KR101704199B1 - L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물 및 이를 이용한 l-트립토판의 제조 방법 - Google Patents

L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물 및 이를 이용한 l-트립토판의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포스파타제의 활성을 불활성화시킴으로써, L-트립토판 생산능이 향상된 에스케리키아속 미생물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 에스케리키아속 미생물을 이용하여 L-트립토판을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물 및 이를 이용한 L-트립토판의 제조 방법{A MICROORGANISM OF ESCHERICHIA GENUS HAVING L-TRYPTOPHAN PRODUCING ACTIVITY AND METHOD FOR PRODUCING L-TRYPTOPHAN USING THE SAME}
본 발명은 포스파타제의 활성이 불활성화되도록 변이된, L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 L-트립토판을 제조하는 방법에 관한 것이다.
L-트립토판(L-tryptophan)은 필수 아미노산의 하나로 사료 첨가제, 수액제 등의 의약품 원료 및 건강식품소재 등으로 널리 사용되어 왔다. 이와 같은, L-트립토판은 화학 합성법, 효소 반응법, 발효법 등을 통해 생산될 수 있으나, 현재에는 미생물을 이용한 직접 발효법이 주로 이용되고 있다.
L-트립토판 생산 균주의 개발 방향은 초기에는 돌연변이 선별로 진행되거나(대한민국 특허 등록 제1987-0001813호), 유전공학의 발달과 함께 생합성 경로 효소들의 트립토판 피드백 저해를 극복하는 방법, 혹은 트립토판 생합성 효소의 발현 강화와 같이 대사과정의 효소 합성 강화를 통해 트립토판 생산 균주의 개발이 진행되었다. 그러나, 여전히 산업상 이용하고자 하는 고 효율의 생산량을 갖는 트립토판 생산 균주의 개발의 필요성이 요구되고 있다.
한편, 미생물에 의한 트립토판 생합성에 있어 마지막 단계의 반응에 참여하는 트립토판 신타제 (tryptophan synthase, EC 4.2.1.20)는 PLP (Pyridoxal Phosphate)를 조효소로 사용하는 것으로 알려져 있다. 또한, 트립토판 신타제 반응에 기질로 사용되는 세린의 경우에도 serC에 의해 코딩되는 포스포하이드록시쓰레오닌 아미노트랜스퍼라제 (phosphohydroxythreonine aminotransferase, EC 2.6.1.52)가 PLP를 조효소로 사용하고 있어, 트립토판 생합성에 있어 PLP는 중요한 조효소라고 할 수 있다.
따라서, PLP의 적절한 농도 유지는 해당 효소의 효율적 반응 및 목적 산물의 생합성 반응에 중요한 역할을 할 것으로 기대할 수 있다. 그러나, 상기 조효소는 트립토판 생산 이외에도 다양한 반응에 관여함에 따라, 적합하게 PLP를 유지시키는 방법이 아직은 없었다. 또한, PLP 를 적절하게 트립토판 생산 미생물 내에서 유지한다고 하더라도 L-트립토판의 생산능이 증가될지 여부는 불분명하다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 L-트립토판을 고효율로 생산하기 위한 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 조효소인 PLP의 분해를 막아, 세포 내 PLP의 농도를 적절하게 유지하여, 트립토판 생산능을 증가시키고자, 그 기능이 아직 명확하지 않은 yigL 유전자에 의해 코딩되는 서열번호 1의 아미노산으로 기재된 단백질의 활성을 불활성화시킨 결과, 트립토판 생성능이 향상됨을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 L-트립토판 생산능을 갖는 미생물을 이용하여 L-트립토판을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태로서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포스파타제 (phosphatase)의 활성이 불활성화되도록 변이된, L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속(Escherichia) 미생물을 제공한다. 예를 들어, 상기 L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물은 포스파타제의 활성이 불활성화되도록 변이되지 않은 L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물에 비해 트립토판 생산능이 증가된 미생물일 수 있다.
본 발명에서 용어, "L-트립토판(L-tryptophan)"은 α-아미노산의 하나로, 체내에서 합성되지 않는 필수 아미노산이며 화학식이 C11H12N2O2인 방향족 L-아미노산을 말한다. 미생물에서 L-트립토판의 생산능을 증가시키기 위해 기존에는 트립토판 생산 경로 상의 생합성 효소의 발현을 강화시키거나 곁가지 경로를 차단시키는 방법 등이 이용되어 왔다.
