KR20230045051A - L-아미노산을 생산하는 재조합 균주 및 이의 구축방법과 응용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 YP97158을 출발균으로 사용하여, 그 NCgl1089 유전자 암호화 영역, 및/또는 NCgl0761 유전자 암호화 영역, 및/또는 ptsS 유전자 암호화 영역에 부위 특이적 돌연변이 및/또는 개선된 발현을 도입하며, 획득된 돌연변이 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 균주는 고효율의 L-아미노산 생산 능력을 가지며, 이는 L-아미노산의 생산량을 크게 증가시키고, 균주 안정성이 우수하여, L-아미노산 생산 균주로서 생산비용을 절감시킨다.

Description

L-아미노산을 생산하는 재조합 균주 및 이의 구축방법과 응용

본 출원은 2020년 08월 07일 중국 국가지식재산권국에 제출된 특허출원번호가 2020107908681인 선행 출원에 대한 우선권을 주장하고, 2020년 10월 15일 중국 국가지식재산권국에 제출된 특허출원번호가 2020111050353인 선행 출원에 대한 우선권을 주장하고, 2020년 10월 13일 중국 국가지식재산권국에 제출된 특허출원번호가 2020110930801인 선행 출원에 대한 우선권을 주장하며, 상술한 선행 출원의 전문은 인용 방식에 의해 본 출원에 결합되었다.

본 발명은 유전공학 및 미생물 기술 분야에 속하며, 보다 상세하게는 강화된 L-아미노산 생산 능력을 갖는 코리네박테리움속의 균주, 이의 구축 방법과 응용에 관한 것이다.

L-아미노산 생산 능력을 갖는 박테리아 등 미생물을 사용하여 발효함으로써, 산업적으로 L-아미노산을 생산한다. 이러한 미생물로서는, 예를 들어 자연계로부터 분리된 균주 및 이의 돌연변이체 균주를 사용할 수 있다.

발효법에 의한 L-아미노산 생산에 대한 개선은 교반 및 산소 공급과 같은 발효 기술에 관한 것이거나; 발효 과정 중의 당 농도와 같은 영양 배지의 조성에 관한 것이거나; 발효액을 건조 및 조립하거나 이온 교환 크로마토그래피를 통하는 것과 같이 발효액을 적합한 제품 형태로 가공하는 것에 관한 것이거나; 관련 미생물 자체의 고유한 성능 성질에 관한 것일 수 있다. 이러한 미생물의 성능 성질을 개선하기 위한 방법에는 돌연변이 유발, 돌연변이 선별 및 스크리닝이 포함된다. 이러한 방식으로 획득한 균주는 항대사물질에 내성이 있거나 조절 중요성을 갖는 대사물질에 대해 영양요구성이며 L-아미노산을 생성한다. 현재 고수율로 보다 경제적으로 L-아미노산을 생산하는 방법을 개발할 필요성이 여전히 존재한다.

본 발명은 L-아미노산을 생산하기 위한 재조합 균주, 이의 재조합 구축 방법, 및 아미노산 발효 생산에서의 응용을 제공한다.

본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 YP97158을 출발균으로 사용하여, 그 NCgl1089 유전자 암호화 영역, 및/또는 NCgl0761 유전자 암호화 영역, 및/또는 ptsS 유전자 암호화 영역에 부위 특이적 돌연변이 및/또는 개선된 발현을 도입하며, 획득된 돌연변이 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 균주는 고효율의 L-아미노산 생산 능력을 가지며, 이는 L-아미노산의 생산량을 크게 증가시키고, 균주 안정성이 우수하여, L-아미노산 생산 균주로서 생산비용을 절감시킨다.

따라서 본 발명은 하기의 기술적 방안을 제공한다.

본 발명은 L-아미노산을 생성하는 코리네박테리움속에 속하는 미생물을 제공하며, 이는 SEQ ID NO:3 및/또는 SEQ ID NO:35 및/또는 SEQ ID NO:63의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 개선된 발현을 갖는다. 본 발명에 따라, 상기 개선된 발현은 상기 폴리뉴클레오티드 발현이 강화된 것이거나, 상기 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 점 돌연변이를 갖는 것이거나, 상기 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 점 돌연변이를 갖고 발현이 강화된 것이다.

본 발명의 제1 양상:

상기 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열은 유전자 NCgl1089에 의해 암호화된 단백질이다.

상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열과 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 점 돌연변이를 가지며, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 170번째 글루탐산이 상이한 아미노산에 의해 치환되도록 만든다.

본 발명에 따라, 바람직하게는 170번째 글루탐산은 라이신에 의해 치환된다.

본 발명에 따라, SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열, 여기에서 170번째 글루탐산(E)은 라이신(K)에 의해 치환된 후의 아미노산 서열이 SEQ ID NO:4로 표시된다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 508번째 염기에서 돌연변이가 발생하여 형성된 것이다.

본 발명에 따라, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 508번째 염기가 구아닌(G)에서 아데닌(A)으로 돌연변이된 것을 포함한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명에 따라, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 발현 조절 서열을 변형시킬 수 있다. 발현 조절 서열은 작동 가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어한다. 상기 조절 서열은 예를 들어 프로모터, 터미네이터, 인핸서, 사일런서 등일 수 있다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 프로모터는 SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(NCgl1089 유전자)의 프로모터이다.

