CN111961635B - 一种产l-赖氨酸的重组菌株及其构建方法与应用 - Google Patents

一种产l-赖氨酸的重组菌株及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种对谷氨酸棒杆菌中NCgl1575基因编码序列引入点突变或改进其表达的方法，所述方法可以使带有所述突变的菌株提高L‑赖氨酸的发酵产量。所述点突变是使NCgl1575基因序列第1775位碱基由腺嘌呤(A)突变为胸腺嘧啶(T)，使编码的相应氨基酸序列第592位酪氨酸(Y)被苯丙氨酸(F)所取代。

Description

一种产L-赖氨酸的重组菌株及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种产L-赖氨酸的重组菌株及其构建方法与应用。
背景技术
L-赖氨酸具有促进发育、增强免疫力和提高中枢神经组织功能等生理功效，是人体和动物不能自身合成且生长必需的8种基本氨基酸之一。目前，L-赖氨酸是世界上的第二大氨基酸品种，主要生产方法是发酵法，其中谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)等是赖氨酸的重要生产菌株。L-赖氨酸工业产量的约90％用作饲料工业中的营养强化剂，10％用作食品工业中的鲜味剂和甜味剂，以及医药行业中的药物中间体。
对发酵法生产L-赖氨酸的改进可以涉及发酵技术如搅拌和供应氧气；或涉及营养培养基的组成，例如发酵过程中的糖浓度；或涉及将发酵液加工成合适的产品形式，例如通过干燥和造粒发酵液或离子交换色谱；或可以涉及相关微生物本身的固有性能性质。
用于改善这些微生物的性能性质的方法包括是诱变、突变体的选择和筛选。以这种方式获得的菌株对抗代谢物具有抗性或对于具有调节重要性的代谢物是营养缺陷型并产生L-赖氨酸。
发明内容
本发明提供了生成L-赖氨酸的属于棒杆菌属的微生物，其中编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的表达改善。本发明还提供了通过使用所述微生物生产L-赖氨酸的方法。
本发明的第一个方面提供了生成L-赖氨酸的属于棒杆菌属的微生物，其具有编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达。根据本发明，所述改善的表达是所述多核苷酸表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的具有点突变，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。
所述SEQ ID NO:3的氨基酸序列是基因NCgl1575编码的蛋白。
所述微生物与野生型或亲本菌株相比具有增强的L-赖氨酸生产能力。
所述多核苷酸可以编码与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有约90％或更高、约92％或更高、约95％或更高、约97％或更高、约98％或更高、或约99％或更高的序列同源性的氨基酸序列。如本文中使用的，术语“同源性”指两种多核苷酸或两种多肽模块之间的百分比同一性。可以通过使用本领域中已知的方法测定一种模块和另一种模块之间的序列同源性。例如，可以通过BLAST算法测定此类序列同源性。
可以如下增强多核苷酸的表达：通过取代或突变表达调节序列、对多核苷酸序列引入突变、通过经由染色体插入或载体导入的多核苷酸拷贝数的增加、或其组合等。
可以修饰多核苷酸的表达调节序列。表达调节序列控制与其可操作连接的多核苷酸的表达，并且例如可以包括启动子、终止子、增强子、沉默子等。多核苷酸可以具有起始密码子的变化。可以将多核苷酸掺入染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。在本文，特定的位点可以包括例如转座子位点或基因间位点。另外，可以将多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。
在本发明的一种实施方式中，通过将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。
在本发明的一种实施方式中，通过将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而过表达所述核酸序列。
在本发明的一种实施方式中，将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。
在本发明的一种实施方式中，将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而过表达所述氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述多核苷酸可以包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的具有点突变，使得SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第592位酪氨酸被不同的氨基酸所取代。
根据本发明，优选第592位酪氨酸被苯丙氨酸所取代。
根据本发明，SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，其中第592位酪氨酸(Y)被苯丙氨酸(F)所取代后的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在本发明的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列是由SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第1775位碱基发生突变而形成的。
根据本发明，所述突变包括SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第1775位碱基由腺嘌呤(A)突变为胸腺嘧啶(T)。
在本发明的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。
如本文中使用的，术语“可操作连接”指调节序列和多核苷酸序列之间的功能性连接，由此调节序列控制多核苷酸序列的转录和/或翻译。调节序列可以是能提高多核苷酸的表达水平的强启动子。调节序列可以是源自属于棒杆菌属的微生物的启动子或者可以是源自其它微生物的启动子。例如，启动子可以是trc启动子、gap启动子、tac启动子、T7启动子、lac启动子、trp启动子、araBAD启动子或cj7启动子。
在本发明的一个具体实施方式中，所述启动子是编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸(NCgl1575基因)的启动子。
如本文中使用的，术语“载体”指含有基因的调节序列和基因序列并且配置为在合适的宿主细胞中表达靶基因的多核苷酸构建体。或者，载体又可以指多核苷酸构建体，其含有可用于同源重组的序列，从而由于对宿主细胞导入的载体，可以改变宿主细胞的基因组中的内源基因的调节序列，或者可以将可以表达的靶基因插入宿主的基因组的特定位点中。在这点上，本发明中使用的载体可以进一步包含选择标志物以确定载体对宿主细胞的导入或者载体对宿主细胞的染色体的插入。选择标志物可以包含赋予可选择表型，诸如药物抗性、营养缺陷型、针对细胞毒剂的抗性、或表面蛋白的表达的标志物。在用此类选择剂处理的环境中，由于仅表达选择标志物的细胞可以存活或者显示不同表型性状，可以选择经转化的细胞。
在本发明的一些具体实施方式中，使用的载体是pK18mobsacB质粒，pXMJ19质粒。
如本文中使用的，术语“转化”指将多核苷酸导入宿主细胞中，从而多核苷酸可以作为基因组外元件或者以插入宿主细胞的基因组中能复制。转化本发明中使用的载体的方法可以包括将核酸导入细胞的方法。另外，如相关技术中公开的，可以根据宿主细胞实施电脉冲方法。
根据本发明，属于棒杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)。
在本发明的一个实施方案中，所述属于棒杆菌属的微生物是谷氨酸棒杆菌YP97158，保藏编号：CGMCC No.12856，保藏日期：2016年8月16日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话：010-64807355。
根据本发明，所述微生物还可以具有与提高L-赖氨酸产量有关的其他改进，例如，与NADPH生成相关的基因(例如编码葡萄糖脱氢酶的基因、编码葡糖酸激酶的基因、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因、编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因、或编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的基因)和/或与L-赖氨酸生物合成或分泌相关的其他基因(例如编码天冬氨酸氨基转移酶的基因、编码天冬氨酸激酶的基因、编码天冬氨酸半醛脱氢酶的基因、编码二氢吡啶二羧酸合酶的基因、编码二氢吡啶二羧酸还原酶的基因、编码间-二氨基庚二酸脱氢酶的基因、编码二氨基庚二酸脱羧酶的基因，lysE)的增强或降低的表达，或者可以使基因被外来基因取代。
本发明的第二个方面，提供一种多核苷酸序列，由该多核苷酸序列编码的氨基酸序列，包括所述多核苷酸序列的重组载体，含有所述多核苷酸序列的重组菌株。
根据本发明，所述多核苷酸序列包括编码含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，其中第592位酪氨酸被不同的氨基酸所取代。
根据本发明，优选第592位酪氨酸被苯丙氨酸所取代。
根据本发明，SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，其中第592位酪氨酸(Y)被苯丙氨酸(F)所取代后的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
根据本发明，优选所述编码含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列含有如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列。
在本发明的一个实施方式中，所述多核苷酸序列是由SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第1775位碱基发生突变而形成的。
根据本发明，所述突变是指所述位点的碱基/核苷酸发生变化，所述突变方法可以选自诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。在本发明中，优选采用PCR定点突变法和/或同源重组。
根据本发明，所述突变包括SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第1775位碱基由腺嘌呤(A)突变为胸腺嘧啶(T)。
在本发明的一个实施方式中，所述多核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。
根据本发明，所述氨基酸序列包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
