WO2021248890A1 - 产l-赖氨酸的重组菌株及其构建方法与应用 - Google Patents

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Definitions

  • the yield of lysine is related to the enzyme activity in the biosynthetic pathway, and the activity can generally be enhanced by amplifying one or more genes in the lysine biosynthetic pathway or by using a modified promoter of the gene.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is the protein encoded by the gene NCgl2176.
  • the microorganism or recombinant strain has an enhanced L-lysine production capacity compared with the wild-type or parent strain.
  • the mutation includes the mutation of base 528 of the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO:1 from adenine (A) to cytosine (C).
  • Selection markers may include markers that confer a selectable phenotype, such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or expression of surface proteins. In an environment treated with such selective agents, since cells expressing only the selection marker can survive or display different phenotypic traits, transformed cells can be selected.
  • the term "transformation” refers to the introduction of a polynucleotide into a host cell so that the polynucleotide can be used as an extra-genomic element or inserted into the genome of the host cell to replicate.
  • the method of transforming the vector used in the present invention may include a method of introducing nucleic acid into a cell.
  • the electric pulse method can be implemented according to the host cell.
  • the microorganism belonging to the genus Corynebacterium is Corynebacterium glutamicum YP97158, preservation number: CGMCC No. 12856, preservation date: August 16, 2016, preservation unit: Chinese microorganism strains General Microbiology Center of the Preservation Management Committee, No. 3, No. 1, Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing, Tel: 010-64807355, which has been recorded in Chinese Patent Application CN106367432A (application date September 1, 2016, publication date February 1, 2017 ).
  • the microorganism or recombinant strain may also have other improvements related to increasing the production of L-lysine, for example, genes related to the production of NADPH (such as genes encoding glucose dehydrogenase, genes encoding gluconate kinase Gene, gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, gene encoding glucose-6-phosphate dehydrogenase, or gene encoding 6-phosphogluconate dehydrogenase) and/or with L-lysine
  • genes related to the production of NADPH such as genes encoding glucose dehydrogenase, genes encoding gluconate kinase Gene, gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, gene encoding glucose-6-phosphate dehydrogenase, or gene encoding 6-phosphogluconate dehydrogenase
  • Other genes related to biosynthesis or secretion e.g.
  • the second aspect of the present invention provides a polynucleotide sequence, an amino acid sequence encoded by the polynucleotide sequence, a recombinant vector including the polynucleotide sequence, and a recombinant strain containing the polynucleotide sequence.
  • the polynucleotide sequence includes a polynucleotide encoding a polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, wherein the lysine at position 176 is replaced by a different amino acid.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 wherein the amino acid sequence after lysine (K) at position 176 is replaced by asparagine (N) is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the polynucleotide sequence encoding the polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 contains the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the mutation refers to a change in the base/nucleotide of the site
  • the mutation method can be selected from at least one of methods such as mutagenesis, PCR site-directed mutagenesis, and/or homologous recombination. kind.
  • PCR site-directed mutagenesis and/or homologous recombination are preferably used.
  • the amino acid sequence includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:4.
  • the plasmid is pK18mobsacB plasmid.
  • the plasmid is pXMJ19 plasmid.
  • the recombinant strain contains the polynucleotide sequence.
  • the polynucleotide sequence of wild-type NCgl2176 shown in SEQ ID NO:1 in the host strain is modified to make the 528th base mutated to obtain a recombinant strain of Corynebacterium containing the gene encoding the mutant NCgl2176.
  • the modification includes at least one of methods such as mutagenesis, PCR site-directed mutagenesis, and/or homologous recombination.
  • the mutation refers to the mutation of the 528th base in SEQ ID NO:1 from adenine (A) to cytosine (C); specifically, the polynucleoside containing the gene encoding the mutation NCgl2176
  • the acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • construction method includes the following steps:
  • the recombinant vector is introduced into the host strain to obtain the recombinant coryneform strain containing the mutant NCgl2176 encoding gene.
  • the Corynebacterium glutamicum genome can be derived from strain ATCC13032, and its genome sequence can be obtained from the NCBI website.
  • the primer is:
  • P2 5'CCGGGGACTGGTTTTCGGGTGTTGGTGTGC 3'(SEQ ID NO: 6)
  • the overlap PCR amplification is performed as follows: denaturation at 94°C for 30s, annealing at 52°C for 30s, and extension at 72°C for 90s (30 cycles).
  • the step (2) includes the construction of recombinant plasmids, including: assembling the isolated and purified NCgl2176 A528C and pK18mobsacB plasmids through the NEBuider recombination system to obtain the recombinant plasmid pK18-NCgl2176 A528C .
  • the host strain is YP97158.
  • the primers for amplifying upstream homology arm fragments are:
  • the primers for amplifying the downstream homology arm fragments are:
  • P12 5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCTATGACACCTTCAACGGATC 3'(SEQ ID NO: 16).
  • the construction method includes the following steps:
  • NCgl 2176 gene coding region and promoter region sequence or NCgl 2176 A528C gene coding region and promoter region sequence, construct an overexpression plasmid vector, and transfer the vector into the host strain to achieve the strain overexpressing NCgl 2176 or NCgl 2176 A528C gene.
  • the primers for amplifying the sequence of the coding region of the gene and its promoter region are:
  • the recombinant strain obtained by the present invention can be used alone in the fermentation production of L-lysine, or can be mixed with other L-lysine-producing bacteria to produce L-lysine by fermentation.
  • nucleotide sequence that has more than 90%, preferably more than 95%, or more than 98% identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 30, and it retains the promoter described in (a) Enhance the activity of, and the -49th nucleotide is kept as adenine (A), the -51th nucleotide is kept as thymine (T), the -54 ⁇ -58th nucleotide is kept as GGTGT .
  • the present invention also provides an expression cassette comprising the above-mentioned promoter, the expression cassette comprising the promoter and a coding sequence operably linked to the promoter.
  • the coding sequence is the coding sequence of the dapB gene.
  • the present invention also provides a recombinant strain containing the above-mentioned promoter nucleotide sequence or the above-mentioned recombinant vector.
  • the recombinant strain according to the present invention may further include other modifications.
  • the primer in the step (1) is:
  • the obtained DNA fragment contains EcoR I and Sph I restriction sites at both ends of the obtained DNA fragment through overlap PCR amplification (Overlap PCR).
  • the step (2) includes: separating and purifying the amplified products of overlapping PCR reactions, and after double-enzyme digestion (EcoR I/Sph I), and the same double-enzyme digestion (EcoR I/Sph I) After the shuttle plasmid is connected, the allelic replacement recombinant vector is obtained.