본 발명은 폴리뉴클레오티드 서열, 상기 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열, 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 균주를 더 제공한다.

본 발명에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 이의 170번째 글루탐산은 상이한 아미노산에 의해 치환된다.

본 발명에 따라, 바람직하게는 170번째 글루탐산은 라이신에 의해 치환된다.

본 발명에 따라, SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열, 여기에서 170번째 글루탐산(E)은 라이신(K)에 의해 치환된 후의 아미노산 서열이 SEQ ID NO:4로 표시된다.

본 발명에 따라, 바람직하게는 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 508번째 염기에서 돌연변이가 발생하여 형성된 것이다.

본 발명에 따라, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 508번째 염기가 구아닌(G)에서 아데닌(A)으로 돌연변이된 것을 포함한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명에 따라, 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO:4로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명에 따라, 상기 재조합 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 플라스미드에 도입하여 구축한 것이다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 플라스미드는 pK18mobsacB 플라스미드이다.

본 발명의 다른 일 실시방식에 있어서, 상기 플라스미드는 pXMJ19 플라스미드이다.

구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드 서열과 상기 플라스미드를 NEBuider 재조합 시스템을 통해 재조합 벡터로 구축할 수 있다.

본 발명에 따라, 상기 재조합 균주는 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 재조합 균주의 출발균은 YP97158이다.

본 발명은 코리네박테리움 재조합 균주의 구축 방법을 더 제공한다.

본 발명에 따라, 상기 구축 방법은 하기 단계를 포함한다.

숙주 균주에서 SEQ ID NO:1로 표시되는 야생형 NCgl1089의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형하여, 그 508번째 염기를 돌연변이시켜, 돌연변이 NCgl1089 암호화 유전자를 포함하는 코리네박테리움 재조합 균주를 획득한다.

본 발명의 구축 방법에 있어서, 상기 변형에는 돌연변이 유발, PCR 부위 특이적 돌연변이법, 및/또는 상동성 재조합 등과 같은 방법 중 적어도 하나가 포함된다.

본 발명의 구축 방법에 있어서, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:1 중 508번째 염기가 구아닌(G)에서 아데닌(A)으로 돌연변이되는 것을 의미하며; 구체적으로, 상기 돌연변이 NCgl1089 암호화 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2로 표시된다.

또한 상기 구축 방법은 하기 단계를 포함한다.

(1) SEQ ID NO:1로 표시되는 야생형 NCgl1089 유전자의 뉴클레오티드 서열을 변형하여, 그 508번째 염기를 돌연변이시켜, 돌연변이된 NCgl1089 유전자 폴리뉴클레오티드 서열을 획득한다.

(2) 상기 돌연변이된 폴리뉴클레오티드 서열과 플라스미드를 NEBuider 재조합 시스템을 통해 재조합 벡터를 구축한다.

(3) 상기 재조합 벡터를 숙주 균주에 도입하여, 상기 돌연변이 NCgl1089 암호화 유전자를 포함하는 코리네박테리움 재조합 균주를 획득한다.

본 발명의 구축 방법에 있어서, 상기 단계 (1)은 다음 과정을 포함한다. 점 돌연변이의 NCgl1089 유전자 구축: 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 서열에 따라, 2쌍의 NCgl1089 유전자 단편을 증폭시키는 프라이머 P1과 P2 및 P3과 P4를 합성하고, PCR 부위 특이적 돌연변이법을 통해 야생형 NCgl1089 유전자 SEQ ID NO:1에 점 돌연변이를 도입하여, 점 돌연변이의 NCgl1089 유전자 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO:2를 획득하며, NCgl1089^G508A로 표기한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈은 ATCC13032 균주에서 유래할 수 있으며, 이의 게놈 서열은 NCBI 웹사이트에서 획득할 수 있다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 단계 (1)에서 상기 프라이머는 하기와 같다.

P1: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCGCGTGGGATCCACGCCAG 3'(SEQ ID NO:5)

P2: 5'CAATGAGGGCTTTCGCCACCTCGCGGGC 3'(SEQ ID NO:6)

P3: 5'GCCCGCGAGGTGGCGAAAGCCCTCATTG 3'(SEQ ID NO:7)

P4: 5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCATGCGTTGGCGATCTTC 3'(SEQ ID NO:8).

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 PCR 증폭은 하기 방식에 따라 수행한다. 즉, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 및 72℃에서 40초 동안 연신(30 사이클)이다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 중첩 PCR 증폭은 하기 방식에 따라 수행한다. 즉, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 및 72℃에서 90초 동안 연신(30 사이클)이다.

본 발명의 구축 방법에 있어서, 상기 단계 (2)는 재조합 플라스미드의 구축을 포함한다. 여기에는 다음이 포함된다. 즉, 분리 정제된 NCgl1089^G508A 및 pK18mobsacB 플라스미드를, NEBuider 재조합 시스템으로 조립하여, 재조합 플라스미드 pK18-NCgl1089^G508A를 획득한다.