본 발명에서 용어, "포스파타제 (phosphatase)"는 기질로부터 인산기를 제거하는 반응을 촉매하는 단백질일 수 있다. 본 발명에서의 "서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 포스파타제"는 유전자 yigL에 의해 코딩되는 단백질로서 PLP를 기질로 하여 피리독살 및 인산으로 분해하는 반응을 촉매하는 것으로 추정된다. 상기 yigL에 의해 코딩되는 단백질의 경우 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) DB에는 PLP 포스파타제 (pyridoxal phosphate phsphatase)로 명명되어 있고 (NCBI gene ID: 12930615), EcoCyc DB (http://www.ecocyc.org)상에는 당인산 포스파타제 (phosphosugar phosphatase)로 명명되어 있어 어느 것이 더 주요한 기능인지는 밝혀진 바가 없다. 최근 연구에 따르면 yigL의 발현이 heat shock에 의해 유도된다고 보고되기도 하였으며 (J. Gen. Appl. Microbiol., (2005) V51, pp 93-103), sRNA의 일종인 sgrS에 의해 yigL의 번역 (translation)이 활성화되어 세포내 당인산 (phosphosugar)을 분해한다는 연구 결과도 있으나 (J. Bacteriol. (2013) V195,pp 4804-4815), 아직 명확한 기능이 밝혀진 바는 없다.
이에, 상기 효소는 서열번호 1로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더 구체적으로는 98% 이상, 더욱 더 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 상기 효소와 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 효소라면 제한없이 포함할 수 있다. 또한 이러한 상동성을 갖으며 각 효소에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 효소 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
상기 아미노산 서열번호 1로 기재한 포스파타제를 코딩하는 유전자는 상기 효소를 코딩할 수 있는 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있으며, yigL 유전자로 나타낼 수 있다. 구체적으로, 상기 효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 기재한 염기서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 98% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기 서열로서 실질적으로 상기 효소와 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 효소를 코딩하는 유전자 서열이라면 제한없이 포함할 수 있다. 또한 이러한 상동성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보, 예로는 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)를 직접 정렬하여 결정될 수 있다(예: BLAST 2.0). 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.
본 발명에서 용어, "내재적 활성"은 미생물이 천연의 상태 또는 해당 효소의 변형 전에 가지고 있는 효소의 활성 상태를 의미한다.
상기 "활성이 불활성화되도록 변이된"은 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않는 경우 및/또는 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미한다.
이와 같이 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화되는 것은 본래 미생물이 천연의 상태 또는 변형 전의 상태에서 가지고 있는 효소의 활성과 비교하였을 때, 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미한다. 상기 감소는 상기 효소를 코딩하는 유전자의 변이 등으로 효소 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 효소의 활성에 비해 낮은 경우와, 이를 코딩하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합 역시 포함하는 개념이다.
이러한 효소 활성이 불활성화되도록 변이시키는 방법은, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 상기 효소의 활성이 제거된 경우를 포함하여 상기 효소의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 효소를 코딩하는 유전자를 대체하는 방법; 효소를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나 없는 서열로 교체하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 효소로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (예컨대, 안티센스 RNA)를 도입하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜 (ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 법 및 해당 서열의 ORF (open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE (Reverse transcription engineering) 방법 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 상기 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 효소를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 세균 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이러한 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법의 일례로 상동 재조합에 의하여 유전자를 결실시키는 방법을 사용할 수 있다.
상기에서 "일부"란, 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 1 내지 300개, 구체적으로는 1 내지 100개, 더욱 구체적으로는 1 내지 50개일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기에서 "상동 재조합(homologous recombination)"이란, 서로 상동성을 지닌 유전자 사슬의 좌위에서 연결 교환을 통해 일어나는 유전자 재조합을 의미한다.
구체적으로, 발현 조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 핵산 서열에 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 프로모터로 교체하는 등의 방법으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
아울러, 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 효소의 활성이 더욱 감소되도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 포스파타제의 내재적 활성을 불활성 시키고자, 당해 포스파타제를 코딩하는 유전자인 yigL을 결실시킨, 트립토판 생산능을 갖는 다양한 대장균이 yigL을 결실시키지 않은 모균주에 비해 L-트립토판의 생산능이 증가함을 확인하여, 내재적 포스파타제의 활성을 불활성화시킨 변이된, L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물이 L-트립토판을 효율적으로 생산할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 상기 L-트립토판 생산능을 갖는 미생물은 상기 배지 중의 탄소원으로부터 L-트립토판을 생산할 수 있는 미생물을 말한다. 또한, 상기 L-트립토판을 생산하는 미생물은 재조합 미생물일 수 있다. 구체적으로 L-트립토판을 생산할 수 있다면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 엔테로박터(Enterbacter) 속, 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 일 수 있으며, 구체적으로는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물일 수 있다.
