr 260 265 270 Pro Arg Ala Ser Trp Arg Ser His Gly Asn Leu Leu Phe Thr Asn Trp 275 280 285 Leu Asn Tyr Tyr Val Tyr Gln Ile Thr Pro Tyr Asp Leu Arg His Met 290 295 300 Asn Pro Thr Leu Asp 305 <210> 10 <211> 930 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> homoserine O-acetyl transferase <400> 10 atgccgattc gtgtgccgga cgagctaccc gccgtcaatt tcttgcgtga agaaaacgtc 60 tttgtgatga caacttctcg tgcgtctggt caggaaattc gtccacttaa ggttctgatc 120 cttaacctga tgccgaagaa gattgaaact gaaaatcagt ttctgcgcct gctttcaaac 180 tcacctttgc aggtcgatat tcagctgttg cgcatcgatt cccgtgaatc gcgcaacacg 240 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tagcatttac tcaccagttc cagcgt 36 <210> 125 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 125 acgctggaac tggtgagtga atgctatttg agcttc 36 <210> 126 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 126 gaagctcaaa tagcattcac tcaccagttc cagcgt 36 <210> 127 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 127 acgctggaac tggtgagttg ctgctatttg agcttc 36 <210> 128 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 128 gaagctcaaa tagcagcaac tcaccagttc cagcgt 36 <210> 129 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 129 acgctggaac tggtgagtac ctgctatttg agcttc 36 <210> 130 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 130 gaagctcaaa tagcaggtac tcaccagttc cagcgt 36 <210> 131 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 131 acgctggaac tggtgagtcg ttgctatttg agcttc 36 <210> 132 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 132 gaagctcaaa tagcaacgac tcaccagttc cagcgt 36 <210> 133 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LeuE variant <400> 133 Val Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly 1 5 10 15 Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Phe Val Leu 20 25 30 Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys 35 40 45 Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly 50 55 60 Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg 65 70 75 80 Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Val Tyr 85 90 95 Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln 100 105 110 Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro 115 120 125 Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val 130 135 140 Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu 145 150 155 160 Glu Leu Val Ser Phe Cys Tyr Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly Ala 165 170 175 Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly 180 185 190 Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala 195 200 205 Thr Leu Gln Ser 210 <210> 134 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LeuE variant <400> 134 Met Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly 1 5 10 15 Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Phe Val Leu 20 25 30 Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys 35 40 45 Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly 50 55 60 Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg 65 70 75 80 Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Val Tyr 85 90 95 Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln 100 105 110 Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro 115 120 125 Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val 130 135 140 Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu 145 150 155 160 Glu Leu Val Ser Phe Cys Tyr Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly Ala 165 170 175 Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly 180 185 190 Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala 195 200 205 Thr Leu Gln Ser 210 <210> 135 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LeuE variant <400> 135 gtgttcgctg aatacggggt tctgaattac tggacctatc tggttggggc catttttatt 60 gtgttggtgc cagggccaaa taccctgttt gtactcaaaa atagcgtcag tagcggtatg 120 aaaggcggtt atcttgcggc ctgcggtgta tttattggcg atgcggtatt gatgtttctg 180 gcatgggctg gagtggcgac attaattaag accaccccga tattattcaa cattgtacgt 240 tatcttggtg cgttttattt gctctatctg gggagtaaaa ttgtgtacgc gaccctgaag 300 ggtaaaaata gcgaggccaa atccgatgag ccccaatacg gtgctatttt taaacgcgcg 360 ttaattttga gcctgactaa tccgaaagcc attttgttct atgtgtcgtt tttcgtacag 420 tttatcgatg ttaatgcccc acatacggga atttcattct ttattctggc ggcgacgctg 480 gaactggtga gtttctgcta tttgagcttc ctgattatat ctggtgcttt tgtcacgcag 540 tacatacgta ccaaaaagaa actggctaaa gttggcaact cactgattgg tttgatgttc 600 gtgggtttcg ctgcccgact ggcgacgctg caatcctga 639 <210> 136 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LeuE variant <400> 136 atgttcgctg aatacggggt tctgaattac tggacctatc tggttggggc catttttatt 60 gtgttggtgc cagggccaaa taccctgttt gtactcaaaa atagcgtcag tagcggtatg 120 aaaggcggtt atcttgcggc ctgcggtgta tttattggcg