본 발명의 구축 방법에 있어서, 상기 단계 (3)은 재조합 균주의 구축을 포함하고, 재조합 플라스미드 pK18-NCgl1089^G508A를 숙주 균주에 형질전환하여 재조합 균주를 획득한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 단계 (3)의 형질전환은 전기형질전환법이다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 YP97158이다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 재조합은 상동성 재조합에 의해 구현된 것이다.

본 발명의 제4 양상은 코리네박테리움 재조합 균주의 구축 방법을 더 제공한다.

본 발명에 따라, 상기 구축 방법은 하기 단계를 포함한다.

NCgl1089 유전자의 업다운스트림 상동성 아암 단편, NCgl1089 유전자 암호화 영역, NCgl1089^G508A 유전자 암호화 영역, 및 상기 유전자의 프로모터 영역 서열을 증폭하고, 상동성 재조합의 방식으로 숙주 균주의 게놈에 NCgl1089 또는 NCgl1089^G508A 유전자를 도입하여, 상기 균주가 NCgl1089 또는 NCgl1089^G508A 유전자를 과발현하도록 구현한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 업스트림 상동성 아암 단편을 증폭시키는 프라이머는 하기와 같다.

P7:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCGTTCTGGACTGAGG 3'(SEQ ID NO:11)

P8: 5'CATGAGTATA AAATCACTGT CGTGCACCGAG AACAGATG 3'(SEQ ID NO:12).

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 다운스트림 상동성 아암 단편을 증폭시키는 프라이머는 하기와 같다.

P13: 5'CGTGCCCACAGAAGAGGTGAGAT GGCGCAATTA AATCAAG 3'(SEQ ID NO:17)

P14:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCTATGACACCTTCAACGGA TC 3'(SEQ ID NO:18)

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 유전자의 프로모터 영역 서열을 증폭시키는 프라이머는 하기와 같다.

P9: 5'CATCTGTTCT CGGTGCACGACAGTGATT TTATACTCAT G 3'(SEQ ID NO:13)

P10: 5'GACGTTTCCA GATGCTCATCACCGAACCC GCTGCACTGT 3'(SEQ ID NO:14)

본 발명의 일 실시방식에 있어서, NCgl1089 유전자 암호화 영역 또는 NCgl1089^G508A 유전자 암호화 영역을 증폭시키는 프라이머는 하기와 같다.

P11: 5'ACAGTGCAGC GGGTTCGGTGATGAGCATCT GGAAACGTC 3'(SEQ ID NO:15)

P12: 5'CTTGATTTAATTGCGCCATCTCACCTCTTC TGTGGGCACG 3'(SEQ ID NO:16)

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 전술한 P9/P12를 프라이머로 사용하고, 증폭하여 획득한 NCgl1089 유전자 프로모터 단편과 NCgl1089 또는 NCgl1089^G508A를 템플릿으로 사용하여, 자체 프로모터를 휴대하는 NCgl1089 또는 NCgl1089^G508A 단편을 증폭 획득한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 전술한 P7/P14를 프라이머로 사용하여, 증폭 획득한 업스트림 상동성 단편, 다운스트림 상동성 단편 및 자체 프로모터를 휴대한 NCgl1089 또는 NCgl1089^G508A의 세 단편을 템플릿으로 혼합하여 증폭시킴으로써, 통합 상동성 아암 단편을 획득한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서 다음과 같이 수행하였다. 사용된 PCR 시스템: 10× Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM) 4μL, Mg²⁺(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL; PCR 증폭은 하기 방식으로 수행: 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 90초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, NEBuider 재조합 시스템을 사용하여, 셔틀 플라스미드 PK18mobsacB와 통합 상동성 아암 단편을 조립하여, 통합 플라스미드를 획득하였다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 통합 플라스미드를 숙주 균주에 형질감염시키고, 상동성 재조합의 방식으로 숙주 균주의 게놈에 NCgl1089 또는 NCgl1089^G508A 유전자를 도입한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 YP97158이다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 SEQ ID NO:2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 휴대하는 균주이다.

본 발명은 코리네박테리움 재조합 균주의 구축 방법을 더 제공한다.

본 발명에 따라, 상기 구축 방법은 하기 단계를 포함한다.

NCgl1089 또는 NCgl1089^G508A 유전자 암호화 영역 및 프로모터 영역 서열을 증폭하고, 과발현 플라스미드 벡터를 구축하며, 상기 벡터를 숙주 균주로 형질전환하여, 상기 균주의 NCgl1089 또는 NCgl1089^G508A 유전자 과발현을 구현한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, NCgl1089 프로모터 단편을 증폭시키는 프라이머는 하기와 같다.

P19: 5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGACAGTGATTTTATACTCATG 3'(SEQ ID NO:23)

P20: 5'GACGTTTCCA GATGCTCATCACCGAACCC GCTGCACTGT 3'(SEQ ID NO:24).

본 발명의 일 실시방식에 있어서, NCgl1089 또는 NCgl1089^G508A 유전자 단편을 증폭시켜 획득하는 프라이머는 하기와 같다.

P21: 5'ACAGTGCAGC GGGTTCGGTGATGAGCATCT GGAAACGTC 3'(SEQ ID NO:25)

P22: 5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACTCACCTCTTCTGTGGGCACG 3'(SEQ ID NO:26).

