JP2023528619A

JP2023528619A - Ｌ－アミノ酸を生産する組換え菌株、並びにその構築方法及び使用

Info

Publication number: JP2023528619A
Application number: JP2022574296A
Authority: JP
Inventors: 魏愛英; 孟剛; 周暁群; 趙春光; 馬風勇; 賈慧萍; 楊立鵬; 蘇厚波; 郭小▲ウェイ▼; 田斌; 高暁航
Original assignee: INNER MONGOLIA EPPEN BIOTECH CO., LTD.
Current assignee: INNER MONGOLIA EPPEN BIOTECH CO., LTD.
Priority date: 2020-06-08
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2023-07-05
Also published as: EP4163377A1; KR20230042224A; US20230313122A1; WO2021248902A1

Abstract

本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３で示されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現が向上されていること、及び／又は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１で示されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現が向上されていること、及び／又は、ＳＥＱＩＤＮＯ：５７で示されるプロモーター領域における－４５ｂｐ位及び－４７ｂｐ位の塩基が突然変異を起こしたことを特徴とする、Ｌ－アミノ酸を生産する細菌を提供する。本発明は、さらに、ポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、当該ポリヌクレオチド配列を含む組換えベクター、組換え菌株、及び、Ｌ－アミノ酸を生産する方法を提供している。ただし、当該ポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３で示されるタンパク質をコードし、且つ前記タンパク質の３３４位のアルギニンがターミネーターで置換されているか、又は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１で示されるタンパク質をコードし、且つ前記タンパク質の５９２位のチロシンがフェニルアラニンで置換されているか、又は、ＳＥＱＩＤＮＯ：５７で示されるプロモーター領域における－４５ｂｐ位及び－４７ｂｐ位の塩基の突然変異により形成されている。【選択図】なし

Description

本出願は、先願である、２０２０年１０月１５日に中国国家知識産権局へ出願された特許出願番号が２０２０１１１０５０６３．５である「Ｌ－アミノ酸を生産する組換え菌株及びその構築方法と使用」と題する特許出願、２０２０年８月７日に中国国家知識産権局へ出願された特許出願番号が２０２０１０７９０８８７．４である「Ｌ－リシンを生産する組換え菌株及びその構築方法と使用」と題する特許出願、及び２０２０年６月８日に中国国家知識産権局へ出願された特許出願番号が２０２０１０５１４０３７．１である「ｌｙｓＣ遺伝子を組み込んだ組換え菌株、及びその構築方法と使用」と題する特許出願の優先権を主張している。前記３つの先願の全文は、参照により本願に組み込まれる。
本発明は、遺伝子工学及び微生物の技術分野に属し、詳しくは、Ｌ－アミノ酸を生産する組換え菌株、及びその構築方法と使用に関する。

Ｌ－リシン（Ｌ－Ｌｙｓｉｎｅ）は、医薬品、食品、飼料などの広い範囲に応用されており、ここで、飼料添加物として応用されているＬ－リシンは、全体の９０％以上を占めている。現在、中国はＬ－リシンの二番目の消費市場であり、一番目のＬ－リシンの生産国である。

現在、Ｌ－リシンは、主に、完備のＬ－リシンの生合成経路を有する菌株を利用し、廃糖蜜、澱粉加水分解液などを基質とし、好気性発酵により生産する直接発酵法により生産されている。この方法は、現在世界の中でのＬ－リシンの生産における三分の二を占めており、その工程は既に確立されており、当該方法は、主に酵母、細菌、カビなどの微生物に広く存在するものである。現在、工業的にＬ－リシンの発酵に用いられる生産菌種としては、コリネバクテリウム属及びブレビバクテリウム属の突然変異育種による変異株が主流である。代謝工学及び遺伝子工学の発展に伴い、遺伝子の突然変異を制御することができるため、代謝工学により出発株を修飾する過程において、代謝過程におけるＬ－リシンの生成のキーとなる酵素遺伝子を正確に見つけ出し、その後、キー酵素遺伝子の発現を向上させることができることにより、Ｌ－リシンの生産量の向上が可能となる。

Ｌ－グルタミン酸は、主に味の素や香料の製造、食塩代替物、栄養補助剤、及び生化学試薬等に使用されている。Ｌ－グルタミン酸自体は、脳内のタンパク質及び糖の代謝に関与して酸化プロセスを促進する薬剤として用いられる。当該薬剤は、インビボでアンモニアと結合して無毒のグルタミンを形成することにより、血液中のアンモニア濃度を低下させ、肝性昏睡の症状を軽減させることができる。従来、味の素の生産は、小麦の生麩（グルテン）の加水分解により行われていたが、現在、大量生産ではその代わりに微生物発酵法が用いられている。

本発明は、Ｌ－アミノ酸を生産する能力を有する新規な菌株を開発し、Ｌ－アミノ酸を効率的に生産する方法を提供することを目的とする。

上記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究した結果、従来技術において、発酵によるアミノ酸生産能を有することが知られていないＮＣｇｌ０６０９遺伝子及び／又はＮＣｇｌ１５７５遺伝子が、前記遺伝子を修飾することにより、又は前記遺伝子の発現を向上することにより、効率的にＬ－アミノ酸生産能を具備することができることを見出した。また、本発明者らは、あるプロモーターの配列を突然変異させることにより、相応な微生物のＬ－アミノ酸生産能も向上することをさらに見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。

本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現が向上されていること、及び／又はＳＥＱＩＤＮＯ：３１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現が向上されていること、及び／又はＳＥＱＩＤＮＯ：５７で示されるプロモーター領域における－４５ｂｐ位及び－４７ｂｐ位の塩基が突然変異を起こしたことを特徴とする、Ｌ－アミノ酸を生産する細菌を提供する。本発明は、前記微生物を用いてＬ－アミノ酸を生産する方法をさらに提供する。

本発明によれば、前記の発現が向上されていることは、前記ポリヌクレオチドの発現が増強されていること、又はＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列若しくはＳＥＱＩＤＮＯ：３１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点突然変異を有していること、又はＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列若しくはＳＥＱＩＤＮＯ：３１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点突然変異を有し且つその発現が増強されていることを意味する。

本発明の第１の態様は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現が向上されていることを特徴とする、Ｌ－アミノ酸を生産する細菌を提供する。好ましくは、前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－リシン又はＬ－グルタミン酸である。

前記ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列は、ＮＣｇｌ０６０９遺伝子によってコードされるタンパク質である。

前記細菌は、増強されたＬ－アミノ酸生産能を有する。

Ｌ－アミノ酸生産能を有する細菌は、目的とするＬ－アミノ酸を好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量で培地に蓄積できるものであってもよい。

前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と約９０％以上、約９２％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、又は約９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードすることができる。

本発明の一実施形態において、前記の発現が向上されているポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド配列を含む。

本発明の一実施形態において、前記の発現が向上されていることは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点突然変異を有することにより、ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列の３３４位のアルギニンがターミネーターに置換されていることを意味する。

本発明によれば、ＳＥＱＩＤＮＯ：３で示されるアミノ酸配列は、３３４位のアルギニンがターミネーターで置換された後のアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：４で示される。

本発明の一実施形態において、前記点突然変異を有するポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるポリヌクレオチド配列の１０００位の塩基が突然変異することによって形成されている。

本発明によれば、前記突然変異は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるポリヌクレオチド配列の１０００位の塩基がシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）に突然変異していることを含む。

本発明の一実施形態において、前記点突然変異を有するポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２で示されるポリヌクレオチド配列を含む。

本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現が向上されたＬ－アミノ酸を生産する細菌をさらに提供するものである。好ましくは、前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－リシンである。好ましくは、前記細菌は、コリネバクテリウム属に属する細菌である。

前記ＳＥＱＩＤＮＯ：３１のアミノ酸配列は、ＮＣｇｌ１５７５遺伝子によってコードされるタンパク質である。

前記微生物は、野生型株又は親株と比較してＬ－リシン生産能が向上している。

前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１のアミノ酸配列に対して約９０％以上、約９２％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、又は約９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードすることができる。

本発明の一実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９のヌクレオチド配列を含んでもよい。

本発明の一実施形態において、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの点突然変異により、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１のアミノ酸配列の５９２位のチロシンが異なるアミノ酸で置換されている。

本発明によれば、好ましくは、５９２位のチロシンがフェニルアラニンで置換されている。

本発明によれば、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１で示されるアミノ酸配列としては、その５９２位のチロシン（Ｙ）がフェニルアラニン（Ｆ）で置換されたアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：３２で示される。

本発明の一実施形態において、前記点突然変異を有しているポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９で示されるポリヌクレオチド配列の１７７５位の塩基が突然変異することによって形成されている。

本発明によれば、前記突然変異は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９で示されるポリヌクレオチド配列の１７７５位の塩基がアデニン（Ａ）からチミン（Ｔ）に突然変異させることを含む。

本発明の一実施形態において、前記点突然変異を有しているポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０で示されるポリヌクレオチド配列を含む。

本発明によれば、前記細菌は、コリネバクテリウム属に属する微生物、例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、又はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｅｋｉｎｅｎｓｅであってもよい。

本発明の一実施形態において、前記コリネバクテリウム属に属する微生物は、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＹＰ９７１５８であり、寄託番号：ＣＧＭＣＣＮｏ．１２８５６、寄託日：２０１６年８月１６日、寄託単位：中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センター、北京朝陽区北辰西路１号院３号、電話番号：０１０－６４８０７３５５、中国特許出願ＣＮ１０６３６７４３２Ａ（出願日２０１６年９月１日、公開日２０１７年２月１日）に記載されている。

本発明の一実施形態において、前記コリネバクテリウム属に属する微生物は、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３８６９である。

ポリヌクレオチドの発現は、置換又は突然変異による調節配列の発現、ポリヌクレオチド配列への突然変異の導入、染色体の挿入又はベクターの導入によるポリヌクレオチドのコピー数の増加、又はそれらの組み合わせなどによって増強することができる。

ポリヌクレオチドの発現調節配列を修飾することができる。発現調節配列は、それらと作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を制御し、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、サイレンサーなどを含むことができる。ポリヌクレオチドは、開始コドンの変化を有することができる。ポリヌクレオチドは、染色体の特定の遺伝子座に組み込まれてコピー数を増加させることができる。本明細書において、特定の遺伝子座は、例えば、トランスポゾン遺伝子座又は遺伝子間遺伝子座を含む場合がある。また、発現ベクターにポリヌクレオチドを組み込み、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、コピー数を増加させることできる。

本発明の一実施形態において、ポリヌクレオチド又は点突然変異を有するポリヌクレオチドを、微生物の染色体の特定遺伝子座に組み込むことによりコピー数を増加させる。

本発明の一実施形態において、プロモーター配列を有するポリヌクレオチド、又はプロモーター配列を有する点突然変異を有するポリヌクレオチドを微生物の染色体の特定遺伝子座に組み込むことにより、前記ヌクレオチド配列を過剰発現させる。

本発明の一実施形態において、ポリヌクレオチド又は点突然変異を有するポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込み、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、コピー数を増加させる。

本発明の一実施形態において、プロモーター配列を有するポリヌクレオチド、又はプロモーター配列を有する点突然変異を有するポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込み、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、前記アミノ酸配列を過剰発現させる。

本発明の一実施形態において、前記プロモーターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（ＮＣｇｌ０６０９遺伝子）のプロモーターである。

本発明の一実施形態において、前記プロモーターは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（ＮＣｇｌ１５７５遺伝子）のプロモーターである。

本発明の一実施形態において、使用されるベクターは、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド、ｐＸＭＪ１９プラスミドである。

本発明によれば、前記細菌は、Ｌ－アミノ酸の生産量の増加に関連する他の改善点を有してもよい。

本発明の第２の態様は、ポリヌクレオチド配列、当該ポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列、前記ポリヌクレオチド配列を含む組換えベクター、及び前記ポリヌクレオチド配列を含む組換え菌株を提供するものである。

本発明によれば、前記ポリヌクレオチド配列の発現が向上されている。前記の発現が向上されていることは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３で示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいて前記アミノ酸配列の３３４位のアルギニンがターミネーターで置換された点突然変異を含むことである。

本発明によれば、ＳＥＱＩＤＮＯ：３で示されるアミノ酸配列としては、その３３４位のアルギニンがターミネーターで置換されたアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４で示される。

本発明によれば、前記ＳＥＱＩＤＮＯ：３で示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるポリヌクレオチド配列を含む。

本発明の一実施形態において、本発明により提供される突然変異された後のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるポリヌクレオチド配列の１０００位の塩基の突然変異によって形成される。

本発明によれば、前記突然変異は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるポリヌクレオチド配列の１０００位の塩基がシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）に突然変異されたことを含む。

本発明の一実施形態において、前記突然変異された後のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２で示されるポリヌクレオチド配列を含む。

本発明によれば、前記置換されたアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４で示されるアミノ酸配列を含む。

本発明によれば、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１で示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、５９２位のチロシンが異るアミノ酸で置換されているポリヌクレオチドである。

本発明によれば、好ましくは、５９２位のチロシンがフェニルアラニンで置換された。

本発明によれば、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１で示されるアミノ酸配列としては、５９２位のチロシン（Ｙ）がフェニルアラニン（Ｆ）で置換された後のアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：３２で示される。

本発明によれば、好ましくは、前記ＳＥＱＩＤＮＯ：３１で示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９で示されるポリヌクレオチド配列を含む。

本発明の一実施形態において、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９で示されるポリヌクレオチド配列の１７７５位の塩基の突然変異により形成された。

本発明によれば、前記突然変異は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９で示されるポリヌクレオチド配列の１７７５位の塩基がアデニン（Ａ）からチミン（Ｔ）に突然変異されたことを含む。

本発明の一実施形態において、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０で示されるポリヌクレオチド配列を含む。

本発明によれば、前記アミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２で示されるアミノ酸配列を含む。

本発明によれば、前記突然変異は、前記部位の塩基／ヌクレオチドが変化することを意味し、前記突然変異の方法は、変異誘発、ＰＣＲ部位特異的変異導入、及び／又は相同組換えなどの方法から選択される少なくとも１つから選択することできる。本発明において、ＰＣＲ部位特異的変異導入及び／又は相同組換えを用いることが好ましい。

本発明によれば、前記組換えベクターは、前記ポリヌクレオチド配列をプラスミドに導入して構築される。

本発明の一実施形態において、前記プラスミドは、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドである。

本発明の一実施形態において、前記プラスミドは、ｐＸＭＪ１９プラスミドである。

詳しくは、前記ポリヌクレオチド配列及び前記プラスミドを、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系により組換えベクターとして構築することができる。

本発明によれば、前記組換え菌株は、前記ポリヌクレオチド配列を含む。

本発明の一実施形態において、前記組換え菌株の出発菌は、ＹＰ９７１５８である。

本発明の一実施形態において、前記組換え菌株の出発菌は、ＡＴＣＣ１３８６９である。

本発明の第３の態様は、さらに、Ｌ－アミノ酸を生産する組換え菌株の構築方法を提供することにある。

本発明によれば、前記構築方法は、宿主菌株におけるＳＥＱＩＤＮＯ：１で示される野生型ＮＣｇｌ０６０９のポリヌクレオチド配列をその１０００位の塩基が突然変異するように修飾し、突然変異されたＮＣｇｌ０６０９コード遺伝子を含む組換え菌株を得るステップを含む。

本発明に係る構築方法によれば、前記改造は、変異誘発、ＰＣＲ部位特異的変異導入、及び／又は相同組換えなどの方法の中での少なくとも１つを含む。

本発明に係る構築方法によれば、前記突然変異は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１における１０００位の塩基がシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）に突然変異したことを意味し、詳しくは、前記の突然変異されたＮＣｇｌ０６０９コード遺伝子を含むポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２で示される。

さらに、前記構築方法は、
ステップ（１）：ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示される野生型ＮＣｇｌ０６０９遺伝子のヌクレオチド配列をその１０００位の塩基が突然変異するように修飾し、突然変異されたＮＣｇｌ０６０９遺伝子のポリヌクレオチド配列を得ること；
ステップ（２）：前記突然変異されたポリヌクレオチド配列をプラスミドと連結して組換えベクターを構築すること；
ステップ（３）：前記組換えベクターを宿主菌株に導入し、前記の突然変異されたＮＣｇｌ０６０９コード遺伝子を含む組換え菌株を得ること、を含む。

本発明に係る構築方法によれば、前記ステップ（１）は、点突然変異されたＮＣｇｌ０６０９遺伝子の構築（未修飾菌株のゲノム配列に従って、ＮＣｇｌ０６０９遺伝子フラグメントを増幅する２対のプライマーＰ１及びＰ２、Ｐ３及びＰ４を合成し、ＰＣＲ部位特異的変異導入により、野生型ＮＣｇｌ０６０９遺伝子のＳＥＱＩＤＮＯ：１に点突然変異を導入して、点突然変異されたＮＣｇｌ０６０９遺伝子のヌクレオチド配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２を得て、ＮＣｇｌ０６０９^{Ｃ１０００Ｔ}と記載する）を含む。