根据本发明，所述重组载体是将所述多核苷酸序列导入质粒构建而成。
在本发明的一个实施方式中，所述质粒为pK18mobsacB质粒。
在本发明的另一个实施方式中，所述质粒为pXMJ19质粒。
具体地，可以将所述多核苷酸序列和所述质粒通过NEBuider重组系统构建成重组载体。
根据本发明，所述重组菌株含有所述的多核苷酸序列。
作为本发明的一个实施方案，所述重组菌株的出发菌为YP97158。
本发明的第三个方面，还提供一种棒杆菌重组菌株的构建方法。
根据本发明，所述构建方法包括如下步骤：
改造宿主菌株中如SEQ ID NO:1所示的野生型NCgl1575的多核苷酸序列，使其第1775位碱基发生突变，得到包含突变NCgl1575编码基因的棒杆菌重组菌株。
根据本发明的构建方法，所述改造包括诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。
根据本发明的构建方法，所述突变是指SEQ ID NO:1中第1775位碱基由腺嘌呤(A)突变为胸腺嘧啶(T)；具体地，所述包含突变NCgl1575编码基因的多核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
进一步地，所述构建方法包括如下步骤：
(1)改造如SEQ ID NO:1所示的野生型NCgl1575基因的核苷酸序列，使其第1775位碱基发生突变，得到突变的NCgl1575基因多核苷酸序列；
(2)将所述突变的多核酸序列与质粒连接，构建重组载体；
(3)将所述重组载体导入宿主菌株，得到所述包含突变NCgl1575编码基因的棒杆菌重组菌株。
根据本发明的构建方法，所述步骤(1)包括：点突变的NCgl1575基因构建：根据谷氨酸棒杆菌的基因组序列，合成两对扩增NCgl1575基因片段的引物P1和P2及P3和P4，通过PCR定点突变法在野生型NCgl1575基因SEQ ID NO:1中引入点突变，得到点突变的NCgl1575基因核苷酸序列SEQ ID NO:2，记为NCgl1575A1775T。
在本发明的一个实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌基因组可以来源于ATCC13032菌株，其基因组序列可以从NCBI网站获取。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)中，所述引物为：
P1:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGTGCGTTCGTCTGCGGTTTCG 3'(SEQID NO:5)
P2:5'ATCGACGCCGCCCCATTCACCCTTCTGATG 3'(SEQ ID NO:6)；
P3:5'CATCAGAAGGGTGAATGGGGCGGCGTCGAT 3'(SEQ ID NO:7)；
P4:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCAAGCCTCGACCCCTACATC 3'(SEQID NO:8)
在本发明的一个实施方案中，所述PCR扩增按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸40s(30个循环)。
在本发明的一个实施方案中，所述重叠PCR扩增按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸90s(30个循环)。
根据本发明的构建方法，所述步骤(2)包括重组质粒的构建，包括：将分离纯化后的NCgl1575A1775T和pK18mobsacB质粒，通过NEBuider重组系统组装，获得重组质粒pK18-NCgl1575A1775T。
根据本发明的构建方法，所述步骤(3)包括重组菌株的构建，将重组质粒pK18-NCgl1575A1775T转化至宿主菌株，得到重组菌株。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤(3)的转化为电转化法。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是YP97158。
在本发明的一个实施方式中，所述重组是通过同源重组实现的。
本发明的第四个方面，还提供一种棒杆菌重组菌株的构建方法。
根据本发明，所述构建方法包括如下步骤：
扩增NCgl1575基因的上下游同源臂片段、NCgl1575基因编码区及其启动子区序列，或者，NCgl1575A1775T基因编码区及其启动子区序列，以同源重组的方式在宿主菌株的基因组中引入NCgl1575或NCgl1575A1775T基因，以实现所述菌株过表达NCgl1575或NCgl1575A1775T基因。
在本发明的一个实施方式中，扩增上游同源臂片段的引物是：
P7：5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCGTTCTGGACTGAGG 3'(SEQID NO:11)
P8：5'GAAACGGCCTTAAGCTAGGTGCACCGAG AACAGATG 3'(SEQ ID NO:12)。
在本发明的一个实施方式中，扩增下游同源臂片段的引物是：
P11：5'AACCGGGCGG GAAAAGCTTGATGGCGCAATTAAATCAAG 3'(SEQ ID NO:15)
P12：5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC GCTAT GACACCTTCAACGGATC3'(SEQ ID NO:16)。
在本发明的一个实施方式中，扩增所述基因编码区及其启动子区序列的引物是：
P9：5'CATCTGTTCTCGGTGCAC CTAGCTTAAG GCCGTTTC 3'(SEQ ID NO:13)
P10：5'CTTGATTTAATTGCGCCATCAAGCTTTTCC CGCCCGGTT 3'(SEQ ID NO:14)。
在本发明的一个实施方式中，以前述P7/P12为引物，以扩增获得的上游同源片段、下游同源片段和带有自身启动子的NCgl1575或NCgl1575A1775T三个片段混合为模板进行扩增，获得整合同源臂片段。
在本发明的一个实施方式中，所采用的PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTPMixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸180s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
在本发明的一个实施方式中，采用NEBuider重组系统，将穿梭质粒PK18mobsacB和整合同源臂片段组装，获得整合质粒。
在本发明的一个实施方式中，将整合质粒转染宿主菌株，以同源重组的方式在宿主菌株的基因组中引入NCgl1575或NCgl1575A1775T基因。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是YP97158。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是携带有SEQ ID NO:2所示多核苷酸序列的菌株。
本发明的第五个方面，还提供一种棒杆菌重组菌株的构建方法。
根据本发明，所述构建方法包括如下步骤：
扩增NCgl1575基因编码区及启动子区序列，或NCgl1575A1775T基因编码区及启动子区序列，构建过表达质粒载体，将所述载体转入宿主菌株中，以实现所述菌株过表达NCgl1575或NCgl1575A1775T基因。
在本发明的一个实施方式中，扩增所述基因编码区及其启动子区序列的引物是：
P17：5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCC CTAGCT TAAG GCCGTTTC 3'(SEQ ID NO:21)
P18：5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAAC AAGCTTT
TCC CGCCCGGTT 3'(SEQ ID NO:22)。
在本发明的一个实施方式中，所述PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTPMixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸120s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
在本发明的一个实施方式中，采用NEBuider重组系统，将穿梭质粒pXMJ19和带有自身启动子的NCgl1575或NCgl1575A1775T片段组装，获得过表达质粒。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是YP97158。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是携带有SEQ ID NO:2所示多核苷酸序列的菌株。
本发明获得重组菌株可以单独应用于发酵生产L-赖氨酸中，也可以和其他产L-赖氨酸的细菌混合发酵生产L-赖氨酸。
本发明的另一个方面提供了生产L-赖氨酸的方法，该方法包括培养微生物；并且从培养物中获得L-赖氨酸。
可以在本领域中已知的培养条件下在合适的培养基中进行微生物的培养。培养基可以包含：碳源、氮源、微量元素、及其组合。在培养中，可以调节培养物的pH。此外，培养时可以包括防止气泡产生，例如通过使用消泡剂进行气泡产生的防止。此外，培养时可以包括将气体注射入培养物中。气体可以包括能够维持培养物的需氧条件的任何气体。在培养中，培养物的温度可以是20至45℃。可以从培养物回收生成的L-赖氨酸，即用硫酸或氢氯酸处理培养物，接着进行诸如阴离子交换层析、浓缩、结晶和等电点沉淀的方法的组合。
在本发明中：
SEQ ID NO:1：NCgl1575野生型ORF序列