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 전술한 P19/P22를 프라이머로 사용하고, 증폭하여 획득한 NCgl1089 유전자 프로모터 단편과 NCgl1089 또는 NCgl1089^G508A를 템플릿으로 사용하여, 중첩 PCR을 거쳐 자체 프로모터를 휴대하는 NCgl1089 또는 NCgl1089^G508A 단편을 증폭 획득한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서 다음과 같이 수행하였다. 상기 PCR 시스템: 10× Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM) 4μL, Mg²⁺(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL; 상기 PCR 증폭은 하기 방식으로 수행: 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 90초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, NEBuider 재조합 시스템을 사용하여, 셔틀 플라스미드 pXMJ19와 자체 프로모터를 휴대한 NCgl1089 또는 NCgl1089^G508A 단편을 조립하여 과발현 플라스미드를 획득한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 YP97158이다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 SEQ ID NO:2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 휴대하는 균주이다.

본 발명에서 획득한 재조합 균주는 L-라이신을 발효 생산하는데 단독으로 사용될 수 있으며, 다른 L-라이신을 생산하는 박테리아와 혼합 발효되어 L-라이신을 생산할 수도 있다.

본 발명은 L-라이신을 생산하는 방법을 더 제공하며, 상기 방법은 미생물을 배양하는 단계; 및 배양물로부터 L-라이신을 수득하는 단계를 포함한다.

본 발명의 제2 양상:

본 발명은 L-아미노산을 생성하는 박테리아를 제공하며, 여기에서 SEQ ID NO:35로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 개선된다. 본 발명은 상기 미생물을 사용하여 L-아미노산을 생산하는 방법을 더 제공하였다.

상기 SEQ ID NO:35의 아미노산 서열은 유전자 NCgl0761에 의해 암호화된 단백질이다.

상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:35의 아미노산 서열과 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다.

상기 박테리아는 변형되지 않은 균주에 비해 강화된 L-아미노산 생산 능력을 갖는다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:33의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 점 돌연변이를 가지며, SEQ ID NO:35의 아미노산 서열의 31번째 류신이 상이한 아미노산에 의해 치환되도록 만든다.

본 발명에 따라, 바람직하게는 31번째 류신은 아르기닌에 의해 치환된다.

본 발명에 따라, SEQ ID NO:35로 표시되는 아미노산 서열, 여기에서 31번째 류신은 아르기닌에 의해 치환된 후의 아미노산 서열이 SEQ ID NO:36으로 표시된다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:33으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 92번째 염기에서 돌연변이가 발생하여 형성된 것이다.

본 발명에 따라, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:33으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 92번째 염기가 티민(T)에서 구아닌(G)으로 돌연변이된 것을 포함한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:34로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명에 따라, 폴리뉴클레오티드의 발현 조절 서열을 변형시킬 수 있다. 발현 조절 서열은 그 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하며, 예를 들어 프로모터, 터미네이터, 인핸서, 사일런서 등을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 시작 코돈에 변화가 있을 수 있다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 프로모터는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(NCgl0761 유전자)의 프로모터이다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 코리네박테리움속에 속하는 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869이다.

본 발명은 폴리뉴클레오티드 서열, 상기 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열, 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 균주를 더 제공한다.

본 발명에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기에서 31번째 류신은 상이한 아미노산에 의해 치환된다.

본 발명에 따라, 바람직하게는 31번째 류신은 아르기닌에 의해 치환된다.

본 발명에 따라, SEQ ID NO:35로 표시되는 아미노산 서열, 여기에서 31번째 류신은 아르기닌에 의해 치환된 후의 아미노산 서열이 SEQ ID NO:36으로 표시된다.

본 발명에 따라, 바람직하게는 SEQ ID NO:35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:33으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:33으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 92번째 염기에서 돌연변이가 발생하여 형성된 것이다.

본 발명에 따라, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:33으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 92번째 염기가 티민(T)에서 구아닌(G)으로 돌연변이된 것을 포함한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:34로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명에 따라, 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명에 따라, 상기 재조합 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 플라스미드에 도입하여 구축한 것이다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 플라스미드는 pK18mobsacB 플라스미드이다.

본 발명의 다른 일 실시방식에 있어서, 상기 플라스미드는 pXMJ19 플라스미드이다.

구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드 서열과 상기 플라스미드를 NEBuider 재조합 시스템을 통해 재조합 벡터로 구축할 수 있다.

본 발명에 따라, 상기 재조합 균주는 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 재조합 균주의 출발균은 YP97158이다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 재조합 균주의 출발균은 ATCC 13869이다.

본 발명은 L-아미노산을 생성하는 재조합 균주의 구축 방법을 더 제공한다.

본 발명에 따라, 상기 구축 방법은 하기 단계를 포함한다.

숙주 균주에서 SEQ ID NO:33으로 표시되는 야생형 NCgl0761의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형하여, 그 92번째 염기를 돌연변이시켜, 돌연변이 NCgl0761 암호화 유전자를 포함하는 재조합 균주를 획득한다.

본 발명의 구축 방법에 있어서, 상기 변형에는 돌연변이 유발, PCR 부위 특이적 돌연변이법, 및/또는 상동성 재조합 등과 같은 방법 중 적어도 하나가 포함된다.