더욱 구체적으로는 에스케리키아속(Escherichia) 미생물은 구체적으로 대장균(Escherichia coli)일 수 있으나, 포스파타제 활성이 불활성화되어 L-트립토판 생산능이 증가될 수 있는 에스케리키아속에 속하는 미생물은 제한 없이 포함될 수 있다.
구체적으로 본 발명에서 상기 포스파타제의 활성의 불활성화에 의하여 L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물의 모균주는 트립토판 생산능을 가지는 미생물이라면 특별히 제한되지 않는다. 트립토판 생산능을 가지는 미생물은, 그 예로, 트립토판 생합성 경로를 강화하기 위하여, 경쟁경로의 유전자, 트립토판 오페론의 방향성 경로의 조절자, 트립토판 유입유전자, 트립토판 유입 및 분해 유전자의 활성의 약화 또는 불활성화 시키거나, 및/또는 트립토판 오페론의 활성을 과발현시킨 미생물일 수 있다. 상기 활성의 약화 또는 불활성화 방법은 상기에서 설명한 바와 같으며, 공지의 방법은 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 트립토판 오페론 활성의 과발현은 공지의 방법은 제한없이 포함되나, 그 예로 오페론 유전자의 염기서열 일부 또는 전부 그 자체 혹은 외부로부터 도입된 발현조절부위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 염색체에 삽입하는 방법, 벡터 시스템에 도입하는 방법에 의하여 카피수를 증가시키는 방법, 유전자의 발현을 조절하는 발현조절부위를 다른 조절서열로 치환, 발현조절부위의 염기서열 전체 혹은 일부 돌연변이가 유발된 변형, 유전자 자체의 변이도입에 의한 오페론 활성 강화 등에 의한 방법 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는 pheA, trpR, mtr 및/또는 tnaAB 유전자의 전체 또는 일부가 결실, 및/또는 트립토판 오페론이 과발현된 대장균일 수 있다.
본 발명에서, pheA, trpR, mtr, tnaAB 유전자 및 트립토판 오페론 및 이들이 코딩하는 단백질 서열을 비롯하여, 본 발명에서 사용되는 유전자 및 단백질 서열들은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등에서 얻을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, pheA, trpR, mtr 및 tnaAB 유전자 등에 대한 구체적인 내용은 대한민국 특허 등록 제10-0792095호, 대한민국 특허 공개 제10-2013-0082121호에 기재되어 있는 내용을 참고할 수 있으며, 상기 특허의 명세서 전체는 본 발명의 참고자료로서 포함될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예들에 비추어, 다양한 모균주에서 상기 포스파타제의 활성을 불활성화시킨 결과, 트립토판 생산능을 갖고 있는 에스케리키아속 미생물이라면 모균주의 종류에 상관없이 상기 포스파타제 활성을 불활성화시키는 경우에는 L-트립토판의 생산능이 유의적으로 향상되는 것으로 확인하였다.
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포스파타제의 활성이 불활성화되도록 변이된, L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양에 따른 배지 또는 상기 미생물로부터 L-트립토판을 회수하는 단계를 포함하는, L-트립토판의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 에스케리키아속 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 구체적으로는 본 발명의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 발명에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스, 만니톨, 소르비톨 등과 같은 탄수화물; 당 알코올, 글리세롤, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 알코올; 유기산, 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
본 발명에서, 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.
배양물의 온도는 구체적으로는 27℃ 내지 40℃, 보다 구체적으로는 30℃ 내지 37℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 10 시간 내지 100 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 L-트립토판을 회수하는 단계는 본 발명의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 L-트립토판을 회수할 수 있다.