ATGGCAGAATCAAACGCTATGGACCGGGCACAAATCTCTGCACTGCTAGATAGAGCACAGCACACAATCAACCTTGCCGAACAAGCAAACAACGTGCTCCGACTGTTGAAAACACCCGGAACGGCCACAGTAGGGGACAACGGGACACTCGGCACCGATACCTATCTGATCCCATCCCGCAACATCACCTGGCCTGACAACCTGTATGTCAACGTCTTTCTAGACGGCATGAATGCAGAAGCCACCCTTACCGATTACGTCGCATCAGTCGCTTCGATCCCACGCCTATGCCAGATCATCAACGAGGGCCAAGGCGGCATGTTCCGCAGACTATTCAACCCCACCAAGGTCCAAGCCGGCGACCAAGCTGTCTTCGACCTCATGGTCAAACTCGACGAGATTTCATCTACCACCCACGAAGTCTCCCGCATGCTCGAGGGCGTCCACGCTGCCCGCACCCGCCAACAACAAGGCGTTGCACTTTTCCCAGGTATTCATGGAGTGGGAGAGCGCTACATCGAACGCGCACAACAGGTACTCGCCTCAGCCCTCGGTATCGCTGGATTCGGTGCCGAACCCTGGGACGGACATACCCTTGCCCAAGCGCGCCGGGTAGTCCAACGCTACGCCCAAGATCCTAACTCCGAATACCGGCTGAAAAGCGAAGCCGAGAAACACCTCACATCCATCAACGAGCTCCGCGTACAGATACTCCTCGAACAACTCCCCGTTGATGCCCTACGCATGGCTACCGACCACCGCCTGCGCTTTGGATCCCTCGATTCCATCCACGTCGCAACCGTCGCCGACGTCCTAAAAACACACACCTCCATCCTCACCACCGTGCAAGGTATCGGCGCCCAAACCGCGGGGCGGATGAAAGCCGCAGCAGAAACACTCAAACAAGAAGCACTACGCCGCCAAAACACCTCCATCGGCGACGAACCTACCCAACCCGCCATGCGTCTAATCAACGTGCTGGCCCGCTTCGACCAAACCGAAACCATCACGCCCGAAGAACGCGCCCGCCGCACCCGCGTCATCGACTACGTAGAACACATACCCCCAAGCCTCGACCCCTACATCGTCATCAACCCAGCAACGCCTGAGTTCAACAACTTCACCGACGACCTCCGCTGGATCGACGCAA ACCCCAACCT CTTCCACCCA CAAACAATCACCACCCCACCCGCCGACATCTGGGACGACTACATCTCCCGTCCCGCTCACTACCAAGGCCTGCTAGCCACGCTGCTCGGCCGCGACATCGAAGGCGCAGACGAACTCCTCGACGCCACCACCCTCCAAAAAATCAGAGACCTCACCCTCGACAAAACTCATCTCACCGACCTCCACCTCC GCGGATACCA ATCATTCGGCGCCCGCTTCGCCATCATCCAAAAGAAAACCCTCCTCGGCGACGACATGGGACTCGGCAAAACAGTCCAAGCCCTCTCCGCAGCTGCACACCTTGCCGCCACCGAAAAAGACTTCCGCACCCTCGTCGTCGTACCCGCATCCGTCATTGTTAACTGGACCCGCGAATGCAAACGCTTCCTCAACCTCCCCGTATTCATCGC CCACGGAGACAACAAACAAGACGCCATCAACGCCTGGTCTAACACCAACGGAATCGCAATCTGCACCTACGACGGCGTCCGCACCATGGACATCCCCGCGCCGGGTCTGGTCATTGCCGATGAAGCCCACCTGATCAAAAACCCCTCCACCAAACGCACCCAAGCACTGCGCAAACTTATCGACGCCGCCCCATACACCCTTCTGATGACCGGCACACCACTAGAAAACAAAGTGGAAGAGTTTGTAAATCTCGTGCGCTACATCCAACCGGAGCTGATCACCCGTGGCATGTCCAAAATGCAGGCCGAGAATTTCCGCGAGCGCATCGCACCAGCCTATCTGCGCAGAAATCAAGCTGATGTGCTTGACGAACTCCCAGAGCGCACCGACTCCATCGACTGGATCGACCTCACCCCAGAAGACCGCAGCGCCTACGACGACCAAGTCCGCCAAGGCAGCTGGATGGGCATGCGCCGCTCCGCCATGCTCTCACCAACACCACGCCTAACTTCCGCAAAAATGCAACGCATCCTAGAACTCTTCGAAGAAGCAGAAGAACACGGCCGCAAAGCCCTCATCTTCACCTACTTCCTCGACGTCCTCGACGAACTGGAAAAGCATCTAGGCGAGCGCGTCATCGGCCGCATTTCCGGCGACGTGCCAGCCACCAAGCGCCAATTGCTTGTCGACGCCCTGTCCCACTCCAAACCCGGATCCGCCCTCATTGCCCAAATCACCGCCGGGGGAGTAGGCCTAAACATCCAATCCGCGAGCCTATGCATTATTTGTGAACCTCAAGTAAAGCCAACCATCGAACAGCAGGCCGTCGCCCGAGTCCACCGCATGGGCCAAACCGCCACCGTCCAAGTCCACCGACTCATCGGCGACGAAACCGCAGACGAACGCATGCTAGAAATCCTGGCAGGCAAAACTCACGTCTTCGACGTCTACGCCCGGCTATCTGAAACCGCAGAGATTCCAGATGCTGTGGATATCACTGAATCACAGCTGGCAGCACGGGTTATTGATGAGGAGCGTGCACGGTTAGGGCTTACTGAATCCACTGGCC CTAAAGATGA AGAAACGGCC TTAAGCTAG
SEQ ID NO:2：NCgl1575A1775T ORF序列
ATGGCAGAATCAAACGCTATGGACCGGGCACAAATCTCTGCACTGCTAGATAGAGCACAGCACACAATCAACCTTGCCGAACAAGCAAACAACGTGCTCCGACTGTTGAAAACACCCGGAACGGCCACAGTAGGGGACAACGGGACACTCGGCACCGATACCTATCTGATCCCATCCCGCAACATCACCTGGCCTGACAACCTGTATGTCAACGTCTTTCTAGACGGCATGAATGCAGAAGCCACCCTTACCGATTACGTCGCATCAGTCGCTTCGATCCCACGCCTATGCCAGATCATCAACGAGGGCCAAGGCGGCATGTTCCGCAGACTATTCAACCCCACCAAGGTCCAAGCCGGCGACCAAGCTGTCTTCGACCTCATGGTCAAACTCGACGAGATTTCATCTACCACCCACGAAGTCTCCCGCATGCTCGAGGGCGTCCACGCTGCCCGCACCCGCCAACAACAAGGCGTTGCACTTTTCCCAGGTATTCATGGAGTGGGAGAGCGCTACATCGAACGCGCACAACAGGTACTCGCCTCAGCCCTCGGTATCGCTGGATTCGGTGCCGAACCCTGGGACGGACATACCCTTGCCCAAGCGCGCCGGGTAGTCCAACGCTACGCCCAAGATCCTAACTCCGAATACCGGCTGAAAAGCGAAGCCGAGAAACACCTCACATCCATCAACGAGCTCCGCGTACAGATACTCCTCGAACAACTCCCCGTTGATGCCCTACGCATGGCTACCGACCACCGCCTGCGCTTTGGATCCCTCGATTCCATCCACGTCGCAACCGTCGCCGACGTCCTAAAAACACACACCTCCATCCTCACCACCGTGCAAGGTATCGGCGCCCAAACCGCGGGGCGGATGAAAGCCGCAGCAGAAACACTCAAACAAGAAGCACTACGCCGCCAAAACACCTCCATCGGCGACGAACCTACCCAACCCGCCATGCGTCTAATCAACGTGCTGGCCCGCTTCGACCAAACCGAAACCATCACGCCCGAAGAACGCGCCCGCCGCACCCGCGTCATCGACTACGTAGAACACATACCCCCAAGCCTCGACCCCTACATCGTCATCAACCCAGCAACGCCTGAGTTCAACAACTTCACCGACGACCTCCGCTGGATCGACGCAA ACCCCAACCT CTTCCACCCA CAAACAATCACCACCCCACCCGCCGACATCTGGGACGACTACATCTCCCGTCCCGCTCACTACCAAGGCCTGCTAGCCACGCTGCTCGGCCGCGACATCGAAGGCGCAGACGAACTCCTCGACGCCACCACCCTCCAAAAAATCAGAGACCTCACCCTCGACAAAACTCATCTCACCGACCTCCACCTCC GCGGATACCA ATCATTCGGCGCCCGCTTCGCCATCATCCAAAAGAAAACCCTCCTCGGCGACGACATGGGACTCGGCAAAACAGTCCAAGCCCTCTCCGCAGCTGCACACCTTGCCGCCACCGAAAAAGACTTCCGCACCCTCGTCGTCGTACCCGCATCCGTCATTGTTAACTGGACCCGCGAATGCAAACGCTTCCTCAACCTCCCCGTATTCATCGC CCACGGAGACAACAAACAAGACGCCATCAACGCCTGGTCTAACACCAACGGAATCGCAATCTGCACCTACGACGGCGTCCGCACCATGGACATCCCCGCGCCGGGTCTGGTCATTGCCGATGAAGCCCACCTGATCAAAAACCCCTCCACCAAACGCACCCAAGCACTGCGCAAACTTATCGACGCCGCCCCATTCACCCTTCTGATGACCGGCACACCACTAGAAAACAAAGTGGAAGAGTTTGTAAATCTCGTGCGCTACATCCAACCGGAGCTGATCACCCGTGGCATGTCCAAAATGCAGGCCGAGAATTTCCGCGAGCGCATCGCACCAGCCTATCTGCGCAGAAATCAAGCTGATGTGCTTGACGAACTCCCAGAGCGCACCGACTCCATCGACTGGATCGACCTCACCCCAGAAGACCGCAGCGCCTACGACGACCAAGTCCGCCAAGGCAGCTGGATGGGCATGCGCCGCTCCGCCATGCTCTCACCAACACCACGCCTAACTTCCGCAAAAATGCAACGCATCCTAGAACTCTTCGAAGAAGCAGAAGAACACGGCCGCAAAGCCCTCATCTTCACCTACTTCCTCGACGTCCTCGACGAACTGGAAAAGCATCTAGGCGAGCGCGTCATCGGCCGCATTTCCGGCGACGTGCCAGCCACCAAGCGCCAATTGCTTGTCGACGCCCTGTCCCACTCCAAACCCGGATCCGCCCTCATTGCCCAAATCACCGCCGGGGGAGTAGGCCTAAACATCCAATCCGCGAGCCTATGCATTATTTGTGAACCTCAAGTAAAGCCAACCATCGAACAGCAGGCCGTCGCCCGAGTCCACCGCATGGGCCAAACCGCCACCGTCCAAGTCCACCGACTCATCGGCGACGAAACCGCAGACGAACGCATGCTAGAAATCCTGGCAGGCAAAACTCACGTCTTCGACGTCTACGCCCGGCTATCTGAAACCGCAGAGATTCCAGATGCTGTGGATATCACTGAATCACAGCTGGCAGCACGGGTTATTGATGAGGAGCGTGCACGGTTAGGGCTTACTGAATCCACTGGCC CTAAAGATGA AGAAACGGCC TTAAGCTAG
SEQ ID NO:3：NCgl1575野生型编码蛋白序列