本発明の一実施形態において、前記未修飾菌株のゲノムは、ＡＴＣＣ１３０３２菌株に由来であってもよく、そのゲノム配列はＮＣＢＩウェブサイトから入手可能である。

本発明の一実施形態において、前記ステップ（１）において、前記プライマーは以下の通りである。
Ｐ１：５’ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＧＴＡＣＡＴＡＡＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：５）
Ｐ２：５’ ＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＡＧＴＣＡＡＡＣＡＧＴＣＡＴＴＴＴＧＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：６）
Ｐ３：５’ ＧＣＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＴＴＴＧＡＣＴＣＡＣＣＧＧＣＡＡＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：７）
Ｐ４：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＣＧＧＣＴＧＧＡＡＡＴＧＴＧＧＡＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：８）

本発明の一実施形態において、前記ＰＣＲ増幅は、９４℃予備変性５分間、９４℃変性３０秒間、５２℃アニーリング３０秒間、７２℃伸長４０秒間（３０サイクル）、７２℃過剰伸長１０分間により行われる。

本発明の一実施形態において、前記オーバーラップＰＣＲ増幅は、９４℃予備変性５分間、９４℃変性３０秒間、５２℃アニーリング３０秒間、７２℃伸長６０秒間（３０サイクル）、７２℃過剰伸長１０分間により行われる。

本発明に係る構築方法によれば、前記ステップ（２）は、分離精製した後のＮＣｇｌ０６０９^{Ｃ１０００Ｔ}及びｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドをＮＥＢｕｉｄｅｒ組み換えシステムにより組み立て組み換えプラスミドを得ることを含む、組み換えプラスミドの構築を含む。

本発明に係る構築方法によれば、前記ステップ（３）は、組換えプラスミドを宿主菌株に形質転換して組換え菌株を得る、組み換え菌株の構築を含む。

本発明の一実施形態において、前記ステップ（３）の形質転換は、電気的形質転換法である。

本発明の一実施形態において、前記宿主菌株は、ＹＰ９７１５８である。

本発明の一実施形態において、前記組み換えは、相同組換えにより実現される。

本発明の第４の態様は、さらに、Ｌ－アミノ酸を生産する組換え菌株の構築方法を提供することにある。

本発明によれば、前記構築方法は、下記ステップを含む。
ＮＣｇｌ０６０９遺伝子の上流及び下流のホモロジーアームフラグメント、ＮＣｇｌ０６０９遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域の配列を増幅したか、又は、ＮＣｇｌ０６０９又はＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域の配列を増幅した後、さらに、ＮＣｇｌ０６０９又はＮＣｇｌ０６０９Ｒ^３３４＊遺伝子を相同組換えにより宿主菌株のゲノムに導入することにより、前記菌株にＮＣｇｌ０６０９又はＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}遺伝子が過剰発現された。

本発明の一実施形態において、上流のホモロジーアームフラグメントを増幅するプライマーは、以下の通りである。
Ｐ７：５’ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）
Ｐ８：５’ ＧＡＧＡＴＧＡＴＣＣＴＣＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＣＣＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）

本発明の一実施形態において、下流のホモロジーアームフラグメントを増幅するプライマーは、以下の通りである。
Ｐ１１：５’ ＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧＴＴＧＴＴＧＣＣＡＧＡＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＡＴＣＡＡＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）
Ｐ１２：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＣＴＡＴＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＧＧＡＴＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）

本発明の一実施形態において、前記遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域の配列を増幅するプライマーは、以下の通りである。
Ｐ９：５’ ＣＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＣＴＧＣＧＡＧＧＡＴＣＡＴＣＴＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）
Ｐ１０：５’ ＧＡＴＴＴＡＡＴＴＧＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＧＣＡＡＣＡＡＣＴＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）

本発明の一実施形態において、前述のＰ７～Ｐ１２をプライマーとし、増幅により得られた上流のホモロジーアームフラグメント、下流のホモロジーアームフラグメント、及び自身のプロモーターを有するＮＣｇｌ０６０９又はＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}の三つのフラグメントの混合物をテンプレートとして増幅することにより、統合されたホモロジーアームフラグメントを取得した。

本発明の一実施形態において、使用したＰＣＲシステム：１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬである。ＰＣＲ増幅は、９４℃予備変性５分間、９４℃変性３０秒間、５２℃アニーリング３０秒間、７２℃伸長６０秒間（３０サイクル）、７２℃過剰伸長１０分間により行われる。

本発明の一実施形態において、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を用い、シャトルプラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢと、上下流のホモロジーアームフラグメント、遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域のフラグメントとを組み立て、統合されたプラスミドを取得した。

本発明の一実施態様において、統合されたプラスミドを宿主菌株にトランスフェクトして、相同組換えによりＮＣｇｌ０６０９又はＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}遺伝子を宿主菌株のゲノムに導入する。

本発明の一実施形態において、前記宿主菌株は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２で示されるポリヌクレオチド配列を有している菌株である。

本発明の第５の態様は、さらに、Ｌ－アミノ酸を生産する組換え菌株の構築方法を提供する。

本発明によれば、前記構築方法は、以下のステップを含む。
ＮＣｇｌ０６０９遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域の配列を増幅したか、又は、ＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域の配列を増幅したことにより、過剰発現されたプラスミドベクターを構築し、前記ベクターを宿主菌株に導入することにより、前記菌株にＮＣｇｌ０６０９又はＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}遺伝子が過剰発現された。

本発明の一実施形態において、前記遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域の配列を増幅するプライマーは、以下の通りである。
Ｐ１７：５’ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＧＡＧＧＡＴＣＡＴＣＴＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）
Ｐ１８：５’ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＣＡＡＣＴＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）

本発明の一実施形態において、前記ＰＣＲシステム：１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬである。前記ＰＣＲ増幅は、９４℃予備変性５分間、９４℃変性３０秒間、５２℃アニーリング３０秒間、７２℃伸長６０秒間（３０サイクル）、７２℃過剰伸長１０分間により行われる。

本発明の一実施形態において、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を用い、シャトルプラスミドｐＸＭＪ１９と、自身のプロモーターを有しているＮＣｇｌ０６０９又はＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}のフラグメントとを組み立て、過剰発現されたプラスミドを得た。

本発明の一実施形態において、前記宿主菌株は、ＡＴＣＣ１３８６９である。

本発明は、さらに、コリネバクテリウムの組換え菌株の構築方法を提供する。

本発明によれば、前記構築方法は、下記ステップを含む。
宿主菌株におけるＳＥＱＩＤＮＯ：２９で示される野生型ＮＣｇｌ１５７５のポリヌクレオチド配列をその１７７５位の塩基が突然変異するように修飾し、突然変異されたＮＣｇｌ１５７５コード遺伝子を含むコリネバクテリウムの組換え菌株を得る。

本発明に係る構築方法によれば、前記修飾は、変異誘発、ＰＣＲ部位特異的変異導入、及び／又は相同組換えなどの方法の中での少なくとも１つを含む。

本発明に係る構築方法によれば、前記突然変異されたことは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９における１７７５位の塩基がアデニン（Ａ）からチミン（Ｔ）に突然変異したことを意味し、詳しくは、前記の突然変異されたＮＣｇｌ１５７５コード遺伝子を含むポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０で示される。

さらに、前記構築方法は、
ステップ（１）：ＳＥＱＩＤＮＯ：２９で示される野生型ＮＣｇｌ１５７５遺伝子のヌクレオチド配列をその１７７５位の塩基が突然変異するように修飾し、突然変異されたＮＣｇｌ１５７５遺伝子のポリヌクレオチド配列を得ること；
ステップ（２）：前記突然変異されたポリヌクレオチド配列をプラスミドと連結して組換えベクターを構築すること；
ステップ（３）：前記組換えベクターを宿主菌株に導入し、前記の突然変異されたＮＣｇｌ１５７５コード遺伝子を含むコリネバクテリウムの組換え菌株を得ること、を含む。

本発明に係る構築方法によれば、前記ステップ（１）は、点突然変異されたＮＣｇｌ１５７５遺伝子の構築（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノム配列に従って、ＮＣｇｌ１５７５遺伝子フラグメントを増幅する２対のプライマーＰ１’及びＰ２’、Ｐ３’及びＰ４’を合成し、ＰＣＲ部位特異的変異導入により、野生型ＮＣｇｌ１５７５遺伝子のＳＥＱＩＤＮＯ：２９に点突然変異を導入し、点突然変異されたＮＣｇｌ１５７５遺伝子のヌクレオチド配列ＳＥＱＩＤＮＯ：３０を得て、ＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}と記載されること）を含む。

本発明の一実施形態において、前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノムは、ＡＴＣＣ１３０３２菌株に由来し得、そのゲノム配列はＮＣＢＩウェブサイトから入手可能である。

本発明の一実施形態において、前記ステップ（１）において、前記プライマーは以下の通りである。
Ｐ１’：５’ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＴＧＣＧＴＴＣＧＴＣＴＧＣＧＧＴＴＴＣＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）
Ｐ２’：５’ ＡＴＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＣＴＴＣＴＧＡＴＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：３４）；
Ｐ３’：５’ ＣＡＴＣＡＧＡＡＧＧＧＴＧＡＡＴＧＧＧＧＣＧＧＣＧＴＣＧＡＴ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）；
Ｐ４’：５’ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＡＡＧＣＣＴＣＧＡＣＣＣＣＴＡＣＡＴＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）

本発明の一実施形態において、前記ＰＣＲ増幅は、９４℃変性３０秒間、５２℃アニーリング３０秒間、７２℃伸長４０秒間（３０サイクル）により行われる。

本発明の一実施形態において、前記オーバーラップＰＣＲ増幅は、９４℃変性３０秒間、５２℃アニーリング３０秒間、７２℃伸長９０秒間（３０サイクル）により行われる。

本発明に係る構築方法によれば、前記ステップ（２）は、分離精製した後のＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}及びｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドをＮＥＢｕｉｄｅｒ組み換え系により組み立てて組み換えプラスミドｐＫ１８－ＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}を得ることを含む、組み換えプラスミドの構築を含む。

本発明に係る構築方法によれば、前記ステップ（３）は、組換えプラスミドｐＫ１８－ＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}を宿主菌株に形質転換して組換え菌株を得る、組み換え菌株の構築を含む。

本発明の一実施形態において、前記組み換えは、相同組換えにより行われる。

本発明は、さらに、コリネバクテリウムの組換え菌株の構築方法を提供することにある。

本発明によれば、前記構築方法は、下記ステップを含む。
ＮＣｇｌ１５７５遺伝子の上下流のホモロジーアームフラグメント、ＮＣｇｌ１５７５遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域の配列を増幅したか、又は、ＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域の配列を増幅した後、ＮＣｇｌ１５７５又はＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}遺伝子を相同組換えにより宿主菌株のゲノムに導入することにより、前記菌株にＮＣｇｌ１５７５又はＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}遺伝子が過剰発現されることを実現させる。

本発明の一実施形態において、上流のホモロジーアームフラグメントを増幅するプライマーは、以下の通りである。
Ｐ７’：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧ
ＣＧＴＴＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：３９）
Ｐ８’：５’ ＧＡＡＡＣＧＧＣＣＴＴＡＡＧＣＴＡＧＧＴＧＣＡＣＣＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：４０）

本発明の一実施形態において、下流のホモロジーアームフラグメントを増幅するプライマーは、以下の通りである。
Ｐ１１’：５’ ＡＡＣＣＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＴＴＧＡＴＧＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＡＴＣＡＡＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：４３）
Ｐ１２’：５’ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＣＴＡＴ
ＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＧＧＡＴＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：４４）

本発明の一実施形態において、前記遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域の配列を増幅するプライマーは、以下の通りである。
Ｐ９’：５’ ＣＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＧＧＴＧＣＡＣＣＴＡＧＣＴＴＡＡＧＧＣＣＧＴＴＴＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）
Ｐ１０’：５’ ＣＴＴＧＡＴＴＴＡＡＴＴＧＣＧＣＣＡＴＣＡＡＧＣＴＴＴＴＣＣＣＧＣＣＣＧＧＴＴ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：４２）

本発明の一実施形態において、前記Ｐ７’／Ｐ１２’をプライマーとし、増幅により得られた上流のホモロジーアームフラグメント、下流のホモロジーアームフラグメント、及び自身のプロモーターを有しているＮＣｇｌ１５７５又はＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}の三つのフラグメントの混合物をテンプレートとして増幅することにより、統合されたホモロジーアームフラグメントを取得した。

本発明の一実施形態において、使用したＰＣＲシステム：１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬである。ＰＣＲ増幅は、９４℃予備変性５分間、９４℃変性３０秒間、５２℃アニーリング３０秒間、７２℃伸長１８０秒間（３０サイクル）、７２℃過剰伸長１０分間により行われる。

本発明の一実施形態において、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換えシステムを用い、シャトルプラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢと、統合されたホモロジーアームフラグメントとを組み立て、統合されたプラスミドを取得した。

本発明の一実施態様において、統合されたプラスミドを宿主菌株にトランスフェクトして、相同組換えによりＮＣｇｌ１５７５又はＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}遺伝子を宿主菌株のゲノムに導入する。

本発明の一実施形態において、前記宿主菌株は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０で示されるポリヌクレオチド配列を有している菌株である。

本発明によれば、前記構築方法は、下記ステップを含む。
ＮＣｇｌ１５７５遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域の配列を増幅したか、又は、ＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域の配列を増幅したことにより、過剰発現されたプラスミドベクターを構築し、前記ベクターを宿主菌株に導入することにより、前記菌株にＮＣｇｌ１５７５又はＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}遺伝子が過剰発現されることを達成させる。

本発明の一実施形態において、前記遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域の配列を増幅するプライマーは、以下の通りである。
Ｐ１７’：５’ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＴＡＧＣＴ
ＴＡＡＧＧＣＣＧＴＴＴＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：４９）
Ｐ１８’：５’ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＣＴＴＴ
ＴＣＣＣＧＣＣＣＧＧＴＴ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：５０）

本発明の一実施形態において、前記ＰＣＲシステム：１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬである。ＰＣＲ増幅は、９４℃予備変性５分間、９４℃変性３０秒間、５２℃アニーリング３０秒間、７２℃伸長１２０秒間（３０サイクル）、７２℃過剰伸長１０分間により行われる。

本発明の一実施形態において、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を用い、シャトルプラスミドｐＸＭＪ１９と、自身のプロモーターを有するＮＣｇｌ１５７５又はＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}のフラグメントとを組み立て、過剰発現されたプラスミドを取得した。

本発明のもう一つの態様は、ＳＥＱＩＤＮＯ：５７で示されるプロモーター領域における－４５ｂｐ位及び－４７ｂｐ位の塩基を突然変異させることにより形成されたヌクレオチド配列を含む、プロモーターのヌクレオチド配列を提供することにある。

本発明によれば、ＳＥＱＩＤＮＯ：５７で示されるプロモーター領域の－４５ｂｐ位のヌクレオチドであるグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に突然変異しており、－４７ｂｐ位のヌクレオチドであるグアニン（Ｇ）がチミン（Ｔ）に突然変異したことが確認された。

本発明によれば、前記プロモーターのヌクレオチド配列は、以下の通りである。
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５８で示されるヌクレオチド配列、又は
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５８で示されるヌクレオチド配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、９８％以上の同一性を有し、且つ（ａ）に係るプロモーターの増強活性を保留し、且つ－４５ｂｐ位にアデニン（Ａ）、－４７ｂｐ位にチミン（Ｔ）を維持されているヌクレオチド配列。

本発明は、さらに、前記プロモーター、及び前記プロモーターの後に操作可能に連結されるコード配列を含む、前記プロモーターを含む発現カセットを提供することにある。本発明の一実施形態において、前記コード配列は、ｌｙｓＣ遺伝子のコード配列である。

本発明は、さらに、本発明のプロモーターのヌクレオチド配列を含む、組換えベクターを提供することにある。

本発明によれば、本発明のプロモーターのヌクレオチド配列をシャトルプラスミドと連結して前記組換えベクターを構築しており、本発明の一実施形態において、前記シャトルプラスミドは、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドである。

本発明は、さらに、前記プロモーターのヌクレオチド配列又は前記組換えベクターを含む、組換え菌株を提供することにある。

本発明による組換え菌株は、ＳＥＱＩＤＮＯ：５８で示されるヌクレオチド配列を含む。前記ＳＥＱＩＤＮＯ：５８で示されるヌクレオチド配列は、ｌｙｓＣ遺伝子のプロモーター区域である。さらに、前記ＳＥＱＩＤＮＯ：５８で示されるヌクレオチド配列がｌｙｓＣ遺伝子をコードする配列に連結されている。詳しくは、前記組換え菌株は、本発明の前記発現カセット又は前記組換えベクターを含んでもよい。詳しくは、本発明の組換え菌株は、発現カセット又は組換えベクターから形質転換して得られた。本発明による組換え菌株は、上記突然変異されたプロモーターのヌクレオチド配列を宿主菌株に導入して組換えて形成された。前記宿主菌株は、当技術分野で公知のＬ－アミノ酸、特にＬ－リシンを生産する菌株から選択されてもよく、例えば、コリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の中での少なくとも一つから選択されてもよい。前記コリネ型細菌は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｒｅｎａｔｕｍ、又はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｅｋｉｎｅｎｓｅであってもよい。好ましくは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。本発明の一実施形態において、前記宿主菌株は、ＹＰ９７１５８である。

