KR100694389B1 - 표적 유전자 변형 원핵 세포 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 코리네박테리아 복제 원점(replication origin), 선별마커 및 표적 유전자에 상동인 서열을 포함하는 표적 유전자 변형 벡터를 이용하여 게놈의 유전자가 변형된 원핵세포, 바람직하게는 코리네박테리움을 생산하는 방법을 제공한다.

코리네박테리아, 게놈 변형, 변형 효율

Description

표적 유전자 변형 원핵 세포 생산 방법{Method for producing prokaryotic cell with modified target genes}

도 1은 pKCG119 벡터의 제작과정을 도시한 도면이다.

도 2는 pKCG119-tkt 벡터의 제작과정을 도시한 도면이다.

도 3은 플라스미드 pKCG119-tkt에서 항생제와 tkt 유전자의 일부를 제외한 나머지의 제거된 원형 DNA 단편 제조과정을 도시한 도면이다.

도 4는 CJHB100의 염색체 상의 tkt의 유전자 불활성화를 도시한 도면이다.

도 5는 pKCG119-pfk 벡터의 제작과정을 도시한 도면이다.

도 6은 플라스미드 pKCG119-pfk에서 항생제와 pfk 유전자의 일부를 제외한 나머지의 제거된 원형 DNA 단편 제조과정을 도시한 도면이다.

도 7은 CJHB100의 염색체 상의 pfk의 유전자 불활성화를 도시한 도면이다.

본 발명은 코리네박테리아 복제 원점(replication origin), 선별마커 및 표 적 유전자에 상동인 서열을 포함하는 표적 유전자 변형 벡터를 이용하여 표적 유전자 변형된 원핵세포, 바람직하게는 코리네박테리움을 생산하는 방법에 관한 것이다.

코리네박테리아는 그람 양성의 박테리아로서, IMP 및 GMP를 포함한 대사 산물의 산업적 생산에 널리 사용되고 있다. 코리네형 세균의 게놈의 특정 유전자를 불활성화 하거나, 염색체상의 유전자나 특정 서열을 효율적으로 변환함으로써, 대사 산물을 보다 높은 효율로 생산할 수 있는 균주를 제조할 수 있다.

게놈상의 특정 유전자를 변형하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 대장균(E.coli)의 경우, 상동부위를 포함하는 선형 DNA를 도입하여 재조합을 통해서 불활성화하는 방법, Cre/loxP를 이용하는 방법 등 다양한 방법들이 이용되고 있다.

