KR100792095B1

KR100792095B1 - Ｌ-페닐알라닌 생산능을 갖는 대장균 변이주로부터유전자조작된 ｌ-트립토판 생산능을 갖는 재조합 대장균균주 및 이를 이용한 트립토판 제조방법

Info

Publication number: KR100792095B1
Application number: KR1020060137650A
Authority: KR
Inventors: 주재영; 최향; 고은성; 이지선; 이진호; 김소영; 진창현; 박영훈
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2006-12-29
Filing date: 2006-12-29
Publication date: 2008-01-04
Also published as: CN101622338A; US8569066B2; US8945907B2; EP2115121A4; EP3059311A1; CN101622338B; EP2115121A1; ES2606705T3; EP2115121B1; US20120276639A1; BRPI0720822B1; BRPI0720822A2; PL2115121T3; US20100028956A1; WO2008082179A1; EP3059310A1

Abstract

본 발명은 L-트립토판 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 L-트립토판 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 L-페닐알라닌 생산능을 갖는 대장균 변이주(KFCC 10066)로부터 염색체상 트립토판 요구성의 해제, L-페닐알라닌 생합성의 차단 및 트립토판 생합성 관련 유전자의 강화를 통한 유전자 조작에 의해 얻어진 트립토판 생산능을 갖는 재조합 대장균 균주 CJ600(KCCM 10812P) 및 이를 이용한 L-트립토판의 제조방법에 관한 것이다.

대장균, L-트립토판, 트립토판 요구성 해제, pheA, trpR, mtr, tnaAB, aroG, trpE, 변이

Description

Ｌ-페닐알라닌 생산능을 갖는 대장균 변이주로부터 유전자조작된 Ｌ-트립토판 생산능을 갖는 재조합 대장균 균주 및 이를 이용한 트립토판 제조방법 {GENETICALLY ENGINEERED L-TRYPTOPHAN PRODUCING RECOMBINANT ESCHERICHIA COLI WHICH HAS ORIGINALLY L-PHENYLALANINE PRODUCTION CHARACTER, AND THE METHOD FOR PRODUCING L-TRYPTOPHAN USING THE MICROORGANISM}

본 발명은 L-트립토판 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 L-트립토판 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 L-페닐알라닌을 생산능을 갖는 대장균 변이주(KFCC 10066)로부터 염색체상 트립토판 요구성의 해제, L-페닐알라닌 생합성의 차단 및 트립토판 생합성 관련 유전자의 강화를 통한 유전자 조작에 의해 얻어진 트립토판 생산이 가능한 재조합 대장균 균주 및 이를 이용한 L-트립토판의 제조방법에 관한 것이다.

L-트립토판은 필수 아미노산의 일종으로 사료첨가제 또는 수면효과나 정신 안정효과가 있어 수액제 등의 의약품 원료 및 건강식품소재 등으로 널리 사용되어 왔으며, 화학합성법, 효소반응법, 발효법 등을 이용하여 생산되고 있다.

그러나, 화학합성법의 경우 고온, 고압의 조건이 필요하며 그 산물에 D형과 L형이 혼재하기 때문에 정제과정이 쉽지 않으며, 효소반응법의 경우, 예컨대 일본에서 공고된 바 있는 마쓰이 도오아쓰이 특허 (대한민국 특허 공고 90-005773)에서의 효소반응법의 경우는 기질로 사용되는 인돌과 세린의 가격이 고가일 뿐만 아니라 사용되는 효소의 안정성에 문제가 있었다.

따라서 현재는 미생물을 이용한 직접 발효법에 의한 제조방법을 주로 사용하고 있다. 종래의 미생물 발효에 의한 L-트립토판의 생산은 대장균과 코리네박테리움 등 여러 다양한 미생물의 영양요구성 균주와 조절부위 변이 균주에서 이루어져 왔으며, 1980년대에 들어서면서부터 유전자 재조합 기술이 급격히 발달하면서 대사과정과 그 조절 기작들이 자세히 규명됨에 따라 많은 연구자들이 유전자 조작 기법을 이용하여 우수한 재조합 균주들을 개발하는데 큰 성과를 거두었고 이는 고도의 생산성 향상을 가져왔다.

미생물을 이용한 직접 발효법으로 트립토판을 생산하는 국내특허로는 트립토판 유사체 내성을 갖거나 영양 요구성을 갖는 변이 균주를 이용한 경우 (대한민국 특허공고 87-1813, 90-8251, 92-7405)와 재조합 균주를 이용한 경우 (대한민국 특허 공고 90-5772, 91-5672)가 각각 공지되어 있다. 트립토판 유사체 내성균주들을 이용한 경우에는 주로 트립토판 생합성 과정에서 효소들의 피드백 저해를 극복하는 것을 주된 목표로 하였고, 유전자 재조합 균주들의 경우 역시 트립토판 생합성 과정에서 효소들의 클로닝에 목표를 두었으며, 모두 실제로 괄목할 만한 성과를 가져왔다. 그러나 종래의 대장균 인공변이주를 이용한 L-트립토판 제조방법은 값싼 배양기질을 사용하여 L-트립토판을 생산할 수 있다는 장점이 있지만, 결정적으로 트 립토판의 생산성이 낮다는 문제점이 있었다. 또한 본 발명자들은 당사에서 개발하여 보유하고 있는 CJ285(KCCM-10534, PCT/KR2004/003030) 균주의 경우에도 발효법에 의해 L-트립토판을 산업적으로 생산하기에는 생산성이 낮은 것으로 판단하고, 유전자 재조합 기술을 통하여 트립토판 생산성을 보다 극대화하기 위하여 모균주로서 우수한 인공변이주의 확보가 필요하다고 판단하였다.