본 발명의 구축 방법에 있어서, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:33 중 92번째 염기가 티민(T)에서 구아닌(G)으로 돌연변이되는 것을 의미하며; 구체적으로, 상기 돌연변이 NCgl0761 암호화 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:34로 표시된다.

또한 상기 구축 방법은 하기 단계를 포함한다.

(1) SEQ ID NO:33으로 표시되는 야생형 NCgl0761 유전자의 뉴클레오티드 서열을 변형하여, 그 92번째 염기를 돌연변이시켜, 돌연변이된 NCgl0761 유전자 폴리뉴클레오티드 서열을 획득한다.

(2) 상기 돌연변이된 폴리뉴클레오티드 서열을 플라스미드와 연결하여, 재조합 벡터를 구축한다.

(3) 상기 재조합 벡터를 숙주 균주에 도입하여, 상기 돌연변이 NCgl0761 암호화 유전자를 포함하는 재조합 균주를 획득한다.

본 발명의 구축 방법에 있어서, 상기 단계 (1)은 다음 과정을 포함한다. 점 돌연변이의 NCgl0761 유전자 구축: 미변형 균주의 게놈 서열에 따라, 2쌍의 NCgl0761 유전자 단편을 증폭시키는 프라이머 P1과 P2 및 P3과 P4를 합성하고, PCR 부위 특이적 돌연변이법을 통해 야생형 NCgl0761 유전자 SEQ ID NO:33에 점 돌연변이를 도입하여, 점 돌연변이의 NCgl0761 유전자 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO:34를 획득하며, NCgl0761^L31R로 표기한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 미변형 균주 게놈은 ATCC13032 균주 또는 ATCC13869에서 유래할 수 있으며, 이의 게놈 서열은 NCBI 웹사이트에서 획득할 수 있다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 단계 (1)에서 상기 프라이머는 하기와 같다.

P1: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCTTGCAGCTAACCTATACCCC3'(SEQ ID NO:37)

P2: 5'GCTTTTCAATATAATCACGTCCATCTGAGCCATC3'(SEQ ID NO:38)

P3: 5'GATGGCTCAGATGGACGTGATTATATTGAAAAGC3'(SEQ ID NO:39)

P4: 5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCTCCCAAATAATTGCCGC3'(SEQ ID NO:40)

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 PCR 증폭은 하기와 같이 수행하였다. 즉, 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 40초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 중첩 PCR 증폭은 하기와 같이 수행하였다. 즉, 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신한다.

본 발명의 구축 방법에 있어서, 상기 단계 (2)는 재조합 플라스미드의 구축을 포함한다. 여기에는 다음이 포함된다. 즉, 분리 정제된 NCgl0761^L31R 및 pK18mobsacB 플라스미드를, NEBuider 재조합 시스템으로 조립하여, 재조합 플라스미드를 획득한다.

본 발명의 구축 방법에 있어서, 상기 단계 (3)은 재조합 균주의 구축을 포함하고, 재조합 플라스미드를 숙주 균주에 형질전환하여 재조합 균주를 획득한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 단계 (3)의 형질전환은 전기형질전환법이다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 YP97158이다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 ATCC 13869이다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 재조합은 상동성 재조합에 의해 구현된 것이다.

본 발명의 제4 양상은 L-아미노산을 생성하는 재조합 균주의 구축 방법을 더 제공한다.

본 발명에 따라, 상기 구축 방법은 하기 단계를 포함한다.

NCgl0761 유전자의 업다운스트림 상동성 아암 단편, NCgl0761 유전자 암호화 영역 및 이의 프로모터 영역 서열, 또는 NCgl0761^L31R 유전자 암호화 영역 및 이의 프로모터 영역 서열을 증폭하여, 상동성 재조합의 방식으로 숙주 균주의 게놈에 NCgl0761과 NCgl0761^L31R 유전자를 도입하여, 상기 균주의 NCgl0761 및 NCgl0761^L31R 유전자 과발현을 구현한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 업스트림 상동성 아암 단편을 증폭시키는 프라이머는 하기와 같다.

P7: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCGTTCTGGACTGAGG3'(SEQ ID NO:43)

P8: 5'CCATCCATACCCCACTACATGTGCACCGAGAACAGATG 3'(SEQ ID NO:44)

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 다운스트림 상동성 아암 단편을 증폭시키는 프라이머는 하기와 같다.

P11: 5'CTGAGCCGGAAACCTCACCC AGAATCAGATGGCGCAATTAAATC 3'(SEQ ID NO:47)

P12: 5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCTATGACACCTTCAACGGATC3'(SEQ ID NO:48)

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 유전자 암호화 영역 및 이의 프로모터 영역 서열을 증폭시키는 프라이머는 하기와 같다.

P9: 5'CATCTGTTCTCGGTGCACATGTAGTGGGGTATGGATGG 3'(SEQ ID NO:45)

P10: 5'GATTTAATTGCGCCATCTGATTCTGGGTGAGGTTTCCGGCTCAG3'(SEQ ID NO:46)

본 발명의 일 실시방식에 있어서 다음과 같이 수행하였다. 사용된 PCR 시스템: 10× Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM) 4μL, Mg²⁺(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL; PCR 증폭은 하기 방식으로 수행: 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, NEBuider 재조합 시스템을 사용하여, 셔틀 플라스미드 PK18mobsacB와 업다운 상동성 아암 단편, 유전자 암호화 영역 및 프로모터 영역 단편을 조립하여, 통합 플라스미드를 획득하였다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 통합 플라스미드를 숙주 균주에 형질감염시키고, 상동성 재조합의 방식으로 숙주 균주의 게놈에 NCgl0761 또는 NCgl0761^L31R 유전자를 도입한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 YP97158이다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 ATCC 13869이다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 SEQ ID NO:2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 휴대하는 균주이다.