코리네박테리아의 게놈은 코리네박테리아에서 복제될 수 없는 벡터를 이용하여 변형 가능하다. 대한민국 특허공개번호 2003-0074597에는 벡터 핵산이 코리네박테리아에서 외부 물질로 인식되지 않는 벡터를 사용하여 코리네박테리아의 게놈 서열을 변형시키는 방법에 대하여 기술하고 있다. 코리네박테리아 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)의 메틸트랜스퍼라제, 특히 cglIM 유전자를 적당한 대장균 균주(예를 들어, NM-522 또는 HB101과 같은 Mcr-BC-결핍성 균주)에서 플라스미드상의 게놈 카피로 발현 시킨 후, 이 대장균 균주에 변형을 원하는 유전자 서열을 포함하고 코리네박테리아 글루타미쿰에서 복제가 되지 않는 벡터, 예를 들어 pSL18 유도체를 전기장충격법(electrophoration)으로 도입하는 방법이다. cglIM 메틸화 패턴을 보유하는 pSL18 유도체는 전기장충격법으로 코리네박테리아 글루타미쿰에 도입되어 게놈의 변형을 유도하게 된다. 씨. 글루타미늄 (C. glutamicum)의 경우 바실러스 서브틸러스 (Bacillus subtilus)의 레반수크라제 (levansucrase) 유전자(sacB)를 포함하는 벡터, 예를 들면 pK*mobsacB가 알려져 있다(Gene, 145(1994) 69-73). pK*mobsacB는 대장균에서 복제가 가능하며 mob 유전자를 통하여 대장균에서 코리네박테리아로 이종접합 (transconjugation)에 의하여 전달될 수 있는 벡터이다. 하지만, pK*mobsacB의 항생제 마커가 젠타마이신으로 변형된 pBSG(KFCC-10532)를 이용하여 씨. 암모니아게스 (C. ammoniagenes)의 게놈을 변형시, DNA의 대장균 특이적 메틸화로 인해 코리네형 세균이 외래 DNA로 인지하여 도입을 방해하거나 도입된 플라스미드를 제거하므로(이하 도입방해), 유전자 변형 효율이 매우 낮다. 일부 경우에, 플라스미드에 특정 인지를 하지 않아 코리네형 세균의 상기 도입방해 기작이 작용하지 않게 한다는 대장균 GM2929을 이용하기도 하였으나, 대장균 복제 원점을 가진 플라스미드를 이용하기 때문에 대장균을 이용해야 하며, 효율 또한 높지 않다. 따라서, 상기한 종래 기술보다 간단하고 효율이 높은 코리네박테리아의 유전자 변형 방법이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 코리네박테리아와 다른 원핵세포인 대장균을 거치치 않고 코리네박테리아 유래의 특정한 유전자의 변형 방법을 연구하던 중, 코리네박테리아의 복제 원점 (replication origin)이 있는 플라스미드를 이용하여, 선별마커 및 표적 유전자의 상동재조합을 유도하기 위한 서열을 나란히 포함하도록 벡터를 제작하고, 코리네박테리아 등의 원핵 세포로 형질전환시켰을 경우, 간단하고 높은 효율로 표적 유전자의 변형을 유도할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은, 코리네박테리아 복제 원점 (replication origin), 선별마커 및 표적 유전자에 상동인 서열을 포함하는 표적 유전자 변형 벡터를 준비하는 단계; 상기 벡터에서 복제 원점을 제거하고 원형으로 연결하는 단계; 상기 벡터로 원핵 세포를 형질전환시키는 단계; 상기 형질전환체를 선별마커를 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및 상동 재조합에 의하여 표적 유전자가 변형된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 표적 유전자 변형된 원핵세포 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법으로 생산된 표적 유전자 변형된 원핵세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 서열번호 1로 기재되는 pKCG119 벡터를 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은, 코리네박테리아 복제 원점 (replication origin), 선별마커 및 표적 유전자에 상동인 서열을 포함하는 표적 유전자 변형 벡터를 준비하는 단계; 상기 벡터에서 복제 원점을 제거하고 원형으로 연결하는 단 계; 상기 벡터로 원핵 세포를 형질전환시키는 단계; 상기 형질전환체를 선별마커를 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및 상동 재조합에 의하여 표적 유전자가 변형된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 표적 유전자 변형된 원핵세포 생산 방법에 관한 것이다.

상기 벡터는, 게놈상의 표적 유전자와 상동 재조합을 유도할 수 있는 표적 유전자에 상동인 서열을 가지므로, 표적 유전자 특이적으로 다양한 변형을 가할 수 있는 벡터임을 특징으로 한다.

본 발명에서, “상동(homologous)”이란 게놈상의 표적 유전자를 코딩하는 핵산 서열과의 동일성 정도를 나타내는 것으로, 90% 이상 동일하고, 바람직하게는 95% 이상 동일하다.   

표적 유전자는, 벡터를 이용하여 변형을 유도하고자 하는 숙주세포가 가지는 유전자를 의미하고, 트랜스케토라제 (tkt: transketolase), 포스포프럭토키나제 (pfk: phosphofructokinase), 말레이트 디하이드로게나제 (mdh: malate dehydrogenase) 등이 있으나, 특별히 한정되지 않는다.

본 발명에서, “표적 유전자 변형”은 표적 유전자 내로 천연의 핵산 서열과 상이한 서열로의 변이를 유도하는 것을 의미하고, 보다 구체적으로는, 유전자 또는 유전자 일부분을 게놈으로부터 제거, 게놈상의 핵산 서열을 치환, 외래 유전자 삽입, 또는 이들의 조합으로 이루어지는 다양한 서열 변이를 포함한다. 이런 유전자 변이를 통하여 표적 유전자의 활성을 증대시키거나 불활성화시킬 수 있다. 표적 유전자의 불활성화는, 표적 유전자내로 벡터내의 유전자, 예를 들어 선별마커 영역 이 표적 유전자내로 삽입되어 통합됨으로써 게놈상의 목적 유전자를 간단하게 불활성화시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 벡터는 선별마커를 포함한다. 선별마커는 세포로 유전자 타겟팅 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제 (selective agent)가 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포를 선별 가능하다. 이런 마커에는, 카나마이신, 젠타마이신, 하이포잔틴 내성 마커 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 벡터와 게놈상의 유전자가 상동재조합이 일어날 때, 선별마커가 표적 유전자내로 통합되므로 특정 유전자의 발현을 불활성화 (knock-out) 시킬수 있다.