atgcggtatt gatgtttctg 180 gcatgggctg gagtggcgac attaattaag accaccccga tattattcaa cattgtacgt 240 tatcttggtg cgttttattt gctctatctg gggagtaaaa ttgtgtacgc gaccctgaag 300 ggtaaaaata gcgaggccaa atccgatgag ccccaatacg gtgctatttt taaacgcgcg 360 ttaattttga gcctgactaa tccgaaagcc attttgttct atgtgtcgtt tttcgtacag 420 tttatcgatg ttaatgcccc acatacggga atttcattct ttattctggc ggcgacgctg 480 gaactggtga gtttctgcta tttgagcttc ctgattatat ctggtgcttt tgtcacgcag 540 tacatacgta ccaaaaagaa actggctaaa gttggcaact cactgattgg tttgatgttc 600 gtgggtttcg ctgcccgact ggcgacgctg caatcctga 639 <210> 137 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LeuE variant <400> 137 Val Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly 1 5 10 15 Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Ala Val Leu 20 25 30 Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys 35 40 45 Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly 50 55 60 Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg 65 70 75 80 Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Leu Tyr 85 90 95 Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln 100 105 110 Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro 115 120 125 Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val 130 135 140 Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu 145 150 155 160 Glu Leu Val Ser Phe Cys Tyr Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly Ala 165 170 175 Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly 180 185 190 Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala 195 200 205 Thr Leu Gln Ser 210 <210> 138 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LeuE variant <400> 138 Met Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly 1 5 10 15 Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Ala Val Leu 20 25 30 Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys 35 40 45 Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly 50 55 60 Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg 65 70 75 80 Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Leu Tyr 85 90 95 Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln 100 105 110 Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro 115 120 125 Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val 130 135 140 Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu 145 150 155 160 Glu Leu Val Ser Phe Cys Tyr Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly Ala 165 170 175 Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly 180 185 190 Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala 195 200 205 Thr Leu Gln Ser 210 <210> 139 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> leuE variant <400> 139 gtgttcgctg aatacggggt tctgaattac tggacctatc tggttggggc catttttatt 60 gtgttggtgc cagggccaaa taccctggcg gtactcaaaa atagcgtcag tagcggtatg 120 aaaggcggtt atcttgcggc ctgcggtgta tttattggcg atgcggtatt gatgtttctg 180 gcatgggctg gagtggcgac attaattaag accaccccga tattattcaa cattgtacgt 240 tatcttggtg cgttttattt gctctatctg gggagtaaaa ttctttacgc gaccctgaag 300 ggtaaaaata gcgaggccaa atccgatgag ccccaatacg gtgctatttt taaacgcgcg 360 ttaattttga gcctgactaa tccgaaagcc attttgttct atgtgtcgtt tttcgtacag 420 tttatcgatg ttaatgcccc acatacggga atttcattct ttattctggc ggcgacgctg 480 gaactggtga gtttctgcta tttgagcttc ctgattatat ctggtgcttt tgtcacgcag 540 tacatacgta ccaaaaagaa actggctaaa gttggcaact cactgattgg tttgatgttc 600 gtgggtttcg ctgcccgact ggcgacgctg caatcctga 639 <210> 140 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> leuE variant <400> 140 atgttcgctg aatacggggt tctgaattac tggacctatc tggttggggc catttttatt 60 gtgttggtgc cagggccaaa taccctggcg gtactcaaaa atagcgtcag tagcggtatg 120 aaaggcggtt atcttgcggc ctgcggtgta tttattggcg atgcggtatt gatgtttctg 180 gcatgggctg gagtggcgac attaattaag accaccccga tattattcaa cattgtacgt 240 tatcttggtg cgttttattt gctctatctg gggagtaaaa ttctttacgc gaccctgaag 300 ggtaaaaata gcgaggccaa atccgatgag ccccaatacg gtgctatttt taaacgcgcg 360 ttaattttga gcctgactaa tccgaaagcc attttgttct atgtgtcgtt tttcgtacag 420 tttatcgatg ttaatgcccc acatacggga atttcattct ttattctggc ggcgacgctg 480 gaactggtga gtttctgcta tttgagcttc ctgattatat ctggtgcttt tgtcacgcag 540 tacatacgta ccaaaaagaa actggctaaa gttggcaact cactgattgg tttgatgttc 600 gtgggtttcg ctgcccgact ggcgacgctg caatcctga 639 <210> 141 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LeuE variant <400> 141 Val Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly 1 5 10 15 Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Phe Val Leu 20 25 30 Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys 35 40 45 Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly 50 55 60 Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg 65 70 75 80 Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Leu Tyr 85 90 95 Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln 100 105 110 Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro 115 120 125 Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val 130 135 140 Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu 145 150 155 160 Glu Leu Val Ser Ala Cys Tyr Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly Ala 165 170 175 Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly 180 185 190 Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala 195 200 205 Thr Leu Gln Ser 210 <210> 142 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LeuE variant <400> 142 Met Phe Ala Glu Tyr Gly Val Leu Asn Tyr Trp Thr Tyr Leu Val Gly 1 5 10 15 Ala Ile Phe Ile Val Leu Val Pro Gly Pro Asn Thr Leu Phe Val Leu 20 25 30 Lys Asn Ser Val Ser Ser Gly Met Lys Gly Gly Tyr Leu Ala Ala Cys 35 40 45 Gly Val Phe Ile Gly Asp Ala Val Leu Met Phe Leu Ala Trp Ala Gly 50 55 60 Val Ala Thr Leu Ile Lys Thr Thr Pro Ile Leu Phe Asn Ile Val Arg 65 70 75 80 Tyr Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Tyr Leu Gly Ser Lys Ile Leu Tyr 85 90 95 Ala Thr Leu Lys Gly Lys Asn Ser Glu Ala Lys Ser Asp Glu Pro Gln 100 105 110 Tyr Gly Ala Ile Phe Lys Arg Ala Leu Ile Leu Ser Leu Thr Asn Pro 115 120 125 Lys Ala Ile Leu Phe Tyr Val Ser Phe Phe Val Gln Phe Ile Asp Val 130 135 140 Asn Ala Pro His Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ile Leu Ala Ala Thr Leu 145 150 155 160 Glu Leu Val Ser Ala Cys Tyr Leu Ser Phe Leu Ile Ile Ser Gly Ala 165 170 175 Phe Val Thr Gln Tyr Ile Arg Thr Lys Lys Lys Leu Ala Lys Val Gly 180 185 190 Asn Ser Leu Ile Gly Leu Met Phe Val Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ala 195 200 205 Thr Leu Gln Ser 210 <210> 143 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> leuE variant <400> 143 gtgttcgctg aatacggggt tctgaattac tggacctatc tggttggggc catttttatt 60 gtgttggtgc cagggccaaa taccctgttt gtactcaaaa atagcgtcag tagcggtatg 120 aaaggcggtt atcttgcggc ctgcggtgta tttattggcg atgcggtatt gatgtttctg 180 gcatgggctg gagtggcgac attaattaag accaccccga tattattcaa cattgtacgt 240 tatcttggtg cgttttattt gctctatctg gggagtaaaa ttctttacgc gaccctgaag 300 ggtaaaaata gcgaggccaa atccgatgag ccccaatacg gtgctatttt taaacgcgcg 360 ttaattttga gcctgactaa tccgaaagcc attttgttct atgtgtcgtt tttcgtacag 420 tttatcgatg ttaatgcccc acatacggga atttcattct ttattctggc ggcgacgctg 480 gaactggtga gtgcgtgcta tttgagcttc ctgattatat ctggtgcttt tgtcacgcag 540 tacatacgta ccaaaaagaa actggctaaa gttggcaact cactgattgg tttgatgttc 600 gtgggtttcg ctgcccgact ggcgacgctg caatcctga 639 <210> 144 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> leuE variant <400> 144 atgttcgctg aatacggggt tctgaattac tggacctatc tggttggggc catttttatt 60 gtgttggtgc cagggccaaa taccctgttt gtactcaaaa atagcgtcag tagcggtatg 120 aaaggcggtt atcttgcggc ctgcggtgta tttattggcg atgcggtatt gatgtttctg 180 gcatgggctg gagtggcgac attaattaag accaccccga tattattcaa cattgtacgt 240 tatcttggtg cgttttattt gctctatctg gggagtaaaa ttctttacgc gaccctgaag 300 ggtaaaaata gcgaggccaa atccgatgag ccccaatacg gtgctatttt taaacgcgcg 360 ttaattttga gcctgactaa tccgaaagcc attttgttct atgtgtcgtt tttcgtacag 420 tttatcgatg ttaatgcccc acatacggga atttcattct ttattctggc ggcgacgctg 480 gaactggtga gtgcgtgcta tttgagcttc ctgattatat ctggtgcttt tgtcacgcag 540 tacatacgta ccaaaaagaa actggctaaa gttggcaact cactgattgg tttgatgttc 600 gtgggtttcg ctgcccgact ggcgacgctg caatcctga 639 <210> 145 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 145 ataattaaag aggttaatat gttcgctgaa tacggg 36 <210> 146 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 146 cccgtattca gcgaacatat taacctcttt aattat 36

Claims (19)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 30번째 아미노산 페닐알라닌, 95번째 아미노산 류신 또는 165번째 아미노산 페닐알라닌으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 30번째 아미노산 페닐알라닌이 알라닌, 트립토판, 류신, 발린, 글리신, 세린, 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 이소류신, 프롤린, 타이로신, 글루타민, 라이신, 글루탐산, 시스테인, 쓰레오닌 및 알지닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환되거나; 95번째 아미노산 류신이 발린, 페닐알라닌, 알라닌, 글리신, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 이소류신, 세린, 프롤린, 타이로신, 글루타민, 라이신, 글루탐산, 시스테인, 트립토판 및 알지닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환되거나; 또는 165번째 아미노산 페닐알라닌이 알라닌, 트립토판, 류신, 발린, 글리신, 세린, 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 이소류신, 프롤린, 타이로신, 글루타민, 라이신, 글루탐산, 시스테인, 쓰레오닌 및 알지닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환된, O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째 아미노산 발린이 메치오닌으로 추가적으로 치환된, O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 133, 134, 137, 138, 141 및 142의 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된, O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드.