  • SEQ ID NO 4 NCgl2176 K176N encoded protein amino acid sequence
  • the dapB gene promoter region (SEQ ID NO:29) introduced a point mutation, the -49bp position C of the nucleotide sequence of the dapB gene promoter region changed to A, the -51bp position G changed to T, and -54--58bp CTGCA changed to GGTGT (SEQ ID NO: 30).

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Abstract

提供了对谷氨酸棒杆菌中NCgl2176基因编码序列引入点突变或改善其表达的方法，和对谷氨酸棒杆菌中的dapB基因的启动子区域序列进行点突变的方法。所述方法可以使带有所述突变的菌株提高L-赖氨酸的发酵产量。

Description

产L-赖氨酸的重组菌株及其构建方法与应用
本申请要求2020年8月7日向中国国家知识产权局提交的专利申请号为202010790877.0，发明名称为“一种产L-赖氨酸的重组菌株及其构建方法与应用”，和2020年6月8日向中国国家知识产权局提交的专利申请号为202010514023.X，发明名称为“一种dapB基因改造的重组菌株及其构建方法与应用”的在先申请的优先权。所述两份在先申请的全文通过引用的方式结合于本申请中。
技术领域
本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及具有增强的L-赖氨酸生产能力的重组菌株及其构建方法与应用。
背景技术
L-赖氨酸具有促进发育、增强免疫力和提高中枢神经组织功能等生理功效，是人体和动物不能自身合成且生长必需的8种基本氨基酸之一。目前，L-赖氨酸是世界上的第二大氨基酸品种，主要生产方法是发酵法，棒杆菌是氨基酸生产中使用的最重要的菌种，其包括谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色棒杆菌(C.flavum)、钝齿棒杆菌(C.crenatum)、北京棒杆菌等，这其中谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是赖氨酸的重要生产菌株。L-赖氨酸工业产量的约90％用作饲料工业中的营养强化剂，10％用作食品工业中的鲜味剂和甜味剂，以及医药行业中的药物中间体。
对发酵法生产L-赖氨酸的改进可以涉及发酵技术如搅拌和供应氧气；或涉及营养培养基的组成，例如发酵过程中的糖浓度；或涉及将发酵液加工成合适的产品形式，例如通过干燥和造粒发酵液或离子交换色谱；或可以涉及相关微生物本身的固有性能性质。
用于改善这些微生物的性能性质的方法包括诱变、突变体的选择和筛选。以这种方式获得的菌株对抗代谢物具有抗性或对于具有调节重要性的代谢物是营养缺陷型并产生L-赖氨酸。
以谷氨酸棒杆菌为例，C.glutamicum生物合成途径中合成1mol L-赖氨酸需要消耗4mol NADPH。因此，为了提高C.glutamicum生物合成途径中L-赖氨酸的积累，提高C.glutamicum代谢途径中NADPH量或降低L-赖氨酸合成途径中NADPH需求量是非常重要的策略。
二氢吡啶二羧酸还原酶(Dihydrodipicolinate reductase,DHDPR)是细菌和高等植物生物合成二氨基庚二酸和L-赖氨酸过程中第二个关键酶，催化二氢吡啶二羧酸的NAD(P)H-依赖的还原性反应，生成六氢吡啶二羧酸。该酶在细胞壁形成中起到关键性作用。DHDPR既以NADH又以NADPH作为辅助因子，不同细菌的DHDPR对不同辅因子的亲和力也不同，如E.coli更青睐NADH，而C.glutamicum中DHDPR主要以NADPH作为辅因子参与L-赖氨酸的合成。和其他已发现的生物体中的DHDPR一样，C.glutamicum中DHDPR由基因dapB编码，其酶活不受合成途径中终产物的调节作用，但受2,6-吡啶二羧酸(2,6-PDC)的抑制。
赖氨酸的产率与生物合成途径中的酶活性有关，该活性一般可以通过扩增赖氨酸生物合成途径中的一个或多个基因或者通过应用基因的修饰的启动子来增强。
发明内容
本发明提供了生成L-赖氨酸的微生物或重组菌株，其中编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的表达改善，和/或，SEQ ID NO:29所示的启动子区域第-49位、第-51位、第-54～-58位的碱基发生突变。本发明还提供了通过使用所述微生物或重组菌株生产L-赖氨酸的方法。
本发明的第一个方面提供了生成L-赖氨酸的属于棒杆菌属的微生物或重组菌株，其具有编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达。根据本发明，所述改善的表达是所述多核苷酸表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。
所述SEQ ID NO:3的氨基酸序列是基因NCgl2176编码的蛋白。
所述微生物或重组菌株与野生型或亲本菌株相比具有增强的L-赖氨酸生产能力。
所述多核苷酸可以编码与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有约90％或更高、约92％或更高、约95％或更高、约97％或更高、约98％或更高、或约99％或更高的序列同源性的氨基酸序列。如本文中使用的，术语“同源性”指两种多核苷酸或两种多肽模块之间的百分比同一性。可以通过使用本领域中已知的方法测定一种模块和另一种模块之间的序列同源性。例如，可以通过BLAST算法测定此类序列同源性。
可以如下增强多核苷酸的表达：通过取代或突变表达调节序列、对多核苷酸序列引入突变、通过经由染色体插入或载体导入的多核苷酸拷贝数的增加、或其组合等。
可以修饰多核苷酸的表达调节序列。表达调节序列控制与其可操作连接的多核苷酸的表达，并且例如可以包括启动子、终止子、增强子、沉默子等。多核苷酸可以具有起始密码子的变化。可以将多核苷酸掺入染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。在本文，特定的位点可以包括例如转座子位点或基因间位点。另外，可以将多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。
在本发明的一种实施方式中，通过将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。
在本发明的一种实施方式中，通过将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而过表达所述核酸序列。
在本发明的一种实施方式中，将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。
在本发明的一种实施方式中，将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而过表达所述核酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述多核苷酸可以包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的具有点突变，使得SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第176位赖氨酸被不同的氨基酸所取代。
根据本发明，优选第176位赖氨酸被天冬酰胺所取代。
根据本发明，SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，其中第176位赖氨酸(K)被天冬酰胺(N)所取代后的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在本发明的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列是由SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第528位碱基发生突变而形成的。
根据本发明，所述突变包括SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第528位碱基由腺嘌呤(A)突变为胞嘧啶(C)。
在本发明的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。
如本文中使用的，术语“可操作连接”指调节序列和多核苷酸序列之间的功能性连接，由此调节序列控制多核苷酸序列的转录和/或翻译。调节序列可以是能提高多核苷酸的表达水平的强启动子。调节序列可以是源自属于棒杆菌属的微生物的启动子或者可以是源自其它微生物的启动子。例如，启动子可以是trc启动子、gap启动子、tac启动子、T7启动子、lac启动 子、trp启动子、araBAD启动子或cj7启动子。