또한 본 발명의 벡터 다중 클로닝 부위 (MCS; multiple cloning sites)는 일반적 유전자 재조합 기술을 이용하여 다양하게 변환 가능하다.

본 발명의 구체적인 양태에서는, 코리네박테리아 복제 원점을 가지는 pKCG119 벡터를 사용하였다. pKCG119 벡터는 pECCG117(한국 특허: 1992-007401) 벡터의 MCS로 SalⅠ, NheⅠ, sphⅠ의 MCS를 가지는 서열을 약 40bp의 서열을 추가한 벡터이다(도1). pKCG119 벡터내로 코리네박테리아 내의 오탄당 포스페이드 경로(Pentose phosphate pathway)에 관여하는 유전자인 tkt 또는 중앙대사경로의 유전자인 pfk에 상동인 서열을 삽입하여 tkt 또는 pfk 표적 유적자 변형 벡터를 제조하였다.

상기 벡터로부터 복제 원점을 제거한 후 원형(circular form)으로 연결한 형태의 벡터를 원핵세포 내로 형질전환 한다. 선별마커 및 상동재조합을 위한 서열만을 포함하는 원형의 벡터와 게놈상의 서열간에 상동 재조합이 일어나면 벡터상의 선별마커를 코딩하는 핵산이 원핵세포의 표적 유전자로 통합(intergration) 되어, 원핵세포의 표적 유전자의 발현은 차단되게 된다. 숙주세포로 벡터, 보다 구체적으로는 복제 원점을 제거한 선형의 벡터를 통상적인 방법으로 분리하여 원형으로 제조한 벡터를 형질전한 시키는 방법은 핵산을 숙주세포내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있으나 전기장충격법(electroporation)이 가장 바람직하다.

상기 벡터로 형질전환되는 숙주세포는 원핵세포로, 에스케리키아 (Escherichia), 브레비박테리움 (Brevibacterium), 코리네박테리움 (Corynebacterium) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는, 코리네박테리움이다.

형질전환체의 배양은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.  배양에 사용되는 배지는 일반적으로 세포의 성장과 생존에 필수적인 모든 영양소와 미생물 변이주 선별마커인 항생제를 포함하는 배지이다. 상기 벡터로 형질전환되어 항생제 내성을 보이는 변이주 중에서 게놈내로 유전자가 삽입되어 표적 유전자가 변형된 세포는 PCR을 통하여 확인 할 수 있다. 그리고, 표적 유전자의 불활성화로 인해 영양요구성화 될 경우에는 고체 배양을 통해서 확인할 수도 있다.

상기 코리네박테리아 복제 원점을 가지고 상동재조합을 유도하는 벡터를 이용해서, 코리네박테리아의 게놈을 변형시키는 방법은, 기존의 대장균 등의 공급 균주를 이용하는 방법에 비하여 공정이 간단하며, 대장균 특이적 메틸화에 의해서 코리네박테리아에서 외부 물질로 인식되어 절단되지 않으므로 효율이 대단히 높다. 상기 벡터를 이용해서 코리네박테리움 뿐만 아니라, 에스케리키아, 브레비박테리움 등의 다양한 원핵세포의 게놈상의 유전자를 효율적으로 변형시킬 수 있다. 본 발명의 구체적인 양태에서 사용한 벡터는 원핵세포, 특히 코리네박테리아의 게놈상의 유전자를 효율적으로 변형할 수 있도록 최적화된 벡터이다. 실제로, 본 발명의 코리네 박테리아 복제 원점을 가지는 표적 유전자 변형 벡터, pKCG119-tkt 또는 pKCG119-pfk 는 표적 유전자내로 상동 재조합을 유도하여 게놈상의 표적 유전자와 안정적으로 통합되는 효율이 pBSG-tkt 또는 pBSG-pfk에 비하여 300배 이상 높았다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 생산된 표적 유전자 변형된 원핵세포에 관한 것이다.