本発明による組み換え菌株は、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドをベクターとした。

本発明による組み換え菌株は、他の修飾をさらに含んでもよい。

本発明は、さらに、下記ステップ（１）を含む、Ｌ－リシン酸を生産する組換え菌株の構築方法を提供する。
ステップ（１）：ＳＥＱＩＤＮＯ：５７で示されるプロモーター領域をその－４５ｂｐ位及び－４７ｂｐ位の塩基が突然変異するように修飾し、突然変異されたプロモーター領域を含むヌクレオチド配列を得る。

本発明によれば、前記突然変異されたことは、ＳＥＱＩＤＮＯ：５７で示されるプロモーター領域における－４５ｂｐ位のヌクレオチドであるグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に突然変異しており、－４７ｂｐ位のヌクレオチドであるグアニン（Ｇ）がチミン（Ｔ）に突然変異したことを意味する。詳しくは、前記の突然変異されたプロモーター領域のヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：５８で示される。さらに、前記構築方法は、下記ステップ（２）及びステップ（３）をさらに含む。
ステップ（２）：前記突然変異されたプロモーター領域のヌクレオチド配列をプラスミドと連結して組換えベクターを構築すること、
ステップ（３）：前記組換えベクターを宿主菌株に導入し、前記の突然変異されたプロモーター領域を含む、Ｌ－リシン酸を生産する組換え菌株を得ること。

本発明によれば、前記ステップ（１）において、前記突然変異を生じさせる方法は、変異誘発、ＰＣＲ部位特異的変異導入又は相同組換えを含み、好ましくは、相同組換えである。

本発明によれば、前記ステップ（１）は、ｌｙｓＣ遺伝子のプロモーター領域を増幅する２対のプライマーを設計し、さらに、突然変異されたプロモーター領域のヌクレオチド配列をＰＣＲ技術により得ることを、含む。

本発明の一実施形態において、前記ステップ（１）におけるプライマーは、以下の通りである。
Ｐ１’’：５’ ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＣＣＡＡＧＧＡＴＧＡＧＧＧＣＴＴＴＧ３’（ＥｃｏＲＩ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９）
Ｐ２’’：５’ ＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＡＴＴＡＴＡＣＣＴＴＴＡＴＡＡＡＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：６０）
Ｐ３’’：５’ ＧＴＴＴＡＴＡＡＡＧＧＴＡＴＡＡＴＴＧＡＧＣＧＧＧＴＡＡＣＴ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：６１）
Ｐ４’’：５’ ＡＣＡＴＧＣＡＴＧＣＧＣＧＴＡＣＧＣＧＡＡＧＴＧＧＣＡＣＡＴ３’（ＳｐｈＩ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：６２）

本発明の一実施形態において、前記ステップ（１）は、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２をテンプレートとし、プライマーＰ１’’及びＰ２’’、Ｐ３’’及びＰ４’’をそれぞれ用いてＰＣＲ増幅を行い、２本のＤＮＡ含有フラグメントを得るステップと、前記２本のＤＮＡフラグメントをテンプレートとし、Ｐ１’’及びＰ４’’をプライマーとし、オーバーラップＰＣＲ（ＯｖｅｒｌａｐＰＣＲ）により増幅を行い、本発明のプロモーター領域のヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８）を含むＤＮＡフラグメントを得るステップと、を含む。

本発明によれば、前記ステップ（１）において、オーバーラップＰＣＲ（ＯｖｅｒｌａｐＰＣＲ）により増幅を行って得られたＤＮＡフラグメントは、両端にそれぞれＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位及びＳｐｈＩ制限酵素切断部位を有している。

本発明によれば、前記ステップ（２）は、オーバーラップＰＣＲ反応によって増幅された産物に対してアガロースゲル電気泳動及び分離精製を行い、フラグメントを二つ酵素（ＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩ）で切断した後、同じように二つ酵素（ＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩ）で切断した後のシャトルプラスミドと連結して対立遺伝子置換による組換えベクターを得ることを含む。

本発明によれば、前記シャトルプラスミドは、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドであり、前記構築された組換えベクターは、ｐＫ１８－ＰｌｙｓＣ^{（Ｇ（－４５）Ａ，Ｇ（－４７）Ｔ）}である。

本発明の一実施形態において、前記組換えプラスミドはカナマイシン耐性マーカーを有する。

本発明の一実施形態において、前記ステップ（３）における形質転換は、電気的形質転換法である。例としては、前記ステップ（３）において、組換えベクターを菌株ＹＰ９７１５８に形質転換させた。

本発明により得られた上記のそれぞれの組換え菌株は、単独でＬ－アミノ酸の発酵生産に適用することもできるし、混合することもできるし、他のＬ－アミノ酸を生産する細菌と混合してＬ－アミノ酸の発酵生産に適用することもできる。

本発明の別の態様は、前記細菌を培養し培養物からＬ－アミノ酸を取得することを含む、Ｌ－アミノ酸を生産する方法を提供することにある。

細菌の培養は、当該技術分野において公知の培養条件下で好適な培地において行うことができる。培地は、炭素源、窒素源、微量元素、及びこれらの組み合わせを含んでもよい。培養中、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養時に、気泡の発生を防止すること、例えば、消泡剤を用いて気泡の発生を防止することを含んでもよい。また、培養時に、培養物に気体を注入することを含んでもよい。気体は、培養物の好気性条件を維持することができる任意の気体を含んでもよい。培養の際、培養物の温度は、２０～４５℃であってもよい。培養物から、生成したＬ－アミノ酸を回収し、即ち、硫酸又は塩酸等で培養物を処理した後、続いて、陰イオン交換クロマトグラフィー、濃縮、結晶及び等電点沈殿等の方法を組み合わせて行うことができる。