MAESNAMDRAQISALLDRAQHTINLAEQANNVLRLLKTPGTATVGDNGTLGTDTYLIPSRNITWPDNLYV NVFLDGMNAE ATLTDYVASV ASIPRLCQII NEGQGGMFRRLFNPTKVQAGDQAVFDLMVK LDEISSTTHE VSRMLEGVHA ARTRQQQGVA LFPGIHGVGERYIERAQQVLASALGIAGFG AEPWDGHTLA QARRVVQRYA QDPNSEYRLK SEAEKHLTSINELRVQILLEQLPVDALRMA TDHRLRFGSLDSIHVATVADVLKTHTSILTTVQGIGAQTAGRMKAAAETLKQEALRRQNT SIGDEPTQPA MRLINVLARF DQTETITPEE RARRTRVIDY VEHIPPSLDPYIVINPATPEFNNFTDDLRW IDANPNLFHP QTITTPPADI WDDYISRPAH YQGLLATLLGRDIEGADELL DATTLQKIRDLTLDKTHLTD LHLRGYQSFG ARFAIIQKKT LLGDDMGLGKTVQALSAAAH LAATEKDFRT LVVVPASVIVNWTRECKRFL NLPVFIAHGD NKQDAINAWSNTNGIAICTY DGVRTMDIPAPGLVIADEAHLIKNPSTKRTQALRKLIDAAPYTLLMTGTPLEN KVEEFVN LVRYIQPELI TRGMSKMQAE NFRERIAPAY LRRNQADVLDELPERTDSIDWIDLTPEDRS AYDDQVRQGS WMGMRRSAML SPTPRLTSAK MQRILELFEEAEEHGRKALIFTYFLDVLDE LEKHLGERVI GRISGDVPAT KRQLLVDALS HSKPGSALIAQITAGGVGLNIQSASLCIIC EPQVKPTIEQ QAVARVHRMG QTATVQVHRL IGDETADERMLEILAGKTHVFDVYARLSET AEIPDAVDIT ESQLAARVID EERARLGLTE STGPKDEETA LS
SEQ ID NO:4：NCgl1575 Y592F编码蛋白序列
MAESNAMDRAQISALLDRAQHTINLAEQANNVLRLLKTPGTATVGDNGTLGTDTYLIPSRNITWPDNLYV NVFLDGMNAE ATLTDYVASV ASIPRLCQII NEGQGGMFRRLFNPTKVQAGDQAVFDLMVK LDEISSTTHE VSRMLEGVHA ARTRQQQGVA LFPGIHGVGERYIERAQQVLASALGIAGFG AEPWDGHTLA QARRVVQRYA QDPNSEYRLK SEAEKHLTSINELRVQILLEQLPVDALRMA TDHRLRFGSLDSIHVATVADVLKTHTSILTTVQGIGAQTAGRMKAAAETLKQEALRRQNT SIGDEPTQPA MRLINVLARF DQTETITPEE RARRTRVIDY VEHIPPSLDPYIVINPATPEFNNFTDDLRW IDANPNLFHP QTITTPPADI WDDYISRPAH YQGLLATLLGRDIEGADELL DATTLQKIRDLTLDKTHLTD LHLRGYQSFG ARFAIIQKKT LLGDDMGLGKTVQALSAAAH LAATEKDFRT LVVVPASVIVNWTRECKRFL NLPVFIAHGD NKQDAINAWSNTNGIAICTY DGVRTMDIPAPGLVIADEAHLIKNPSTKRTQALRKLIDAAPFTLLMTGTPLEN KVEEFVN LVRYIQPELI TRGMSKMQAE NFRERIAPAY LRRNQADVLDELPERTDSIDWIDLTPEDRS AYDDQVRQGS WMGMRRSAML SPTPRLTSAK MQRILELFEEAEEHGRKALIFTYFLDVLDE LEKHLGERVI GRISGDVPAT KRQLLVDALS HSKPGSALIAQITAGGVGLNIQSASLCIIC EPQVKPTIEQ QAVARVHRMG QTATVQVHRL IGDETADERMLEILAGKTHVFDVYARLSET AEIPDAVDIT ESQLAARVID EERARLGLTE STGPKDEETA LS
有益效果
本发明通过对NCgl1575基因的弱化或敲除，发现该基因编码的产物对L-赖氨酸生产能力产生影响，通过在编码序列引入点突变，或者增加该基因的拷贝数或过表达获得重组菌株，所获得的菌株与未改造的菌株相比，有利于生产高浓度的L-赖氨酸。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备；所进行的操作都是本领域已知的，或者按照市售商品的用户手册进行。
以下实施例中培养所述菌株使用的基础培养基组成相同，在此基础培养基组成上添加相应需要的蔗糖、卡那霉素或氯霉素等，基础培养基组成如下：
成分 配方
蔗糖 10g/L
多聚蛋白胨 10g/L
牛肉膏 10g/L
酵母粉 5g/L
尿素 2g/L
氯化钠 2.5g/L
琼脂粉 20g/L
pH 7.0
培养温度 32度
实施例1构建包含点突变的NCgl1575基因编码区的转化载体pK18-NCgl1575A1775T
依据NCBI公布的野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，设计并合成两对扩增NCgl1575基因编码区序列的引物，以等位基因置换的方式在菌株YP97158(保藏编号：CGMCC No.12856，保藏日期：2016年8月16日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话：010-64807355，记载于中国专利申请CN106367432A(申请日2016年9月1日，公开日2017年2月1日)中)背景中的NCgl1575基因编码区(SEQ ID NO:1)中引入点突变，对应编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，NCgl1575基因的核苷酸序列第1775位A变为T(SEQ ID NO:2：NCgl1575 A1775T)，对应编码蛋白的氨基酸序列第592位酪氨酸变为苯丙氨酸(SEQ ID NO:4：NCgl1575 Y592F)。
引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P1:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG TGCGTTCGTCTGCGGTTTCG 3'(SEQID NO:5)
P2:5'ATCGACGCCGCCCCATTCACCCTTCTGATG 3'(SEQ ID NO:6)
P3:5'CATCAGAAGGGTGAATGGGGCGGCGTCGAT 3'(SEQ ID NO:7)
P4:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC AAGCCTCGACCCCTACATC 3'(SEQ ID NO:8)
构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4，进行PCR扩增。
PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸40s(30个循环)，72℃过度延伸10min，获得两条大小分别为766bp和759bp，含有NCgl1575基因编码区的DNA片段(NCgl1575 Up和NCgl1575Down)。
将上述两条DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，再以上述两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过重叠PCR扩增长约1495bp的片段。
PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
此DNA片段(NCgl1575 A1775T)导致YP97158 NCgl1575基因编码区的第1775位的腺嘌呤(A)变为胸腺嘧啶(T)，最终导致编码蛋白的第592位氨基酸由酪氨酸(Y)变为苯丙氨酸(F)。
将琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的NCgl1575 A1775T和用Xba I酶切回收的pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司)用NEBuider重组系统组装，获得载体pK18-NCgl1575A1775T，该质粒上含有卡那霉素抗性标记。并将载体pK18-NCgl1575A1775T送测序公司测序鉴定，将含有正确点突变(A-T)的载体pK18-NCgl1575A1775T保存备用。
实施例2构建包含点突变的NCgl1575A1775T的工程菌株
构建方法：将等位替换质粒pK18-NCgl1575A1775T通过电击转化入L-赖氨酸生产菌专利菌株YP97158中(其构建方法可参见WO2014121669A1；经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的NCgl1575基因编码区)，对培养产生的单菌落分别通过引物P1和通用引物M13R进行鉴定，能扩增出1502bp大小条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用如下引物(上海invitrogen公司合成)进行PCR鉴定：
P5:5'CACATC AGCTTGATTT CTGC 3'(SEQ ID NO:9)
P6:5'GGTCATTGCC GATGAAGCCC 3'(SEQ ID NO:10)
上述PCR扩增产物256bp通过高温变性、冰浴后进行sscp电泳(以质粒pK18-NCgl1575A1775T扩增片段为阳性对照，YP97158扩增片段为阴性对照，水作为空白对照)，由于片段结构不同，电泳位置不同，因此片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。以引物P5和P6再次通过PCR扩增等位替换成功的菌株目的片段，并连接到PMD19-T载体测序，通过序列比对碱基序列发生突变的序列验证菌株的等位替换成功，并被命名为YPL-4-023。
SSCP电泳PAGE的制备及条件
实施例3构建基因组上过表达NCgl1575或NCgl1575A1775T基因的工程菌株
依据NCBI公布的野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，设计并合成三对扩增上下游同源臂片段及NCgl1575或NCgl1575A1775T基因编码区及启动子区序列的引物，以同源重组的方式在菌株YP97158中引入NCgl1575或NCgl1575A1775T基因。
引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P7：5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATG
CGTTCTGGACTGAGG 3'(SEQ ID NO:11)
P8：5'GAAACGGCCTTAAGCTAGGTGCACCGAG AACAGATG 3'(SEQ ID NO:12)
P9：5'CATCTGTTCTCGGTGCAC CTAGCTTAAG GCCGTTTC 3'(SEQ ID NO:13)
P10：5'CTTGATTTAATTGCGCCATCAAGCTTTTCC CGCCCGGTT 3'(SEQ ID NO:14)
P11：5'AACCGGGCGG GAAAAGCTTGATGGCGCAATTAAATCAAG 3'(SEQ ID NO:15)