본 발명은 L-아미노산을 생성하는 재조합 균주의 구축 방법을 더 제공한다.

본 발명에 따라, 상기 구축 방법은 하기 단계를 포함한다.

NCgl0761 유전자 암호화 영역 및 프로모터 영역 서열, 또는 NCgl0761^L31R 유전자 암호화 영역 및 프로모터 영역 서열을 증폭하고, 과발현 플라스미드 벡터를 구축하고, 상기 벡터를 숙주 균주로 형질전환하여, 상기 균주의 NCgl0761 및 NCgl0761^L31R 유전자 과발현을 구현한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 유전자 암호화 영역 및 이의 프로모터 영역 서열을 증폭시키는 프라이머는 하기와 같다.

P17: 5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCATGTAGTGGGGTATGGATGG3'(SEQ ID NO:53)

P18: 5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAAC GTGAGGTTTCCGGCTCAG3'(SEQ ID NO:54)

본 발명의 일 실시방식에 있어서 다음과 같이 수행하였다. 상기 PCR 시스템: 10× Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM) 4μL, Mg²⁺(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL; 상기 PCR 증폭은 하기 방식으로 수행: 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, NEBuider 재조합 시스템을 사용하여, 셔틀 플라스미드 pXMJ19와 자체 프로모터를 휴대한 NCgl0761 또는 NCgl0761^L31R 단편을 조립하여 과발현 플라스미드를 획득한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 YP97158이다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 ATCC 13869이다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 SEQ ID NO:34로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 휴대하는 균주이다.

본 발명에서 획득한 재조합 균주는 L-아미노산을 발효 생산하는데 단독으로 사용될 수 있으며, 다른 L-아미노산을 생산하는 박테리아와 혼합 발효되어 L-아미노산을 생산할 수도 있다.

본 발명은 L-아미노산을 생산하는 방법을 더 제공하며, 상기 방법은 박테리아를 배양하는 단계; 및 배양물로부터 L-아미노산을 수득하는 단계를 포함한다.

본 발명의 제3 양상:

본 발명은 L-아미노산을 생성하는 박테리아를 제공하며, 이는 SEQ ID NO:63으로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 개선된 발현을 갖는다. 본 발명에 따라, 상기 개선된 발현은 상기 폴리뉴클레오티드 발현이 강화된 것이거나, 상기 SEQ ID NO:63의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 점 돌연변이를 갖는 것이거나, SEQ ID NO:63의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 점 돌연변이를 갖고 발현이 강화된 것이다.

상기 SEQ ID NO:63의 아미노산 서열은 유전자 ptsS에 의해 암호화된 단백질이다.

상기 박테리아는 강화된 L-아미노산 생산 능력을 갖는다.

L-아미노산 생산 능력을 갖는 박테리아는 배지에서 바람직하게는 0.5g/L 이상, 보다 바람직하게는 1.0g/L 이상의 양으로 표적 L-아미노산을 축적할 수 있는 박테리아일 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열과 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다.

본 발명의 일부 구체적인 실시방식에 있어서, 사용된 벡터는 pK18mobsacB 플라스미드, pXMJ19 플라스미드이다.

본 발명의 구체적인 일 실시방식에 있어서, 상기 SEQ ID NO:63의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:61의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 발현 개선은 SEQ ID NO:63의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 점 돌연변이를 가지며, SEQ ID NO:63의 아미노산 서열의 162번째 메티오닌이 상이한 아미노산에 의해 치환되도록 만드는 것이다.

본 발명에 따라, 바람직하게는 162번째 메티오닌은 트레오닌에 의해 치환된다.

본 발명에 따라, SEQ ID NO:63로 표시되는 아미노산 서열, 여기에서 162번째 메티오닌은 트레오닌에 의해 치환된 후의 아미노산 서열이 SEQ ID NO:64로 표시된다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:61로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 485번째 염기에서 돌연변이가 발생하여 형성된 것이다.

본 발명에 따라, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:61로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 485번째 염기가 티민(T)에서 사이토신(C)으로 돌연변이된 것을 포함한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:62로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 조절 서열과 작동 가능하게 연결된다.

본 발명의 구체적인 일 실시방식에 있어서, 상기 프로모터는 SEQ ID NO:63의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(ptsS 유전자)의 프로모터이다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 코리네박테리움속에 속하는 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869이다. 본 발명에 따라, 상기 박테리아는 L-아미노산 생산량 향상과 관련된 기타 개선을 가질 수도 있다.

본 발명은 폴리뉴클레오티드 서열, 상기 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열, 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 균주를 더 제공한다.

본 발명에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 개선된 발현을 가지며, 상기 개선은 SEQ ID NO:63으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에서 점 돌연변이가 발생하여, 상기 아미노산 서열 162번째 메티오닌이 상이한 아미노산에 의해 치환되도록 만드는 것을 포함한다.