한편, 당사에서 개발하여 보유하고 있는 L-페닐알라닌 생산균주(KFCC 10066, 대한민국 특허공보 1985-0001232)의 경우 방향족 아미노산(L-트립토판, L-페닐알라닌, L-타이로신) 합성의 공통 대사경로를 보유하고 있으므로, 본 균주를 유전공학적인 방법으로 적절히 조작하여 L-트립토판의 생산을 유도할 수 있을 것으로 판단하였다. 따라서 본 발명자는 당사에서 개발하여 보유하고 있는 L-페닐알라닌 생산균주 (KFCC 10066, 대한민국 특허공보 1985-0001232)를 모균주로 이용하여, 트립토판 요구성의 복원 및 L-페닐알라닌 생합성을 차단하고 트립토판 생합성 관련 유전자를 강화하여 L-트립토판을 고수율로 생산할 수 있는 대장균 재조합 균주를 제조하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 L-페닐알라닌을 생산하는 대장균 모균주(KFCC 10066)를 이용하여 염색체상 트립토판 요구성의 복원 및 L-페닐알라닌 생합성을 차단하고 트립토판 생합성을 유도하기 위해 염색체상의 pheA, trpR, mtr, tnaAB 유전자를 불활성화시키고, 염색체상의 aroG, trpE 유전자를 변이시켜 얻어진 트립토판 생산이 가능한 재조합 대장균 균주를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 대장균 균주를 포도당이 함유된 발효배지에서 직접발효법으로 배양함으로써 고농도, 고수율의 L-트립토판을 생산하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 L-페닐알라닌 생산능을 갖는 대장균 변이주(KFCC 10066)의 염색체상 트립토판 요구성을 해제하는 단계; L-페닐알라닌의 생합성을 차단하는 단계, 즉 L-페닐알라닌 생합성에 관여하는 pheA 유전자, 트립토판 생합성의 조절에 관여하는 trpR 유전자, 생성된 트립토판의 세포내 재유입에 관여하는 mtr 유전자 및 생성된 트립토판의 분해에 관여하는 tnaAB 유전자들을 불활성화 시키는 단계 ; 트립토판 생합성 관련 유전자를 강화하는 단계, 즉 염색체상의 3-디옥시아라비노-헵툴로소네이트-7-포스페이트(3-deoxyarabinose-heptulosonate-7-phosphate; DAHP)를 합성하는 효소를 코딩하는 aroG 유전자 및 트립토판 생합성에 관여하는 trpE 유전자의 대사산물저해(feedback inhibition) 조절을 해제하기 위해 해당 유전자들을 변이시키는 단계 ; 및 상기 방법에 의해 얻어진 재조합 대장균 균주를 이용하여 포도당 함유 발효배지에서 직접발효법으로 L-트립토판의 생산성을 확인하는 단계로 구성된다.

본 발명의 염색체상 트립토판 요구성을 해제하는 단계는 트립토판에 대해 요구성이 있는 L-페닐알라닌 생산 균주의 염색체에 있는 트립토판 오페론 유전자를 야생주 형태로 복원하는 것을 포함한다. 트립토판 오페론 유전자는 trpEDCBA의 형태로 이루어져 있으며, 코리스메이트(chorismate)를 트립토판으로 전환하는 단계에 필요한 유전자들로 트립토판 생산균주에는 반드시 필요한 유전자이기 때문에 복원대상 유전자로 선정하였다.

본 발명의 L-페닐알라닌 생합성을 차단하는 단계는 L-페닐알라닌 생합성에 관련된 유전자를 불활성화시키는 것을 포함한다. 본 발명에 있어서, "불활성화"란 세포 내의 활성이 있는 pheA, trpR, mtr, tnaAB 유전자가 결여되어 있거나 pheA, trpR, mtr, tnaAB 유전자가 코딩하는 단백질의 수준이 감소되도록 변이되어 있는 것을 의미한다.

상기 pheA 유전자 (NCBI gene ID: 16130520)(서열번호 33)는 대장균의 L-페닐알라닌을 생합성하는데 필요한 단백질을 코딩하는 유전자로 코리스메이트 (chorismate) 에서 트립토판 생합성경로와 경쟁하는 단계에 있는 유전자이기 때문에, 트립토판 생산균주를 제작하는데 있어서 꼭 불활성화시키기 위한 대상 유전자로 선정하였다.

상기 trpR 유전자 (NCBI gene ID: 16132210)(서열번호 34)는 대장균의 트립토판 오페론(trpEDCBA)의 생합성을 조절하는데 필요한 단백질인 TrpR을 코딩하는 것으로 알려졌으며, 세포내 트립토판과 결합하여 트립토판 오페론의 mRNA 발현을 억제 (repression)하는 리프레서(repressor)로 작용하는 단백질이기 때문에 이 단백질의 불활성화로 인해 트립토판 오페론 mRNA가 과발현되어 트립토판의 농도향상을 도모할 수 있다고 판단되어 불활성화시키기 위한 대상 유전자로 선정하였다.

상기 mtr 유전자 (NCBI gene ID: 16131053)(서열번호 35)는 대장균의 세포밖에 존재하는 트립토판의 유입에 필요한 단백질을 코딩하는 것으로 알려졌으며, L- 트립토판을 생산하는 배양 조건에서는 필수적으로 파쇄해야할 것으로 예상되어 불활성화시키기 위한 대상 유전자로 선정하였다.

상기 tnaAB (NCBI gene ID: 90111643, 16131577)(서열번호 36 및 서열번호 37)는 세포내 생합성된 트립토판의 분해에 필요한 단백질을 코딩하는 유전자인 tnaA 및 세포 외부에 존재하는 트립토판의 유입에 작용하는 단백질을 코딩하는 유전자인 tnaB로 구성되어 있으며, L-트립토판을 생산하는 배양 조건에서는 필요하지 않을 것으로 예상되어 불활성화시키기 위한 대상 유전자로 선정하였다.