P12：5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC GCTAT GACACCTTCAACGGATC3'(SEQ ID NO:16)
构建方法：分别以谷氨酸棒杆菌ATCC13032或YPL-4-023为模板，分别以引物P7/P8，P9/P10，P11/P12进行PCR扩增，获得上游同源臂片段802bp，NCgl1575基因及其启动子片段2737bp，或NCgl1575A1775T基因及其启动子片段2737bp，下游同源臂片段647bp，再以P7/P12为引物，以以上扩增的三个片段(上游同源臂片段，NCgl1575基因及其启动子片段，下游同源臂片段；或者，上游同源臂片段，NCgl1575A1775T基因及其启动子片段，下游同源臂片段)混合为模板进行扩增，获得整合同源臂片段4111bp。
PCR反应结束后，对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒(TIANGEN)进行回收所需要的4111bp的DNA片段，采用NEBBuider重组系统与经Xba I酶切回收的穿梭质粒PK18mobsacB相连接，获得整合质粒PK18mobsacB-NCgl1575或PK18mobsacB-NCgl1575A1775T。质粒上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。
PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸180s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
将2个整合质粒分别电转化入L-赖氨酸生产菌专利菌株YP97158中，对培养产生的单菌落通过P13/P14引物进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1778bp的片段的为阳性菌株，扩增不到片段的为原菌。阳性菌株在15％蔗糖培养基上筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P15/P16引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1756bp的菌为NCgl1575或NCgl1575A1775T基因整合到YP97158基因组上的菌株，其分别被命名为YPL-4-024(不含突变点)和YPL-4-025(含突变点)。
P13:5'TCCAAGGAAGATACACGCC 3'(SEQ ID NO:17)
P14:5'CTTCTGATGA CCGGCACACC 3'(SEQ ID NO:18)
P15:5'TAGTCGATGA CGCGGGTGCG 3'(SEQ ID NO:19)
P16:5'CGTTGGAATCTTGCGTTG 3'(SEQ ID NO:20)
实施例4构建质粒上过表达NCgl1575或NCgl1575A1775T基因的工程菌株
依据NCBI公布的野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，设计并合成一对扩增NCgl1575或NCgl1575A1775T基因编码区及启动子区序列的引物，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P17：5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCC CTAGCT TAAG GCCGTTTC 3'(SEQ ID NO:21)
P18：5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAAC AAGCTTT
TCC CGCCCGGTT 3'(SEQ ID NO:22)
构建方法：分别以ATCC13032和YPL-4-023为模板，以引物P17/P18进行PCR扩增，获得NCgl1575或NCgl1575A1775T基因及其启动子片段2749bp，对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行回收所需要的2749bp的DNA片段，采用NEBuider重组系统与经EcoR I酶切回收的穿梭质粒pXMJ19相连接，获得过表达质粒pXMJ19-NCgl1575和pXMJ19-NCgl1575A1775T。质粒上含有氯霉素抗性标记，可以通过氯霉素筛选获得质粒转化到菌株中。
PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸120s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
将pXMJ19-NCgl1575和pXMJ19-NCgl1575A1775T质粒分别电转化入L-赖氨酸生产菌专利菌株YP97158中，对培养产生的单菌落通过M13(-48)和P18引物进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小2752bp的片段的为转入菌株，其被命名为YPL-4-026(不含突变点)和YPL-4-027(含突变点)。
实施例5构建基因组上缺失NCgl1575基因的工程菌株
根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组序列，合成两对扩增NCgl1575基因编码区两端片段的引物，作为上下游同源臂片段。引物设计如下(上海英俊公司合成)：
P19：5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGACCG
GCGCAG ATGCCAACGC 3'(SEQ ID NO:23)
P20：CCCAGAACTGAAGGTCTAATTGCCTAAGG CCGGAATT 3'(SEQ ID NO:24)
P21：AATTCCGGCCTTAGGCAATTAGACCTTC AGTTCTGGG 3'(SEQ ID NO:25)
P22：5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC GCT
TGATGAA GGCTCCAG 3'(SEQ ID NO:26)
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，分别以引物P19/P20和P21/P22进行PCR扩增，获得上游同源臂片段775bp及下游同源臂片段807bp，再用引物P19/P22进行重叠PCR得到整个同源臂片段1545bp。PCR反应结束后，对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行回收所需要的1545bp的DNA片段，并通过NEBuider重组系统与经Xba I酶切回收的穿梭质粒pk18mobsacB质粒相连接，获得敲除质粒。该质粒上含有卡那霉素抗性标记。
将敲除质粒电转化入赖氨酸生产专利菌株YP97158，对培养产生的单菌落分别通过如下引物(上海英俊公司合成)进行PCR鉴定：
P23:5'ACCGGCGCAG ATGCCAACGC 3'(SEQ ID NO:27)
P24:5'GCTTGATGAA GGCTCCAG 3'(SEQ ID NO:28)
上述PCR扩增出大小1471bp及4150bp的条带的菌株为阳性菌株，只扩增出4150bp条带的菌株为原菌。阳性菌株在15％蔗糖培养基上筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P23/P24引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1471bp条带的菌株为NCgl1575基因编码区被敲除的基因工程菌株，其被命名为YPL-4-028。
实施例6L-赖氨酸发酵实验
将实施例构建的菌株和原始菌株YP97158在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(购自上海百仑生物科技有限公司)中以表1所示的培养基和表2所示的控制工艺进行发酵实验。每个菌株重复三次，结果如表3所示。
表1发酵培养基配方
成分 配方
淀粉水解糖 30g/L
硫酸铵 12g/L
硫酸镁 0.87g/L
糖蜜 20g/L
酸化玉米浆 3mL/L
磷酸 0.4mL/L
氯化钾 0.53g/L
消泡剂(2％泡敌) 4mL/L
硫酸亚铁 120mg/L
硫酸锰 120mg/L
烟酰胺 42mg/L
泛酸钙 6.3mg/L
维生素B1 6.3mg/L
铜、锌盐溶液 0.6g/L
生物素 0.88mg/L
表1发酵控制工艺
表2 L-赖氨酸发酵实验结果
菌株 L-赖氨酸产量(g/100ml) OD(660nm)
YP97158 18.8 37.3
YPL-4-023 19.6 36.8
YPL-4-024 19.6 37.0
YPL-4-025 19.8 35.5
YPL-4-026 19.3 36.3
YPL-4-027 19.7 37.2
YPL-4-028 18.0 36.8
结果如表3所示，在谷氨酸棒杆菌中对NCgl1575基因过表达，或者对NCgl1575基因编码区进行点突变NCgl1575 A1775T及过表达，有助于L-赖氨酸产量的提高，而对基因进行弱化或敲除，不利于L-赖氨酸的积累。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 内蒙古伊品生物科技有限公司
<120> 一种产L-赖氨酸的重组菌株及其构建方法与应用
<130> CPCN20410445
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2679
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 1
atggcagaat caaacgctat ggaccgggca caaatctctg cactgctaga tagagcacag 60
cacacaatca accttgccga acaagcaaac aacgtgctcc gactgttgaa aacacccgga 120
acggccacag taggggacaa cgggacactc ggcaccgata cctatctgat cccatcccgc 180
aacatcacct ggcctgacaa cctgtatgtc aacgtctttc tagacggcat gaatgcagaa 240
gccaccctta ccgattacgt cgcatcagtc gcttcgatcc cacgcctatg ccagatcatc 300
aacgagggcc aaggcggcat gttccgcaga ctattcaacc ccaccaaggt ccaagccggc 360
gaccaagctg tcttcgacct catggtcaaa ctcgacgaga tttcatctac cacccacgaa 420
gtctcccgca tgctcgaggg cgtccacgct gcccgcaccc gccaacaaca aggcgttgca 480
cttttcccag gtattcatgg agtgggagag cgctacatcg aacgcgcaca acaggtactc 540
gcctcagccc tcggtatcgc tggattcggt gccgaaccct gggacggaca tacccttgcc 600