상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다. 상기 정제공정은 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 회수된 L-트립토판을 정제할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 포스파타제의 활성이 불활성화되도록 변이된, L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물을 제공하여, 이를 이용해 L-트립토판을 보다 고수율로 효율적이고 경제적으로 제조할 수 있는 효과를 나타낸다. 이를 통해 제조된 L-트립토판은 동물 사료 또는 사료 첨가제뿐만 아니라 인간의 식품 또는 식품 첨가제, 의약품 등 다양한 제품에 응용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 포스파타제 ( phosphatase )가 결손된 야생형 균주의 제작
본 실시예에서는 트립토판 생산능을 갖는 균주에서 포스파타제 활성이 불활성화된 균주를 제작하고자 하였다.
대표적인 에스케리키아속 미생물인, 대장균 야생형 균주인 W3110 균주에, 트립토판 생산능을 강화시키기 위하여, 코리슴산 뮤타제 (chorismate mutase)/ 프레펜산 탈수효소 (prephenate dehydratase, CM-PDT)를 코딩하는 pheA 유전자 (NCBI gene ID: 12934467)와 트립토판 분해효소 (Tryptophanase)를 코딩하는 tnaA유전자 (NCBI gene ID: 12933600), 트립토판 임포터 (importer)를 코딩하는 tnaB유전자(NCBI gene ID: 12933602)의 오페론 형태인 tnaAB 유전자가 결실된 W3110 trpΔ2 균주 대한민국 특허 공개 제10-2013-0082121호)로부터, 포스파타제 (phosphotase)를 코딩하는 것으로 추정되는 yigL 유전자를 상동 재조합에 의하여 결실시켰다.
구체적으로, 서열번호 2의 염기 서열을 가지는 유전자 yigL의 결실을 위하여, Datsenko KA 등이 개발한 람다 레드 재조합효소 (lambda Red recombinase)를 이용한, 1-단계 불활성화 (one step inactivation) 방법을 사용하였다 (Proc Natl Acad Sci USA, (2000) V97, pp6640-6645). 유전자 내부로의 삽입을 확인하기 위한 마커로, pUC19 (New England Biolabs (USA))에 rmf 프로모터를 라이게이션시키고, pACYC184(New England Biolab)로부터 수득된 돌연변이 loxP-CmR-loxP 카세트를 라이게이션시켜 수득된 pUCprmfmloxP의 클로람페니콜 유전자를 사용하였다 (대한민국 특허 공개 제10-2009-0075549호).
먼저, yigL 유전자의 일부분과 pUCprmfmloxP 유전자의 클로람페니콜 (chloramphenicol) 내성 유전자의 일부 염기서열을 갖는 서열번호 3 및 4의 프라이머 조합을 이용하여 pUCprmfmloxP를 주형으로 하고, 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1분간 신장시키는 것으로 이루어진 사이클을 30회 반복하는 1차 중합효소 연쇄반응 (이하 'PCR')에 의해 약 1.2 kb의 PCR 산물 ΔyigL1st를 수득하였다. 그 후, PCR을 통해 수득된 1.2 kb의 PCR 산물 ΔyigL1st를 0.8% 아가로스겔에서의 전기영동 후 용리하여 2차 PCR의 주형으로 사용하였다. 2차 PCR은 1차 PCR에서 수득된 PCR 산물의 5' 및 3' 영역의 20 bp의 염기서열을 포함하는 서열번호 5 및 6 프라이머 조합을 이용하여, 용리된 1차 PCR 산물을 주형으로 하여, 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1분간 신장시키는 것으로 이루어진 사이클을 30회 반복하는 것에 의해 수행하여 약 1.3kb의 PCR 산물 ΔyigL을 수득하였다. 수득된 PCR 산물을 0.8% 아가로스겔에서의 전기영동후 용리하여 재조합에 사용하였다.
Datsenko KA 등이 개발한 1-단계 불활성화 방법 (Proc Natl Acad Sci USA., (2000) V97, pp6640-6645)에 따라 pKD46 벡터로 형질전환된 대장균 W3110 trpΔ2 를 컴피턴트 (competent)한 상태로 제조한 후, 1차 및 2차 PCR을 통해 수득된 1.3 kb의 단편 ΔyigL를 도입하여 형질전환시켰다. 이후, 클로람페니콜을 포함하는 LB 배지에서 배양하여 클로람페니콜 내성을 갖는 1차 형질전환체를 선별하였다.