상기 방법으로, 특정 유전자를 불활성화 하거나, 염색체상의 유전자나 특정 서열을 효율적으로 변환함으로써, 특정 대사 산물에 대한 생산 효율성이 증가한는 원핵세포, 특히 코리네박테리아를 생산할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 pKCG119 벡터(수탁번호 KCCM 10618)에 관한 것이다.

pKCG119 벡터는 pECCG117(한국 특허 공고번호: 1992-007401) 벡터 유래의 벡터이다. pECCG117은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13058로부터 분리한 크립틱 플라스미드(cryptic plasmid) pCB1과 대장균 ATCC37031로부터 분리한 pACYC117를 접합시켜 제조한 복합 플라스미드 pECCG1에서 코리네형 세균에서 앰피실린 마커 유전자에 해당하는 부위와 pCB1에서 복제에 관련되지 않는 부위를 제거한 벡터로, 대장균 및 코리네박테리아에서 안정적으로 발현되는 벡터이다. pKCG119 벡터는 코리네박테리아 복제 원점 부분을 제거 할 수 있도록, pECCG117의 MCS에 NheⅠ, sphⅠ등의 서열을 도입한 벡터로, 서열번호 1로 기재되는 핵산서열을 가진다.

pECCG117 벡터의 MCS에 추가될 DNA 단편은 상부 (upper strand)과 하부 가닥 (down strand) 각각을 프라이머로 합성한 뒤, 어닐링하여 이중가닥으로 만들고, 이를 EcoRV와 SalI으로 절제된 pECCG117와 연결시켜서 대장균에 전기충격법으로 형질전환시켜서 클로닝 된 벡터를 분리하였다. 이런 과정으로 얻은, 새로운 MCS를 포함하는 pECCG117 벡터를 pKCG119라고 명명하였고(수탁번호 KCCM 10618), 상기 벡터는 본 발명의 목적에 적합하게, 코리네박테리아의 다양한 표적 유전자 변이 유도에 효율적으로 사용될 수 있는 벡터이다. 본 발명의 구체적인 양태에서는, pKCG119 벡터를 이용하여 트랜스케토라제 변이 벡터 pKCG119-tkt와 포스포프럭토키나제 변형 벡터 pKCG119-pfk를 제조하였다.

다음의 실시예에서 본 발명을 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명이 이들 실시예에만 국한되는 것은 아니다.

실시예 1 - 재조합 플라스미드 pKCG119의 제작

도 1은 pKCG119 벡터의 제조과정을 나타낸 것으로, pKG119 벡터는 pECCG117 의 MCS가 변형되어 제한효소 EcoRV 부위부터 SalI 부위가 제거되고, 상기 두 제한효소 사이에 새로운 제한효소 SalI, NheI, SphI 부위가 순서대로 삽입이 되었다. 따라서 플라스미드 벡터 pKCG119는 MCS를 제외한 나머지 DNA 서열은 상기 pECCG117 벡터와 동일하다.

상기 pKCG119 벡터를 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 우선 MCS에 새로 추가될 단편을 만들기 위해, 제작된 서열번호 2 및 서열번호 3의 단일 가닥 DNA(single strand DNA)를 섞은 후, 100℃ 부터 2분 간격으로 10℃씩 온도를 하강시켜 4℃로 되게 하여 이중 가닥 DNA (double strand DNA)를 제작하였다. 상기 pECCG117 벡터를 두 개의 제한효소 EcoRV와 SalI으로 절단하였다. 그리고, 리가아제를 이용하여 상기 제작된 단편을 EcoRV 과 SalI 제한효소로 절단시킨 선상의 pECCG117 벡터에 접합하였다. 접합된 DNA를 대장균 GM2929(Escherichia coli genetic stock center, Yale University, New Haven, Connecticut)에 통상적인 전기장충격법을 통하여 형질전환하여 1리터 당 카나마이신은 10 ㎎ 되게 항생제가 포함된 LB 고체배지(효모엑기스 10 g/L, 박토트립톤 10g/L, 염화나트륨 10 g/L, 박토 아가 1.7%, pH 7.0)에서 자란 단일 콜로니들을 회수하였다. 회수된 콜로니들을 동일한 항생제가 첨가된 LB 배지에서 배양한 균체로부터 플라스미드를 분리하여 포함된 플라스미드의 크기를 일차로 확인하고 2차로 다시 EcoRV ,SalI, NheI, 및 Sph I 으로 절단하고 각 제한효소 부위의 위치를 확인하고, 3차로 DNA 염기서열을 분석하여 최종적으로 확인함으로써, pECCG117의 MCS내의 제한효소 EcoRV 위치부터 SalI 위치 사이에 상기 제한효소 SalI, NheI, SphI 부의를 새로 추가된 서열번호 1의 핵산 서열을 가지는 플라스미드 pKCG119(5933 kb)를 제작하였다. 상기 벡터는2004년11월 16일자로 국제기탁기관인 서울시 서대문구 홍제1동 361-222, 유림빌딩 소재의 한국미생물보존센터(KCCM: Korean Culture Center of Microorganism)에 수탁번호 KCCM 10618로 기탁하였다.