따라서, 본 발명의 미생물은 L-트립토판 생산능을 가진 미생물의 염색체에 존재하는 pheA, trpR, mtr, tnaAB 유전자를 불활성화시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 불활성화 방법에는, 자외선과 같은 빛 또는 화학물질을 이용하여 돌연변이를 유발하고, 얻어진 돌연변이체로부터 pheA, trpR, mtr, tnaAB 를 코딩하는 유전자가 불활성화된 균주를 선별할 수 있다. 또한, 상기 불활성화 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함된다. 상기 DNA 재조합 기술에는 예를 들면, 상기 pheA, trpR, mtr, tnaAB 를 코딩하는 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합 (homologous recombination)이 일어나게 함으로써 이루어질 수 있다. 또한, 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터에는 우성 선별 마커를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 불활성화된 pheA, trpR, mtr, tnaAB 유전자 또는 그의 DNA 단편이란, 숙주 내의 pheA, trpR, mtr, tnaAB 유전자와 서열 상동성을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하나, 절단 (truncation), 결 실(deletion), 치환(substitution), 삽입(insertion), 및 역위(inversion)와 같은 돌연변이가 도입되어 활성이 있는 pheA, trpR, mtr, tnaAB 유전자가 코딩하는 산물을 발현할 수 없는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 상기 불활성화된 pheA, trpR, mtr, tnaAB 유전자 또는 그의 DNA 단편을 숙주세포 내로 도입하는 과정은 예를 들면, 형질전환 (transformation), 접합 (conjugation), 형질도입 (transduction) 또는 전기천공 (electroporation)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

상기 불활성화된 pheA, trpR, mtr, tnaAB 유전자 또는 그의 DNA 단편이 형질전환에 의하여 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 불활성화 절차는 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 균주의 배양물과 혼합하여 수행할 수 있다. 이 경우, 균주는 천연적으로 DNA 유입에 대해 컴피턴트(competent) 하여 형질전환할 수 있으나, 사전에 균주를 적절한 방법에 의해 DNA 유입을 위해 컴피턴트하도록 만드는 것이 바람직하다 (LeBlanc 등, Plasmid 28, 130-145, 1992; Pozzi 등, J. Bacteriol. 178, 6087-6090, 1996 참조). 상동 재조합을 위하여 pheA, trpR, mtr, tnaAB 유전자의 단편은 게놈 DNA 내의 pheA, trpR, mtr, tnaAB 유전자 일부분을 제거하거나, 외래 DNA 조각을 도입하고, 이 서열의 야생형 염색체 카피를 불활성화 상태로 치환시킨다.

본 발명의 트립토판 생합성 관련 유전자를 강화하는 단계는 트립토판 생합성에 관련된 유전자를 변이시키는 것을 포함한다. 본 발명에 있어서, "변이"란 세포 내의 활성이 있는 aroG, trpE 유전자가 코딩하는 단백질의 활성이 대사산물저해에 의한 조절 해제가 감소되도록 변형되어 있는 것을 의미한다.

상기 aroG (NCBI gene ID: 16128722)(서열번호 38)는 방향족 아미노산 (트립토판, L-페닐알라닌, 타이로신)의 생합성 경로의 출발점이 되는 7P-2-디하이드로-3-데옥시 아라비노헵토오즈(7P-2-dehydro-3-deoxy-D-arabinoheptose)를 합성하는데 필요한 단백질을 코딩하는 유전자로 트립토판 생합성을 증가시키기 위해 변이가 필요한 것으로 판단되었다.

상기 trpE (NCBI gene ID: 16129225)(서열번호 39)는 안트라닐레이트(anthranilate)를 합성하는 단백질을 코딩하는 유전자로 트립토판 오페론을 구성하는 관련 유전자들 중 트립토판에 의해 저해를 받으므로, 이를 해제하기 위해 상기 유전자의 변이가 필요한 것으로 판단되었다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제작된 재조합 대장균 균주를 포도당이 함유된 발효배지에서 직접발효법으로 배양함으로써 고농도, 고수율의 L-트립토판을 생산하는 방법을 제공하는데 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1 : 트립토판 요구성이 해제된 균주의 제작

본 실시예에서는 트립토판에 대해 요구성이 있는 L-페닐알라닌 생산 균주의 염색체에 있는 트립토판 오페론 유전자를 야생주 형태로 복원하였다.

이를 위하여 P1 파지로 감염(infection)시킨 대장균 야생주의 용해물 (lysate)를 사용하였다. 우선 대장균을 LB (Lurina-Bertani. 이하 LB라 칭함. 배지조성: 박토 트립톤 10g/l, 박토 효모엑기스 5g/l, 염화나트륨 10g/l) 액체 배지에 한 백금이만큼 접종하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양한 균주를 모아서 LB-GMC (0.2% 글루코오스, 1mM 마그네슘 설페이트 (MgSO₄), 0.05mM 칼슘 클로라이드 (CaCl₂)) 액체 배지에 재현탁하여, P1 파지 2μl를 넣어서 감염시켰다. 37℃에서 약 30분 동안 배양한 후, 0.1M 구연산 나트륨 (Na-citrate)으로 잔존하는 P1 파지를 제거하기 위해 2번 세척하였다. 얻어진 균주는 최종적으로 0.1ml 구연산 나트륨에 재현탁한 뒤, 20mg/l의 타이로신 (tyrosine) 이 첨가된 M9 고체 최소배지에 도말하였다. 나온 콜로니는 트립토판을 넣지 않은 배지에서 자라는 것으로 트립토판 요구성이 해제된 것을 확인하였다. 제작된 균주는 CJ001(Trp⁺) 이라 명명하였다.

실시예 2 : pheA 가 불활성화된 재조합 L-트립토판 생산 균주의 제작

본 실시예에서는 대장균에서 pheA 유전자를 상동 재조합에 의하여 불활성화시켰다.