本発明においては、以下の通りである。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１：ＮＣｇｌ０６０９野生型ＯＲＦ配列
ＧＴＧＴＣＡＣＡＣＡＣＣＧＣＧＴＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＣＣＡＧＡＧＧＡＡＴＡＣＴＣＣＧＣＧＣＡＧＣＡＡＣＣＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＧＣＡＣＴＣＧＣＧＴＴＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＧＣＡＴＡＡＣＣＡＡＡＧＴＣＴＴＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＡＡＡＴＣＴＧＣＴＡＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＧＣＴＴＧＡＴＡＡＴＧＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＧＴＡＧＡＡＣＣＣＧＧＴＧＡＧＧＴＡＡＴＣＧＧＣＡＴＣＡＴＣＧＧＴＴＡＣＴＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＡＧＴＣＣＡＣＴＣＴＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＣＴＣＣＣＣＣＡＣＧＡＧＣＧＧＴＴＣＧＴＴＧＣＴＧＣＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＡＴＣＧＴＣＧＧＡＡＴＧＣＣＣＧＡＧＴＣＴＡＡＧＣＴＧＣＧＴＡＡＡＣＴＧＣＧＣＡＧＴＡＡＴＡＴＣＧＧＣＡＴＧＡＴＴＴＴＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＣＴＧＴＴＣＣＡＧＴＣＧＣＧＴＡＣＴＧＣＧＧＣＴＧＧＡＡＡＴＧＴＧＧＡＧＴＡＣＣＣＧＣＴＧＧＡＡＧＴＴＧＣＣＡＡＧＡＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＡＧＣＴＣＧＴＡＡＡＧＣＴＣＧＣＧＴＧＣＡＡＧＡＡＡＴＧＣＴＣＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＣＡＡＡＧＧＣＡＡＡＡＡＣＴＡＣＣＣＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＣＧＧＧＣＧＧＣＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＧＣＧＴＣＧＧＣＡＴＴＧＣＣＣＧＴＧＣＡＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡＡＴＣＣＡＡＣＧＣＴＴＴＴＧＣＴＴＧＣＣＧＡＣＧＡＡＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＴＴＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＡＡＣＣＡＣＣＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＧＣＡＡＧＧＴＡＡＡＣＣＧＣＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＧＴＴＧＴＧＡＴＣＡＣＣＣＡＣＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧＴＴＧＴＧＣＧＴＴＣＣＡＴＣＧＣＡＧＡＣＡＡＧＧＴＴＧＣＴＧＴＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＧＴＴＧＴＧＧＡＡＴＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＴＡＣＧＡＧＧＴＧＴＴＣＴＣＣＡＡＴＣＣＡＣＡＡＡＣＡＣＡＧＧＴＴＧＣＴＣＡＡＡＡＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＡＣＣＧＣＧＣＴＧＣＧＴＡＡＣＡＣＣＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＴＧＧＡＡＴＣＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＴＴＡＧＣＣＡＴＧＡＧＧＧＡＣＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＣＴＧＡＣＴＧＡＡＡＣＧＴＣＣＧＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＡＧＣＡＡＣＣＧＣＴＣＧＴＧＣＴＧＣＣＧＡＡＣＡＡＧＧＴＧＣＴＴＴＴＧＴＣＡＡＣＡＴＣＧＴＴＣＡＣＧＧＴＧＧＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＴＣＡＴＴＴＧＧＣＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＴＴＣＧＡＣＴＣＡＣＣＧＧＣＡＡＣＡＣＣＧＣＴＧＣＧＡＴＴＧＡＡＧＡＧＴＴＣＴＡＴＣＡＡＡＣＣＴＴＧＡＣＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＡＣＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＣＣＧＡＴＧＡ
ＳＥＱＩＤＮＯ：２：ＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊} ＯＲＦ配列
ＧＴＧＴＣＡＣＡＣＡＣＣＧＣＧＴＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＣＣＡＧＡＧＧＡＡＴＡＣＴＣＣＧＣＧＣＡＧＣＡＡＣＣＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＧＣＡＣＴＣＧＣＧＴＴＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＧＣＡＴＡＡＣＣＡＡＡＧＴＣＴＴＴＡＧＣＡＡＣＡＡＴＡＡＡＴＣＴＧＣＴＡＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＧＣＴＴＧＡＴＡＡＴＧＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＧＴＡＧＡＡＣＣＣＧＧＴＧＡＧＧＴＡＡＴＣＧＧＣＡＴＣＡＴＣＧＧＴＴＡＣＴＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＡＧＴＣＣＡＣＴＣＴＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＣＴＣＣＣＣＣＡＣＧＡＧＣＧＧＴＴＣＧＴＴＧＣＴＧＣＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＡＴＣＧＴＣＧＧＡＡＴＧＣＣＣＧＡＧＴＣＴＡＡＧＣＴＧＣＧＴＡＡＡＣＴＧＣＧＣＡＧＴＡＡＴＡＴＣＧＧＣＡＴＧＡＴＴＴＴＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＣＴＧＴＴＣＣＡＧＴＣＧＣＧＴＡＣＴＧＣＧＧＣＴＧＧＡＡＡＴＧＴＧＧＡＧＴＡＣＣＣＧＣＴＧＧＡＡＧＴＴＧＣＣＡＡＧＡＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＡＧＣＴＣＧＴＡＡＡＧＣＴＣＧＣＧＴＧＣＡＡＧＡＡＡＴＧＣＴＣＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＣＡＡＡＧＧＣＡＡＡＡＡＣＴＡＣＣＣＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＣＧＧＧＣＧＧＣＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＧＣＧＴＣＧＧＣＡＴＴＧＣＣＣＧＴＧＣＡＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡＡＴＣＣＡＡＣＧＣＴＴＴＴＧＣＴＴＧＣＣＧＡＣＧＡＡＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＴＴＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＡＡＣＣＡＣＣＣＡＴＧＡＡＧＴＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＧＣＡＡＧＧＴＡＡＡＣＣＧＣＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＧＴＴＧＴＧＡＴＣＡＣＣＣＡＣＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧＴＴＧＴＧＣＧＴＴＣＣＡＴＣＧＣＡＧＡＣＡＡＧＧＴＴＧＣＴＧＴＧＡＴＧＧＡＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＧＴＴＧＴＧＧＡＡＴＡＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＴＡＣＧＡＧＧＴＧＴＴＣＴＣＣＡＡＴＣＣＡＣＡＡＡＣＡＣＡＧＧＴＴＧＣＴＣＡＡＡＡＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＡＣＣＧＣＧＣＴＧＣＧＴＡＡＣＡＣＣＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＴＧＧＡＡＴＣＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＴＴＡＧＣＣＡＴＧＡＧＧＧＡＣＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＣＴＧＡＣＴＧＡＡＡＣＧＴＣＣＧＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＡＧＣＡＡＣＣＧＣＴＣＧＴＧＣＴＧＣＣＧＡＡＣＡＡＧＧＴＧＣＴＴＴＴＧＴＣＡＡＣＡＴＣＧＴＴＣＡＣＧＧＴＧＧＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＴＣＡＴＴＴＧＧＣＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＴＴＴＧＡＣＴＣＡＣＣＧＧＣＡＡＣＡＣＣＧＣＴＧＣＧＡＴＴＧＡＡＧＡＧＴＴＣＴＡＴＣＡＡＡＣＣＴＴＧＡＣＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＡＣＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＣＣＧＡＴＧＡ
ＳＥＱＩＤＮＯ：３：ＮＣｇｌ０６０９野生型コードタンパク質のアミノ酸配列
ＭＳＨＴＡＳＴＰＴＰＥＥＹＳＡＱＱＰＳＴＱＧＴＲＶＥＦＲＧＩＴＫＶＦＳＮＮＫＳＡＫＴＴＡＬＤＮＶＴＬＴＶＥＰＧＥＶＩＧＩＩＧＹＳＧＡＧＫＳＴＬＶＲＬＩＮＧＬＤＳＰＴＳＧＳＬＬＬＮＧＴＤＩＶＧＭＰＥＳＫＬＲＫＬＲＳＮＩＧＭＩＦＱＱＦＮＬＦＱＳＲＴＡＡＧＮＶＥＹＰＬＥＶＡＫＭＤＫＡＡＲＫＡＲＶＱＥＭＬＥＦＶＧＬＧＤＫＧＫＮＹＰＥＱＬＳＧＧＱＫＱＲＶＧＩＡＲＡＬＡＴＮＰＴＬＬＬＡＤＥＡＴＳＡＬＤＰＥＴＴＨＥＶＬＥＬＬＲＫＶＮＲＥＬＧＩＴＩＶＶＩＴＨＥＭＥＶＶＲＳＩＡＤＫＶＡＶＭＥＳＧＫＶＶＥＹＧＳＶＹＥＶＦＳＮＰＱＴＱＶＡＱＫＦＶＡＴＡＬＲＮＴＰＤＱＶＥＳＥＤＬＬＳＨＥＧＲＬＦＴＩＤＬＴＥＴＳＧＦＦＡＡＴＡＲＡＡＥＱＧＡＦＶＮＩＶＨＧＧＶＴＴＬＱＲＱＳＦＧＫＭＴＶＲＬＴＧＮＴＡＡＩＥＥＦＹＱＴＬＴＫＴＴＴＩＫＥＩＴＲ
ＳＥＱＩＤＮＯ：４：ＮＣｇｌ０６０９Ｒ３３４＊コードタンパク質のアミノ酸配列
ＭＳＨＴＡＳＴＰＴＰＥＥＹＳＡＱＱＰＳＴＱＧＴＲＶＥＦＲＧＩＴＫＶＦＳＮＮＫＳＡＫＴＴＡＬＤＮＶＴＬＴＶＥＰＧＥＶＩＧＩＩＧＹＳＧＡＧＫＳＴＬＶＲＬＩＮＧＬＤＳＰＴＳＧＳＬＬＬＮＧＴＤＩＶＧＭＰＥＳＫＬＲＫＬＲＳＮＩＧＭＩＦＱＱＦＮＬＦＱＳＲＴＡＡＧＮＶＥＹＰＬＥＶＡＫＭＤＫＡＡＲＫＡＲＶＱＥＭＬＥＦＶＧＬＧＤＫＧＫＮＹＰＥＱＬＳＧＧＱＫＱＲＶＧＩＡＲＡＬＡＴＮＰＴＬＬＬＡＤＥＡＴＳＡＬＤＰＥＴＴＨＥＶＬＥＬＬＲＫＶＮＲＥＬＧＩＴＩＶＶＩＴＨＥＭＥＶＶＲＳＩＡＤＫＶＡＶＭＥＳＧＫＶＶＥＹＧＳＶＹＥＶＦＳＮＰＱＴＱＶＡＱＫＦＶＡＴＡＬＲＮＴＰＤＱＶＥＳＥＤＬＬＳＨＥＧＲＬＦＴＩＤＬＴＥＴＳＧＦＦＡＡＴＡＲＡＡＥＱＧＡＦＶＮＩＶＨＧＧＶＴＴＬＱＲＱＳＦＧＫＭＴＶ
ＳＥＱＩＤＮＯ：２９：ＮＣｇｌ１５７５野生型ＯＲＦ配列
ＡＴＧＧＣＡＧＡＡＴＣＡＡＡＣＧＣＴＡＴＧＧＡＣＣＧＧＧＣＡＣＡＡＡＴＣＴＣＴＧＣＡＣＴＧＣＴＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＡＣＡＣＡＡＴＣＡＡＣＣＴＴＧＣＣＧＡＡＣＡＡＧＣＡＡＡＣＡＡＣＧＴＧＣＴＣＣＧＡＣＴＧＴＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＣＧＧＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＧＴＡＧＧＧＧＡＣＡＡＣＧＧＧＡＣＡＣＴＣＧＧＣＡＣＣＧＡＴＡＣＣＴＡＴＣＴＧＡＴＣＣＣＡＴＣＣＣＧＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＡＣＡＡＣＣＴＧＴＡＴＧＴＣＡＡＣＧＴＣＴＴＴＣＴＡＧＡＣＧＧＣＡＴＧＡＡＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＣＣＣＴＴＡＣＣＧＡＴＴＡＣＧＴＣＧＣＡＴＣＡＧＴＣＧＣＴＴＣＧＡＴＣＣＣＡＣＧＣＣＴＡＴＧＣＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＣＧＡＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＧＧＣＡＴＧＴＴＣＣＧＣＡＧＡＣＴＡＴＴＣＡＡＣＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＴＣＣＡＡＧＣＣＧＧＣＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＴＣＴＴＣＧＡＣＣＴＣＡＴＧＧＴＣＡＡＡＣＴＣＧＡＣＧＡＧＡＴＴＴＣＡＴＣＴＡＣＣＡＣＣＣＡＣＧＡＡＧＴＣＴＣＣＣＧＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＧＧＣＧＴＣＣＡＣＧＣＴＧＣＣＣＧＣＡＣＣＣＧＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＧＣＧＴＴＧＣＡＣＴＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＴＡＣＡＴＣＧＡＡＣＧＣＧＣＡＣＡＡＣＡＧＧＴＡＣＴＣＧＣＣＴＣＡＧＣＣＣＴＣＧＧＴＡＴＣＧＣＴＧＧＡＴＴＣＧＧＴＧＣＣＧＡＡＣＣＣＴＧＧＧＡＣＧＧＡＣＡＴＡＣＣＣＴＴＧＣＣＣＡＡＧＣＧＣＧＣＣＧＧＧＴＡＧＴＣＣＡＡＣＧＣＴＡＣＧＣＣＣＡＡＧＡＴＣＣＴＡＡＣＴＣＣＧＡＡＴＡＣＣＧＧＣＴＧＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＣＴＣＡＣＡＴＣＣＡＴＣＡＡＣＧＡＧＣＴＣＣＧＣＧＴＡＣＡＧＡＴＡＣＴＣＣＴＣＧＡＡＣＡＡＣＴＣＣＣＣＧＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＣＡＴＧＧＣＴＡＣＣＧＡＣＣＡＣＣＧＣＣＴＧＣＧＣＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＴＴＣＣＡＴＣＣＡＣＧＴＣＧＣＡＡＣＣＧＴＣＧＣＣＧＡＣＧＴＣＣＴＡＡＡＡＡＣＡＣＡＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＡＣＣＡＣＣＧＴＧＣＡＡＧＧＴＡＴＣＧＧＣＧＣＣＣＡＡＡＣＣＧＣＧＧＧＧＣＧＧＡＴＧＡＡＡＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＣＴＣＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＴＡＣＧＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＡＡＣＣＴＡＣＣＣＡＡＣＣＣＧＣＣＡＴＧＣＧＴＣＴＡＡＴＣＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＧＣＴＴＣＧＡＣＣＡＡＡＣＣＧＡＡＡＣＣＡＴＣＡＣＧＣＣＣＧＡＡＧＡＡＣＧＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＧＣＧＴＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＧＴＡＧＡＡＣＡＣＡＴＡＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＴＣＧＡＣＣＣＣＴＡＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＡＡＣＣＣＡＧＣＡＡＣＧＣＣＴＧＡＧＴＴＣＡＡＣＡＡＣＴＴＣＡＣＣＧＡＣＧＡＣＣＴＣＣＧＣＴＧＧＡＴＣＧＡＣＧＣＡＡＡＣＣＣＣＡＡＣＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＣＡＣＡＡＡＣＡＡＴＣＡＣＣＡＣＣＣＣＡＣＣＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＴＧＧＧＡＣＧＡＣＴＡＣＡＴＣＴＣＣＣＧＴＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＡＣＣＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＧＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＡＴＣＧＡＡＧＧＣＧＣＡＧＡＣＧＡＡＣＴＣＣＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＡＧＡＧＡＣＣＴＣＡＣＣＣＴＣＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＡＣＣＧＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＧＧＡＴＡＣＣＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＣＧＣＣＣＧＣＴＴＣＧＣＣＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＣＣＴＣＧＧＣＧＡＣＧＡＣＡＴＧＧＧＡＣＴＣＧＧＣＡＡＡＡＣＡＧＴＣＣＡＡＧＣＣＣＴＣＴＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＡＡＡＡＡＧＡＣＴＴＣＣＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＡＣＣＣＧＣＡＴＣＣＧＴＣＡＴＴＧＴＴＡＡＣＴＧＧＡＣＣＣＧＣＧＡＡＴＧＣＡＡＡＣＧＣＴＴＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＣＣＣＧＴＡＴＴＣＡＴＣＧＣＣＣＡＣＧＧＡＧＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＡＡＣＧＣＣＴＧＧＴＣＴＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＧＡＡＴＣＧＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＧＴＣＣＧＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＣＣＣＣＧＣＧＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＴＣＡＴＴＧＣＣＧＡＴＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＴＧＡＴＣＡＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＡＣＧＣＡＣＣＣＡＡＧＣＡＣＴＧＣＧＣＡＡＡＣＴＴＡＴＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＡＴＡＣＡＣＣＣＴＴＣＴＧＡＴＧＡＣＣＧＧＣＡＣＡＣＣＡＣＴＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＴＡＡＡＴＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＧＧＡＧＣＴＧＡＴＣＡＣＣＣＧＴＧＧＣＡＴＧＴＣＣＡＡＡＡＴＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＴＴＴＣＣＧＣＧＡＧＣＧＣＡＴＣＧＣＡＣＣＡＧＣＣＴＡＴＣＴＧＣＧＣＡＧＡＡＡＴＣＡＡＧＣＴＧＡＴＧＴＧＣＴＴＧＡＣＧＡＡＣＴＣＣＣＡＧＡＧＣＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＣＡＴＣＧＡＣＴＧＧＡＴＣＧＡＣＣＴＣＡＣＣＣＣＡＧＡＡＧＡＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＧＡＣＧＡＣＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧＧＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＧＣＣＧＣＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＴＣＴＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＧＣＣＴＡＡＣＴＴＣＣＧＣＡＡＡＡＡＴＧＣＡＡＣＧＣＡＴＣＣＴＡＧＡＡＣＴＣＴＴＣＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＣＴＣＧＡＣＧＴＣＣＴＣＧＡＣＧＡＡＣＴＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＴＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧＴＣＡＴＣＧＧＣＣＧＣＡＴＴＴＣＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＣＧＣＣＡＡＴＴＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＡＡＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣＣＣＡＡＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＧＴＡＧＧＣＣＴＡＡＡＣＡＴＣＣＡＡＴＣＣＧＣＧＡＧＣＣＴＡＴＧＣＡＴＴＡＴＴＴＧＴＧＡＡＣＣＴＣＡＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＣＡＴＣＧＡＡＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＴＣＣＡＣＣＧＣＡＴＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＧＣＣＡＣＣＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＡＣＣＧＡＣＴＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＡＡＡＣＣＧＣＡＧＡＣＧＡＡＣＧＣＡＴＧＣＴＡＧＡＡＡＴＣＣＴＧＧＣＡＧＧＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＣＴＴＣＧＡＣＧＴＣＴＡＣＧＣＣＣＧＧＣＴＡＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＣＡＧＡＧＡＴＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴＧＴＧＧＡＴＡＴＣＡＣＴＧＡＡＴＣＡＣＡＧＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣＧＧＧＴＴＡＴＴＧＡＴＧＡＧＧＡＧＣＧＴＧＣＡＣＧＧＴＴＡＧＧＧＣＴＴＡＣＴＧＡＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＣＣＴＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＣＧＧＣＣＴＴＡＡＧＣＴＡＧ
ＳＥＱＩＤＮＯ：３０：ＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ} ＯＲＦ配列
ＡＴＧＧＣＡＧＡＡＴＣＡＡＡＣＧＣＴＡＴＧＧＡＣＣＧＧＧＣＡＣＡＡＡＴＣＴＣＴＧＣＡＣＴＧＣＴＡＧＡＴＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＡＣＡＣＡＡＴＣＡＡＣＣＴＴＧＣＣＧＡＡＣＡＡＧＣＡＡＡＣＡＡＣＧＴＧＣＴＣＣＧＡＣＴＧＴＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣＣＧＧＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＧＴＡＧＧＧＧＡＣＡＡＣＧＧＧＡＣＡＣＴＣＧＧＣＡＣＣＧＡＴＡＣＣＴＡＴＣＴＧＡＴＣＣＣＡＴＣＣＣＧＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＡＣＡＡＣＣＴＧＴＡＴＧＴＣＡＡＣＧＴＣＴＴＴＣＴＡＧＡＣＧＧＣＡＴＧＡＡＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＣＣＣＴＴＡＣＣＧＡＴＴＡＣＧＴＣＧＣＡＴＣＡＧＴＣＧＣＴＴＣＧＡＴＣＣＣＡＣＧＣＣＴＡＴＧＣＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＣＧＡＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＧＧＣＡＴＧＴＴＣＣＧＣＡＧＡＣＴＡＴＴＣＡＡＣＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＴＣＣＡＡＧＣＣＧＧＣＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＴＣＴＴＣＧＡＣＣＴＣＡＴＧＧＴＣＡＡＡＣＴＣＧＡＣＧＡＧＡＴＴＴＣＡＴＣＴＡＣＣＡＣＣＣＡＣＧＡＡＧＴＣＴＣＣＣＧＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＧＧＣＧＴＣＣＡＣＧＣＴＧＣＣＣＧＣＡＣＣＣＧＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＧＣＧＴＴＧＣＡＣＴＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＴＡＣＡＴＣＧＡＡＣＧＣＧＣＡＣＡＡＣＡＧＧＴＡＣＴＣＧＣＣＴＣＡＧＣＣＣＴＣＧＧＴＡＴＣＧＣＴＧＧＡＴＴＣＧＧＴＧＣＣＧＡＡＣＣＣＴＧＧＧＡＣＧＧＡＣＡＴＡＣＣＣＴＴＧＣＣＣＡＡＧＣＧＣＧＣＣＧＧＧＴＡＧＴＣＣＡＡＣＧＣＴＡＣＧＣＣＣＡＡＧＡＴＣＣＴＡＡＣＴＣＣＧＡＡＴＡＣＣＧＧＣＴＧＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＣＴＣＡＣＡＴＣＣＡＴＣＡＡＣＧＡＧＣＴＣＣＧＣＧＴＡＣＡＧＡＴＡＣＴＣＣＴＣＧＡＡＣＡＡＣＴＣＣＣＣＧＴＴＧＡＴＧＣＣＣＴＡＣＧＣＡＴＧＧＣＴＡＣＣＧＡＣＣＡＣＣＧＣＣＴＧＣＧＣＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＴＴＣＣＡＴＣＣＡＣＧＴＣＧＣＡＡＣＣＧＴＣＧＣＣＧＡＣＧＴＣＣＴＡＡＡＡＡＣＡＣＡＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＡＣＣＡＣＣＧＴＧＣＡＡＧＧＴＡＴＣＧＧＣＧＣＣＣＡＡＡＣＣＧＣＧＧＧＧＣＧＧＡＴＧＡＡＡＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＣＴＣＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＴＡＣＧＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＡＡＣＣＴＡＣＣＣＡＡＣＣＣＧＣＣＡＴＧＣＧＴＣＴＡＡＴＣＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＧＣＴＴＣＧＡＣＣＡＡＡＣＣＧＡＡＡＣＣＡＴＣＡＣＧＣＣＣＧＡＡＧＡＡＣＧＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＧＣＧＴＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＧＴＡＧＡＡＣＡＣＡＴＡＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＴＣＧＡＣＣＣＣＴＡＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＡＡＣＣＣＡＧＣＡＡＣＧＣＣＴＧＡＧＴＴＣＡＡＣＡＡＣＴＴＣＡＣＣＧＡＣＧＡＣＣＴＣＣＧＣＴＧＧＡＴＣＧＡＣＧＣＡＡＡＣＣＣＣＡＡＣＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＣＡＣＡＡＡＣＡＡＴＣＡＣＣＡＣＣＣＣＡＣＣＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＴＧＧＧＡＣＧＡＣＴＡＣＡＴＣＴＣＣＣＧＴＣＣＣＧＣＴＣＡＣＴＡＣＣＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＧＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＡＴＣＧＡＡＧＧＣＧＣＡＧＡＣＧＡＡＣＴＣＣＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＡＧＡＧＡＣＣＴＣＡＣＣＣＴＣＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＡＣＣＧＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＧＧＡＴＡＣＣＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＣＧＣＣＣＧＣＴＴＣＧＣＣＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＣＣＴＣＧＧＣＧＡＣＧＡＣＡＴＧＧＧＡＣＴＣＧＧＣＡＡＡＡＣＡＧＴＣＣＡＡＧＣＣＣＴＣＴＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＡＡＡＡＡＧＡＣＴＴＣＣＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＡＣＣＣＧＣＡＴＣＣＧＴＣＡＴＴＧＴＴＡＡＣＴＧＧＡＣＣＣＧＣＧＡＡＴＧＣＡＡＡＣＧＣＴＴＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＣＣＣＧＴＡＴＴＣＡＴＣＧＣＣＣＡＣＧＧＡＧＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＡＡＣＧＣＣＴＧＧＴＣＴＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＧＡＡＴＣＧＣＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＧＴＣＣＧＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＣＣＣＣＧＣＧＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＴＣＡＴＴＧＣＣＧＡＴＧＡＡＧＣＣＣＡＣＣＴＧＡＴＣＡＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＡＣＧＣＡＣＣＣＡＡＧＣＡＣＴＧＣＧＣＡＡＡＣＴＴＡＴＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＣＴＴＣＴＧＡＴＧＡＣＣＧＧＣＡＣＡＣＣＡＣＴＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＴＡＡＡＴＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＧＧＡＧＣＴＧＡＴＣＡＣＣＣＧＴＧＧＣＡＴＧＴＣＣＡＡＡＡＴＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＴＴＴＣＣＧＣＧＡＧＣＧＣＡＴＣＧＣＡＣＣＡＧＣＣＴＡＴＣＴＧＣＧＣＡＧＡＡＡＴＣＡＡＧＣＴＧＡＴＧＴＧＣＴＴＧＡＣＧＡＡＣＴＣＣＣＡＧＡＧＣＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＣＡＴＣＧＡＣＴＧＧＡＴＣＧＡＣＣＴＣＡＣＣＣＣＡＧＡＡＧＡＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣＧＡＣＧＡＣＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＡＧＧＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＧＣＣＧＣＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＴＣＴＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＣＧＣＣＴＡＡＣＴＴＣＣＧＣＡＡＡＡＡＴＧＣＡＡＣＧＣＡＴＣＣＴＡＧＡＡＣＴＣＴＴＣＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＣＴＣＧＡＣＧＴＣＣＴＣＧＡＣＧＡＡＣＴＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＴＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧＴＣＡＴＣＧＧＣＣＧＣＡＴＴＴＣＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＣＧＣＣＡＡＴＴＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＡＡＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＣＴＣＡＴＴＧＣＣＣＡＡＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＡＧＴＡＧＧＣＣＴＡＡＡＣＡＴＣＣＡＡＴＣＣＧＣＧＡＧＣＣＴＡＴＧＣＡＴＴＡＴＴＴＧＴＧＡＡＣＣＴＣＡＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＣＡＴＣＧＡＡＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＴＣＧＣＣＣＧＡＧＴＣＣＡＣＣＧＣＡＴＧＧＧＣＣＡＡＡＣＣＧＣＣＡＣＣＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＡＣＣＧＡＣＴＣＡＴＣＧＧＣＧＡＣＧＡＡＡＣＣＧＣＡＧＡＣＧＡＡＣＧＣＡＴＧＣＴＡＧＡＡＡＴＣＣＴＧＧＣＡＧＧＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＣＴＴＣＧＡＣＧＴＣＴＡＣＧＣＣＣＧＧＣＴＡＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＣＡＧＡＧＡＴＴＣＣＡＧＡＴＧＣＴＧＴＧＧＡＴＡＴＣＡＣＴＧＡＡＴＣＡＣＡＧＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣＧＧＧＴＴＡＴＴＧＡＴＧＡＧＧＡＧＣＧＴＧＣＡＣＧＧＴＴＡＧＧＧＣＴＴＡＣＴＧＡＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＣＣＴＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＣＧＧＣＣＴＴＡＡＧＣＴＡＧ
ＳＥＱＩＤＮＯ：３１：ＮＣｇｌ１５７５野生型コードタンパク質の配列
ＭＡＥＳＮＡＭＤＲＡＱＩＳＡＬＬＤＲＡＱＨＴＩＮＬＡＥＱＡＮＮＶＬＲＬＬＫＴＰＧＴＡＴＶＧＤＮＧＴＬＧＴＤＴＹＬＩＰＳＲＮＩＴＷＰＤＮＬＹＶＮＶＦＬＤＧＭＮＡＥＡＴＬＴＤＹＶＡＳＶＡＳＩＰＲＬＣＱＩＩＮＥＧＱＧＧＭＦＲＲＬＦＮＰＴＫＶＱＡＧＤＱＡＶＦＤＬＭＶＫＬＤＥＩＳＳＴＴＨＥＶＳＲＭＬＥＧＶＨＡＡＲＴＲＱＱＱＧＶＡＬＦＰＧＩＨＧＶＧＥＲＹＩＥＲＡＱＱＶＬＡＳＡＬＧＩＡＧＦＧＡＥＰＷＤＧＨＴＬＡＱＡＲＲＶＶＱＲＹＡＱＤＰＮＳＥＹＲＬＫＳＥＡＥＫＨＬＴＳＩＮＥＬＲＶＱＩＬＬＥＱＬＰＶＤＡＬＲＭＡＴＤＨＲＬＲＦＧＳＬＤＳＩＨＶＡＴＶＡＤＶＬＫＴＨＴＳＩＬＴＴＶＱＧＩＧＡＱＴＡＧＲＭＫＡＡＡＥＴＬＫＱＥＡＬＲＲＱＮＴＳＩＧＤＥＰＴＱＰＡＭＲＬＩＮＶＬＡＲＦＤＱＴＥＴＩＴＰＥＥＲＡＲＲＴＲＶＩＤＹＶＥＨＩＰＰＳＬＤＰＹＩＶＩＮＰＡＴＰＥＦＮＮＦＴＤＤＬＲＷＩＤＡＮＰＮＬＦＨＰＱＴＩＴＴＰＰＡＤＩＷＤＤＹＩＳＲＰＡＨＹＱＧＬＬＡＴＬＬＧＲＤＩＥＧＡＤＥＬＬＤＡＴＴＬＱＫＩＲＤＬＴＬＤＫＴＨＬＴＤＬＨＬＲＧＹＱＳＦＧＡＲＦＡＩＩＱＫＫＴＬＬＧＤＤＭＧＬＧＫＴＶＱＡＬＳＡＡＡＨＬＡＡＴＥＫＤＦＲＴＬＶＶＶＰＡＳＶＩＶＮＷＴＲＥＣＫＲＦＬＮＬＰＶＦＩＡＨＧＤＮＫＱＤＡＩＮＡＷＳＮＴＮＧＩＡＩＣＴＹＤＧＶＲＴＭＤＩＰＡＰＧＬＶＩＡＤＥＡＨＬＩＫＮＰＳＴＫＲＴＱＡＬＲＫＬＩＤＡＡＰＹＴＬＬＭＴＧＴＰＬＥＮＫＶＥＥＦＶＮＬＶＲＹＩＱＰＥＬＩＴＲＧＭＳＫＭＱＡＥＮＦＲＥＲＩＡＰＡＹＬＲＲＮＱＡＤＶＬＤＥＬＰＥＲＴＤＳＩＤＷＩＤＬＴＰＥＤＲＳＡＹＤＤＱＶＲＱＧＳＷＭＧＭＲＲＳＡＭＬＳＰＴＰＲＬＴＳＡＫＭＱＲＩＬＥＬＦＥＥＡＥＥＨＧＲＫＡＬＩＦＴＹＦＬＤＶＬＤＥＬＥＫＨＬＧＥＲＶＩＧＲＩＳＧＤＶＰＡＴＫＲＱＬＬＶＤＡＬＳＨＳＫＰＧＳＡＬＩＡＱＩＴＡＧＧＶＧＬＮＩＱＳＡＳＬＣＩＩＣＥＰＱＶＫＰＴＩＥＱＱＡＶＡＲＶＨＲＭＧＱＴＡＴＶＱＶＨＲＬＩＧＤＥＴＡＤＥＲＭＬＥＩＬＡＧＫＴＨＶＦＤＶＹＡＲＬＳＥＴＡＥＩＰＤＡＶＤＩＴＥＳＱＬＡＡＲＶＩＤＥＥＲＡＲＬＧＬＴＥＳＴＧＰＫＤＥＥＴＡＬＳ
ＳＥＱＩＤＮＯ：３２：ＮＣｇｌ１５７５ ^{Ｙ５９２Ｆ}コードタンパク質の配列
ＭＡＥＳＮＡＭＤＲＡＱＩＳＡＬＬＤＲＡＱＨＴＩＮＬＡＥＱＡＮＮＶＬＲＬＬＫＴＰＧＴＡＴＶＧＤＮＧＴＬＧＴＤＴＹＬＩＰＳＲＮＩＴＷＰＤＮＬＹＶＮＶＦＬＤＧＭＮＡＥＡＴＬＴＤＹＶＡＳＶＡＳＩＰＲＬＣＱＩＩＮＥＧＱＧＧＭＦＲＲＬＦＮＰＴＫＶＱＡＧＤＱＡＶＦＤＬＭＶＫＬＤＥＩＳＳＴＴＨＥＶＳＲＭＬＥＧＶＨＡＡＲＴＲＱＱＱＧＶＡＬＦＰＧＩＨＧＶＧＥＲＹＩＥＲＡＱＱＶＬＡＳＡＬＧＩＡＧＦＧＡＥＰＷＤＧＨＴＬＡＱＡＲＲＶＶＱＲＹＡＱＤＰＮＳＥＹＲＬＫＳＥＡＥＫＨＬＴＳＩＮＥＬＲＶＱＩＬＬＥＱＬＰＶＤＡＬＲＭＡＴＤＨＲＬＲＦＧＳＬＤＳＩＨＶＡＴＶＡＤＶＬＫＴＨＴＳＩＬＴＴＶＱＧＩＧＡＱＴＡＧＲＭＫＡＡＡＥＴＬＫＱＥＡＬＲＲＱＮＴＳＩＧＤＥＰＴＱＰＡＭＲＬＩＮＶＬＡＲＦＤＱＴＥＴＩＴＰＥＥＲＡＲＲＴＲＶＩＤＹＶＥＨＩＰＰＳＬＤＰＹＩＶＩＮＰＡＴＰＥＦＮＮＦＴＤＤＬＲＷＩＤＡＮＰＮＬＦＨＰＱＴＩＴＴＰＰＡＤＩＷＤＤＹＩＳＲＰＡＨＹＱＧＬＬＡＴＬＬＧＲＤＩＥＧＡＤＥＬＬＤＡＴＴＬＱＫＩＲＤＬＴＬＤＫＴＨＬＴＤＬＨＬＲＧＹＱＳＦＧＡＲＦＡＩＩＱＫＫＴＬＬＧＤＤＭＧＬＧＫＴＶＱＡＬＳＡＡＡＨＬＡＡＴＥＫＤＦＲＴＬＶＶＶＰＡＳＶＩＶＮＷＴＲＥＣＫＲＦＬＮＬＰＶＦＩＡＨＧＤＮＫＱＤＡＩＮＡＷＳＮＴＮＧＩＡＩＣＴＹＤＧＶＲＴＭＤＩＰＡＰＧＬＶＩＡＤＥＡＨＬＩＫＮＰＳＴＫＲＴＱＡＬＲＫＬＩＤＡＡＰＦＴＬＬＭＴＧＴＰＬＥＮＫＶＥＥＦＶＮＬＶＲＹＩＱＰＥＬＩＴＲＧＭＳＫＭＱＡＥＮＦＲＥＲＩＡＰＡＹＬＲＲＮＱＡＤＶＬＤＥＬＰＥＲＴＤＳＩＤＷＩＤＬＴＰＥＤＲＳＡＹＤＤＱＶＲＱＧＳＷＭＧＭＲＲＳＡＭＬＳＰＴＰＲＬＴＳＡＫＭＱＲＩＬＥＬＦＥＥＡＥＥＨＧＲＫＡＬＩＦＴＹＦＬＤＶＬＤＥＬＥＫＨＬＧＥＲＶＩＧＲＩＳＧＤＶＰＡＴＫＲＱＬＬＶＤＡＬＳＨＳＫＰＧＳＡＬＩＡＱＩＴＡＧＧＶＧＬＮＩＱＳＡＳＬＣＩＩＣＥＰＱＶＫＰＴＩＥＱＱＡＶＡＲＶＨＲＭＧＱＴＡＴＶＱＶＨＲＬＩＧＤＥＴＡＤＥＲＭＬＥＩＬＡＧＫＴＨＶＦＤＶＹＡＲＬＳＥＴＡＥＩＰＤＡＶＤＩＴＥＳＱＬＡＡＲＶＩＤＥＥＲＡＲＬＧＬＴＥＳＴＧＰＫＤＥＥＴＡＬＳ
ＳＥＱＩＤＮＯ：５７：野生型プロモーター配列
ｔｔｃａｇｇｇｔａｇｔｔｇａｃｔａａａｇａｇｔｔｇｃｔｃｇｃｇａａｇｔａｇｃａｃｃｔｇｔｃａｃｔｔｔｔｇｔｃｔｃａａａｔａｔｔａａａｔｃｇａａｔａｔｃａａｔａｔａｔｇｇｔｃｔｇｔｔｔａｔｔｇｇａａｃｇｃｇｔｃｃｃａｇｔｇｇｃｔｇａｇａｃｇｃａｔｃｃｇｃｔａａａｇｃｃｃｃａｇｇａａｃｃｃｔｇｔｇｃａｇａａａｇａａａａｃａｃｔｃｃｔｃｔｇｇｃｔａｇｇｔａｇａｃａｃａｇｔｔｔａｔａａａｇｇｔａｇａｇｔｔｇａｇｃｇｇｇｔａａｃｔｇｔｃａｇｃａｃｇｔａｇａｔｃｇａａａｇｇｔｇｃａｃａａａｇ
ＳＥＱＩＤＮＯ：５８：突然変異された後のプロモーター配列
ｔｔｃａｇｇｇｔａｇｔｔｇａｃｔａａａｇａｇｔｔｇｃｔｃｇｃｇａａｇｔａｇｃａｃｃｔｇｔｃａｃｔｔｔｔｇｔｃｔｃａａａｔａｔｔａａａｔｃｇａａｔａｔｃａａｔａｔａｔｇｇｔｃｔｇｔｔｔａｔｔｇｇａａｃｇｃｇｔｃｃｃａｇｔｇｇｃｔｇａｇａｃｇｃａｔｃｃｇｃｔａａａｇｃｃｃｃａｇｇａａｃｃｃｔｇｔｇｃａｇａａａｇａａａａｃａｃｔｃｃｔｃｔｇｇｃｔａｇｇｔａｇａｃａｃａｇｔｔｔａｔａａａｇｇｔａｔａａｔｔｇａｇｃｇｇｇｔａａｃｔｇｔｃａｇｃａｃｇｔａｇａｔｃｇａａａｇｇｔｇｃａｃａａａｇ