본 발명에 따라, 바람직하게는 162번째 메티오닌은 트레오닌에 의해 치환된다.

본 발명에 따라, SEQ ID NO:63로 표시되는 아미노산 서열, 여기에서 162번째 메티오닌은 트레오닌에 의해 치환된 후의 아미노산 서열이 SEQ ID NO:64로 표시된다.

본 발명에 따라, 상기 SEQ ID NO:63으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:61로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 본 발명에서 제공하는 돌연변이된 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:61로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 485번째 염기에서 돌연변이가 발생하여 형성된 것이다.

본 발명에 따라, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:61로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 485번째 염기가 티민(T)에서 사이토신(C)으로 돌연변이된 것을 포함한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 돌연변이된 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:62로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명에 따라, 상기 치환된 아미노산 서열은 SEQ ID NO:64로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명에 따라, 상기 재조합 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 플라스미드에 도입하여 구축한 것이다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 플라스미드는 pK18mobsacB 플라스미드이다.

본 발명의 다른 일 실시방식에 있어서, 상기 플라스미드는 pXMJ19 플라스미드이다.

구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드 서열과 상기 플라스미드를 NEBuider 재조합 시스템을 통해 재조합 벡터로 구축할 수 있다.

본 발명에 따라, 상기 재조합 균주는 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 재조합 균주의 출발균은 YP97158이다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 재조합 균주의 출발균은 ATCC 13869이다.

본 발명은 L-아미노산을 생성하는 재조합 균주의 구축 방법을 더 제공한다.

본 발명에 따라, 상기 구축 방법은 하기 단계를 포함한다.

숙주 균주에서 SEQ ID NO:61로 표시되는 야생형 ptsS의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형하여, 그 485번째 염기를 돌연변이시켜, 돌연변이 ptsS 암호화 유전자를 포함하는 재조합 균주를 획득한다.

본 발명의 구축 방법에 있어서, 상기 변형에는 돌연변이 유발, PCR 부위 특이적 돌연변이법, 및/또는 상동성 재조합 등과 같은 방법 중 적어도 하나가 포함된다.

본 발명의 구축 방법에 있어서, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:61 중 485번째 염기가 티민(T)에서 사이토신(C)으로 돌연변이되는 것을 의미하며; 구체적으로, 상기 돌연변이 ptsS 암호화 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:62로 표시된다.

더 나아가, 상기 구축 방법은 하기 단계를 포함한다.

(1) SEQ ID NO:61로 표시되는 야생형 ptsS 유전자의 뉴클레오티드 서열을 변형하여, 그 485번째 염기를 돌연변이시켜, 돌연변이된 ptsS 유전자 폴리뉴클레오티드 서열을 획득한다.

(2) 상기 돌연변이된 폴리뉴클레오티드 서열을 플라스미드와 연결하여, 재조합 벡터를 구축한다.

(3) 상기 재조합 벡터를 숙주 균주에 도입하여, 상기 돌연변이 ptsS 암호화 유전자를 포함하는 재조합 균주를 획득한다.

본 발명의 구축 방법에 있어서, 상기 단계 (1)은 다음 과정을 포함한다. 점 돌연변이의 ptsS 유전자 구축: 미변형 균주의 게놈 서열에 따라, 2쌍의 ptsS 유전자 단편을 증폭시키는 프라이머 P1과 P2 및 P3과 P4를 합성하고, PCR 부위 특이적 돌연변이법을 통해 야생형 ptsS 유전자 SEQ ID NO:61에 점 돌연변이를 도입하여, 점 돌연변이의 ptsS 유전자 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO:62를 획득하며, ptsS ^T485C 로 표기한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 미변형 균주 게놈은 ATCC13032 균주에서 유래할 수 있으며, 이의 게놈 서열은 NCBI 웹사이트에서 획득할 수 있다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 단계 (1)에서 상기 프라이머는 하기와 같다.

P1: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGACACCTGAAGCACCTGC3'(SEQ ID NO:65)

P2: 5'GAGATGATCAACCTCACGGCATCTGCGC 3'(SEQ ID NO:66)

P3: 5'GCGCAGATGCCGTGAGGTTGATCATCTC 3'(SEQ ID NO:67)

P4: 5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGATGGACAGGTTTCATTCGC3'(SEQ ID NO:68)

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 PCR 증폭은 하기와 같이 수행하였다. 즉, 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 40초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 중첩 PCR 증폭은 하기와 같이 수행하였다. 즉, 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 90초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신한다.

본 발명의 구축 방법에 있어서, 상기 단계 (2)는 재조합 플라스미드의 구축을 포함한다. 여기에는 다음이 포함된다. 즉, 분리 정제된 ptsS^M162T 및 pK18mobsacB 플라스미드를 NEBuider 재조합 시스템으로 조립하여, 재조합 플라스미드를 획득한다.

본 발명의 구축 방법에 있어서, 상기 단계 (3)은 재조합 균주의 구축을 포함하고, 재조합 플라스미드를 숙주 균주에 형질전환하여 재조합 균주를 획득한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 단계 (3)의 형질전환은 전기형질전환법이다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 YP97158이다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 재조합은 상동성 재조합에 의해 구현된 것이다.