5'-atcacgctagtcgacctagctagctagacatgcatgcatgtt-3’(서열번호 2)

5'-tcgaaacatgcatgcatgtctagctagctaggtcgactagcgtgat-3’(서열번호 3)

실시예 2 - tkt 유전자 일부의 클로닝

tkt 유전자의 pKCG119로의 클로닝

도 2는 pKCG119-tkt 벡터의 제조과정을 나타낸 것으로, pKCG119 벡터의 MCS내의 제한효소 BamHI 위치와 XbaI 사이에 상기 유전자 tkt를 클로닝하였다. 플라스미드 벡터 pKCG119-tkt는 상기 pKCG119 벡터에 tkt 유전자의 일부인 1497bp를 포함 하고 있다.

상기 pKCG119-tkt 벡터를 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 우선 서열번호 4 및 5의 프라이머를 이용하는 PCR을 통하여 얻은 1,513bp의 tkt 유전자의 일부 단편을 두 개의 제한효소 XbaI과 BamHI으로 절단하였다. 그리고 리가아제를 이용하여 상기 tkt 유전자 단편을 XbaI과 BamHI 제한효소로 절단시킨 선상의 pKCG119 벡터에 접합하였다. 제조한 pKCG119-tkt를 코리네형 세균에 통상적인 전기장충격법을 통하여 형질전환하여 1리터 당 카나마이신(kanamycine)은 10㎎ 되게 항생제가 포함된 CM 고체배지 (효모엑기스 10 g/L, 박토펩톤 10g/L, 염화나튜륨 2.5 g/L, 박토아가 1.7%, 아덴닌 100mg/L, 구아닌 100mg/L, pH 7.0)에서 자란 단일 콜로니들을 회수하였다. 회수된 콜로니들을 동일한 항생제가 첨가된 상기 고체배지에서 배양한 균체로부터 플라스미드를 분리하여 포함된 플라스미드의 크기를 일차로 확인하고 2차로 다시 Xba I과 BamHI으로 2중 절단하여 1513bp 크기의 DNA 절편이 나오는지를 확인함으로써 tkt 유전자 단편이 포함된 재조합 플라스미드 pKCG119-tkt 를 제작하였다.

프라이머 1 -tkt-XbaI : 5`-gctctagagttgacccagtacatccagc-3’(서열번호 4)

프라이머 2-tkt-BamHI : 5`-cgcggatccgattacatctggggtttccg-3’(서열번호 5)

tkt 유전자의 pBSG로의 클로닝

상기 pBSG-tkt의 pBSG(KCCM-10532) 벡터는 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 우선 서열번호 4 및 5의 프라이머를 이용하는 PCR을 통하여 얻은 1513bp의 tkt 유전자의 일부 단편을 두 개의 제한효소 XbaI과 BamHI으로 절단하였다. 그리고 리가아제를 이용하여 상기 tkt 유전자 단편을 XbaI과 BamHI 제한효소로 절단시킨 선상의 pBSG 벡터에 접합하였다. pBSG 벡터는 pBRINT-Gm 벡터 유래의 MCS 와 젠타마이신 아세틸트란스퍼라제 유전자(accC1)를 가지며 pECCG122(KFCC10696) 벡터 유래의 코리네 박테리움 글루타미쿰 및 대장균 오리진을 포함하고, 바실러스 서브틸러스 마버그 168(Bacillus subtilus Marburg 168)로부터 유래된 레반스크라제 유전자 sacB 를 가지는 벡터이다. 제조한 pBSG-tkt를 대장균 GM2929에 통상적인 전기장충격법을 통하여 형질전환하여 1리터 당 젠타마이신(gentamycin)은 5 ㎎ 되게 항생제가 포함된 LB 고체배지(효모엑기스 10 g/L, 박토트립톤 10g/L, 염화나트륨 10 g/L, 박토아가 1.7%, pH 7.0)에서 자란 단일 콜로니들을 회수하였다. 회수된 콜로니들을 동일한 항생제가 첨가된 LB 배지에서 배양한 균체로부터 플라스미드를 분리하여 포함된 플라스미드의 크기를 일차로 확인하고 2차로 다시 XbaI과 BamHI으로 2중 절단하여 1513bp 크기의 DNA 절편이 나오는지를 확인함으로써 tkt 유전자 단편이 포함된 재조합 플라스미드 pBSG-tkt(5590kb)를 제작하였다.