在本发明的一个具体实施方式中，所述启动子是编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸(NCgl2176基因)的启动子。
如本文中使用的，术语“载体”指含有基因的调节序列和基因序列并且配置为在合适的宿主细胞中表达靶基因的多核苷酸构建体。或者，载体又可以指多核苷酸构建体，其含有可用于同源重组的序列，从而由于对宿主细胞导入的载体，可以改变宿主细胞的基因组中的内源基因的调节序列，或者可以将可以表达的靶基因插入宿主的基因组的特定位点中。在这点上，本发明中使用的载体可以进一步包含选择标志物以确定载体对宿主细胞的导入或者载体对宿主细胞的染色体的插入。选择标志物可以包含赋予可选择表型，诸如药物抗性、营养缺陷型、针对细胞毒剂的抗性、或表面蛋白的表达的标志物。在用此类选择剂处理的环境中，由于仅表达选择标志物的细胞可以存活或者显示不同表型性状，可以选择经转化的细胞。
在本发明的一些具体实施方式中，使用的载体是pK18mobsacB质粒，pXMJ19质粒。
如本文中使用的，术语“转化”指将多核苷酸导入宿主细胞中，从而多核苷酸可以作为基因组外元件或者以插入宿主细胞的基因组中能复制。转化本发明中使用的载体的方法可以包括将核酸导入细胞的方法。另外，如相关技术中公开的，可以根据宿主细胞实施电脉冲方法。
根据本发明，属于棒杆菌属的微生物或重组菌株可以是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)。
在本发明的一个实施方案中，所述属于棒杆菌属的微生物是谷氨酸棒杆菌YP97158，保藏编号：CGMCC No.12856，保藏日期：2016年8月16日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话：010-64807355，已经记载于中国专利申请CN106367432A(申请日2016年9月1日，公开日2017年2月1)。
根据本发明，所述微生物或重组菌株还可以具有与提高L-赖氨酸产量有关的其他改进，例如，与NADPH生成相关的基因(例如编码葡萄糖脱氢酶的基因、编码葡糖酸激酶的基因、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因、编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因、或编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的基因)和/或与L-赖氨酸生物合成或分泌相关的其他基因(例如编码天冬氨酸氨基转移酶的基因、编码天冬氨酸激酶的基因、编码天冬氨酸半醛脱氢酶的基因、编码二氢吡啶二羧酸合酶的基因、编码二氢吡啶二羧酸还原酶的基因、编码间-二氨基庚二酸脱氢酶的基因、编 码二氨基庚二酸脱羧酶的基因，lysE)的增强或降低的表达，或者可以使基因被外来基因取代。
本发明的第二个方面，提供一种多核苷酸序列，由该多核苷酸序列编码的氨基酸序列，包括所述多核苷酸序列的重组载体，含有所述多核苷酸序列的重组菌株。
根据本发明，所述多核苷酸序列包括编码含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，其中第176位赖氨酸被不同的氨基酸所取代。
根据本发明，优选第176位赖氨酸被天冬酰胺所取代。
根据本发明，SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，其中第176位赖氨酸(K)被天冬酰胺(N)所取代后的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
根据本发明，优选所述编码含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列含有如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列。
在本发明的一个实施方式中，所述多核苷酸序列是由包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列第528位碱基发生突变而形成的。
根据本发明，所述突变是指所述位点的碱基/核苷酸发生变化，所述突变方法可以选自诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。在本发明中，优选采用PCR定点突变法和/或同源重组。
根据本发明，所述突变包括SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第528位碱基由腺嘌呤(A)突变为胞嘧啶(C)。
在本发明的一个实施方式中，所述多核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。
根据本发明，所述氨基酸序列包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
根据本发明，所述重组载体是将所述多核苷酸序列导入质粒构建而成。
在本发明的一个实施方式中，所述质粒为pK18mobsacB质粒。
在本发明的另一个实施方式中，所述质粒为pXMJ19质粒。
具体地，可以将所述多核苷酸序列和所述质粒通过NEBuider重组系统构建成重组载体。
根据本发明，所述重组菌株含有所述的多核苷酸序列。
作为本发明的一个实施方案，所述重组菌株的出发菌为YP97158。
本发明的第三个方面，还提供一种谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建方法。
根据本发明，所述构建方法包括如下步骤：
改造宿主菌株中如SEQ ID NO:1所示的野生型NCgl2176的多核苷酸序列，使其第528位碱基发生突变，得到包含突变NCgl2176编码基因的棒杆菌重组菌株。
根据本发明的构建方法，所述改造包括诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。
根据本发明的构建方法，所述突变是指SEQ ID NO:1中第528位碱基由腺嘌呤(A)突变为胞嘧啶(C)；具体地，所述包含突变NCgl2176编码基因的多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步地，所述构建方法包括如下步骤：
(1)改造如SEQ ID NO:1所示的野生型NCgl2176基因的核苷酸序列，使其第528位碱基发生突变，得到突变的NCgl2176基因多核苷酸序列；
(2)将所述突变的多核酸序列与质粒连接，构建重组载体；
(3)将所述重组载体导入宿主菌株，得到所述包含突变NCgl2176编码基因的棒杆菌重组菌株。
根据本发明的构建方法，所述步骤(1)包括：点突变的NCgl2176基因构建：根据谷氨酸棒杆菌的基因组序列，合成两对扩增NCgl2176基因片段的引物P1和P2及P3和P4，通过PCR定点突变法在野生型NCgl2176基因SEQ ID NO:1中引入点突变，得到点突变的NCgl2176基因核苷酸序列SEQ ID NO:2，记为NCgl2176 A528C。
在本发明的一个实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌基因组可以来源于ATCC13032菌株，其基因组序列可以从NCBI网站获取。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)中，所述引物为：
P1:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCGGCGACCGCATGGACACCG 3'(SEQ ID NO:5)
P2:5'CCGGGGACTGGTTTTCGGGTGTTGGTGTGC 3'(SEQ ID NO:6)
P3:5'GCACACCAACACCCGAAAACCAGTCCCCGG 3'(SEQ ID NO:7)
P4:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCGAGGTCTCTCAGAATCGGT 3'(SEQ ID NO:8)
在本发明的一个实施方案中，所述PCR扩增按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸40s(30个循环)。
在本发明的一个实施方案中，所述重叠PCR扩增按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸90s(30个循环)。
根据本发明的构建方法，所述步骤(2)包括重组质粒的构建，包括：将分离纯化后的NCgl2176 A528C和pK18mobsacB质粒，通过NEBuider重组系统组装，获得重组质粒pK18-NCgl2176 A528C。