이를 위하여, Datsenko KA 등이 개발한 람다 레드 재조합효소 (lambda Red recombinase)를 이용한 1단계 불활성화 (one step inactivation) 방법을 사용하였다 (One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Datsenko KA, Wanner BL., Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun 6;97(12):6640-5). 유전자 내부로의 삽입을 확인하기 위한 마커로는 pKD3의 클로람페니콜(chloramphenicol) 유전자를 사용하였다. 상기 pheA 유전자의 일부분과 pKD3 유전자의 클로람페니콜 내성 유전자의 일부 염기서열을 갖는 표 1의 프라이머 1과 2를 이용하여 pKD3를 주형으로 하여 중합연속반응법(polymerase chain reaction, 이하 PCR법이라 칭함) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories]에 의해 약 1100 쌍의 유전자 단편을 증폭하였다. 이 때 사용한 반응액은 PCR HL 프리믹스 키트(PCR HL premix kit, BIONEER(사) 제품)이며, 변성(Denaturation) 94℃ 30초, 어닐링(Annealing) 55℃ 30초, 신장(Elongation) 72℃ 1분을 30회 반복 수행하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 얻었다.

프라이머 1	5'- aggcaacactatgacatcgtgtaggctggagctgcttc -3' (서열번호 1)
프라이머 2	5'- ggtcgccattaacaacgtggcatatgaatatcctccttag -3' (서열번호 2)

또한, 대장균 pheA 유전자의 5’ DNA 단편을 얻기 위하여 표2 의 프라이머 3과 4를 이용하여 대장균 W3110의 염색체를 주형으로 하여 PCR법에 의해 약 250 쌍의 유전자 단편을 증폭하였다. 이 때 사용한 반응액은 PCR HL 프리믹스 키트이며, 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 20초를 30회 반복 수행하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 얻었다.

프라이머 3	5'- tattgagtgtatcgccaac -3' (서열번호 3)
프라이머 4	5'- cgatgtcatagtgttgcc -3' (서열번호 4)

또한, 대장균 pheA 유전자의 3’ DNA 단편을 얻기 위하여 표 3의 프라이머 5과 6을 이용하여 대장균 W3110의 염색체를 주형으로 하여 PCR법에 의해 약 250 쌍의 유전자 단편을 증폭하였다. 이 때 사용한 반응액은 PCR HL 프리믹스 키트 이며, 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 20초를 30회 반복 수행하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 얻었다.

프라이머 5	5'- ccacgttgttaatggcgacc -3' (서열번호 5)
프라이머 6	5'- ttcattgaacgggtgatttc -3' (서열번호 6)

여기에서, 프라이머 1과 4의 18쌍의 염기서열이 상보적 (complementary) 이며, 프라이머 2와 5의 20 쌍이 상보적이기 때문에, 프라이머 1과 2를 이용하여 얻어진 단편, 프라이머 3과 4로 얻어진 단편, 프라이머 5와 6으로 얻어진 단편들은 하나의 단편으로 연결 될 수 있다. 얻어진 PCR 단편들을 프라이머 없이 5회 PCR법으로 증폭한 이 후 프라이머 3과 6를 첨가한 후 다시 25회 PCR법으로 증폭하였다. 그 결과 약 1600 염기쌍 크기의 유전자 단편을 증폭하였다.

Datsenko KA 등이 개발한 방법에 따라 pKD46으로 형질 전환된 대장균 CJ001을 컴피턴트 세포로 제작후, PCR로 얻어진 1600 염기쌍 크기의 유전자 단편을 유입하여 클로람페니콜이 함유된 (30mg/L) LB 고체배지에 도말하였다. 얻어진 균주는 다시 프라이머 3과 6을 이용한 PCR법으로 얻어진 크기가 1600 염기쌍으로 pheA가 불활성화 되었다는 것을 확인하였다. 제작된 균주는 CJ100 (Trp⁺ Δ pheA) 이라 명명하였다.

실시예 3 : trpR 이 불활성화된 재조합 L-트립토판 생산 균주의 제작

본 실시예에서는 대장균에서 trpR 유전자를 상동 재조합에 의하여 불활성화 시켰다.

상기 trpR 유전자의 일부분과 pKD3 유전자의 클로람페니콜 내성 유전자의 일부 염기서열을 갖는 표 4의 프라이머 7과 8를 이용하여 pKD3를 주형으로 하여 PCR법에 의해 약 1100 쌍의 유전자 단편을 증폭하였다. 이 때 사용한 반응액은 PCR HL 프리믹스 키트 이며, 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 1분을 30회 반복 수행하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 얻었다.

프라이머 7	5'- tccgcacgtttatgatatgctatcgtactctttagcgagtacaaccgggggtgtaggctggagctgcttc -3' (서열번호 7)
프라이머 8	5'- gccacgtcttatcaggcctacaaaatcaatcgcttttcagcaacacctctcatatgaatatcctccttag -3' (서열번호 8)

또한, 대장균 trpR 유전자의 5’ DNA 단편을 얻기 위하여 표 5의 프라이머 9과 10을 이용하여 대장균 W3110의 염색체를 주형으로 하여 PCR법에 의해 약 250 쌍의 유전자 단편을 증폭하였다. 이 때 사용한 반응액은 PCR HL 프리믹스 키트 이며, 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 20초를 30회 반복 수행하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 얻었다.

프라이머 9	5'- gcgccgggcgtatcgacgca -3' (서열번호 9)
프라이머 10	5'- gcatatcataaacgtgcgga -3' (서열번호 10)

또한, 대장균 trpR 유전자의 3’ DNA 단편을 얻기 위하여 표 6 의 프라이머 11과 12를 이용하여 대장균 W3110을 주형으로 하여 PCR법 에 의해 약 250 쌍의 유전자 단편을 증폭하였다. 이 때 사용한 반응액은 PCR HL 프리믹스 키트 이며, 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 20초를 30회 반복 수행하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 얻었다.