실시예 3 - 플라스미드 pKCG119-tkt에서 항생제와 tkt 유전자의 일부를 제외한 나머지의 재조합단편 제작

도 3은 플라스미드 pKCG119-tkt에서 항생제와 tkt 유전자의 일부를 제외한 나머지의 제거된 원형 DNA 단편 제조과정을 나타낸 것으로, 최종 제작된 원형 DNA 단편에는 코리네박테리움 암모니아제네스의 복제 원점이 존재하지 않는다. 원형 DNA 단편은 카나마이신과, 재조합을 위한 tkt 일부인 1513p를 포함하여 총 3349bp이다.

상기 원형 DNA 단편을 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 우선 코리네박테리움 암모니아제네스로부터 분리한 재조합 플라스미드 pKCG119-tkt를 제한효소 NheI으로 절단하였다. 그리고 나서, 상기 두부분으로 절단된 단편중 카나마이신과 tkt 일부만을 포함한 3349bp 단편만을 통상적인 전기장충격법을 통하여 수거하였다. 그리고 나서, 리가아제를 이용하여 상기 DNA 단편의 제한효소 NheI 부위 양끝을 접합하여 재조합단편을 제작하였다.

실시예 4 - tkt 유전자가 불활성된 균주의 선별

실시예 3에서 기술된 플라스미드 pKCG119-tkt로부터 제작된 재조합 단편을 사용하여 5‘-이노신산 생산균주인 CJHB100(KCCM-10330)에 형질전환하여 10 mg/L 카나마이신이 첨가된 CM 고체배지 (효모엑기스 10 g/L, 박토펩톤 10g/L, 염화나트륨 2.5 g/L, 박토아가 1.7%, 아데닌 100mg/L, 구아닌 100mg/L, pH 7.0)에 도말하여 32?에서 96시간 배양하였다. 단일 콜로니 중에서, 5‘-이노신산 생산 균주인 CJHB100(KCCM-10330)의 염색체의 특정 위치에 삽입된 재조합 균주를 선별하기 위하 여, 서열번호 6 및 7의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 코리네박테리움 암모니아제네스에서 tkt가 불활성화되면 쉬키믹산 요구성주가 된다. 이에 MM 고체배지(Glucose 20 g/l, (NH₄)₂SO₄ 3g/l, KH₂PO₄ 1g/l, K₂HPO₄ 3g/l, MgSO₄7H₂O 0.3g/l, CaCl₂2H₂O 10mg/l, FeSO₄7H₂O 10mg/l, ZnSO₄7H ₂O 1mg/l, MnCl₂4H₂O 3.6mg/l, L-Cysteine 20mg/l, ThiamineHCl 5mg/l, Ca-D-Pantothenate 10 mg/l, α-Biotin 30ug/l, Yeast extract 0.2g/l, Adenine 20mg/l, Guanine 20mg/l, pH7.3)에 쉬키믹산(shikimic acid)을 100mg/l로 첨가하여 요구성을 시험한 결과, 쉬키믹산을 첨가하지 않은 MM배지에서는 상기 선별된 재조합 균주가 생장하지 못함을 확인되었다.

도 4는 CJHB100(KCCM-10330)의 염색체 상의 tkt의 유전자가 불활성화되는 과정을 도식화한 것이다.

프라이머 1-tkt-FC : 5`-agttccccgccgcacctaat-3’(서열번호 6)

프라이머 2-tkt-FB : 5`-ctaaagagcttccagacc-3’(서열번호 7)

한편, 상기 제작된 pBSG-tkt 플라스미드를 직접 5‘-이노신산 생산균주인 CJHB100에 형질전환하여 0.01mg/L 젠타마이신이 첨가된 CM 고체배지에 도말하여 32?에서 96시간 배양하였다. 단일 콜로니들을 PCR을 통해서 5‘-이노신산 생산균주인 CJHB100의 염색체의 특정 위치에 삽입된 재조합 균주를 선별하였다. 염색체 상의 tkt 유전자가 불활성된 균주의 선별방법과 사용된 프라이머는, 상기 재조합단편 삽입으로 염색체 상의 tkt 유전자가 불활성된 균주의 선별와 동일하다.