根据本发明的构建方法，所述步骤(3)包括重组菌株的构建，将重组质粒pK18-NCgl2176 A528C转化至宿主菌株，得到重组菌株。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤(3)的转化为电转化法。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是YP97158。
在本发明的一个实施方式中，所述重组是通过同源重组实现的。
本发明的第四个方面，还提供一种棒杆菌重组菌株的构建方法。
根据本发明，所述构建方法包括如下步骤：
扩增NCgl2176基因的上下游同源臂片段、NCgl2176基因编码区及其启动子区序列，或者，NCgl2176 A528C基因编码区及其启动子区序列，以同源重组的方式在宿主菌株的基因组中引入NCgl2176或NCgl2176 A528C基因，以实现所述菌株过表达NCgl2176或NCgl2176 A528C基因。
在本发明的一个实施方式中，扩增上游同源臂片段的引物是：
P7:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCGTTCTGGACTGAGG3'(SEQ ID NO:11)
P8:5'AACACCATTGTCCCTGTTTTGGGCGAAATTTTCCCGGTGCACCGAGAACAGATG3'(SEQ ID NO:12)。
在本发明的一个实施方式中，扩增下游同源臂片段的引物是：
P11:5'CTACGAGACGAAGCCGTTCGCCTGAGATGGCGCAATTAAATCAAG 3'(SEQ ID NO:15)
P12:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCTATGACACCTTCAACGGATC 3'(SEQ ID NO:16)。
在本发明的一个实施方式中，扩增所述基因编码区及其启动子区序列的引物是：
P9:5'CGGGAAAATTTCGCCCAAAACAGGGACAATGGTGTTATGGCATTTGCAGACATTGTGCGC3'(SEQ ID NO:13)
P10:5'CTTGATTTAATTGCGCCATCTCAGGCGAACGGCTTCGTCTCGTAG3'(SEQ ID NO:14)。
在本发明的一个实施方式中，以前述P7/P12为引物，以扩增获得的上游同源片段、下游同源片段和带有自身启动子的NCgl2176或NCgl2176 A528C三个片段混合为模板进行扩增，获得整合同源臂片段。
在本发明的一个实施方式中，所采用的PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg 2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸120s(30个循 环)，72℃过度延伸10min。
在本发明的一个实施方式中，采用NEBuider重组系统，将穿梭质粒PK18mobsacB和整合同源臂片段组装，获得整合质粒。
在本发明的一个实施方式中，将整合质粒转染宿主菌株，以同源重组的方式在宿主菌株的基因组中引入NCgl2176或NCgl2176 A528C基因。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是YP97158。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是携带有SEQ ID NO:2所示多核苷酸序列的菌株。
本发明的第五个方面，还提供一种棒杆菌重组菌株的构建方法。
根据本发明，所述构建方法包括如下步骤：
扩增NCgl 2176基因编码区及启动子区序列，或NCgl 2176 A528C基因编码区及启动子区序列，构建过表达质粒载体，将所述载体转入宿主菌株中，以实现所述菌株过表达NCgl 2176或NCgl 2176 A528C基因。
在本发明的一个实施方式中，扩增所述基因编码区及其启动子区序列的引物是：
P17:5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCGGGAAAATTTCGCCCAAAACAG3'(SEQ ID NO:21)，
P18:5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACTCAGGCGAACGGCTTCGTCTCGTAG 3'(SEQ ID NO:22)。
在本发明的一个实施方式中，所述PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg 2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
在本发明的一个实施方式中，采用NEBuider重组系统，将穿梭质粒pXMJ19和带有自身启动子的NCgl2176或NCgl2176 A528C片段组装，获得过表达质粒。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是YP97158。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是携带有SEQ ID NO:2所示多核苷酸序列的菌株。
本发明获得重组菌株可以单独应用于发酵生产L-赖氨酸中，也可以和其他产L-赖氨酸的细菌混合发酵生产L-赖氨酸。
本发明的再一个方面是提供一种启动子核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:29所示的启动子区域第-49位、第-51位、第-54～-58位的碱基发生突变形成的核苷酸序列。
根据本发明，SEQ ID NO:29所示的启动子区域的第-49位核苷酸胞嘧啶(C)突变为腺嘌呤(A)、第-51位的核苷酸鸟嘌呤(G)突变为胸腺嘧啶(T)、第-54～-58位的核苷酸CTGCA突变为GGTGT。
根据本发明，所述启动子核苷酸序列如下所述：
(a)SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列；或者是，
(b)与SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列具有90％以上，优选的具有95％以上、或98％以上同一性的核苷酸序列，且其保留(a)所述启动子的增强活性，并且第-49位核苷酸保持为腺嘌呤(A)、第-51位的核苷酸保持为胸腺嘧啶(T)、第-54～-58位的核苷酸保持为GGTGT。
本发明还提供一种包含上述启动子的表达盒，所述表达盒包含所述启动子和可操纵地连接在所述启动子后的编码序列。在本发明的一个实施方案中，所述编码序列为dapB基因的编码序列。
本发明还提供一种包含本发明的启动子核苷酸序列的重组载体。
根据本发明，将本发明的启动子核苷酸序列与穿梭质粒相连接来构建所述重组载体；作为本发明的一个实施方案，所述穿梭质粒为pK18mobsacB质粒。
本发明还提供一种包含上述启动子核苷酸序列或上述重组载体的重组菌株。
根据本发明的重组菌株，其包含SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列。所述SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列为dapB基因的启动子区域。进一步地，所述SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列连接dapB基因编码序列。具体地，所述重组菌株可以包括本发明上述的表达盒或者重组载体。具体地，本发明的重组菌株由表达盒或者重组载体转化得到。根据本发明的重组菌株，是将上述突变的启动子核苷酸序列导入宿主菌株中重组形成；所述宿主菌株可以选自本领域已知的产L-赖氨酸的菌株，例如选自棒杆菌中的至少一种，所述棒杆菌可以为谷氨酸棒杆菌、黄色棒杆菌、钝齿棒杆菌、北京棒杆菌；优选谷氨酸棒杆菌。作为本发明的一个实施方案，所述宿主菌株为YP97158。
根据本发明的重组菌株，是以pK18mobsacB质粒为载体。
根据本发明的重组菌株，还可进一步包括其他改造。
本发明还提供一种产L-赖氨酸的重组菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)改造如SEQ ID NO:29所示的启动子区域，使其第-49位、第-51位和第-54～-58位碱基发生突变，得到包含突变的启动子区域的核苷酸序列。
根据本发明，所述突变是指SEQ ID NO:29所示的启动子区域的第-49位核苷酸胞嘧啶(C)突变为腺嘌呤(A)、第-51位的核苷酸鸟嘌呤(G)突变为胸腺嘧啶(T)、第-54～-58位的核苷酸CTGCA突变为GGTGT。具体地，所述突变后的启动子区域的核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示。进一步地，所述构建方法还包括如下步骤：