caagcgcgcc gggtagtcca acgctacgcc caagatccta actccgaata ccggctgaaa 660
agcgaagccg agaaacacct cacatccatc aacgagctcc gcgtacagat actcctcgaa 720
caactccccg ttgatgccct acgcatggct accgaccacc gcctgcgctt tggatccctc 780
gattccatcc acgtcgcaac cgtcgccgac gtcctaaaaa cacacacctc catcctcacc 840
accgtgcaag gtatcggcgc ccaaaccgcg gggcggatga aagccgcagc agaaacactc 900
aaacaagaag cactacgccg ccaaaacacc tccatcggcg acgaacctac ccaacccgcc 960
atgcgtctaa tcaacgtgct ggcccgcttc gaccaaaccg aaaccatcac gcccgaagaa 1020
cgcgcccgcc gcacccgcgt catcgactac gtagaacaca tacccccaag cctcgacccc 1080
tacatcgtca tcaacccagc aacgcctgag ttcaacaact tcaccgacga cctccgctgg 1140
atcgacgcaa accccaacct cttccaccca caaacaatca ccaccccacc cgccgacatc 1200
tgggacgact acatctcccg tcccgctcac taccaaggcc tgctagccac gctgctcggc 1260
cgcgacatcg aaggcgcaga cgaactcctc gacgccacca ccctccaaaa aatcagagac 1320
ctcaccctcg acaaaactca tctcaccgac ctccacctcc gcggatacca atcattcggc 1380
gcccgcttcg ccatcatcca aaagaaaacc ctcctcggcg acgacatggg actcggcaaa 1440
acagtccaag ccctctccgc agctgcacac cttgccgcca ccgaaaaaga cttccgcacc 1500
ctcgtcgtcg tacccgcatc cgtcattgtt aactggaccc gcgaatgcaa acgcttcctc 1560
aacctccccg tattcatcgc ccacggagac aacaaacaag acgccatcaa cgcctggtct 1620
aacaccaacg gaatcgcaat ctgcacctac gacggcgtcc gcaccatgga catccccgcg 1680
ccgggtctgg tcattgccga tgaagcccac ctgatcaaaa acccctccac caaacgcacc 1740
caagcactgc gcaaacttat cgacgccgcc ccatacaccc ttctgatgac cggcacacca 1800
ctagaaaaca aagtggaaga gtttgtaaat ctcgtgcgct acatccaacc ggagctgatc 1860
acccgtggca tgtccaaaat gcaggccgag aatttccgcg agcgcatcgc accagcctat 1920
ctgcgcagaa atcaagctga tgtgcttgac gaactcccag agcgcaccga ctccatcgac 1980
tggatcgacc tcaccccaga agaccgcagc gcctacgacg accaagtccg ccaaggcagc 2040
tggatgggca tgcgccgctc cgccatgctc tcaccaacac cacgcctaac ttccgcaaaa 2100
atgcaacgca tcctagaact cttcgaagaa gcagaagaac acggccgcaa agccctcatc 2160
ttcacctact tcctcgacgt cctcgacgaa ctggaaaagc atctaggcga gcgcgtcatc 2220
ggccgcattt ccggcgacgt gccagccacc aagcgccaat tgcttgtcga cgccctgtcc 2280
cactccaaac ccggatccgc cctcattgcc caaatcaccg ccgggggagt aggcctaaac 2340
atccaatccg cgagcctatg cattatttgt gaacctcaag taaagccaac catcgaacag 2400
caggccgtcg cccgagtcca ccgcatgggc caaaccgcca ccgtccaagt ccaccgactc 2460
atcggcgacg aaaccgcaga cgaacgcatg ctagaaatcc tggcaggcaa aactcacgtc 2520
ttcgacgtct acgcccggct atctgaaacc gcagagattc cagatgctgt ggatatcact 2580
gaatcacagc tggcagcacg ggttattgat gaggagcgtg cacggttagg gcttactgaa 2640
tccactggcc ctaaagatga agaaacggcc ttaagctag 2679
<210> 2
<211> 2679
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
atggcagaat caaacgctat ggaccgggca caaatctctg cactgctaga tagagcacag 60
cacacaatca accttgccga acaagcaaac aacgtgctcc gactgttgaa aacacccgga 120
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aacatcacct ggcctgacaa cctgtatgtc aacgtctttc tagacggcat gaatgcagaa 240
gccaccctta ccgattacgt cgcatcagtc gcttcgatcc cacgcctatg ccagatcatc 300
aacgagggcc aaggcggcat gttccgcaga ctattcaacc ccaccaaggt ccaagccggc 360
gaccaagctg tcttcgacct catggtcaaa ctcgacgaga tttcatctac cacccacgaa 420
gtctcccgca tgctcgaggg cgtccacgct gcccgcaccc gccaacaaca aggcgttgca 480
cttttcccag gtattcatgg agtgggagag cgctacatcg aacgcgcaca acaggtactc 540
gcctcagccc tcggtatcgc tggattcggt gccgaaccct gggacggaca tacccttgcc 600
caagcgcgcc gggtagtcca acgctacgcc caagatccta actccgaata ccggctgaaa 660
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caagcactgc gcaaacttat cgacgccgcc ccattcaccc ttctgatgac cggcacacca 1800
ctagaaaaca aagtggaaga gtttgtaaat ctcgtgcgct acatccaacc ggagctgatc 1860
acccgtggca tgtccaaaat gcaggccgag aatttccgcg agcgcatcgc accagcctat 1920
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cactccaaac ccggatccgc cctcattgcc caaatcaccg ccgggggagt aggcctaaac 2340
atccaatccg cgagcctatg cattatttgt gaacctcaag taaagccaac catcgaacag 2400
caggccgtcg cccgagtcca ccgcatgggc caaaccgcca ccgtccaagt ccaccgactc 2460
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ttcgacgtct acgcccggct atctgaaacc gcagagattc cagatgctgt ggatatcact 2580
gaatcacagc tggcagcacg ggttattgat gaggagcgtg cacggttagg gcttactgaa 2640
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<210> 3
<211> 892
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 3
Met Ala Glu Ser Asn Ala Met Asp Arg Ala Gln Ile Ser Ala Leu Leu
1 5 10 15
Asp Arg Ala Gln His Thr Ile Asn Leu Ala Glu Gln Ala Asn Asn Val
20 25 30
Leu Arg Leu Leu Lys Thr Pro Gly Thr Ala Thr Val Gly Asp Asn Gly
35 40 45
Thr Leu Gly Thr Asp Thr Tyr Leu Ile Pro Ser Arg Asn Ile Thr Trp
50 55 60
Pro Asp Asn Leu Tyr Val Asn Val Phe Leu Asp Gly Met Asn Ala Glu
65 70 75 80
Ala Thr Leu Thr Asp Tyr Val Ala Ser Val Ala Ser Ile Pro Arg Leu
85 90 95
Cys Gln Ile Ile Asn Glu Gly Gln Gly Gly Met Phe Arg Arg Leu Phe
100 105 110
Asn Pro Thr Lys Val Gln Ala Gly Asp Gln Ala Val Phe Asp Leu Met
115 120 125
Val Lys Leu Asp Glu Ile Ser Ser Thr Thr His Glu Val Ser Arg Met
130 135 140
Leu Glu Gly Val His Ala Ala Arg Thr Arg Gln Gln Gln Gly Val Ala
145 150 155 160
Leu Phe Pro Gly Ile His Gly Val Gly Glu Arg Tyr Ile Glu Arg Ala
165 170 175
Gln Gln Val Leu Ala Ser Ala Leu Gly Ile Ala Gly Phe Gly Ala Glu
180 185 190