상기에서 수득된 클로람페니콜 내성을 갖는 1차 재조합 균주로부터 pKD46을 제거한 후, pJW168 벡터 (Gene, (2000) V247, pp255-264)를 도입하여 클로람페니콜 마커 유전자를 균체로부터 제거하였다(Gene, (2000) V247,pp255-264). 최종적으로 수득된 균체로부터 서열번호 7과 8의 프라이머를 이용한 PCR을 통해 수득된 약 0.6 kb PCR 산물에 의해 yigL 유전자가 결실되었다는 것을 확인하고, W3110 trpΔ2 yigL로 명명하였다.
본 실시예에서 사용한 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타냈다.
프라이머 서열 서열번호
yigL-Cm-R2 ttgcgtctgatttagatggcacgttactttctcccgaccatacgttatccTAgTggATCTgA TgggTACC 3
yigL-R1 cccagcggaaaccgctctacagaggtttaaatttcttATGtaccaggttgttgcgtctgatttagatggc 4
yigL-Cm-F2 ccattgtagcgaagtatcaggttgacaactgaccaaataaagaacgaTTAAggTgACACTAT AgAACgCg 5
yigL-F1 Tggtgatgataagtagcgccacaatggaaaactctttgattaacgggtatccattgtagcgaagtatcag 6
yigL conF1 AACCGCATGCATGACCGTTT 7
yigL conR1 ATATACAGGCCGACCGTTTT 8
실시예 2: 포스파타제가 불활성화된 트립토판 생산 균주의 제작
본 실시예에서는 트립토판을 생산하는 또 다른 대표적인 대장균인 KCCM11166P (대한민국 등록 특허 제10-1261147호)를 모균주로 하여 포스파타제를 코딩하는 것으로 추정되는 yigL 유전자를 상기 실시예 1에 기술한 방법과 동일하게 상동 재조합에 의하여 결실시켰다.
최종적으로 수득된 균체로부터 서열번호 7과 8의 프라이머를 이용한 PCR을 통해 수득된 약 0.6 kb PCR 산물에 의해 yigL 유전자가 결실되었다는 것을 확인하고, CA04-2803으로 명명하였다.
실시예 3: yigL 유전자가 결실된 야생형 균주의 트립토판 생성능 평가
상기 실시예 1에서 제조한 W3110 trpΔ2 yigL와 모균주인 W3110 trpΔ2의 트립토판 생성능을 비교하기 위하여 각각의 균주에 pCL-Dtrp_att-trpEDCBA와 pBAC-Dtrp_att-trpDCBA를 형질전환 방법에 의해 도입하였다. 도입된 벡터들은 트립토판 오페론 조절 부위의 조절 기작이 해제되어 트립토판을 과량 생산할 수 있도록 트립토판 오페론 발현이 강화된 벡터들이다 (대한민국 특허 공개 제10-2013-0082121호). 벡터가 도입된 균주들은 하기 표 2의 조성대로 제조된 트립토판 평가 배지에서 배양하여 L-트립토판 생산능을 비교하였다.
트립토판 평가 배지 조성
조성물 농도 (리터당)
Glucose 2 g
K2HPO4 1 g
(NH4)2SO4 12 g
NaCl 1 g
Na2HPO4·H2O 5 g
MgSO4·H2O 1 g
MnSO4·H2O 15 mg
CuSO4·H2O 3 mg
ZnSO4·H2O 30 mg
구연산나트륨 1 g
효모액기스 1 g
페닐알라닌 0.15 g
pH 6.8
37℃ 배양기(incubator)에서 LB 고체 배지 상에 밤새 배양한 균주들을 각각 상기 표 2의 25 ㎖ 평가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 37℃, 200 rpm의 배양기에서 48시간 동안 배양하여 트립토판 농도를 비교하였다 (표 3).
균주 트립토판 농도 (g/L)
W3110 trpΔ2 / pCL-Dtrp_att-trpEDCBA, pBAC-Dtrp_att-trpDCBA 0.5
W3110 trpΔ2 yigL / pCL-Dtrp_att-trpEDCBA, pBAC-Dtrp_att-trpDCBA 0.8
상기와 같은 결과는, 유전자 yigL에 의해 코딩되는 포스파타제의 활성이 불활성화된 균주의 트립토판 생성능이 상기 포스파타제의 활성이 불활성화되지 않은 균주에 비해 60% 증가한 것으로, yigL에 의해 코딩되는 포스파타제의 불활성화에 의해 트립토판 생성능이 향상될 수 있음을 확인하였다. 이는 yigL에 의해 코딩되는 포스파타제의 불활성에 의하여 트립토판 생합성에 중요한 조효소의 역할을 하는 PLP의 농도가 높아져 트립토판 생합성이 증가된 결과로 해석할 수 있다.