(2)将所述突变的启动子区域核苷酸序列与质粒连接，构建重组载体；
(3)将所述重组载体导入宿主菌株，得到所述包含突变的启动子区域的产L-赖氨酸重组菌株。
根据本发明，所述步骤(1)中，使所述发生突变的方法包括诱变、PCR定点突变或同源重组，优选PCR定点突变法。
根据本发明，所述步骤(1)包括：
设计两对扩增dapB基因的启动子区域的引物，再通过PCR技术得到突变的启动子区域核苷酸序列。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)中的引物为：
P1’:5' CCGGAATTCACCATGCCGGACATGCGGAC3'(EcoR I)(SEQ ID NO:31)
P2’:5'CCTTCTGAACGGGTTGTGGTATAATGGTGG 3'(SEQ ID NO:32)
P3’:5'CCACCATTATACCACAACCCGTTCAGAAGG 3'(SEQ ID NO:33)
P4’:5' ACATGCATGCGAATATTGACGTTGAGGAAG 3'(Sph I)(SEQ ID NO:34)。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)包括：以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，分别以引物P1’和P2’，P3’和P4’，进行PCR扩增，获得两条含有点突变的DNA片段；以上述两条DNA片段为模板，以P1’和P4’为引物，通过重叠PCR扩增(Overlap PCR)，得到包含本发明的启动子区域核苷酸序列(SEQ ID NO:30)的DNA片段。
根据本发明，步骤(1)中，通过重叠PCR扩增(Overlap PCR)，获得的DNA片段两端分别含有EcoR I和Sph I酶切位点。
根据本发明，所述步骤(2)包括：对于重叠PCR反应扩增的产物进行分离纯化，将片段双酶切(EcoR I/Sph I)后，与同样双酶切(EcoR I/Sph I)后的穿梭质粒相连接，获得等位替换重组载体。
根据本发明，所述穿梭质粒为pK18mobsacB质粒；所构建的重组载体为pK18-P dapB (C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)。
在本发明的一个实施方案中，所述重组质粒具有卡那霉素抗性标记。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤(3)的转化为电转化法；示例性地，所述步骤(3)中，是将重组质粒转化至菌株YP97158。
本发明还提供了本发明前述的微生物或重组菌株在L-赖氨酸制备中的应用；或者提供一种提高L-赖氨酸发酵量的方法；或者提供一种生产L-赖氨酸的方法。
根据本发明所述应用和方法，包括培养所述微生物或重组菌株进行发酵，并从所述培养物中回收L-赖氨酸，制备得到L-赖氨酸。根据本发明所述的应用和方法，可以单独使用本发明的重组菌株，也可以和其他产L-赖氨酸的细菌混合使用。
可以在本领域中已知的培养条件下在合适的培养基中进行微生物的培养。培养基可以包含：碳源、氮源、微量元素、及其组合。在培养中，可以调节培养物的pH。此外，培养时可以包括防止气泡产生，例如通过使用消泡剂进行气泡产生的防止。此外，培养时可以包括将气体注射入培养物中。气体可以包括能够维持培养物的需氧条件的任何气体。在培养中，培养物的温度可以是20至45℃。可以从培养物回收生成的L-赖氨酸，即用硫酸或氢氯酸处理培养物，接着进行诸如阴离子交换层析、浓缩、结晶和等电点沉淀的方法的组合。
在本发明中：
SEQ ID NO 1：NCgl2176野生型ORF序列
Figure PCTCN2020141539-appb-000001
SEQ ID NO 2：NCgl2176 A528C ORF序列
Figure PCTCN2020141539-appb-000002
SEQ ID NO 3：NCgl2176野生型编码蛋白氨基酸序列
Figure PCTCN2020141539-appb-000003
SEQ ID NO 4：NCgl2176 K176N编码蛋白氨基酸序列
Figure PCTCN2020141539-appb-000004
SEQ ID NO 29：野生型启动子序列
Figure PCTCN2020141539-appb-000005
Figure PCTCN2020141539-appb-000006
SEQ ID NO 30：突变后启动子序列
cttaagtctc atatttcaaa catagttcca cctgtgtgat taatccctag aacggaacaaactgatgaac aatcgttaac aacacagacc aaaacggtca gttaggtatg gatatcagcaccttctgaac gggttgtggt ataatggtgg gcgtttgaaa aactcttcgc cccacgaaaa tgaaggagca ta有益效果
本发明通过对NCgl 2176基因的弱化或敲除，发现该基因编码的产物对L-赖氨酸生产能力产生影响，通过在编码序列引入点突变，或者增加该基因的拷贝数或过表达获得重组菌株，所获得的菌株与未改造的菌株相比，有利于生产高浓度的L-赖氨酸。
此外，通过对dapB基因的启动子区域引入点突变，获得重组型菌株，所获得的菌株与未突变的菌株相比，也大幅提高了L-赖氨酸的产量，进一步提高了生成效率，降低生成成本，便于推广应用。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备；所进行的操作都是本领域已知的，或者按照市售商品的用户手册进行。
以下实施例中培养所述菌株使用的基础培养基组成相同，在此基础培养基组成上添加相应需要的蔗糖、卡那霉素或氯霉素等，基础培养基组成如下：
成分 配方
蔗糖 10g/L
多聚蛋白胨 10g/L
牛肉膏 10g/L
酵母粉 5g/L
尿素 2g/L
氯化钠 2.5g/L
琼脂粉 20g/L
pH 7.0
培养温度 32度
以下实施例中SSCP电泳PAGE的制备及条件为：
Figure PCTCN2020141539-appb-000007
以下实施例中L-赖氨酸的发酵培养基配方和发酵控制工艺如下：
表1发酵培养基配方
成分 配方
淀粉水解糖 30g/L
硫酸铵 12g/L
硫酸镁 0.87g/L
糖蜜 20g/L
酸化玉米浆 3mL/L
磷酸 0.4mL/L
氯化钾 0.53g/L
消泡剂(2％泡敌) 4mL/L
硫酸亚铁 120mg/L
硫酸锰 120mg/L
烟酰胺 42mg/L
泛酸钙 6.3mg/L
维生素B1 6.3mg/L
铜、锌盐溶液 0.6g/L
生物素 0.88mg/L
表2发酵控制工艺
Figure PCTCN2020141539-appb-000008
Figure PCTCN2020141539-appb-000009
实施例1构建包含点突变的NCgl 2176基因编码区的转化载体pK18-NCgl 2176 A528C
依据NCBI公布的野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，设计并合成两对扩增NCgl 2176基因编码区序列的引物，以等位基因置换的方式在菌株YP97158(保藏编号：CGMCC No.12856，保藏日期：2016年8月16日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话：010-64807355，记载于中国专利申请CN106367432A(申请日2016年9月1日，公开日2017年2月1日)中)背景中的NCgl2176基因编码区(SEQ ID NO:1)中引入点突变，对应编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，NCgl2176基因的核苷酸序列第528位A变为C(SEQ ID NO:2：NCgl2176 A528C)，对应编码蛋白的氨基酸序列第176位赖氨酸变为天冬酰胺(SEQ ID NO:4：NCgl2176 K176N)。
引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P1:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCGGCGACCGCATGGACACCG 3'(SEQ ID NO:5)
P2:5'CCGGGGACTGGTTTTCGGGTGTTGGTGTGC 3'(SEQ ID NO:6)
P3:5'GCACACCAACACCCGAAAACCAGTCCCCGG 3'(SEQ ID NO:7)
P4:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCGAGGTCTCTCAGAATCGGT 3'(SEQ ID NO:8)
构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4，进行PCR扩增。
PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg 2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸40s(30个循环)，72℃过度延伸10min，获得两条大小分别为796bp和786bp，含有NCgl 2176基因编码区的DNA片段(NCgl2176Up和NCgl2176Down)。
将上述两条DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，再以上述两条DNA片段为模板，以 P1和P4为引物，通过重叠PCR扩增长约1552bp的片段。
PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg 2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
此DNA片段(NCgl 2176 A528C)导致YP97158NCgl2176基因编码区的第528位的腺嘌呤(A)变为胞嘧啶(C)，最终导致编码蛋白的第176位氨基酸由赖氨酸(K)变为天冬酰胺(N)。
将pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司)用Xba I酶切后，用琼脂糖凝胶电泳分离纯化NCgl2176 A528C和线性化的pK18mobsacB质粒，再通过NEBuider重组系统组装，获得载体pK18-NCgl2176 A528C，该质粒上含有卡那霉素抗性标记。并将载体pK18-NCgl2176 A528C送测序公司测序鉴定，将含有正确点突变(A-C)的载体pK18-NCgl2176 A528C保存备用。
实施例2构建包含点突变的NCgl2176 A528C的工程菌株
构建方法：将等位替换质粒pK18-NCgl2176 A528C通过电击转化入L-赖氨酸生产菌株YP97158中(其构建方法可参见WO2014121669A1；经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的NCgl2176基因编码区)，对培养产生的单菌落分别通过引物P1和通用引物M13R进行鉴定，能扩增出大小约1559bp条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用如下引物(上海invitrogen公司合成)进行PCR鉴定：
P5:5'GAAAACACCGCCCGAATC 3'(SEQ ID NO:9)
P6:5'GGAGTGCGTGTTTGTTGATG 3'(SEQ ID NO:10)
上述PCR扩增产物通过高温变性、冰浴后进行sscp电泳(以质粒pK18-NCgl2176 A528C扩增片段为阳性对照，YP97158扩增片段为阴性对照，水作为空白对照)，由于片段结构不同，电泳位置不同，因此片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。以引物P5和P6再次通过PCR扩增等位替换成功的菌株目的片段，并连接到PMD19-T载体测序，通过序列比对碱基序列发生突变的序列验证菌株的等位替换成功，并被命名为YPL-4-011。
实施例3构建基因组上过表达NCgl2176或NCgl2176 A528C基因的工程菌株
依据NCBI公布的野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，设计并合成三对扩增上下 游同源臂片段及NCgl2176或NCgl 2176 A528C基因编码区及启动子区序列的引物，以同源重组的方式在菌株YP97158中引入NCgl2176或NCgl2176 A528C基因。
引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P7:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCGTTCTGGACTGAGG3'(SEQ ID NO:11)
P8:5'AACACCATTGTCCCTGTTTTGGGCGAAATTTTCCCGGTGCACCGAGAACAGATG3'(SEQ ID NO:12)
P9:5'CGGGAAAATTTCGCCCAAAACAGGGACAATGGTGTTATGGCATTTGCAGACATTGTGCGC3'(SEQ ID NO:13)
P10:5'CTTGATTTAATTGCGCCATCTCAGGCGAACGGCTTCGTCTCGTAG3'(SEQ ID NO:14)
P11:5'CTACGAGACGAAGCCGTTCGCCTGAGATGGCGCAATTAAATCAAG 3'(SEQ ID NO:15)
P12:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCTATGACACCTTCAACGGATC 3'(SEQ ID NO:16)
构建方法：分别以谷氨酸棒杆菌ATCC13032或YPL-4-011为模板，分别以引物P7/P8，P9/P10，P11/P12进行PCR扩增，获得上游同源臂片段约720bp，NCgl2176基因及其启动子片段约1092bp，NCgl2176 A528C基因及其启动子片段约1092bp，及下游同源臂片段约653bp。再以P7/P12为引物，以以上扩增的三个片段(上游同源臂片段，NCgl2176基因及其启动子片段，下游同源臂片段；或者，上游同源臂片段，NCgl2176 A528C基因及其启动子片段，下游同源臂片段)混合为模板进行扩增，获得整合同源臂片段。
PCR反应结束后，对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒(TIANGEN)进行回收所需要的约2504bp的DNA片段，采用NEBuider重组系统与经Xba I酶切回收的穿梭质粒PK18mobsacB相连接，分别获得整合质粒PK18mobsacB-NCgl2176或PK18mobsacB-NCgl2176 A528C，质粒上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。
PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg 2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸120s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
将2个整合质粒分别电转化入L-赖氨酸生产菌菌株YP97158中，对培养产生的单菌落通过P13/P14引物进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小约1609bp的片段的为阳性菌株，扩增不到片 段的为原菌。阳性菌株经15％蔗糖筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P15/P16引物进行PCR鉴定，扩增出大小约1123bp的菌为NCgl2176或NCgl2176 A528C基因整合到YP97158基因组上的菌株，其分别被命名为YPL-4-012(不含突变点)和YPL-4-013(含突变点)。
P13:5'TCCAAGGAAGATACACGCC 3'(SEQ ID NO:17)
P14:5'CCTGAGCGGAATAGTCCTGTG3'(SEQ ID NO:18)
P15:5'ACGCACCCGTGTTCTACCT3'(SEQ ID NO:19)
P16:5'CGTTGGAATCTTGCGTTG 3'(SEQ ID NO:20)
实施例4构建质粒上过表达NCgl2176或NCgl2176 A528C基因的工程菌株
依据NCBI公布的野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，设计并合成一对扩增NCgl2176或NCgl2176 A528C基因编码区及启动子区序列的引物，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P17:5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCGGGAAAATTTCGCCCAAAACAG3'(SEQ ID NO:21)
P18:5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACTCAGGCGAACGGCTTCGTCTCGTAG 3'(SEQ ID NO:22)