Pro Trp Asp Gly His Thr Leu Ala Gln Ala Arg Arg Val Val Gln Arg
195 200 205
Tyr Ala Gln Asp Pro Asn Ser Glu Tyr Arg Leu Lys Ser Glu Ala Glu
210 215 220
Lys His Leu Thr Ser Ile Asn Glu Leu Arg Val Gln Ile Leu Leu Glu
225 230 235 240
Gln Leu Pro Val Asp Ala Leu Arg Met Ala Thr Asp His Arg Leu Arg
245 250 255
Phe Gly Ser Leu Asp Ser Ile His Val Ala Thr Val Ala Asp Val Leu
260 265 270
Lys Thr His Thr Ser Ile Leu Thr Thr Val Gln Gly Ile Gly Ala Gln
275 280 285
Thr Ala Gly Arg Met Lys Ala Ala Ala Glu Thr Leu Lys Gln Glu Ala
290 295 300
Leu Arg Arg Gln Asn Thr Ser Ile Gly Asp Glu Pro Thr Gln Pro Ala
305 310 315 320
Met Arg Leu Ile Asn Val Leu Ala Arg Phe Asp Gln Thr Glu Thr Ile
325 330 335
Thr Pro Glu Glu Arg Ala Arg Arg Thr Arg Val Ile Asp Tyr Val Glu
340 345 350
His Ile Pro Pro Ser Leu Asp Pro Tyr Ile Val Ile Asn Pro Ala Thr
355 360 365
Pro Glu Phe Asn Asn Phe Thr Asp Asp Leu Arg Trp Ile Asp Ala Asn
370 375 380
Pro Asn Leu Phe His Pro Gln Thr Ile Thr Thr Pro Pro Ala Asp Ile
385 390 395 400
Trp Asp Asp Tyr Ile Ser Arg Pro Ala His Tyr Gln Gly Leu Leu Ala
405 410 415
Thr Leu Leu Gly Arg Asp Ile Glu Gly Ala Asp Glu Leu Leu Asp Ala
420 425 430
Thr Thr Leu Gln Lys Ile Arg Asp Leu Thr Leu Asp Lys Thr His Leu
435 440 445
Thr Asp Leu His Leu Arg Gly Tyr Gln Ser Phe Gly Ala Arg Phe Ala
450 455 460
Ile Ile Gln Lys Lys Thr Leu Leu Gly Asp Asp Met Gly Leu Gly Lys
465 470 475 480
Thr Val Gln Ala Leu Ser Ala Ala Ala His Leu Ala Ala Thr Glu Lys
485 490 495
Asp Phe Arg Thr Leu Val Val Val Pro Ala Ser Val Ile Val Asn Trp
500 505 510
Thr Arg Glu Cys Lys Arg Phe Leu Asn Leu Pro Val Phe Ile Ala His
515 520 525
Gly Asp Asn Lys Gln Asp Ala Ile Asn Ala Trp Ser Asn Thr Asn Gly
530 535 540
Ile Ala Ile Cys Thr Tyr Asp Gly Val Arg Thr Met Asp Ile Pro Ala
545 550 555 560
Pro Gly Leu Val Ile Ala Asp Glu Ala His Leu Ile Lys Asn Pro Ser
565 570 575
Thr Lys Arg Thr Gln Ala Leu Arg Lys Leu Ile Asp Ala Ala Pro Tyr
580 585 590
Thr Leu Leu Met Thr Gly Thr Pro Leu Glu Asn Lys Val Glu Glu Phe
595 600 605
Val Asn Leu Val Arg Tyr Ile Gln Pro Glu Leu Ile Thr Arg Gly Met
610 615 620
Ser Lys Met Gln Ala Glu Asn Phe Arg Glu Arg Ile Ala Pro Ala Tyr
625 630 635 640
Leu Arg Arg Asn Gln Ala Asp Val Leu Asp Glu Leu Pro Glu Arg Thr
645 650 655
Asp Ser Ile Asp Trp Ile Asp Leu Thr Pro Glu Asp Arg Ser Ala Tyr
660 665 670
Asp Asp Gln Val Arg Gln Gly Ser Trp Met Gly Met Arg Arg Ser Ala
675 680 685
Met Leu Ser Pro Thr Pro Arg Leu Thr Ser Ala Lys Met Gln Arg Ile
690 695 700
Leu Glu Leu Phe Glu Glu Ala Glu Glu His Gly Arg Lys Ala Leu Ile
705 710 715 720
Phe Thr Tyr Phe Leu Asp Val Leu Asp Glu Leu Glu Lys His Leu Gly
725 730 735
Glu Arg Val Ile Gly Arg Ile Ser Gly Asp Val Pro Ala Thr Lys Arg
740 745 750
Gln Leu Leu Val Asp Ala Leu Ser His Ser Lys Pro Gly Ser Ala Leu
755 760 765
Ile Ala Gln Ile Thr Ala Gly Gly Val Gly Leu Asn Ile Gln Ser Ala
770 775 780
Ser Leu Cys Ile Ile Cys Glu Pro Gln Val Lys Pro Thr Ile Glu Gln
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Gln Ala Val Ala Arg Val His Arg Met Gly Gln Thr Ala Thr Val Gln
805 810 815
Val His Arg Leu Ile Gly Asp Glu Thr Ala Asp Glu Arg Met Leu Glu
820 825 830
Ile Leu Ala Gly Lys Thr His Val Phe Asp Val Tyr Ala Arg Leu Ser
835 840 845
Glu Thr Ala Glu Ile Pro Asp Ala Val Asp Ile Thr Glu Ser Gln Leu
850 855 860
Ala Ala Arg Val Ile Asp Glu Glu Arg Ala Arg Leu Gly Leu Thr Glu
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Ser Thr Gly Pro Lys Asp Glu Glu Thr Ala Leu Ser
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<210> 4
<211> 892
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
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1 5 10 15
Asp Arg Ala Gln His Thr Ile Asn Leu Ala Glu Gln Ala Asn Asn Val
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Leu Arg Leu Leu Lys Thr Pro Gly Thr Ala Thr Val Gly Asp Asn Gly
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Pro Asp Asn Leu Tyr Val Asn Val Phe Leu Asp Gly Met Asn Ala Glu
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Ala Thr Leu Thr Asp Tyr Val Ala Ser Val Ala Ser Ile Pro Arg Leu
85 90 95
Cys Gln Ile Ile Asn Glu Gly Gln Gly Gly Met Phe Arg Arg Leu Phe
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Asn Pro Thr Lys Val Gln Ala Gly Asp Gln Ala Val Phe Asp Leu Met
115 120 125
Val Lys Leu Asp Glu Ile Ser Ser Thr Thr His Glu Val Ser Arg Met
130 135 140
Leu Glu Gly Val His Ala Ala Arg Thr Arg Gln Gln Gln Gly Val Ala
145 150 155 160
Leu Phe Pro Gly Ile His Gly Val Gly Glu Arg Tyr Ile Glu Arg Ala
165 170 175
Gln Gln Val Leu Ala Ser Ala Leu Gly Ile Ala Gly Phe Gly Ala Glu
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Pro Trp Asp Gly His Thr Leu Ala Gln Ala Arg Arg Val Val Gln Arg
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Thr Ala Gly Arg Met Lys Ala Ala Ala Glu Thr Leu Lys Gln Glu Ala
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Leu Arg Arg Gln Asn Thr Ser Ile Gly Asp Glu Pro Thr Gln Pro Ala
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Thr Pro Glu Glu Arg Ala Arg Arg Thr Arg Val Ile Asp Tyr Val Glu