프라이머 11	5'- tgtaggcctgataagacgtg -3' (서열번호 11)
프라이머 12	5'- aaggggcgatcggcgtgttt -3' (서열번호 12)

여기에서, 프라이머 7과 10의 20 쌍의 염기서열이 상보적이며, 프라이머 8과 11의 20 쌍이 상보적이기 때문에, 프라이머 7과 8을 이용하여 얻어진 단편, 프라이머 9와 10으로 얻어진 단편, 프라이머 11과 12로 얻어진 단편들은 하나의 단편으로 연결 될 수 있다. 얻어진 PCR 단편들을 프라이머 없이 5회 PCR법으로 증폭한 이 후 프라이머 9와 12를 첨가한 후 다시 25회 연쇄 증폭하였다. 그 결과 약 1600 염기쌍 크기의 유전자 단편을 증폭하였다.

Datsenko KA 등이 개발한 방법에 따라 pKD46으로 형질 전환된 대장균 CJ100를 컴피턴트 상태로 제조하고, PCR법으로 제조된 1600 염기 쌍 크기의 유전자 단편을 유입하여 클로람페니콜이 함유된 LB 고체배지에 도말하였다.

얻어진 균주는 다시 프라이머 9와 12를 이용한 PCR법으로 얻어진 크기가 1600 염기쌍으로 trpR 이 불활성화 되었다는 것을 확인하였다. 제작된 균주는 CJ200 (Trp⁺ Δ pheA Δ trpR) 이라 명명하였다.

실시예 4 : mtr 이 불활성화된 재조합 L-트립토판 생산 균주의 제작

본 실시예에서는 대장균에서 mtr 유전자를 상동 재조합에 의하여 불활성시켰다.

상기 mtr 유전자의 일부분과 pKD3 유전자의 클로람페니콜 내성 유전자의 일부 염기서열을 갖는 표 7의 프라이머 13과 14를 이 이용하여 pKD3를 주형으로 하여 PCR법에 의해 약 1100 쌍의 유전자 단편을 증폭하였다. 이 때 사용한 반응액은 PCR HL 프리믹스 키트 이며, 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 1분을 30회 반복 수행하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 얻었다.

프라이머 13	5'- atggcaacactaaccaccacccaaacgtcaccgtcgctgcttggcggcgtgtgtaggctggagctgcttc -3' (서열번호 13)
프라이머 14	5'- ttactgatacaccggcagtaaattaaagctcgataaaatatgcaccagtgcatatgaatatcctccttag -3' (서열번호 14)

또한, 대장균 mtr 유전자의 5' DNA 단편을 얻기 위하여 표 8의 프라이머 15와 16을 이용하여 대장균 W3110을 주형으로 하여 PCR법에 의해 약 500 쌍의 유전자 단편을 증폭하였다. 이 때 사용한 반응액은 PCR HL 프리믹스 키트 이며, 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 30초를 30회 반복 수행하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 얻었다.

프라이머 15	5'- gcagccgttacattggtaac -3' (서열번호 15)
프라이머 16	5'- gtggtggttagtgttgccat -3' (서열번호 16)

또한, 대장균 mtr 유전자의 3' DNA 단편을 얻기 위하여 표 9의 프라이머 17과 18을 이용하여 대장균 W3110을 주형으로 하여 PCR법에 의해 약 500 쌍의 유전자 단편을 증폭하였다. 이 때 사용한 반응액은 PCR HL 프리믹스 키트 이며, 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 30초를 30회 반복 수행하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 얻었다.

프라이머 17	5'- tactgccggtgtatcagtaa -3' (서열번호 17)
프라이머 18	5'- tcaaaccgtcagcacggctg -3'(서열번호 18)

여기에서, 프라이머 13과 16의 20 쌍의 염기서열이 상보적이며, 프라이머 14와 17의 20 쌍이 상보적이기 때문에, 프라이머 13과 14를 이용하여 얻어진 단편, 프라이머 15와 16으로 얻어진 단편, 프라이머 17과 18로 얻어진 단편들은 하나의 단편으로 연결 될 수 있다. 얻어진 PCR 단편들을 프라이머 없이 5회 PCR법으로 증폭한 이 후 프라이머 15와 18을 첨가한 후 다시 25회 연쇄 증폭하였다. 그 결과 약 2100 염기쌍 크기의 유전자 단편을 증폭하였다.

Datsenko KA 등이 개발한 방법에 따라 pKD46으로 형질 전환된 대장균 CJ200를 컴피턴트 상태로 제조하여, PCR로 얻어진 2100 염기쌍 크기의 유전자 단편을 유입하여 클로람페니콜이 함유된 LB 고체배지에 도말하였다.

얻어진 균주는 다시 프라이머 15와 18을 이용한 PCR법으로 얻어진 크기가 2100 염기쌍으로 mtr 이 불활성화 되었다는 것을 확인하였다. 제작된 균주는 CJ300 (Trp⁺ ΔpheAΔtrpRΔmtr) 이라 명명하였다.

실시예 5 : tnaAB 가 불활성화된 재조합 L-트립토판 생산 균주의 제작

본 실시예에서는 대장균에서 tnaAB 유전자를 상동 재조합에 의하여 불활성화시켰다.

상기 tnaAB 유전자의 일부분과 pKD3 유전자의 클로람페니콜 내성 유전자의 일부 염기서열을 갖는 표 10의 프라이머 19와 20을 이용하여 pKD3를 주형으로 하여 PCR법에 의해 약 1100 쌍의 유전자 단편을 증폭하였다. 이 때 사용한 반응액은 PCR HL 프리믹스 키트 이며, 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 1분을 30회 반복 수행하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 얻었다.