실시예 5 - pfk (Phosphofructokinase) 유전자 일부의 클로닝, 원형 제조합 단편의 제작 및 pfk 불활성화 균주의 제작

pfk 유전자의 pKCG119로의 클로닝

도 5는 pKCG119-pfk 벡터의 제조과정을 나타낸 것으로, pKCG119 벡터의 MCS내의 제한효소 BamHI 위치와 EcoRV 사이에 상기 유전자 pfk를 클로닝하였다. 플라스미드 벡터 pKCG119- pfk는 상기 pKCG119 벡터에 pfk 유전자의 일부인 639bp를 포함하고 있다.

상기 pKCG119- pfk 벡터를 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 우선, 서열번호 8 및 9의 프라이머를 이용하는 PCR을 통하여 얻은 683bp의 pfk 유전자의 일부 단편을 두 개의 제한효소 EcoRV 과 BamHI으로 절단하였다. 그리고 리가아제를 이용하여 상기 pfk 유전자 단편을 EcoRV 과 BamHI 제한효소로 절단시킨 선상의 pKCG119 벡터에 접합하였다. 제조한 pKCG119- pfk를 코리네형 세균에 통상적인 전기장충격법을 통하여 형질전환하여 1리터 당 카나마이신은 10 ㎎ 되게 항생제가 포함된 CM 고체배지에서 자란 단일 콜로니들을 회수하였다. 회수된 콜로니들을 동일한 항생제가 첨가된 상기 고체배지에서 배양한 균체로부터 플라스미드를 분리하여 포함된 플라스미드의 크기를 일차로 확인하고 2차로 다시 EcoRV 과 BamHI으로 2중 절단하여 683bp 크기의 DNA 절편이 나오는지를 확인함으로써 pfk 유전자 단편이 포 함된 재조합 플라스미드 pKCG119- pfk 를 제작하였다.

여기에 사용된 프라이머들은 다음과 같다.

프라이머 1-pfk--BamHI: 5`-cgcggatccggttgggtggggctgatggaagac-3’서열번호 8)

프라이머 2-pfk-EcoRV: 5`-acgcgatatcttgcccgatgccgttgaaggtttt-3’(서열번호 9)

pfk 유전자의 pBSG로의 클로닝

pBSG- pfk 벡터는 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 우선, 서열번호 8 및 9의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 얻은 683 bp의 pfk 유전자의 일부 단편을 두 개의 제한효소 BamHI과 EcoRV으로 절단하였다. 그리고 리가아제를 이용하여 상기 pfk 유전자 단편을 BamHI과 SmaI의 제한효소로 절단시킨 선상의 pBSG 벡터에 접합하였다. 제조한 pBSG- pfk를 대장균 GM2929에 통상적인 전기장충격법을 통하여 형질전환하여 1 리터 당 젠타마이신(gentamycin)은 5 ㎎ 되게 항생제가 포함된 LB 고체배지에서 자란 단일 콜로니들을 회수하였다. 회수된 콜로니들을 동일한 항생제가 첨가된 LB 배지에서 배양한 균체로부터 플라스미드를 분리하여 포함된 플라스미드의 크기를 일차로 확인하고 2차로 다시 BamHI과 EcoRV으로 2중 절단하여 683bp 크기의 DNA 절편이 나오는지를 확인함으로써 pfk 유전자 단편이 포함된 재조합 플라스미드 pBSG-pfk (4762kb)를 제작하였다.

플라스미드 pKCG119- pfk 에서 항생제와 pfk 유전자의 일부를 제외한 나머지의 재조합 단편 제작

도 6은 플라스미드 pKCG119-pfk 에서 항생제와 pfk 유전자의 일부를 제외한 나머지의 제거된 원형 DNA 단편 제조과정을 나타낸 것으로, 최종적으로 제작된 원형 DNA 단편에는 코리네박테리움 암모니아제네스의 복제 원점이 존재하지 않는다. 원형 DNA 단편은 카나마이신과, 제조합을 위한 pfk 일부인 683bp를 포함하여 총 2519bp이다.

코리네박테리움 암모니아제네스로부터 분리한 재조합 플라스미드 pKCG119- pfk 를 제한효소 NheI으로 절단하였다. 그리고 나서, 상기 두부분으로 절단된 단편중 카나마이신과 pfk 일부만을 포함한 2519bp 단편만을 통상적인 전기장충격법을 통하여 수거하였다. 그리고 나서, 리가아제를 이용하여 상기 DNA 단편의 제한효소 NheI 부위 양끝을 접합하여 재조합단편을 제작하였다.