用語の定義は、以下の通りである。
本発明において、「Ｌ－アミノ酸生産能を有する細菌」という用語は、細菌が培地で培養される時にＬ－アミノ酸を生産する細菌を収集できるように、培地及び／又は細菌の細胞内に目的のＬ－アミノ酸を生成し蓄積する能力を有する細菌を指す。Ｌ－アミノ酸生産能を有する細菌は、培地及び／又は細菌の細胞内部に、未修飾菌株よりも多くの量で、目的のＬ－アミノ酸を蓄積することができる細菌であってもよい。

Ｌ－アミノ酸の例としては、Ｌ－リシン、Ｌ－オルニチン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－ヒスチジン及びＬ－シトルリンなどの塩基性アミノ酸；Ｌ－イソロイシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、グリシンなどの脂肪族アミノ酸；Ｌ－トレオニン及びＬ－セリンなどのヒドロキシ－モノアミノカルボン酸のアミノ酸；Ｌ－プロリンなどの環状アミノ酸；Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－チロシン、Ｌ－トリプトファンなどの芳香族アミノ酸；Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－メチオニンなどの含硫アミノ酸；Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン酸などの酸性アミノ酸；並びに、Ｌ－グルタミン及びＬ－アスパラギンなどの側鎖にアミド基を有するアミノ酸が挙げられる。Ｌ－アミノ酸の具体的な例としては、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－リシン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－チロシン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－システインが挙げられる。Ｌ－アミノ酸のより具体的な例としては、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－リシン、Ｌ－トレオニン、及びＬ－トリプトファンが挙げられる。Ｌ－アミノ酸のより具体的な例としては、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－リシンが挙げられる。

本発明において、特に断らない限り、「アミノ酸」という用語はＬ－アミノ酸を指す。本発明において、特に断らない限り、用語「Ｌ－アミノ酸」は、遊離形態のＬ－アミノ酸、その塩、又はそれらの混合物を指す。

「未修飾菌株」という用語は、所定の特徴を有するように修飾されていない対照菌株を指す。即ち、未修飾菌株の例としては、野生型菌株及び親本菌株が挙げられる。

「相同性」という用語は、２つの種類のポリヌクレオチド又は２つの種類のポリペプチドモジュールの間のパーセント同一性を意味する。１つの種類のモジュールと他の１つの種類のモジュールとの間の配列相同性は、当該技術分野で既知の方法を用いて決定することができる。例えば、このような配列相同性は、ＢＬＡＳＴ計算方法によって決定することができる。

「操作可能に連結される」という用語は、調節配列とポリヌクレオチド配列との間の機能的な連結を意味し、それにより、調節配列はポリヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を制御する。調節配列は、ポリヌクレオチドの発現レベルを高めることができる強いプロモーターであってもよい。調節配列は、コリネバクテリウム属に属する微生物に由来するプロモーターであってもよいし、他の微生物に由来するプロモーターであってもよい。例えば、プロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター、又はｃｊ７プロモーターであってもよい。

「ベクター」という用語は、遺伝子の調節配列及び遺伝子の配列を含み、且つ適切な宿主細胞中で標的遺伝子を発現するように構築されるポリヌクレオチド構築物を指す。又は、ベクターは、相同組換えに有用な配列を含むポリヌクレオチド構築物も指すことができ、それにより、宿主細胞に導入されるベクターのために、宿主細胞のゲノムにおける内因性遺伝子の調節配列を変更したり、発現可能な標的遺伝子を宿主のゲノムの特定部位に挿入したりすることができる。この点で、本発明で使用されるベクターは、宿主細胞へのベクターの導入、又は宿主細胞の染色体へのベクターの挿入を決定するための、選択マーカーをさらに含むことができる。選択マーカーは、薬物耐性、栄養欠陥型、細胞毒剤に対する耐性、又は表面タンパク質の発現などの選択可能な表現型を付与するマーカーを含むことができる。このような選択剤で処理される環境において、選択マーカーを発現する細胞のみは、生きることができるか、異なる表現型形質を示すことができるかので、形質転換された細胞を選択することができる。

本明細書で使用されるように、用語「形質転換」は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することにより、ポリヌクレオチドをゲノム以外の要素とするか、又は宿主細胞のゲノムに挿入して複製することができることを意味する。本発明で使用されるベクターを形質転換する方法は、核酸を細胞に導入する方法を含むことができる。また、関連技術に開示されているように、宿主細胞に基づいて電気パルス法を実施することができる。

［有利な効果］
本発明によれば、ＮＣｇｌ０６０９遺伝子又はＮＣｇｌ１５７５遺伝子を弱化する又はノックアウトすることにより、前記遺伝子がコードする産物がアミノ酸生産能へ影響を与えている。コード配列に点突然変異を導入するか、又は当該遺伝子のコピー数を増加するか、又は過剰発現することにより組換え菌株を獲得し、獲得した菌株は野生型菌株と比べて高濃度のアミノ酸の生産に有利である。一方、ｌｙｓＣ遺伝子のプロモーター領域に点突然変異を導入し、組換え体菌株を獲得し、獲得した菌株は突然変異されていない菌株と比べてＬ－リシンの生産量も大幅に向上させ、さらに生産率を向上させ、生産コストが低減下げ、その応用は容易になった。

以下、具体的な実施例と結び付けて本発明の技術態様をさらに詳しく説明する。以下の実施形態は、本発明を例示的に説明し、理解するためのものに過ぎず、本発明の権利範囲の制限として解釈されるべきではない。本発明の上記内容に基づいて実現される技術のすべては、本発明の権利範囲内に含まれる。特に断らない限り、以下の実施例で使用される原料及び試薬は市販品であるか、又は既知の方法で製造することができる。操作は、すべて当該技術分野で知られているか、市販品のユーザーズマニュアルに従って行われる。