프라이머 19	5'- atgaaggattatgtaatggaaaactttaaacatctccctgaaccgttccggtgtaggctggagctgcttc-3' (서열번호 19)
프라이머 20	5'- ttagccaaatttaggtaacacgttaaagacgttgccgaaccagcacaaaacatatgaatatcctccttag -3' (서열번호 20)

Datsenko KA 등이 개발한 방법에 따라 pKD46으로 형질 전환된 L-트립토판 생산 대장균 CJ300을 컴피턴트 상태로 제조하고, PCR로 얻어진 1100 염기쌍 크기의 유전자 단편을 유입하여 클로람페니콜이 함유된 LB 고체배지에 도말하였다. 얻어진 균주는 다시 프라이머 21과 22를 이용한 PCR법으로 얻어진 크기가 1900 염기쌍으로 tnaAB이 불활성화 되었다는 것을 확인하였다. 제작된 균주는 CJ400 (Trp⁺ Δ pheA ΔtrpRΔmtrΔtnaAB) 라 명명하였다.

프라이머 21	5'- ttaagcgaaatcaccggggaa -3' (서열번호 21)
프라이머 22	5'- atgtccgagcactggcgc -3' (서열번호 22)

실시예 6 : 염색체의 특정 유전자에 돌연변이를 유발하는 pSKH 벡터 제작

본 실시 예에서는 대장균 염색체내에 특정 유전자의 돌연변이를 유발시킬 수 있는 벡터를 제작하였다.

이를 위하여 대한민국 특허공고 10-2006-0079297에서 사용한 pKCG119 벡터를 바탕으로 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)의 sacB 유전자를 삽입하여 사용하였다. 외부 유전자의 도입 없이 원하는 유전자의 돌연변이가 일어난 균주를 선별하기 위해서 sacB 유전자를 사용하였다.

sacB (1.9 kb) 유전자는 바실러스 서브틸리스 야생균주 (Marburg168)의 염색체를 주형으로 프라이머 23과 24를 사용하여 PCR법에 의해 증폭하였다. (Molecular organization of intrinsic restriction and modification genes BsuM of Bacillus subtilis Marburg, Ohshima H, Matsuoka S, Asai K, Sadaie Y. J Bacteriol. 2002 Jan;184(2):381-9) 이 때 사용한 반응액은 PCR HL 프리믹스 키트 이며, 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 2분을 30회 반복 수행하였다.

프라이머 23	5'- tgctctagagatcctttttaacccatcacatat -3' (서열번호 23)
프라이머 24	5'- cgcggatcctcgtgatggcaggttgggcgtcgc -3' (서열번호 24)

이 PCR 결과물을 제한효소 XbaⅠ, BamHⅠ 으로 처리한 후 0.8% 아가로스 겔에서 용리하여 1.9kb 정도의 DNA 단편을 얻었으며, 얻어진 단편과 Xba I, BamH I으로 제한효소 처리된 pKCG119 벡터와 접합하였다 (NEB Ligation Kit). 접합 혼합액 (ligation mixture) 은 대장균 Top10 세포로 형질 전환 후 카나마이신 (kanamycin) 이 든 (50mg/L) LB고체배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다.

콜로니를 투쓰픽 (toothpick) 하여 카나마이신이 든 LB액체배지 3mL에 접종하여 밤새 배양 후 플라스미드 미니프랩키트로 플라스미드 DNA를 회수하여 변이된 sacB 염기 서열을 DNA 시퀀싱을 통하여 확인하였다. 제작된 벡터는 pSKH라 명명하였다.

실시예 7 : aroG 가 변이된 재조합 L-트립토판 생산 균주의 제작

본 실시예에서는 대장균에서 aroG 유전자를 변이시켰다.

QIAGEN(사) 제품의 지노믹 팁(Genomic-tip) 시스템을 이용하여 트립토판 균주로부터 염색체 DNA를 추출하였고, 이 염색체 DNA를 주형으로 PCR법을 이용하여 aroG의 ORF를 포함하는 DNA 단편 660bp를 표 13의 프라이머 25와 26을 이용하여 증폭하였다. 이 때 사용한 반응액은 PCR HL 프리믹스 키트 이며, 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 30초를 30회 반복 수행하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 얻었다.

프라이머 25	5'- cgcggatccgaaaagcgatccataagatat -3' (서열번호 25)
프라이머 26	5'- cgcgtcgactgctggcaggcctgctttgtt -3' (서열번호 26)

PCR법으로 얻어진 aroG 유전자 단편을 TA 클로닝 키트 (Invitrogen사 제품)를 이용하여 pCR2.1-TOPO 벡터에 접합 (ligation) 후 대장균 Top10 세포로 형질전환 시키고, 암피실린(Ampicillin) 이 함유된 (100mg/L) LB 고체배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 제작된 백터는 TOPO2.1-aroG라 명명하였다.

콜로니를 투쓰픽하여 암피실린이 든 LB액체배지 3mL에 접종하여 밤새 배양 후 플라스미드 미니프랩키트 (QIAGEN사 제품)로 플라스미드 DNA를 회수하여 TOPO2.1-aroG의 크기를 확인하였다. aroG 유전자의 변이형을 만들고자 TOPO2.1-aroG 벡터를 주형으로 표 14의 프라이머 27과 28을 이용하여 특정부위변이 (site directed mutation) (QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit, STRATAGENE사 제품)를 수행하였다. 이 때 사용한 반응 조건은 변성 95℃ 30초, 어닐링 55℃ 1분, 신장 68℃ 6분 30초를 18회 반복 수행하여 각 반응액의 12μL를 대장균 Top10 세포로 형질전환 시키고, 암피실린이 함유된 LB고체배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 제작된 벡터는 TOPO2.1-maroG로 명명하였다.