  5. 제1항의 O-아세틸 호모세린 배출능을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 삭제
  7. 제5항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 135, 136, 139, 140, 143 및 144의 핵산 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된, 폴리뉴클레오티드.
  8. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 또는 이의 변이체 폴리펩티드가 포함되거나 과발현된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아(Escherichia) 속 미생물로서,
    상기 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 30번째 아미노산 페닐알라닌, 95번째 아미노산 류신 또는 165번째 아미노산 페닐알라닌으로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것인, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아(Escherichia) 속 미생물.
  9. 삭제
  10. 제8항에 있어서, 상기 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 30번째 아미노산 페닐알라닌이 알라닌, 트립토판, 류신, 발린, 글리신, 세린, 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 이소류신, 프롤린, 타이로신, 글루타민, 라이신, 글루탐산, 시스테인, 쓰레오닌 및 알지닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환되거나; 95번째 아미노산 류신이 발린, 페닐알라닌, 알라닌, 글리신, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 이소류신, 세린, 프롤린, 타이로신, 글루타민, 라이신, 글루탐산, 시스테인, 트립토판 및 알지닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환되거나; 또는 165번째 아미노산 페닐알라닌이 알라닌, 트립토판, 류신, 발린, 글리신, 세린, 아스파라긴, 아스파르트산, 히스티딘, 이소류신, 프롤린, 타이로신, 글루타민, 라이신, 글루탐산, 시스테인, 쓰레오닌 및 알지닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 변이체 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째 아미노산 발린이 메치오닌으로 추가적으로 치환된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물.
  12. 제8항에 있어서, 상기 에스케리키아 속 미생물은 대장균(Escherichia coli)인, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물.
  13. 제8항에 있어서, 상기 에스케리키아 속 미생물은 추가적으로 시스타치오닌 신타아제(cystathionine synthase)의 활성이 불활성화된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물.
  14. 제8항에 있어서, 상기 에스케리키아 속 미생물은 추가적으로 호모세린 키나아제(homoserine kinase)의 활성이 불활성화된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물.
  15. 제8항에 있어서, 상기 에스케리키아 속 미생물은 추가적으로 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제(homoserine acetyltransferase)의 활성이 비변이 미생물에 비하여 강화된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물.
  16. 제8항에 있어서, 상기 에스케리키아 속 미생물은 추가적으로 아스파테이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제 (aspartate semialdehyde dehydrogenase), 피리딘 뉴클레오티드 트랜스하이드로게나아제 (pyridine nucleotide transhydrogenase) 또는 이들의 조합의 활성이 비변이 미생물에 비하여 강화된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물.
  17. 제8항, 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 배양단계에서 배양된 미생물 또는 배지에서 O-아세틸 호모세린을 회수하는 단계를 포함하는, O-아세틸 호모세린 생산방법.
  18. 제8항, 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 배양단계에서 배양된 미생물 또는 배지에, 또는 상기 배양단계에서 배양된 미생물 또는 배지에서 회수한 O-아세틸 호모세린에 메틸머캅탄과 메치오닌 전환 효소를 처리하여 O-아세틸 호모세린을 L-메치오닌으로 전환하는 단계를 포함하는, L-메치오닌 생산방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 메치오닌 전환 효소는 O-아세틸 호모세린 설피드릴라제인, L-메치오닌 생산방법.
KR1020160069827A 2015-06-04 2016-06-03 O-아세틸-호모세린을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 o-아세틸-호모세린을 생산하는 방법 KR101859276B1 (ko)

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