실시예 4: yigL 유전자가 결실된 균주의 트립토판 생성능 평가
상기 실시예 2에서 제조한 yigL 결손주 (CA04-2803)와 모균주인 KCCM11166P의 트립토판 역가를 측정하기 위하여 하기 표 4의 조성대로 제조된 트립토판 역가 배지에서 배양하여 L-트립토판 생산효율 향상을 확인하였다.
트립토판 역가 배지 조성
조성물 농도 (리터당)
Glucose 60 g
K2HPO4 1 g
(NH4)2SO4 10 g
NaCl 1 g
MgSO4·7H2O 1 g
구연산나트륨 5 g
효모액기스 2 g
탄산칼슘 40 g
구연산나트륨 5 g
페닐알라닌 0.15 g
타이로신 0.1 g
pH 6.8
37℃ 배양기 (incubator)에서 LB 고체 배지 상에 밤새 배양한 대장균 KCCM 11166P 및 대장균 CA04-2803을 각각 상기 표 4의 25 ㎖ 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 37℃, 200 rpm의 배양기에서 48시간 동안 배양하여 당 소모속도 및 트립토판 농도를 비교하였다.
그 결과, 하기 표 5에 기재된 바와 같이, 대조군인 KCCM11166P에 비해 유전자 yigL에 의해 코딩되는 포스파타제의 활성이 불활성화된 균주인 CA04-2803의 트립토판 농도가 약 30% 증가하는 결과를 보였다.
균주 트립토판 농도 (g/L)
KCCM11166P 7.48
CA04-2803 9.62
본 발명자들은 KCCM11166P 균주 기반, 포스파타제를 코딩하는 yigL이 결손된 불활성화된 균주에서 트립토판 생산능력이 증가됨을 확인하고, 상기 균주를 "CA04-2803" 또는 "CA04-2803(KCCM11166P_ΔyigL)"로 명명한 후 부다페스트 조약 하에 국제기탁기관인 한국미생물보존센터 (KCCM)에 2014년 12월 5일자에 기탁하여 수탁번호 KCCM11635P를 부여받았다.
상기와 같은 결과들은, 본 발명의 트립토판 생산 에스케리키아속 미생물에서 포스파타제의 활성을 불활성화시킨 균주가 상기 효소를 불활성화시키지 않은 균주보다 L-트립토판 생산능이 증가되는 것을 시사하는 것이다. 또한, 이와 같이 트립토판 생성량이 증가한 결과들은, yigL에 의해 코딩되는 포스파타제의 불활성화에 의한 것으로, 상기 유전자에 의해 코딩되는 포스파타제의 예상 기능 중 하나로 추정되는 PLP 포스파타제로서의 기능이 불활성화된 것에 의한 것으로 추론되며, 이는 세포 내 높아진 PLP 농도에 의한 가능성이 높다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11635P 20141205
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A MICROORGANISM OF ESCHERICHIA GENUS HAVING L-TRYPTOPHAN PRODUCING ACTIVITY AND METHOD FOR PRODUCING L-TRYPTOPHAN USING THE SAME <130> KPA141284-KR <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 266 <212> PRT <213> Escherichia <400> 1 Met Tyr Gln Val Val Ala Ser Asp Leu Asp Gly Thr Leu Leu Ser Pro 1 5 10 15 Asp His Thr Leu Ser Pro Tyr Ala Lys Glu Thr Leu Lys Leu Leu Thr 20 25 30 Ala Arg Gly Ile Asn Phe Val Phe Ala Thr Gly Arg His His Val Asp 35 40 45 Val Gly Gln Ile Arg Asp Asn Leu Glu Ile Lys Ser Tyr Met Ile Thr 50 55 60 Ser Asn Gly Ala Arg Val His Asp Leu Asp Gly Asn Leu Ile Phe Ala 65 70 75 80 His Asn Leu Asp Arg Asp Ile Ala Ser Asp Leu Phe Gly Val Val Asn 85 90 95 Asp Asn Pro Asp Ile Ile Thr Asn Val Tyr Arg Asp Asp Glu Trp Phe 100 105 110 Met Asn Arg His Arg Pro Glu Glu Met Arg Phe Phe Lys Glu Ala Val 115 120 125 Phe Gln Tyr Ala Leu Tyr Glu Pro Gly Leu Leu Glu Pro Glu Gly Val 130 135 140 Ser Lys Val Phe Phe Thr Cys Asp Ser His Glu Gln Leu Leu Pro Leu 145 150 155 160 Glu Gln Ala Ile Asn Ala Arg Trp Gly Asp Arg Val Asn Val Ser Phe 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Cys Leu Glu Val Met Ala Gly Gly Val Ser Lys Gly 180 185 190 His Ala Leu Glu Ala Val Ala Lys Lys Leu Gly Tyr Ser Leu Lys Asp 195 200 205 Cys Ile Ala Phe Gly Asp Gly Met Asn Asp Ala Glu Met Leu Ser Met 210 215 220 Ala Gly Lys Gly Cys Ile Met Gly Ser Ala His Gln Arg Leu Lys Asp 225 230 235 240 Leu His Pro Glu Leu Glu Val Ile Gly Thr Asn Ala Asp Asp Ala Val 245 250 255 Pro His Tyr Leu Arg Lys Leu Tyr Leu Ser 260 265 <210> 2 <211> 801 <212> DNA <213> Escherichia <220> <221> gene <222> (1)..