염색체 상의 pfk 유전자가 불활성된 균주의 선별

상기에서 기술된 플라스미드 pKCG119- pfk로부터 제작된 재조합단편을 사용하여 5‘-이노신산 생산균주인 CJHB100(KCCM-10330)에 형질전환하여 10 mg/L 카나마이신이 첨가된 CM 고체배지에 도말하여 32?에서 96시간 배양하였다. 단일 콜로니 중에서, 5‘-이노신산 생산균주인 CJHB100의 염색체의 특정 위치에 삽입된 재조 합 균주를 선별하기 위하여, 서열번호 10 및 11의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다

도 7은 CJHB100의 염색체 상의 pfk 유전자가 불활성화 되는 상동재조합 과정를 도식화 한 것이다.

프라이머 1-pfk FC : 5`-gcaccgcgtctaatgagttc -3’서열번호 10)

프라이머 2-pfk -FB : 5`-cggccaggtcgacgagtttgatgt -3’서열번호 11)

한편, 상기 제작된 pBSG- pfk 플라스미드를 직접 5‘-이노신산 생산균주인 CJHB100에 형질전환하여 0.01mg/L 전타마이신이 첨가된 CM 고체배지에 도말하여 32℃에서 96시간 배양하였다. 단일 콜로니들을 PCR을 통해서 5‘-이노신산 생산균주인 CJHB100의 염색체의 특정 위치에 삽입된 재조합 균주를 선별하였다. 염색체 상의 pfk 유전자가 불활성된 균주의 선별방법과 사용된 프라이머는, 상기 재조합단편 삽입으로 염색체 상의 pfk 유전자가 불활성된 균주의 선별와 동일하다.

실시예 6 - 유전자 불활성화 효율 비교

코리네박테리움 암모니아제네스 염색체 상의 유전자를 불활성화하기 위해 사용된 재조합 단편들과 pBSG-tkt, pBSG-pfk 각각의 불활성화 효율은 다음 표와 같다. 실제 tkt외에 여러 유전자의 불활성화 실험을 수행하였으나 본 발명에서는 pfk(Phosphofructokinase)와 tkt(Transketolase)의 게놈상의 변형 결과만을 기재한다.

통상의 방법인 대장균 유래의 플라스미드 pBSG-tkt와 pBSG-pfk를 통해선 불활성화 재조합균주를 얻지 못하거나 아주 소량 얻을 수 있었으나, 본 발명의 방법으로 제작된, 즉 코리네박테리움 암모니아제네스 유래의 플라스미드 pKCG119-tkt와 pKCG119-pfk에서 분리해낸 재조합단편을 통해서는 pBSG 유도체보다 보다 소량의 DNA를 사용했음에도 각각 90개와 115개의 콜로니를 얻을 수 있어 더 높은 효율로 게놈상의 유전자 변형을 유도할 수 있었다.

본 발명의 벡터를 이용할 경우 원핵세포, 보다 바람직하게는 코리네박테리움 등의 표적 유전자의 변형을 고효율로 유도할 수 있으므로, 목적에 적합한 표적 유 전자 변형된 원핵세포를 간단하게 생산할 수 있다.

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Claims (6)

1. 다음의 단계를 포함하는 표적 유전자 변형된 원핵세포 생산방법:

   (a) 코리네박테리아 복제원점(replication origin), 선별마커 및 표적 유전자에 상동인 서열을 포함하는 표적 유전자 변형 벡터를 준비하는 단계;

   (b) 상기 벡터에서 복제원점을 제거하고 원형으로 연결하는 단계;

   (c) 상기 복제원점이 제거된 벡터를 원핵세포에 삽입하여 형질전환 미생물을 준비하는 단계;

   (d) 상기 형질전환 미생물을 선별마커가 함유된 배지에서 배양하는 단계; 및

   (e) 상동 재조합에 의하여 표적 유전자가 변형된 세포를 선택하는 단계.
2. 제1항에 있어서, 단계 (a)의 벡터가 수탁번호 KCCM 10618로부터 유래되는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 표적 유전자가 트랜스케토라제 (tkt: transketolase), 포스포프럭토키나제 (pfk: phosphofructokinase) 또는 말레이트 디하이드로게나제 (mdh: malate dehydrogenase)인 방법.
4. 제1항에 있어서, 원핵세포가 에스케리키아(Escherichia), 브레비박테리움 (Brevibacterium) 또는 코리네박테리움 (Corynebacterium)인 방법.
5. 제1항의 방법으로 생산된 표적 유전자 변형된 원핵세포.
6. 수탁번호 KCCM 10618의 벡터.

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