프라이머 27	5'-cgatatgatcaccctacaatatctcgctga -3' (서열번호 27)
프라이머 28	5'-tcagcgagatattgtagggtgatcatatcg-3' (서열번호 28)

콜로니를 투쓰픽하여 암피실린이 든 LB액체배지 3mL에 접종하여 밤새 배양 후 플라스미드 미니프랩 키트로 플라스미드 DNA를 회수하여 변이된 aroG 염기 서열을 DNA 시퀀싱을 통하여 확인하였다. 변이 aroG 유전자를 함유한 TOPO2.1-maroG 플라스미드를 제한효소 BamHⅠ, SalⅠ 으로 처리한 후 0.8% 아가로스 겔에서 용리하여 660bp 정도의 DNA 단편을 얻었으며, 얻어진 단편과 BamH I, Sal I으로 제한효소 처리된 pSKH 벡터와 접합하였다. 접합 혼합액은 대장균 Top10 세포로 형질 전환 후 카나마이신이 든 LB고체배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 제작된 벡터를 pSKH-maroG라 명명하였다.

콜로니를 투쓰픽하여 카나마이신이 든 LB액체배지 3mL에 접종하여 밤새 배양 후 플라스미드 미니프랩 키트로 플라스미드 DNA를 회수하여, 상기 pSKH-maroG의 크기를 확인하였다. NheⅠ으로 제한효소 처리를 하여 대장균 기원 (origin) 을 제거한 뒤 다시 접합한 후 형질전환용 세포상태로 제조된 CJ400으로 유입하여 카나마이신이 든 LB고체배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 생성된 콜로니를 프라이머 25, 26번을 이용하여 PCR법을 수행하여 4.4Kb 정도의 밴드를 확인하였고, 이를 통하여 변이 aroG를 포함한 pSKH 벡터가 염색체 DNA 상으로 도입되었음을 확인하였다. 염색체 DNA 상으로 도입된 벡터의 변이 aroG를 제외한 부분을 제거하기 위하여 균주를 LB + 10% 슈크로스 (sucrose) 배지에서 16시간 정도 키운 뒤 LB 평판배지에 도말하였다. 생성된 군락을 카나마이신을 함유한 고체배지와 함유하지 않은 고체배지에서 동시에 배양하여 항생제가 없는 배지에서만 자라는 군락을 선별하였고, 이 균주를 DNA 시퀀싱을 통하여 aroG 유전자의 150번째 아미노산이 루이신으로 변이가 일어난 균주를 최종적으로 선별하였다. 제작된 균주는 CJ500 (Trp⁺ Δ pheA ΔtrpRΔmtrΔtnaAB aroG ^m ) 라 명명하였다.

실시예 8 : trpE 가 변이된 재조합 L-트립토판 생산 균주의 제작

본 실시예 에서는 대장균에서 trpE 유전자를 변이시켰다.

QIAGEN 지노믹 팁 시스템을 이용하여 트립토판 균주로부터 염색체 DNA를 추출하였고, 이 염색체 DNA를 주형으로 PCR법을 이용하여 trpE의 ORF의 일부를 포함하는 DNA 단편 600bp를 증폭하였다. 이때 사용한 프라이머는 표 15의 프라이머 29와 30이며, 사용한 반응액은 PCR HL 프리믹스 키트이며 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 30초이며 30회 반복 수행하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 얻었다.

프라이머 29	5'- cgcggatccaccgtggaaatttccacgccg -3' (서열번호 29)
프라이머 30	5'- cgcgtcgactttccgctgacagttgcggta -3' (서열번호 30)

PCR법으로 얻어진 trpE 유전자 단편을 TA 클로닝 키트를 이용하여 pCR2.1-TOPO 벡터에 접합 후 대장균 Top10 세포로 형질전환 시키고, 암피실린이 든 LB고체배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 제조된 벡터를 TOPO2.1-trpE라 명명하였다.

콜로니를 투쓰픽하여 암피실린이 든 LB액체배지 3mL에 접종하여 밤새 배양 후 플라스미드 미니프랩키트로 플라스미드 DNA를 회수하여 상기 TOPO2.1-trpE의 크기를 확인하였다. trpE 유전자의 변이형을 만들고자 TOPO2.1-trpE 벡터를 주형으로 표 16의 프라이머 31과 32을 이용하여 특정부위 변이를 수행하였다. 반응 조건은 변성 95℃ 30초, 어닐링 55℃ 1분, 신장 68℃ 6분 30초를 18회 반복 수행하여 각 반응액의 12?L를 대장균 Top10 세포로 형질전환 시키고, 암피실린이 든 LB고체배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 제조된 벡터를 TOPO2.1-mtrpE라 명명하였다.

프라이머 31	5'- gcttatcgcgacaatgccaccgcgctttttcac -3' (서열번호 31)
프라이머 32	5'- gtgaaaaagcgcggtggcattgtcgcgataagc-3' (서열번호 32)

콜로니를 투쓰픽하여 암피실린이 든 LB액체배지 3mL에 접종하여 밤새 배양 후 플라스미드 미니프랩 키트로 플라스미드 DNA를 회수하여 변이 trpE 염기 서열을 DNA 시퀀싱을 통하여 확인하였다. 변이 trpE 유전자를 함유한 TOPO2.1-mtrpE 플라스미드를 제한효소 BamHⅠ, SalⅠ 으로 처리한 후 0.8% 아가로스 겔에서 용리하여 660bp 정도의 DNA 단편을 얻었으며, 얻어진 단편과 BamH I, Sal I으로 제한효소 처리된 pSKH 벡터와 접합하였다. 접합 혼합액은 대장균 Top10 세포로 형질 전환 후 카나마이신이 든 LB고체배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 제작된 벡터는 pSKH-mtrpE로 명명하였다.