构建方法：分别以野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032或YPL-4-011为模板，以引物P17/P18进行PCR扩增，获得NCgl2176或NCgl2176 A528C基因及其启动子片段1140bp，对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行回收所需要的1140bp的DNA片段，采用NEBuider重组系统与经EcoR I酶切回收的穿梭质粒pXMJ19相连接，获得过表达质粒pXMJ19-NCgl2176或pXMJ19-NCgl2176 A528C。质粒上含有氯霉素抗性标记，可以通过氯霉素筛选获得质粒转化到菌株中。
PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg 2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
将质粒分别电转化入L-赖氨酸生产菌菌株YP97158中，对培养产生的单菌落通过M13R(-48)和P18引物进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小约1147bp的片段的为转入菌株，其分别被命名为YPL-4-014(不含点突变)和YPL-4-015(含点突变)。
实施例5构建基因组上缺失NCgl2176基因的工程菌株
根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组序列，合成两对扩增NCgl2176基因编码区两端片段的引物，作为上下游同源臂片段。引物设计如下(上海英俊公司合成)：
P19:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGTCAAAGAGGGCGAGATAAT3'(SEQ ID NO:23)
P20:5'GTTCATGAGACACCCAGTAGG ACGACCTACAGAATACTAGTCAGTG 3'(SEQ ID NO:24)
P21:5'CACTGACTAGTATTCTGTAGGTCGTCCTACTGGGTGTCTCATGAAC 3'(SEQ ID NO:25)
P22:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCACCGCACGATGGTTCACT3'(SEQ ID NO:26)
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，分别以引物P19/P20及P21/P22进行PCR扩增，获得上游同源臂片段852bp及下游同源臂片段787bp；再用引物P19/P22进行重叠PCR得到整个同源臂片段1639PCR反应结束后，对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行回收所需要的1639bp的DNA片段，并通过NEBuider重组系统与经Xba I酶切回收的穿梭质粒pk18mobsacB质粒相连接，获得敲除质粒。该质粒上含有卡那霉素抗性标记。
将敲除质粒电转化入赖氨酸生产菌株YP97158，对培养产生的单菌落分别通过如下引物(上海英俊公司合成)进行PCR鉴定：
P23:5'TCAAAGAGGGCGAGATAAT 3'(SEQ ID NO:27)
P24:5'ACCGCACGATGGTTCACT 3'(SEQ ID NO:28)
上述PCR扩增出大小1521bp及2556bp的条带的菌株为阳性菌株，只扩增出2556bp条带的菌株为原菌。阳性菌株在15％蔗糖培养基上筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P23/P24引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1521bp条带的菌株为NCgl2176基因编码区被敲除的基因工程菌株，其被命名为YPL-4-016。
实施例6 L-赖氨酸发酵实验
将实施例2-5构建的菌株和原始菌株YP97158在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(购自上海百仑生物科技有限公司)中以表1所示的培养基和表2所示的控制工艺进行发酵实验。每个菌株重复三次，结果如表3所示。
表3 L-赖氨酸发酵实验结果
菌株 L-赖氨酸产量(g/100ml) OD(660nm)
YP97158 18.8 37.3
YPL-4-011 19.0 37.2
YPL-4-012 19.3 36.5
YPL-4-013 19.8 37.0
YPL-4-014 20.1 36.8
YPL-4-015 20.3 35.9
YPL-4-016 18.2 36.7
结果如表3所示，在谷氨酸棒杆菌中对NCgl2176基因过表达，或者对NCgl2176基因编码区进行点突变NCgl2176 A528C及过表达，有助于L-赖氨酸产量的提高，而对基因进行弱化或敲除，不利于赖氨酸的积累。
实施例7构建包含点突变的dapB基因启动子区的转化载体pK18-PdapB (C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)
依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，设计并合成两对扩增dapB基因启动子区序列的引物，以等位基因置换的方式在菌株YP97158背景中的dapB基因启动子区(SEQ ID NO:29)中引入点突变，dapB基因启动子区核苷酸序列的-49bp位C变为A、-51bp位的G变为T、-54--58bp CTGCA变为GGTGT(SEQ ID NO:30)。
引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P1’:5' CCGGAATTCACCATGCCGGACATGCGGAC3'(EcoR I)(SEQ ID NO:31)
P2’:5'CCTTCTGAACGGGTTGTGGTATAATGGTGG 3'(SEQ ID NO:32)
P3’:5'CCACCATTATACCACAACCCGTTCAGAAGG 3'(SEQ ID NO:33)
P4’:5' ACATGCATGCGAATATTGACGTTGAGGAAG 3'(Sph I)(SEQ ID NO:34)。
构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，分别以引物P1’和P2’，P3’和P4’，进行PCR扩增。
PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg 2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸60s，30个循环，72℃过度延伸10min。
获得含有点突变的、长度分别为665bp和644bp的两条DNA片段(dapB Up和dapB Down片段)。将上述两条DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，再以纯化后的两条DNA片段为模板，以P1’和P4’为引物，通过Overlap PCR扩增出长度约为1279bp的片段(Up-Down片段)。
Overlap PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg 2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
所述Overlap PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸90s，30个循环，72℃过度延伸10min。
将上述Up-Down片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化，该片段包含dapB基因启动子区及其上下游序列，且片段两端分别含有EcoR I和Sph I酶切位点。此DNA片段导致YP97158 dapB基因启动子区的-49bp位的C变为A、-51bp位的G变为T、-54--58bp CTGCA变为GGTGT。
将片段双酶切(EcoR I/Sph I)后纯化回收，与同样双酶切(EcoR I/Sph I)后的穿梭质粒pK18mobsacB(购自Addgene公司)相连接，获得等位替换质粒pK18-PdapB (C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)，该质粒上含有卡那霉素抗性标记。并将载体pK18-PdapB (C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)送测序公司测序鉴定，将含有正确点突变的载体pK18-PdapB (C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)保存备用。
实施例8构建包含点突变的pK18-PdapB (C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)的工程菌株