(801) <223> yigL <400> 2 atgtaccagg ttgttgcgtc tgatttagat ggcacgttac tttctcccga ccatacgtta 60 tccccttacg ccaaagaaac tctgaagctg ctcaccgcgc gcggcatcaa ctttgtgttt 120 gcgaccggtc gtcaccacgt tgatgtgggg caaattcgcg ataatctgga gattaagtct 180 tacatgatta cctccaatgg tgcgcgcgtt cacgatctgg atggtaatct gatttttgct 240 cataacctgg atcgcgacat tgccagcgat ctgtttggcg tagtcaacga caatccggac 300 atcattacta acgtttatcg cgacgacgaa tggtttatga atcgccatcg cccggaagag 360 atgcgctttt ttaaagaagc ggtgttccaa tatgcgctgt atgagcctgg attactggag 420 ccggaaggcg tcagcaaagt gttcttcacc tgcgattccc atgaacaact gctgccgctg 480 gagcaggcga ttaacgctcg ttggggcgat cgcgtcaacg tcagtttctc taccttaacc 540 tgtctggaag tgatggcggg cggcgtttca aaaggccatg cgctggaagc ggtggcgaag 600 aaactgggct acagcctgaa ggattgtatt gcgtttggtg acgggatgaa cgacgccgaa 660 atgctgtcga tggcggggaa aggctgcatt atgggcagtg cgcaccagcg tctgaaagac 720 cttcatcccg agctggaagt gattggtact aatgccgacg acgcggtgcc gcattatctg 780 cgtaaactct atttatcgta a 801 <210> 3 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YIGL-CM-R2 Primer <400> 3 ttgcgtctga tttagatggc acgttacttt ctcccgacca tacgttatcc tagtggatct 60 gatgggtacc 70 <210> 4 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yigL-R1 Primer <400> 4 cccagcggaa accgctctac agaggtttaa atttcttatg taccaggttg ttgcgtctga 60 tttagatggc 70 <210> 5 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yigL-Cm-F2 Primer <400> 5 ccattgtagc gaagtatcag gttgacaact gaccaaataa agaacgatta aggtgacact 60 atagaacgcg 70 <210> 6 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yigL-F1 Primer <400> 6 tggtgatgat aagtagcgcc acaatggaaa actctttgat taacgggtat ccattgtagc 60 gaagtatcag 70 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yigL conF1 Primer <400> 7 aaccgcatgc atgaccgttt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yigL conR1 Primer <400> 8 atatacaggc cgaccgtttt 20

Claims (3)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 포스파타제 (phosphatase)의 활성이 불활성화되도록 변이된, L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속(Escherichia) 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 에스케리키아속 미생물은 대장균(Escherichia coli)인 것인, L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물.
  3. (i) 제1항 또는 제2항의 에스케리키아속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
    (ii) 상기 배양에 따른 배지 또는 상기 미생물로부터 L-트립토판을 회수하는 단계를 포함하는, L-트립토판의 제조 방법.