以下の実施例において前記菌株を培養するために用いられる基礎培地の組成は同じであり、これに対応する必要なスクロース、カナマイシン又はクロラムフェニコールなどを添加した。即ち、基礎培地の組成は以下の通りである。

以下の実施例において、ＳＳＣＰ電気泳動ＰＡＧＥの調製及び条件は、以下の通りである。

以下の実施例において、Ｌ－リシンの発酵培地及び発酵プロセスを以下の表１と表２に示す。

以下の実施例において、Ｌ－グルタミン酸の発酵培地及び発酵プロセスを以下の表３と表４に示す。

実施例１点突然変異されたＮＣｇｌ０６０９遺伝子コード領域を含む形質転換用ベクターｐｋ１８－ＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}を構築すること
ＮＣＢＩより開示されているＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、ＮＣｇｌ０６０９遺伝子コード領域の配列を増幅する２対のプライマーを設計して合成し、対立遺伝子置換の方式で、菌株ＹＰ９７１５８［寄託番号：ＣＧＭＣＣＮｏ．１２８５６、寄託日：２０１６年８月１６日、寄託単位：中国微生物菌種寄託管理委員会普通微生物センター、北京朝陽区北辰西路１号院３号、電話番号：０１０－６４８０７３５５、中国特許出願ＣＮ１０６３６７４３２Ａ（出願日２０１６年９月１日、公開日２０１７年２月１日）、当該菌株の染色体に野生型ＮＣｇｌ０６０９遺伝子が残存していることがシーケンシングにより確認された］の背景中のＮＣｇｌ０６０９遺伝子コード領域（ＳＥＱＩＤＮＯ：１、対応するコードタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３である）に点突然変異を導入し、ＮＣｇｌ０６０９遺伝子のヌクレオチド配列の１０００位のＣをＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）に変更させ、対応するコードタンパク質のアミノ酸配列の３３４位のアルギニンをターミネーター（ＳＥＱＩＤＮＯ：４：ＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}）に変更させた。プライマーの設計は、以下の通りである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成される）。
Ｐ１：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＧＴＡＣＡＴＡＡＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：５）
Ｐ２：５’ ＧＴＴＧＣＣＧＧＴＧＡＧＴＣＡＡＡＣＡＧＴＣＡＴＴＴＴＧＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：６）
Ｐ３：５’ ＧＣＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＴＴＴＧＡＣＴＣＡＣＣＧＧＣＡＡＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：７）
Ｐ４：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＣＧＧＣＴＧＧＡＡＡＴＧＴＧＧＡＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：８）

構築方法：ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２をテンプレートとし、それぞれプライマーＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４によりＰＣＲ増幅する。ＰＣＲシステム：１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬである。前記ＰＣＲ増幅は、９４℃での予備変性５分間、（９４℃変性３０秒間、５２℃アニーリング３０秒間、７２℃伸長４０秒間、３０サイクル）、７２℃過剰伸長１０分間により行うことにより、ＮＣｇｌ０６０９遺伝子コード領域を含むサイズがそれぞれ６９８ｂｐと６４８ｂｐであるＤＮＡフラグメント（ＮＣｇｌ０６０９Ｕｐ及びＮＣｇｌ０６０９Ｄｏｗｎ）を二本得た。上記二本のＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離精製した後、さらに上記二本のＤＮＡフラグメントをテンプレートとし、Ｐ１とＰ４をプライマーとして、オーバーラップＰＣＲにより長さが１３１７ｂｐであるフラグメントに増幅させた。

ＰＣＲシステム：１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬである。前記ＰＣＲ増幅は、９４℃予備変性５分間、（９４℃変性３０秒間、５２℃アニーリング３０秒間、７２℃伸長６０秒間、３０サイクル）、７２℃過剰伸長１０分間により行われる。

このＤＮＡフラグメントにより、ＹＰ９７１５８ＮＣｇｌ０６０９遺伝子コード領域の１０００位のシトシン（Ｃ）をチミン（Ｔ）に変更させ、最終的にコードタンパク質の３３４位のアミノ酸をアルギニン（Ｒ）からターミネーターに変更させた。このＤＮＡフラグメントに対してアガロースゲル電気泳動により精製して得られたものと、二つ酵素で切断した後精製したｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社から購入し、それぞれ二つ酵素ＸｂａｌＩ／ＢａｍＨＩで切断した）とを、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ酵素（ＮＥＢ社から購入する）により５０℃で３０分間接続した。接続して得られた生成物を形質転換した後に成長してなったモノクローナルに対して、ｐｃｒ同定を行い、カナマイシン耐性マーカーを含む陽性ベクターｐｋ１８－ＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}を得た。正しく酵素切断されたベクターｐｋ１８－ＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}をシーケンシング会社へ送って同定し、正しい点突然変異（Ｃ－Ｔ）を含むベクターｐｋ１８－ＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}を保存しておいた。

実施例２点突然変異されたＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}を含むエンジニアリング菌株を構築すること
構築方法：対立遺伝子置換プラスミドｐｋ１８－ＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}を電気ショックによりＬ－リシンを生産する菌株ＹＰ９７１５８に形質転換した（その構築方法は、ＷＯ２０１４１１２６６９Ａ１を参照することができる。当該菌株の染色体に野生型ＮＣｇｌ０６０９遺伝子コード領域が残存していることがシーケンシングにより確認された）。培養して産生した単コロニーをそれぞれプライマーＰ１と汎用プライマーＭ１３Ｒにより同定し、陽性菌株である１３７５ｂｐの大きさのストリップの菌株に増幅することができる。
陽性菌株を、スクロースを１５％含む培地で培養し、培養して産生された単コロニーをそれぞれカナマイシン含有培地とカナマイシン非含有培地で培養した。カナマイシン非含有培地で増殖したがカナマイシン含有培地で増殖していなかった菌株に対して、さらに以下のプライマー（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）でＰＣＲ同定を行った。
Ｐ５：５’ ＣＴＡＧＣＣＧＧＴＴＣＣＡＧＴＣＡＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：９）
Ｐ６：５’ ＧＧＡＣＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＣＡＴＴＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）

上記ＰＣＲ増幅による産物２６４ｂｐを９５℃で高温変性１０分間、氷浴５分間を行った後、ｓｓｃｐ電気泳動（プラスミドｐｋ１８－ＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}増幅フラグメントを陽性対照とし、ＹＰ９７１５８増幅フラグメントを陰性対照とし、水を空白対照とする）を行った。フラグメント構造が異なり、電気泳動の位置が異なったため、フラグメントの電気泳動位置が陰性対照フラグメントの位置と一致せず、陽性対照フラグメント位置と一致している菌株は、対立遺伝子置換が成功した菌株である。再度、プライマーＰ５／Ｐ６により、陽性菌株ＮＣｇｌ０６０９フラグメントをＰＣＲ増幅し、ＰＭＤ１９－Ｔベクターに接続してシーケンシングを行った。シーケンス比較により、塩基配列が突然変異（Ｃ－Ｔ）が起こした菌株は、対立遺伝子置換が成功した陽性菌株であり、ＹＰＬ－４－０４１と命名された。

実施例３ゲノムにＮＣｇｌ０６０９とＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}遺伝子を過剰発現させるエンジニアリング菌株を構築すること
ＮＣＢＩより開示された野生型ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、上下流のホモロジーアームフラグメント、並びにＮＣｇｌ０６０９又はＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}遺伝子コード領域及びプロモーター領域の配列を増幅する３対のプライマーを設計して合成し、相同組換えの方式で菌株ＹＰ９７１５８にＮＣｇｌ０６０９又はＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}遺伝子を導入する。

プライマーの設計は、以下の通りである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成される）。
Ｐ７：５’ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）
Ｐ８：５’ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）
Ｐ９：５’ ＣＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＣＴＧＣＧＡＧＧＡＴＣＡＴＣＴＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）
Ｐ１０：５’ ＧＡＴＴＴＡＡＴＴＧＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＴＣＴＧＧＣＡＡＣＡＡＣＴＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）
Ｐ１１：５’ ＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧＴＴＧＴＴＧＣＣＡＧＡＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＡＴＣＡＡＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：１５）
Ｐ１２：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＣＴＡＴＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＧＧＡＴＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）

構築方法：ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２又はＹＰＬ－４－０４１をそれぞれテンプレートとし、Ｐ７／Ｐ８、Ｐ９／Ｐ１０、Ｐ１１／Ｐ１２をそれぞれプライマーとしてＰＣＲ増幅し、上流のホモロジーアームフラグメント７６８ｂｐ、ＮＣｇｌ０６０９又はＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}遺伝子及びそのプロモーターフラグメント１６２６ｂｐ、及び下流のホモロジーアームフラグメント６２３ｂｐを得た。ＰＣＲ反応終了後、増幅した３つのフラグメントに対して、柱状ＤＮＡゲル回収キットによりそれぞれ電気泳動回収を行った。回収した３つのフラグメントと、二つ酵素で切断した後精製されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社から購入し、それぞれ二つ酵素ＸｂａｌＩ／ＢａｍＨＩで切断した）とを、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ酵素（ＮＥＢ社から購入する）により５０℃で３０分間接続した。接続して得られた生成物を形質転換した後に成長してなったモノクローナルに対して、ｐｃｒ同定を行い、統合された陽性プラスミドを得た。当該プラスミドにカナマイシン耐性マーカーを含み、カナマイシンスクリーニングによりプラスミドがゲノムに統合された組換え体（recombinant）を得ることができる。

ＰＣＲシステム：１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬである。前記ＰＣＲ増幅は、９４℃予備変性５分間、９４℃変性３０秒間、５２℃アニーリング３０秒間、７２℃伸長６０秒間（３０サイクル）、７２℃過剰伸長１０分間により行われる。

シーケンシングが正しい統合されたプラスミドを、Ｌ－リシンを生産する菌株ＹＰ９７１５８に電気的形質転換し、培養して生成された単コロニーをＰ１３／Ｐ１４プライマーによりＰＣＲ同定することにより、サイズ1317bpのフラグメントを含むものを陽性株、フラグメント増幅のないものをプロト菌として同定した。陽性菌株を、スクロースを１５％含む培地で培養し、培養して生成された単コロニーをさらにＰ１５／Ｐ１６プライマーによりＰＣＲ同定し、増幅してなった大きさ１３５２ｂｐの菌は、ＮＣｇｌ０６０９又はＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}遺伝子がＹＰ９７１５８ゲノムに統合された陽性菌株であり、ＹＰＬ－４－０４２（突然変異点を含まない）とＹＰＬ－４－０４３（突然変異点を含む）と命名された。
Ｐ１３：５’ ＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＡＣＡＣＧＣＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）
Ｐ１４：５’ ＣＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧＴＴＧＴＧＣＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：１８）
Ｐ１５：５’ ＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＧＡＴＴＡＣＣＴＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）
Ｐ１６：５’ ＣＧＴＴＧＧＡＡＴＣＴＴＧＣＧＴＴＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：２０）

実施例４プラスミドにＮＣｇｌ０６０９又はＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}遺伝子を過剰発現させるエンジニアリング菌株を構築すること
ＮＣＢＩが開示している野生型ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、ＮＣｇｌ０６０９又はＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}遺伝子コード領域及びプロモーター領域の配列を増幅する１対のプライマーを設計して合成する。プライマーの設計は、以下の通りである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成される）。
Ｐ１７：５’ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＧＡＧＧＡＴＣＡＴＣＴＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：２１）
Ｐ１８：５’ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＣＡＡＣＴＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：２２）

構築方法：ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２及びＹＰＬ－４－０４１をそれぞれテンプレートとし、Ｐ１７／Ｐ１８をプライマーとしてＰＣＲにより増幅することで、ＮＣｇｌ０６０９又はＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}遺伝子及びそのプロモーターフラグメント１５８２ｂｐを得た。増幅した生成物に対して、電気泳動を行い、柱状ＤＮＡゲル回収キットにより精製した。回収したＤＮＡラグメントと、酵素ＥｃｏＲＩで切断して回収されたシャトルプラスミドｐＸＭＪ１９とを、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ酵素（ＮＥＢ社から購入する）により５０℃で３０分間接続した。接続して得られた生成物を形質転換した後に成長してなったモノクローナルに対して、プライマーＭ１３によりｐｃｒ同定し、過剰発現された陽性プラスミドｐＸＭＪ１９－ＮＣｇｌ０６０９和ｐＸＭＪ１９－ＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}を得た。当該プラスミドをシーケンシングへ送った。プラスミドにクロラムフェニコール耐性マーカーを含んでいるため、プラスミドが菌株に形質転換されるかどうかをクロラムフェニコールによりスクリーニングすることができる。

シーケンシングが正しいｐＸＭＪ１９－ＮＣｇｌ０６０９及びｐＸＭＪ１９－ＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}プラスミドを、それぞれＬ－リシンを生産する菌株ＹＰ９７１５８において電気的形質転換し、培養して産生された単コロニーをＭ１３Ｆ／Ｐ１８プライマーによりＰＣＲ同定し、ＰＣＲにより増幅してなった大きさ１５８５ｂｐのフラグメントを含むものは、陽性菌株であり、ＹＰＬ－４－０４４（突然変異点を含まない）とＹＰＬ－４－０４５（突然変異点を含む）と命名された。

実施例５ゲノムにＮＣｇｌ０６０９遺伝子が欠損しているエンジニアリング菌株を構築すること
ＮＣＢＩが開示しているＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、ＮＣｇｌ０６０９遺伝子コード領域の両端のフラグメントを増幅する２対のプライマーを設計して合成し、上下流のホモロジーアームフラグメントとした。プライマーの設計は、以下の通りである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成される）。
Ｐ１９：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＡＴＧＧＧＡＴＧＧＧＴＣＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）
Ｐ２０：５’ ＣＡＴＣＡＴＣＧＧＴＴＡＣＴＣＴＧＧＣＣＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧＴＴＧＴＧＣＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：２４）
Ｐ２１：５’ ＣＧＣＡＣＡＡＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＧＧＣＣＡＧＡＧＴＡＡＣＣＧＡＴＧＡＴＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：２５）
Ｐ２２：５’ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＡＣＡＡＣＴＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：２６）

構築方法：ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２をテンプレートとし、Ｐ１９／Ｐ２０、及びＰ２１／Ｐ２２をそれぞれプライマーとしてＰＣＲにより増幅することで、上流のホモロジーアームフラグメント６６１ｂｐ、及び下流のホモロジーアームフラグメント６９２ｂｐを得た。さらに、プライマーＰ１９／Ｐ２２でＯｖｅｒｌａｐＰＣＲにより増幅を行ったことで、全体のホモロジーアームフラグメント１３３４ｂｐを得た。増幅した産物に対して、電気泳動を行い、柱状ＤＮＡゲル回収キットにより精製した。回収したＤＮＡフラグメントと、二つ酵素で切断した後精製したｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社から購入し、それぞれ二つ酵素ＸｂａｌＩ／ＢａｍＨＩで切断した）とを、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ酵素（ＮＥＢ社から購入する）により５０℃で３０分間接続した。接続して得られた生成物を形質転換した後に成長してなったモノクローナルに対して、Ｍ１３プライマーによりｐｃｒ同定を行って、ノックアウトされた陽性ベクターｐＫ１８－ΔＮＣｇｌ０６０９を得た。当該プラスミドをシーケンシングへ送った。当該プラスミドに、スクリーニングマーカーとしてカナマイシン耐性マーカーが含まれている。

ＰＣＲシステム：１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬである。前記ＰＣＲ増幅は、９４℃予備変性５分間、９４℃変性３０秒間、５２℃アニーリング３０秒間、７２℃伸長９０秒間（３０サイクル）、７２℃過剰伸長１０分間により行われる。

シーケンシングが正しいノックアウトされたｐＫ１８－ΔＮＣｇｌ０６０９プラスミドを、Ｌ－リシンを生産する菌株ＹＰ９７１５８において電気的形質転換し、培養して産生された単コロニーに対して下記のプライマー（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成される）によりＰＣＲ同定を行った。
Ｐ２３：５’ ＡＡＴＧＡＡＴＧＧＧＡＴＧＧＧＴＣＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：２７）
Ｐ２４：５’ ＣＡＡＣＡＡＣＴＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：２８）

上記ＰＣＲにより同時にサイズが１３３４ｂｐ及び１７８８ｂｐであるのストリップが増幅された菌株は陽性菌株であり、１７８８ｂｐのストリップのみ増幅された菌株はプロト菌である。陽性菌株を、スクロースを１５％含む培地でスクリーニングした後、それぞれカナマイシン含有培地とカナマイシン非含有培地で培養した。カナマイシン非含有培地で増殖したがカナマイシン含有培地で増殖していなかった菌株に対して、さらにＰ２３／Ｐ２４プライマーを用いてＰＣＲ同定を行った。サイズが１３３４ｂｐであるストリップが増幅された菌株は、ＮＣｇｌ０６０９遺伝子コード領域がノックアウトされた陽性菌株である。再び、プライマーＰ２３／Ｐ２４で陽性菌株ＮＣｇｌ０６０９フラグメントをＰＣＲにより増幅し、ＰＭＤ１９－Ｔベクターに接続してシーケンシングを行った。シーケンシングが正しい菌株は、ＹＰＬ－４－０４６と命名された。