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His Ile Pro Pro Ser Leu Asp Pro Tyr Ile Val Ile Asn Pro Ala Thr
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Pro Asn Leu Phe His Pro Gln Thr Ile Thr Thr Pro Pro Ala Asp Ile
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Trp Asp Asp Tyr Ile Ser Arg Pro Ala His Tyr Gln Gly Leu Leu Ala
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Thr Thr Leu Gln Lys Ile Arg Asp Leu Thr Leu Asp Lys Thr His Leu
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Thr Val Gln Ala Leu Ser Ala Ala Ala His Leu Ala Ala Thr Glu Lys
485 490 495
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515 520 525
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
Asp Asp Gln Val Arg Gln Gly Ser Trp Met Gly Met Arg Arg Ser Ala
675 680 685
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690 695 700
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740 745 750
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770 775 780
Ser Leu Cys Ile Ile Cys Glu Pro Gln Val Lys Pro Thr Ile Glu Gln
785 790 795 800
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835 840 845
Glu Thr Ala Glu Ile Pro Asp Ala Val Asp Ile Thr Glu Ser Gln Leu
850 855 860
Ala Ala Arg Val Ile Asp Glu Glu Arg Ala Arg Leu Gly Leu Thr Glu
865 870 875 880
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<212> DNA
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<223> 人工序列
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagaatg cgttctggac tgagg 55
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<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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catctgttct cggtgcacct agcttaaggc cgtttc 36
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<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 14
cttgatttaa ttgcgccatc aagcttttcc cgcccggtt 39
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 15
aaccgggcgg gaaaagcttg atggcgcaat taaatcaag 39
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 16
cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccgc tatgacacct tcaacggatc 60
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 17
tccaaggaag atacacgcc 19
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 人工序列
<400> 18
cttctgatga ccggcacacc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 人工序列
<400> 19
tagtcgatga cgcgggtgcg 20
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 人工序列
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cgttggaatc ttgcgttg 18
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<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 人工序列
<400> 21
gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccctag cttaaggccg tttc 54
<210> 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 人工序列
<400> 22
atcaggctga aaatcttctc tcatccgcca aaacaagctt ttcccgcccg gtt 53
<210> 23
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 人工序列
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cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagaccg gcgcagatgc caacgc 56
<210> 24
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
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cccagaactg aaggtctaat tgcctaaggc cggaatt 37
<210> 25
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> 人工序列
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aattccggcc ttaggcaatt agaccttcag ttctggg 37
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<211> 56
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<213> Artificial Sequence
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cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccgc ttgatgaagg ctccag 56
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<213> Artificial Sequence
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accggcgcag atgccaacgc 20
<210> 28
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<213> Artificial Sequence
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<223> 人工序列
<400> 28
gcttgatgaa ggctccag 18

Claims (10)

1.一种生成L-赖氨酸的属于棒杆菌属的微生物，其特征在于，具有编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达；所述改善的表达是编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的；所述编码SEQ IDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸的点突变，使得SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第592位酪氨酸被苯丙氨酸所取代；和，所述微生物是谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）。
2.如权利要求1所述的微生物，其特征在于，编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述具有点突变的多核苷酸具有SEQ IDNO:2所示的序列。
4.如权利要求1-3任一项所述的微生物，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）为YP97158，保藏编号：CGMCC No.12856。
5.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列具有编码SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的多核苷酸序列。
6.如权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO:2所示。
7.一种蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
8.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求5或6所述的多核苷酸。
9.一种重组菌株，其特征在于，包含权利要求5或6所述的多核苷酸。
10.一种生产L-赖氨酸的方法，所述方法包括：培养权利要求1-4任一项所述的微生物，并从所述培养物中回收L-赖氨酸。
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