将等位替换质粒pK18-PdapB (C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)通过电击转化入L-赖氨酸生产菌株YP97158中(经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的dapB基因启动子)，对培养产生的单菌落分别通过引物P1’和通用引物M13F进行鉴定，能扩增出1350bp大小条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养。
在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用如下引物(上海invitrogen公司合成)进行PCR鉴定：
P5’:5'AGATCGTCGGACTCATTGAC3'(SEQ ID NO:35)
P6’:5'CAAACATAGTTCCACCTGTG 3'(SEQ ID NO:36)
上述PCR扩增产物通过高温变性、冰浴后进行SSCP电泳(以质粒pK18-PdapB (C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)扩增片段为阳性对照，YP97158扩增片段为阴性对照，水作为空白对照)，由于片段结构不同，电泳位置不同，因此片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。再次通过PCR扩增 阳性菌株目的片段，并连接到PMD19-T载体测序，通过序列比对，碱基序列发生突变的序列验证菌株的等位替换成功，并被命名为YPL-4-010。
实施例9 L-赖氨酸发酵实验
将实施例8构建的菌株YPL-4-010和原始菌株YP97158在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(购自上海百仑生物科技有限公司)中以表1所示的培养基和表2所示的控制工艺进行发酵实验。每个菌株重复三次，结果如表4所示。
表4 L-赖氨酸发酵实验结果
Figure PCTCN2020141539-appb-000010
注：转化率＝(赖氨酸的总质量/葡萄糖的总消耗量)×100％
结果如表4所示，在谷氨酸棒杆菌中对dapB基因启动子进行点突变PdapB (C(-49)A,G(-51)T,CTGCA(-54--58)GGTGT)，有助于L-赖氨酸产量的提高。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

  1. 一种生成L-赖氨酸的属于棒杆菌属的微生物，其特征在于，具有编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达，和/或，SEQ ID NO:29所示的启动子区域第-49位、第-51位、第-54～-58位的碱基发生突变；
    优选，所述改善的表达是编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。
  2. 如权利要求1所述的微生物，其特征在于，编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的点突变，使得SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第176位赖氨酸被不同的氨基酸所取代；优选第176位赖氨酸被天冬酰胺所取代。
  3. 如权利要求1-2任一项所述的微生物，其特征在于，编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
  4. 如权利要求1-3任一项所述的微生物，其特征在于，所述具有点突变的多核苷酸序列是由SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第528位碱基发生突变而形成的；
    优选，所述突变包括SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第528位碱基由腺嘌呤(A)突变为胞嘧啶(C)；
    优选，所述具有点突变的多核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。
  5. 如权利要求1-4任一项所述的微生物，其特征在于，SEQ ID NO:29所示的启动子区域的第-49位核苷酸胞嘧啶(C)突变为腺嘌呤(A)、第-51位的核苷酸鸟嘌呤(G)突变为胸腺嘧啶(T)、第-54～-58位的核苷酸CTGCA突变为GGTGT；
    优选，所述启动子核苷酸序列如下所述：
    (a)SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列；或者是，
    (b)与SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列具有90％以上，优选的具有95％以上、或98％以上同一性的核苷酸序列，且其保留(a)所述启动子的增强活性，并且第-49位核苷酸保持为腺嘌呤(A)、第-51位的核苷酸保持为胸腺嘧啶(T)、第-54～-58位的核苷酸保持为GGTGT。
  6. 如权利要求1-5任一项所述的微生物，其特征在于，所述微生物是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)；优选为YP97158。
  7. 一种多核苷酸序列，其特征在于，包括编码含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多核苷酸，其第176位赖氨酸被不同的氨基酸所取代；优选第176位赖氨酸被天冬酰胺所取代；
    优选所述多核苷酸序列包括编码含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的多核苷酸；
    优选所述多核苷酸序列是由SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第528位碱基发生突变而形成的；优选所述突变是SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第528位碱基由腺嘌呤(A)突变为胞嘧啶(C)；
    优选所述多核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。
  8. 一种氨基酸序列，其特征在于，所述序列如SEQ ID NO:4所示。
  9. 一种重组载体，其特征在于，包含权利要求7所述的多核苷酸序列。
  10. 一种重组菌株，其特征在于，包含权利要求7所述的多核苷酸序列。
  11. 一种启动子核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:29所示的启动子区域第-49位、第-51位、第-54～-58位的碱基发生突变形成的核苷酸序列；
    优选，SEQ ID NO:29所示的启动子区域的第-49位核苷酸胞嘧啶(C)突变为腺嘌呤(A)、第-51位的核苷酸鸟嘌呤(G)突变为胸腺嘧啶(T)、第-54～-58位的核苷酸CTGCA突变为GGTGT。
  12. 如权利要求11所述的启动子核苷酸序列，其特征在于，所述启动子核苷酸序列如下所述：
    (a)SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列；或者是，
    (b)与SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列具有90％以上，优选的具有95％以上、或98％以上同一性的核苷酸序列，且其保留(a)所述启动子的增强活性，并且第-49位核苷酸保持为腺嘌呤(A)、第-51位的核苷酸保持为胸腺嘧啶(T)、第-54～-58位的核苷酸保持为GGTGT。
  13. 一种启动子的表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求11-12任一项所述的启动子核苷酸序列，和可操纵地连接在所述启动子后的编码序列；
    优选，所述编码序列为dapB基因的编码序列。
  14. 一种重组载体，其特征在于，包含权利要求11-12任一项所述的启动子核苷酸序列；
    优选，所述启动子核苷酸序列与pK18mobsacB质粒相连接来构建所述重组载体。
  15. 一种重组菌株，其特征在于，包含权利要求11-12任一项所述的启动子核苷酸序列，或包含权利要求13所述的表达盒，或包含权利要求14所述的重组载体；
    优选，所述重组菌株的宿主菌株是YP97158。
  16. 一种生产L-赖氨酸的方法，所述方法包括：培养权利要求1-6任一项所述的微生物或者权利要求10或15所述的重组菌株，并从所述培养物中回收L-赖氨酸。
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