実施例６Ｌ－リシンの発酵試験
実施例２－５で構築した菌株と原始菌株ＹＰ９７１５８をＢＬＢＩＯ－５ＧＣ－４－Ｈ型式の発酵タンク（ＳｈａｎｇｈａｉｂａｉｌｕｎＢｉｏ－ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．から購入する）の中で、表１に示す培地と表２に示す制御プロセスで発酵試験を行った。各菌株を３回繰り返し、その結果を表５に示す。

結果を表５に示すように、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの中で、ＮＣｇｌ０６０９遺伝子コード領域に対して点突然変異ＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}及び過剰発現を行うことにより、Ｌ－リシンの産量及び成長速度の向上に役立っているが、遺伝子を弱化或いはノックアウトすることは、Ｌ－リシンの蓄積に不利であり、同時に菌株の成長速度を低下させた。

実施例７グルタミン酸を生産する菌株にＮＣｇｌ０６０９遺伝子の過剰発現を導入するか、又はＮＣｇｌ０６０９遺伝子コード領域に対して点突然変異ＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}及び過剰発現を行い、発酵試験を行うこと
実施例１－５の方法に従って、同じプライマーと試験条件を用いて、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３８６９を出発菌とし、ＡＴＣＣ１３８６９の菌を発現菌として、点突然変異されたＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}を含むグルタミン酸生産エンジニアリング菌株ＹＰＧ－０１３、ゲノム上でＮＣｇｌ０６０９とＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}遺伝子を過剰発現されたグルタミン酸生産エンジニアリング菌株ＹＰＧ－０１４とＹＰＧ－０１５、プラスミド上でＮＣｇｌ０６０９とＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}遺伝子を過剰発現されたグルタミン酸生産エンジニアリング菌株ＹＰＧ－０１６とＹＰＧ－０１７、及びゲノム上でＮＣｇｌ０６０９遺伝子を欠損されたグルタミン酸生産エンジニアリング菌株ＹＰＧ－０１８を得た。

実施例で構築した菌株と原始菌株は、ＡＴＣＣ１３８６９の菌を発現菌とし、ＢＬＢＩＯ－５ＧＣ－４－Ｈ型式の発酵タンク（ＳｈａｎｇｈａｉｂａｉｌｕｎＢｉｏ－ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．から購入する）の中で、表３に示す培地と表４に示す制御プロセスで発酵試験を行った。各菌株を３回繰り返し、その結果を表６に示す。

結果を表６に示すように、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの中で、ＮＣｇｌ０６０９遺伝子コード領域に対して点突然変異ＮＣｇｌ０６０９^{Ｒ３３４＊}及び過剰発現を行うことにより、Ｌ－グルタミン酸の産量及び成長速度の向上に役立っているが、遺伝子を弱化或いはノックアウトすることは、Ｌ－グルタミン酸の蓄積に不利で、同時に菌株の成長速度を低下させた。

実施例８点突然変異されたＮＣｇｌ１５７５遺伝子コード領域を含む形質転換ベクターｐＫ１８－ＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}を構築すること
ＮＣＢＩより開示された野生型ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、ＮＣｇｌ１５７５遺伝子コード領域の配列を増幅する２対のプライマーを設計して合成し、対立遺伝子置換の方式で菌株ＹＰ９７１５８（当該菌株の染色体に野生型ＮＣｇｌ１５７５遺伝子が残存していることがシーケンシングにより確認された）の背景中のＮＣｇｌ１５７５遺伝子コード領域（ＳＥＱＩＤＮＯ：２９）に点突然変異を導入し、対応するコードタンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１であり、ＮＣｇｌ１５７５遺伝子のヌクレオチド配列の１７７５位のＡをＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０：ＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}）に変更させ、対応するコードタンパク質のアミノ酸配列の５９２位のチロシンをフェニルアラニン（ＳＥＱＩＤＮＯ：３２：ＮＣｇｌ１５７５Ｙ５９２Ｆ）に変更させた。

プライマーの設計は、以下の通りである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成される）。
Ｐ１’：５’ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＴＧＣＧＴＴＣＧＴＣＴＧＣＧＧＴＴＴＣＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）
Ｐ２’：５’ ＡＴＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣＣＴＴＣＴＧＡＴＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：３４）
Ｐ３’：５’ ＣＡＴＣＡＧＡＡＧＧＧＴＧＡＡＴＧＧＧＧＣＧＧＣＧＴＣＧＡＴ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）
Ｐ４’：５’ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＡＡＧＣＣＴＣＧＡＣＣＣＣＴＡＣＡＴＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）

構築方法：ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２をテンプレートとし、Ｐ１’とＰ２’、Ｐ３’とＰ４’をそれぞれプライマーとしてＰＣＲにより増幅する。

ＰＣＲシステム：１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬである。前記ＰＣＲ増幅は、９４℃予備変性５分間、９４℃変性３０秒間、５２℃アニーリング３０秒間、７２℃伸長４０秒間（３０サイクル）、７２℃過剰伸長１０分間により行われる。これにより、サイズがそれぞれ７６６ｂｐと７５９ｂｐであり、ＮＣｇｌ１５７５遺伝子コード領域を含むＤＮＡフラグメント（ＮＣｇｌ１５７５Ｕｐ及びＮＣｇｌ１５７５Ｄｏｗｎ）を２本得た。

上記２本のＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離精製した後、さらに上記２本のＤＮＡフラグメントをテンプレートとし、Ｐ１’とＰ４’をプライマーとして、オーバーラップＰＣＲで増幅し、長さが１４９５ｂｐあるフラグメントを生育させた。

このＤＮＡフラグメント（ＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}）により、ＹＰ９７１５８ＮＣｇｌ１５７５遺伝子コード領域の１７７５位のアデニン（Ａ）をチミン（Ｔ）に変更させ、最終的にコードタンパク質の５９２位のアミノ酸をチロシン（Ｙ）からフェニルアラニン（Ｆ）に変更させた。

アガロースゲル電気泳動により分離精製した後のＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}と、酵素ＸｂａＩで切断して回収されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社から購入する）とを、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ組み換え系より組み立て、ベクターｐＫ１８－ＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}を得た。当該プラスミド上でカナマイシン耐性マーカーを含んでいる。ベクターｐＫ１８－ＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}をシーケンシング会社へ送って同定し、正しい点突然変異（Ａ－Ｔ）を含むベクターｐＫ１８－ＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}を保存しておく。

実施例９点突然変異されたＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}を含むエンジニアリング菌株を構築すること
構築方法：対立遺伝子置換プラスミドｐＫ１８－ＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}を電気ショックによりＬ－リシンを生産する菌株ＹＰ９７１５８に形質転換した。培養して産生した単コロニーをそれぞれプライマーＰ１’と汎用プライマーＭ１３Ｒにより同定し、１５０２ｂｐの大きさのストリップが増幅される菌株は、陽性菌株である。陽性菌株を、スクロースを１５％含む培地で培養し、培養して産生された単コロニーをそれぞれカナマイシン含有培地とカナマイシン非含有培地で培養した。カナマイシン非含有培地で増殖したがカナマイシン含有培地で増殖していなかった菌株は、さらに以下のプライマー（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＰＣＲ同定を行った。
Ｐ５’：５’ ＣＡＣＡＴＣＡＧＣＴＴＧＡＴＴＴＣＴＧＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）
Ｐ６’：５’ ＧＧＴＣＡＴＴＧＣＣＧＡＴＧＡＡＧＣＣＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）

上記ＰＣＲ増幅による産物２５６ｂｐに対して、高温変性、氷浴を行った後、ｓｓｃｐ電気泳動（プラスミドｐＫ１８－ＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}増幅フラグメントを陽性対照とし、ＹＰ９７１５８増幅フラグメントを陰性対照とし、水を空白対照とする）を行った。フラグメント構造が異なり、電気泳動の位置が異なったため、フラグメントの電気泳動の位置が陰性対照フラグメントの位置と一致せず、陽性対照フラグメント位置と一致している菌株は、対立遺伝子置換が成功した菌株である。再度、Ｐ５’及びＰ６’をプライマーとし、ＰＣＲにより対立遺伝子置換が成功した菌株の目的フラグメントを増幅し、ＰＭＤ１９－Ｔベクターに接続してシーケンシングを行った。シーケンス比較により、塩基配列が突然変異を起こした菌株は、対立遺伝子置換が成功した菌株であり、ＹＰＬ－４－０２３と命名された。

実施例１０ゲノムにＮＣｇｌ１５７５又はＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}遺伝子を過剰発現させるエンジニアリング菌株を構築すること
ＮＣＢＩが開示している野生型ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、上下流のホモロジーアームフラグメント、並びにＮＣｇｌ１５７５又はＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}遺伝子コード領域及びプロモーター領域の配列を増幅する３対のプライマーを設計して合成し、相同組換えの方式で菌株ＹＰ９７１５８にＮＣｇｌ１５７５又はＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}遺伝子を導入する。

プライマーの設計は、以下の通りである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成される）。
Ｐ７’：５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧ
ＣＧＴＴＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：３９）
Ｐ８’：５’ ＧＡＡＡＣＧＧＣＣＴＴＡＡＧＣＴＡＧＧＴＧＣＡＣＣＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：４０）
Ｐ９’：５’ ＣＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＧＧＴＧＣＡＣＣＴＡＧＣＴＴＡＡＧＧＣＣＧＴＴＴＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）
Ｐ１０’：５’ ＣＴＴＧＡＴＴＴＡＡＴＴＧＣＧＣＣＡＴＣＡＡＧＣＴＴＴＴＣＣＣＧＣＣＣＧＧＴＴ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：４２）
Ｐ１１’：５’ ＡＡＣＣＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＴＴＧＡＴＧＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＡＴＣＡＡＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：４３）
Ｐ１２’：５’ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＣＴＡＴ
ＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＧＧＡＴＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：４４）

構築方法：ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２又はＹＰＬ－４－０２３をそれぞれテンプレートとし、Ｐ７’／Ｐ８’，Ｐ９’／Ｐ１０’，Ｐ１１’／Ｐ１２’をそれぞれプライマーとしてＰＣＲにより増幅することで、上流のホモロジーアームフラグメント８０２ｂｐ、ＮＣｇｌ１５７５遺伝子及びそのプロモーターフラグメント２７３７ｂｐ、又はＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}遺伝子及びそのプロモーターフラグメント２７３７ｂｐ、及び下流のホモロジーアームフラグメント６４７ｂｐを得た。さらに、Ｐ７’／Ｐ１２’をプライマーとし、上記の増幅された三つのフラグメント（上流のホモロジーアームフラグメント、ＮＣｇｌ１５７５遺伝子及びそのプロモーターフラグメント、下流のホモロジーアームフラグメント、又は、上流のホモロジーアームフラグメント、ＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}遺伝子及びそのプロモーターフラグメント、下流のホモロジーアームフラグメント）の混合物をテンプレートとして増幅することで、統合されたホモロジーアームフラグメント４１１１ｂｐを得た。

ＰＣＲ反応終了後、増幅した産物に対して、電気泳動回収を行った。柱状ＤＮＡゲル回収キット（ＴＩＡＮＧＥＮ）により、要求される４１１１ｂｐのＤＮＡフラグメントを回収した。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ組み換え系を用いて酵素ＸｂａｌＩで切断して回収されたシャトルプラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢと接続したことで、統合されたプラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＮＣｇｌ１５７５又はＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}を得た。当該プラスミドにカナマイシン耐性マーカーを含み、カナマイシンスクリーニングによりプラスミドがゲノムに統合された組換え体を得ることができる。

ＰＣＲシステム：１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬである。前記ＰＣＲ増幅は、９４℃予備変性５分間、９４℃変性３０秒間、５２℃アニーリング３０秒間、７２℃伸長１８０秒間（３０サイクル）、７２℃過剰伸長１０分間により行われる。

二つの統合されたプラスミドを、それぞれ、Ｌ－リシンを生産する菌株ＹＰ９７１５８に電気的形質転換し、培養して産生された単コロニーをＰ１３’／Ｐ１４’プライマーによりＰＣＲ同定し、ＰＣＲにより増幅してなった大きさ１７７８ｂｐのフラグメントを含むものが陽性菌株であり、フラグメントまで増幅していないものがプロト菌である。陽性菌株を、スクロースを１５％含む培地でスクリーニングした後、それぞれカナマイシン含有培地とカナマイシン非含有培地で培養した。カナマイシン非含有培地で増殖したがカナマイシン含有培地で増殖していなかった菌株に対して、さらにプライマーＰ１５’／Ｐ１６’を用いてＰＣＲ同定を行った。１７５６ｂｐが増幅された菌は、ＮＣｇｌ１５７５又はＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}遺伝子がＹＰ９７１５８ゲノムに統合された菌株であり、ＹＰＬ－４－０２４（突然変異点を含まない）とＹＰＬ－４－０２５（突然変異点を含む）と命名された。

Ｐ１３’：５’ ＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧＡＴＡＣＡＣＧＣＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：４５）
Ｐ１４’：５’ ＣＴＴＣＴＧＡＴＧＡＣＣＧＧＣＡＣＡＣＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：４６）
Ｐ１５’：５’ ＴＡＧＴＣＧＡＴＧＡＣＧＣＧＧＧＴＧＣＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：４７）
Ｐ１６’：５’ ＣＧＴＴＧＧＡＡＴＣＴＴＧＣＧＴＴＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：４８）

実施例１１プラスミドにＮＣｇｌ１５７５又はＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}遺伝子を過剰発現させるエンジニアリング菌株を構築すること
ＮＣＢＩより開示された野生型ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、ＮＣｇｌ１５７５又はＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}遺伝子コード領域及びプロモーター領域の配列を増幅する１対のプライマーを設計して合成した。プライマーの設計は、以下の通りである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成される）。
Ｐ１７’：５’ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＴＡＧＣＴ
ＴＡＡＧＧＣＣＧＴＴＴＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：４９）
Ｐ１８’：５’ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＡＡＧＣＴＴＴ
ＴＣＣＣＧＣＣＣＧＧＴＴ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：５０）

構築方法：ＡＴＣＣ１３０３２及びＹＰＬ－４－０２３をそれぞれテンプレートとし、Ｐ１７’／Ｐ１８’をプライマーとしてＰＣＲにより増幅することで、ＮＣｇｌ１５７５又はＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}遺伝子及びそのプロモーターフラグメント２７４９ｂｐを得た。増幅した産物に対して電気泳動回収を行い、柱状ＤＮＡゲル回収キットにより、要求される２７４９ｂｐのＤＮＡフラグメントを回収した。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ組み換え系を用いて酵素ＥｃｏＲＩで切断して回収されたシャトルプラスミドｐＸＭＪ１９と接続したことで、過剰発現されたプラスミドｐＸＭＪ１９－ＮＣｇｌ１５７５とｐＸＭＪ１９－ＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}を得た。当該プラスミドにクロラムフェニコール耐性マーカーを含んでいるため、プラスミドが菌株において形質転換されるかどうかをクロラムフェニコールによりスクリーニングすることができる。

ＰＣＲシステム：１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬである。前記ＰＣＲ増幅は、９４℃予備変性５分間、９４℃変性３０秒間、５２℃アニーリング３０秒間、７２℃伸長１２０秒間（３０サイクル）、７２℃過剰伸長１０分間により行われる。

プラスミドｐＸＭＪ１９－ＮＣｇｌ１５７５とｐＸＭＪ１９－ＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}を、それぞれＬ－リシンを生産する菌株ＹＰ９７１５８において電気的形質転換し、培養して産生された単コロニーをＭ１３（－４８）とＰ１８’プライマーによりＰＣＲ同定し、ＰＣＲにより増幅してなった大きさ２７５２ｂｐのフラグメントを含むものは、形質転換された菌株であり、ＹＰＬ－４－０２６（突然変異点を含まない）とＹＰＬ－４－０２７（突然変異点を含む）と命名された。

実施例１２ゲノムにＮＣｇｌ１５７５遺伝子が欠損しているエンジニアリング菌株を構築すること
ＮＣＢＩより開示されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、ＮＣｇｌ１５７５遺伝子コード領域の両端のフラグメントを増幅する２対のプライマーを合成し、上下流のホモロジーアームフラグメントとした。プライマーの設計は、以下の通りである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成される）。
Ｐ１９’：５’ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＣＣＧ
ＧＣＧＣＡＧＡＴＧＣＣＡＡＣＧＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：５１）
Ｐ２０’：ＣＣＣＡＧＡＡＣＴＧＡＡＧＧＴＣＴＡＡＴＴＧＣＣＴＡＡＧＧＣＣＧＧＡＡＴＴ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：５２）
Ｐ２１’：ＡＡＴＴＣＣＧＧＣＣＴＴＡＧＧＣＡＡＴＴＡＧＡＣＣＴＴＣＡＧＴＴＣＴＧＧＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：５３）
Ｐ２２’：５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＣＴ
ＴＧＡＴＧＡＡＧＧＣＴＣＣＡＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：５４）

ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２をテンプレートとし、Ｐ１９’／Ｐ２０’及びＰ２１’／Ｐ２２’をそれぞれプライマーとしてＰＣＲにより増幅することで、上流のホモロジーアームフラグメント７７５ｂｐ、及び下流のホモロジーアームフラグメント８０７ｂｐを得た。さらに、プライマーＰ１９’／Ｐ２２’を用いてＯｖｅｒｌａｐＰＣＲにより増幅を行ったことで、全体のホモロジーアームフラグメント１５４５ｂｐを得た。ＰＣＲ反応終了後、増幅した産物に対して電気泳動回収を行い、柱状ＤＮＡゲル回収キットにより、要求される１５４５ｂｐのＤＮＡフラグメントを回収した。さらに、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ組み換え系を用いて酵素ＸｂａＩで切断して回収されたシャトルプラスミドｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢと接続したことで、ノックアウトされたプラスミドを得た。当該プラスミドにカナマイシン耐性マーカーが含まれている。

ノックアウトされたプラスミドをＬ－リシンを生産する菌株ＹＰ９７１５８において電気的形質転換し、培養して産生された単コロニーを下記プライマー（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成される）によりＰＣＲ同定した。
Ｐ２３’：５’ ＡＣＣＧＧＣＧＣＡＧＡＴＧＣＣＡＡＣＧＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：５５）
Ｐ２４’：５’ ＧＣＴＴＧＡＴＧＡＡＧＧＣＴＣＣＡＧ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：５６）

上記のＰＣＲによりサイズが１４７１ｂｐ及び４１５０ｂｐであるストリップが増幅された菌株は、陽性菌株であり、４１５０ｂｐのストリップのみ増幅された菌株はプロト菌である。陽性菌株を、スクロースを１５％含む培地でスクリーニングした後、それぞれカナマイシン含有培地とカナマイシン非含有培地で培養した。カナマイシン非含有培地で増殖したがカナマイシン含有培地で増殖していなかった菌株は、さらにＰ２３’／Ｐ２４’プライマーを用いてＰＣＲ同定を行った。サイズが１４７１ｂｐであるストリップが増幅された菌株は、ＮＣｇｌ１５７５遺伝子コード領域がノックアウトされた遺伝子工学菌株であり、ＹＰＬ－４－０２８と命名された。

実施例１３Ｌ－リシンの発酵試験
実施例９－１２で構築した菌株と原始菌株ＹＰ９７１５８をＢＬＢＩＯ－５ＧＣ－４－Ｈ型式の発酵タンク（ＳｈａｎｇｈａｉｂａｉｌｕｎＢｉｏ－ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．から購入する）の中で、表１に示す培地と表２に示す制御プロセスで発酵試験を行った。各菌株を３回繰り返し、その結果を表７に示す。

結果を表７に示すように、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの中で、ＮＣｇｌ１５７５遺伝子に対して過剰発現を行うか、又は、ＮＣｇｌ１５７５遺伝子コード領域に対して点突然変異ＮＣｇｌ１５７５^{Ａ１７７５Ｔ}及び過剰発現を行うことにより、Ｌ－リシンの産量の向上に役立っているが、遺伝子を弱化或いはノックアウトすることは、Ｌ－リシンの蓄積に不利である。

実施例１４点突然変異されたｌｙｓＣ遺伝子プロモーター領域を含む形質転換用ベクターｐＫ１８－ＰｌｙｓＣ^{（Ｇ（－４５）Ａ，Ｇ（－４７）Ｔ）}
ＮＣＢＩより開示されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２ゲノム配列に従って、ｌｙｓＣ遺伝子プロモーター領域の配列を増幅する２対のプライマーを設計して合成し、対立遺伝子置換の方式で菌株ＹＰ９７１５８の背景中のｌｙｓＣ遺伝子プロモーター領域（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７）に点突然変異を導入し、ｌｙｓＣ遺伝子プロモーター領域のヌクレオチド配列の－４５ｂｐ位ＧをＡに変更させ、－４７ｂｐ位ＧをＴに変更された（ＳＥＱＩＤＮＯ：５８）。

プライマーの設計は、以下の通りである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により合成される）。
Ｐ１’’：５’ ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＣＣＡＡＧＧＡＴＧＡＧＧＧＣＴＴＴＧ３’（ＥｃｏＲＩ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：５９）
Ｐ２’’：５’ ＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＡＴＴＡＴＡＣＣＴＴＴＡＴＡＡＡＣ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：６０）
Ｐ３’’：５’ ＧＴＴＴＡＴＡＡＡＧＧＴＡＴＡＡＴＴＧＡＧＣＧＧＧＴＡＡＣＴ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：６１）
Ｐ４’’：５’ ＡＣＡＴＧＣＡＴＧＣＧＣＧＴＡＣＧＣＧＡＡＧＴＧＧＣＡＣＡＴ３’（ＳｐｈＩ）（ＳＥＱＩＤＮＯ：６２）。

構築方法：ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２をテンプレートとし、Ｐ１’’とＰ２’’、Ｐ３’’とＰ４’’をそれぞれプライマーとしてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲシステム：１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬである。前記ＰＣＲ増幅は、９４℃予備変性５分間、９４℃変性３０秒間、５２℃アニーリング３０秒間、７２℃伸長４０秒間、３０サイクル、７２℃過剰伸長１０分間により行われる。これにより、点突然変異を含む、長さがそれぞれ７２９ｂｐ、７６０ｂｐであるＤＮＡフラグメント（ｌｙｓＣプロモーターＵｐフラグメント及びｌｙｓＣプロモーターＤｏｗｎフラグメント）を２本得た。上記２本のＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離精製した後、さらに精製した後の２本のＤＮＡフラグメントをテンプレートとし、Ｐ１’’とＰ４’’をプライマーとして、オーバーラップＰＣＲにより長さが１４５９ｂｐあるフラグメント（Ｕｐ－Ｄｏｗｎフラグメント）に増幅させた。ＰＣＲシステム：１０×ＥｘＴａｑＢｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、Ｍｇ^２＋（２５ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、ＥｘＴａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、総体積５０μＬである。前記ＰＣＲ増幅は、９４℃予備変性５分間、９４℃変性３０秒間、５２℃アニーリング３０秒間、７２℃伸長９０秒間、３０サイクル、７２℃過剰伸長１０分間により行われる。上記述Ｕｐ－Ｄｏｗｎフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離精製した。当該フラグメントは、ｌｙｓＣ遺伝子プロモーター領域及びその上下流の配列を含み、当該フラグメントの両端にそれぞれＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位及びＳｐｈＩ制限酵素切断部位を有している。このＤＮＡフラグメントにより、ＹＰ９７１５８ｌｙｓＣ遺伝子プロモーター領域における－４５ｂｐ位のヌクレオチドであるグアニン（Ｇ）をアデニン（Ａ）に変更させ、－４７ｂｐ位のヌクレオチドであるグアニン（Ｇ）をチミン（Ｔ）に変更された。フラグメントを二つ酵素（ＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩ）で切断して回収した後、同じように二つ酵素（ＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩ）で切断した後のシャトルプラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（Ａｄｄｇｅｎｅ社から購入する）と連結することで、対立遺伝子置換によるプラスミドｐＫ１８－ＰｌｙｓＣ^{（Ｇ（－４５）Ａ，Ｇ（－４７）Ｔ）}を得て、当該プラスミドにカナマイシン耐性マーカーが含まれている。ベクターｐＫ１８－ＰｌｙｓＣ^{（Ｇ（－４５）Ａ，Ｇ（－４７）Ｔ）}をシーケンシング会社へ送って同定し、正しい点突然変異を含むベクターｐＫ１８－ＰｌｙｓＣ^{（Ｇ（－４５）Ａ，Ｇ（－４７）Ｔ）}を保存しておく。

実施例１５点突然変異されたＰｌｙｓＣ^{（Ｇ（－４５）Ａ，Ｇ（－４７）Ｔ）}を含むエンジニアリング菌株を構築すること
対立遺伝子置換によるプラスミドｐＫ１８－ＰｌｙｓＣ^{（Ｇ（－４５）Ａ，Ｇ（－４７）Ｔ）}を電気ショックによりＬ－リシンを生産する菌株ＹＰ９７１５８へ形質転換した。培養して産生した単コロニーをそれぞれプライマーＰ１’’と汎用プライマーＭ１３Ｆにより同定し、１５００ｂｐの大きさのストリップが増幅された菌株は、陽性菌株である。陽性菌株を、スクロースを１５％含む培地で培養し、培養して産生された単コロニーをそれぞれカナマイシン含有培地とカナマイシン非含有培地で培養した。カナマイシン非含有培地で増殖したがカナマイシン含有培地で増殖していなかった菌株は、さらに以下のプライマー（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＰＣＲ同定を行った。
Ｐ５’’：５’ ＡＴＣＡＡＴＡＴＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＡ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：６３）
Ｐ６’’：５’ ＣＴＴＧＧＴＧＧＣＡＡＣＧＡＴＣＣＧＴＴ３’ （ＳＥＱＩＤＮＯ：６４）

上記ＰＣＲ増幅による産物に対して、高温変性、氷浴を行った後、ｓｓｃｐ電気泳動（プラスミドｐＫ１８－ＰｌｙｓＣ^{（Ｇ（－４５）Ａ，Ｇ（－４７）Ｔ）}増幅フラグメントを陽性対照とし、ＹＰ９７１５８増幅フラグメントを陰性対照とし、水を空白対照とする）を行った。フラグメント構造が異なり、電気泳動の位置が異なったため、フラグメントの電気泳動の位置が陰性対照フラグメントの位置と一致せず、陽性対照フラグメント位置と一致している菌株は、対立遺伝子置換が成功した菌株である。再び、ＰＣＲにより陽性菌株の目的フラグメントを増幅し、ＰＭＤ１９－Ｔベクターに接続してシーケンシングを行った。シーケンス比較により、塩基配列が突然変異を起こした菌株は、対立遺伝子置換が成功した菌株であり、ＹＰＬ－４－００９と命名された。

実施例１６Ｌ－リシンの発酵試験
実施例１５で構築した菌株ＹＰＬ－４－００９と原始菌株ＹＰ９７１５８をＢＬＢＩＯ－５ＧＣ－４－Ｈ型式の発酵タンク（ＳｈａｎｇｈａｉｂａｉｌｕｎＢｉｏ－ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ．から購入する）の中で、表１に示す培地と表２に示す制御プロセスで発酵試験を行った。各菌株を３回繰り返し、その結果を表８に示す。

結果を表８に示すように、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの中で、ｌｙｓＣ遺伝子プロモーターに対して点突然変異ＰｌｙｓＣ^{（Ｇ（－４５）Ａ，Ｇ（－４７）Ｔ）}を行うことにより、Ｌ－リシンの産量の向上に役立っている。

以上、本発明の実施形態について説明した。ただし、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。本発明の思想及び原理内に行われたいかなる修正、均等な置換、並びに改良等は、全て本発明の特許請求の範囲の権利範囲内に含まれるべきである。

Claims

ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現が向上されていること、及び／又はＳＥＱＩＤＮＯ：３１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現が向上されていること、及び／又はＳＥＱＩＤＮＯ：５７で示されるプロモーター領域における－４５ｂｐ位及び－４７ｂｐ位の塩基に突然変異があることを特徴とする、Ｌ－アミノ酸を生産する細菌であって、
好ましくは、前記ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現が向上されていることは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現が増強されていること、又はＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点突然変異を有していること、又はＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点突然変異を有し且つその発現が増強されていることであり、
好ましくは、前記ＳＥＱＩＤＮＯ：３１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現が向上されていることは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現が増強されていること、又はＳＥＱＩＤＮＯ：３１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点突然変異を有していること、又はＳＥＱＩＤＮＯ：３１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点突然変異を有し且つその発現が増強されていることである、細菌。
ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの点突然変異により、ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列の３３４位のアルギニンがターミネーターで置換されているか、又はＳＥＱＩＤＮＯ：３１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの点突然変異により、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１のアミノ酸配列の５９２位のチロシンが異なっているアミノ酸で置換されており、好ましくは、５９２位のチロシンがフェニルアラニンで置換されていることを特徴とする、請求項１に記載の細菌。
ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド配列を含むか、又はＳＥＱＩＤＮＯ：３１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の細菌。
前記ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列をコードする、点突然変異を有しているポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるポリヌクレオチド配列の１０００位の塩基の突然変異により形成されており、好ましくは、前記突然変異は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるポリヌクレオチド配列の１０００位の塩基がシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）に突然変異することを含み、好ましくは、前記点突然変異を有しているポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２で示されるポリヌクレオチド配列を含むか、又は
前記ＳＥＱＩＤＮＯ：３１のアミノ酸配列をコードする、点突然変異を有しているポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９で示されるポリヌクレオチド配列の１７７５位の塩基の突然変異により形成されており、好ましくは、前記突然変異は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９で示されるポリヌクレオチド配列の１７７５位の塩基がアデニン（Ａ）からチミン（Ｔ）に突然変異することを含み、好ましくは、前記点突然変異を有しているポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０で示されるポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、
請求項１から３のいずれか一項に記載の細菌。
ＳＥＱＩＤＮＯ：５７で示されるプロモーター領域における－４５ｂｐ位のヌクレオチドであるグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に突然変異しており、－４７ｂｐ位のヌクレオチドであるグアニン（Ｇ）がチミン（Ｔ）に突然変異しており、
好ましくは、前記プロモーターのヌクレオチド配列は、
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５８で示されるヌクレオチド配列、又は
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５８で示されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性、好ましくは９５％以上、９８％以上の同一性を有し、且つ（ａ）に係るプロモーターの活性が向上し、且つ－４５ｂｐ位にアデニン（Ａ）、－４７ｂｐ位にチミン（Ｔ）を維持されたヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、
請求項１から４のいずれか一項に記載の細菌。
前記微生物がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍであり、好ましくは、ＹＰ９７１５８又はＡＴＣＣ１３８６９であることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の細菌。
ＳＥＱＩＤＮＯ：３で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであって、３３４位のアルギニンがターミネーターで置換されたポリヌクレオチドを含み、
好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含み、
好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるポリヌクレオチド配列の１０００位の塩基の突然変異により形成されており、
好ましくは、前記突然変異は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるポリヌクレオチド配列の４８５位の塩基がシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）に突然変異があることを含み、
好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２で示されるポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、
ポリヌクレオチド配列。
ＳＥＱＩＤＮＯ：３１で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであって、５９２位のチロシンが異なっているアミノ酸で置換されたポリヌクレオチドを含み、好ましくは、５９２位のチロシンがフェニルアラニンで置換されており、
好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２で示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含み、
前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９で示されるポリヌクレオチド配列の１７７５位の塩基の突然変異により形成されており、好ましくは、前記突然変異は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９で示されるポリヌクレオチド配列の１７７５位の塩基がアデニン（Ａ）からチミン（Ｔ）に突然変異があることであり、
好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０で示されるポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、
ポリヌクレオチド配列。
ＳＥＱＩＤＮＯ：４又はＳＥＱＩＤＮＯ：３２で示されることを特徴とする、アミノ酸配列。
請求項７又は８に記載のポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、組換えベクター。
請求項７又は８に記載のポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、組換え菌株。
ＳＥＱＩＤＮＯ：５７で示されるプロモーター領域における－４５ｂｐ位及び－４７ｂｐ位の塩基が突然変異して形成されたヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、ＳＥＱＩＤＮＯ：５７で示されるプロモーター領域における－４５ｂｐ位のヌクレオチドであるグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に突然変異しており、－４７ｂｐ位のヌクレオチドであるグアニン（Ｇ）がチミン（Ｔ）に突然変異したことを特徴とする、
プロモーターのヌクレオチド配列。
（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５８で示されるヌクレオチド配列、又は
（ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５８で示されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性、好ましくは９５％以上、９８％以上の同一性を有し、且つ（ａ）に係るプロモーターの増強活性を保留し、且つ－４５ｂｐ位にアデニン（Ａ）、－４７ｂｐ位にチミン（Ｔ）を維持されているヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、
請求項１２に記載のプロモーターのヌクレオチド配列。
請求項１２又は１３に記載のプロモーターのヌクレオチド配列、及び前記プロモーターのヌクレオチド配列の後に操作可能に連結されるコード配列を含み、好ましくは、前記コード配列はｌｙｓＣ遺伝子のコード配列であることを特徴とする、発現カセット。
請求項１２又は１３に記載のプロモーターのヌクレオチド配列を含み、好ましくは、前記プロモーターのヌクレオチド配列は、シャトルプラスミドと連結して前記組換えベクターを構築し、好ましくは、前記シャトルプラスミドはｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドであることを特徴とする、組換えベクター。
請求項１２若しくは１３に記載のプロモーターのヌクレオチド配列、又は請求項１５に記載の組換えベクターを含み、好ましくは、ＳＥＱＩＤＮＯ：５８で示されるヌクレオチド配列を含み、好ましくは、ＳＥＱＩＤＮＯ：５８で示されるヌクレオチド配列にｌｙｓＣ遺伝子のコード配列が連結されていることを特徴とする、組換え菌株。
請求項１から６のいずれか一項に記載の細菌、又は請求項１１若しくは１６に記載の組換え菌株を培養し、前記培養物からＬ－アミノ酸を回収することを含むことを特徴とする、Ｌ－アミノ酸を生産する方法。