KR1020150067660A 2015-05-14 2015-05-14 L-트립토판 생산능을 갖는 에스케리키아속 미생물 및 이를 이용한 l-트립토판의 제조 방법 KR101704199B1 (ko)

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US15/573,236 US10081822B2 (en) 2015-05-14 2016-05-10 Microorganism of the genus Escherichia producing L-tryptophan and method for producing L-tryptophan using the same
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HUE16792967A HUE054774T2 (hu) 2015-05-14 2016-05-10 Eljárás L-triptofán elõállítására, Escherichia nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok alkalmazásával
DK16792967.8T DK3296400T3 (da) 2015-05-14 2016-05-10 Fremsgangsmåde til produktion af l-tryptofan ved hjælp af mikroorganismer af arten escherichia
BR112017024401-2A BR112017024401A2 (pt) 2015-05-14 2016-05-10 ?microrganismo do gênero escherichia que produz l-triptofano e método para produzir l-triptofano com o uso do mesmo?
RU2017141773A RU2692645C2 (ru) 2015-05-14 2016-05-10 Микроорганизм рода Escherichia, продуцирующий L-триптофан, и способ получения L-триптофана с его использованием
EP16792967.8A EP3296400B1 (en) 2015-05-14 2016-05-10 Method for producing l-tryptophan using microorganisms of genus escherichia
MYPI2017704222A MY175834A (en) 2015-05-14 2016-05-10 A microorganism of the genus escherichia producing l-tryptophan and method for producing l-tryptophan using the same

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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019182413A1 (ko) 2018-03-23 2019-09-26 씨제이제일제당 (주) L-아미노산을 포함하는 과립 및 이의 제조방법
KR101991206B1 (ko) * 2018-11-29 2019-06-19 씨제이제일제당 (주) cAMP 수용 단백질 변이체 및 이를 이용한 L-아미노산 제조방법
KR101996767B1 (ko) 2018-11-29 2019-07-04 씨제이제일제당 (주) cAMP 수용 단백질 변이체 및 이를 이용한 L-아미노산 제조방법
KR101991207B1 (ko) 2018-11-29 2019-06-19 씨제이제일제당 (주) cAMP 수용 단백질 변이체 및 이를 이용한 L-아미노산 제조방법
KR102284726B1 (ko) * 2021-01-25 2021-08-02 씨제이제일제당 주식회사 신규한 타우토머레이즈 pptA 변이체 및 이를 이용한 L-트립토판 생산 방법

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR870001813B1 (ko) 1985-05-20 1987-10-13 한국과학기술원 발효법에 의한 l-트립토판의 제조방법
KR970001533B1 (en) 1987-01-30 1997-02-11 American Cyanamid Co Dihydro derivatives and pseudoaglycons of ll-e33288 antibiotics and anticancer ages, preparation and purification method thereof
JPH08103283A (ja) * 1994-10-06 1996-04-23 Mitsubishi Chem Corp トリプトファンの製造法
US8372989B2 (en) 2002-04-23 2013-02-12 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of monatin and its precursors
KR101142885B1 (ko) * 2003-12-15 2012-05-10 씨제이제일제당 (주) 트립토판 생합성 관련 변이유전자를 함유한 대장균 변이주및 이를 이용한 트립토판 제조방법
KR100792095B1 (ko) * 2006-12-29 2008-01-04 씨제이 주식회사 Ｌ-페닐알라닌 생산능을 갖는 대장균 변이주로부터유전자조작된 ｌ-트립토판 생산능을 갖는 재조합 대장균균주 및 이를 이용한 트립토판 제조방법
KR20090075549A (ko) 2008-01-04 2009-07-08 씨제이제일제당 (주) 향상된 ｌ-쓰레오닌 생산능을 갖는 대장균 및 이를 이용한ｌ-쓰레오닌의 생산 방법
KR101261147B1 (ko) 2011-01-18 2013-05-06 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산의 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법
KR101327093B1 (ko) * 2012-01-06 2013-11-07 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산을 생산할 수 있는 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법
ES2910377T3 (es) * 2012-01-10 2022-05-12 Cj Cheiljedang Corp Microorganismos de Escherichia coli que tienen la producción de L-triptófano mejorada y método para producir L-triptófano mediante el uso de los mismos
RU2013118637A (ru) * 2013-04-23 2014-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK
RU2013144250A (ru) * 2013-10-02 2015-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Jundishapur Journal of Microbiology. Vol. 6, No. 4, e5370 (2013.06.10.)*

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Publication number Publication date
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