콜로니를 카나마이신이 든 LB액체배지 3mL에 접종하여 밤새 배양 후 플라스미드 미니프랩키트로 플라스미드 DNA를 회수하여 pSKH-mtrpE의 크기를 확인하였다. NheⅠ으로 제한효소 처리를 하여 대장균 기원을 제거한 뒤 다시 접합 후 형질전환용 세포상태로 제조된 CJ500으로 유입하여 카나마이신이 든 LB고체배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 생성된 콜로니를 프라이머 27과 28번을 이용하여 PCR법을 수행하여 4.4Kb 정도의 밴드를 확인하였고, 이를 통하여 변이 trpE를 포함한 pSKH 벡터가 염색체 DNA 상으로 도입되었음을 확인하였다. 염색체 DNA 상으로 도입된 벡터의 변이 trpE를 제외한 부분을 제거하기 위하여 균주를 LB + 10% 슈크로스 배지에서 16시간 정도 키운 뒤 LB 평판배지에 도말하였다. 생성된 콜로니를 카나마이신을 함유한 고체배지와 함유하지 않은 고체배지에 동시에 배양하여 항생제가 없는 배지에서만 자라는 콜로니를 선별하였고, 이 균주를 DNA 시퀀싱을 통하여 trpE 유전자의 21번째 아미노산이 알라닌으로 변이가 일어난 균주를 최종적으로 선별하였다. 제작된 균주를 대장균 CJ600 (Trp⁺ Δ pheA Δ trpR ΔmtrΔ tnaAB aroG ^m trpE ^m )라 명명하였으며, 그를 2006년 12월 8일자로 일자로 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제 1동 361-221번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM 10812P로 기탁하였다.

실시예 9 : 유전자 재조합에 의해 제작된 미생물의 트립토판 생산능 비교

본 실시예에서는 실시예 1에서 6 까지 제작된 재조합 균주 CJ001, CJ100, CJ200, CJ300, CJ400, CJ500, CJ600(KCCM 10812P)의 콜로니를 백금이를 이용하여 LB 고체 배지에서 밤새 배양한 후, 성장한 균주들을 표 17에서와 같은 조성을 갖는 플라스크 역가 배지에 한 백금이 씩 접종하였다. 균주 접종 후 37℃, 200rpm에서 48시간 동안 배양하고, 그로부터 얻어진 트립토판 및 L-페닐알라닌 농도와 L-페닐알라닌 생산 대장균 변이주 KFCC 10066에서 얻어진 트립토판 및 L-페닐알라닌의 농도를 비교하였다. 얻어진 세포 현탁도 (optical density, OD라 칭함), L-트립토판 농도 및 L-페닐알라닌 농도는 3개의 플라스크 실험결과의 평균값을 사용하였다.

조성	농도(g/L)
글루코오스 (glucose)	60
효모 추출물 (yeast extract)	2.5
암모늄 설페이트 [(NH₄)₂SO₄ ^.7H₂O]	20
마그네슘 설페이트 (MgSO₄)	1
구연산 나트륨 (Na-citrate)	5
소디움 클로라이드 (NaCl)	1
타이로신 (L-tyrosine)	0.1
L-페닐알라닌 (L-phenylalanine)	0.15
칼슘 카르보네이트 (CaCO₃)	40
포타슘 디히드로겐포스페이트 (KH₂PO₄)	2

그 결과, 표 18와 같이 L-트립토판이 L-페닐알라닌 생산 대장균 변이주 KFCC 10066 에서는 생산되지 않는 반면, 본 발명에서 개발된 대장균 CJ600(KCCM 10812P) 의 경우 6.5g/L 가 생산되었음을 확인하였다.

균주명	세포 OD (562nm)	L-트립토판(g/L)	L-페닐알라닌 (g/l)
KFCC 10066	15.2	0.0	9.1
CJ001	17.6	0.0	3.5
CJ100	16.1	0.1	0
CJ200	16.3	0.3	0
CJ300	16.8	0.3	0
CJ400	16.4	0.3	0
CJ500	16.3	0.4	0
CJ600	13.5	6.5	0

L-페닐알라닌 생산 대장균 변이주로부터 트립토판 요구성을 해제시키고 여러 유전자를 불활성화 시키거나 변이시킴으로써 단기간 내에 L-페닐알라닌은 생성하지 않으면서 고농도의 트립토판을 생산하는 재조합 대장균 CJ600 균주를 개발하였다. 구체적으로는 L-페닐알라닌을 생산하는 대장균 변이주 KFCC 10066에서 염색체상 트립토판 요구성 해제, pheA, trpR, mtr, tnaAB 유전자의 불활성화, 및 aroG, trpE 가 변이된 재조합 대장균 CJ600 균주(KCCM 10812P)를 제조하고, 이의 배양을 통해 L-트립토판을 고농도로 생산하여 그 생산성을 증가시킬 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

L-페닐알라닌 생산능을 갖는 대장균 변이주(KFCC 10066)로부터 염색체상의 트립토판 요구성이 해제되고, 불활성화된 pheA, trpR, mtr, tnaAB 유전자 및 변이된 aroG, trpE 유전자를 갖는 것을 특징으로 하는 L-트립토판 생산능을 갖는 재조합 대장균 CJ600(KCCM 10812P).
L-트립토판 생산능을 갖는 재조합 대장균의 제조방법으로서,

상기 유전자 조작이 염색체상 트립토판 요구성을 해제하는 단계;

pheA, trpR, mtr, tnaAB 유전자를 불활성화시켜 L-페닐알라닌의 생합성을 차단하는 단계; 및

aroG, trpE 유전자를 변이시켜 L-트립토판 생합성 관련 유전자를 강화하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 따라 제조된 재조합 대장균을 사용함을 특징으로 하는 L-트립토판의 제조방법.