본 발명은 L-아미노산을 생성하는 재조합 균주의 구축 방법을 더 제공한다.

본 발명에 따라, 상기 구축 방법은 하기 단계를 포함한다.

ptsS 유전자의 업다운스트림 상동성 아암 단편, ptsS 유전자 암호화 영역 및 이의 프로모터 영역 서열, 또는 ptsS 또는 PtsS^M162T 유전자 암호화 영역 및 이의 프로모터 영역 서열을 증폭시킨 다음, 상동성 재조합의 방식으로 숙주 균주의 게놈에 PtsS 또는 PtsS^M162T 유전자를 도입하여, 상기 균주의 PtsS 또는 PtsS^M162T 유전자 과발현을 구현한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 업스트림 상동성 아암 단편을 증폭시키는 프라이머는 하기와 같다.

P7: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCGTTCTGGACTGAGG3'(SEQ ID NO:71)

P8: 5'GTGACTCTACGCATCTTTGACAGTGCACCG AGAACAGATG 3'(SEQ ID NO:72)

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 다운스트림 상동성 아암 단편을 증폭시키는 프라이머는 하기와 같다.

P11: 5'CACCACCACGATCCACAGACCCAGAATCAGATGGCGCAATTAAAT CAAG 3'(SEQ ID NO:75)

P12: 5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCTATGACACCTTCAACGGATC3'(SEQ ID NO:76)

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 유전자 암호화 영역 및 이의 프로모터 영역 서열을 증폭시키는 프라이머는 하기와 같다.

P9: 5'CATCTGTTCTCGGTGCACTGTCAAAGATGCGTA GAGTCAC 3'(SEQ ID NO:73)

P10: 5'CTTGATTTAATTGCGCCATCTGATTCTGGGTCTGTGGATCGTGG TGGTG 3'(SEQ ID NO:74).

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 전술한 P7-P12를 프라이머로 사용하여, 증폭 획득한 업스트림 상동성 단편, 다운스트림 상동성 단편 및 자체 프로모터를 휴대한 PtsS 또는 PtsS^M162T의 세 단편을 템플릿으로 혼합하여 증폭시킴으로써, 통합 상동성 아암 단편을 획득한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서 다음과 같이 수행하였다. 사용된 PCR 시스템: 10× Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM) 4μL, Mg²⁺(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL; PCR 증폭은 하기 방식으로 수행: 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, NEBuider 재조합 시스템을 사용하여, 셔틀 플라스미드 PK18mobsacB와 업다운 상동성 아암 단편, 유전자 암호화 영역 및 플라스미드 영역 단편을 조립하여, 통합 플라스미드를 획득하였다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 통합 플라스미드를 숙주 균주에 형질감염시키고, 상동성 재조합의 방식으로 숙주 균주의 게놈에 PtsS 또는 PtsS^M162T 유전자를 도입한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 YP97158이다. 본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 SEQ ID NO:62로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 휴대하는 균주이다.

본 발명은 L-아미노산을 생성하는 재조합 균주의 구축 방법을 더 제공한다.

본 발명에 따라, 상기 구축 방법은 하기 단계를 포함한다.

PtsS 유전자 암호화 영역 및 프로모터 영역 서열, 또는 PtsS^M162T 유전자 암호화 영역 및 프로모터 영역 서열을 증폭하고, 과발현 플라스미드 벡터를 구축하고, 상기 벡터를 숙주 균주로 형질전환하여, 상기 균주의 PtsS 및 PtsS^M162T 유전자 과발현을 구현한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 유전자 암호화 영역 및 이의 프로모터 영역 서열을 증폭시키는 프라이머는 하기와 같다.

P17: 5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCTGTCAAAGATGCGTAGAGTCAC3'(SEQ ID NO:81)

P18: 5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACGTCTGTGGATCGTGGTGGTG3'(SEQ ID NO:82)

본 발명의 일 실시방식에 있어서 다음과 같이 수행하였다. 상기 PCR 시스템: 10× Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM) 4μL, Mg²⁺(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL; 상기 PCR 증폭은 하기 방식으로 수행: 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, NEBuider 재조합 시스템을 사용하여, 셔틀 플라스미드 pXMJ19와 자체 프로모터를 휴대한 PtsS 또는 PtsS^M162T 단편을 조립하여 과발현 플라스미드를 획득한다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 YP97158이다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 ATCC 13869이다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 SEQ ID NO:62로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 휴대하는 균주이다.

본 발명에서 획득한 재조합 균주는 L-아미노산을 발효 생산하는데 단독으로 사용될 수 있으며, 다른 L-아미노산을 생산하는 박테리아와 혼합 발효되어 L-아미노산을 생산할 수도 있다.

본 발명은 L-아미노산을 생산하는 방법을 더 제공하며, 상기 방법은 박테리아를 배양하는 단계; 및 배양물로부터 L-아미노산을 수득하는 단계를 포함한다.

이하에서는 본 발명을 상세하게 설명한다.

용어 "L-아미노산 생산 능력을 갖는 박테리아"는 배지 및/또는 박테리아의 세포에서 후술하는 정도로 표적 L-아미노산을 생성 및 축적하는 능력을 가져, 박테리아가 배지에서 배양될 때 L-아미노산을 수집할 수 있는 박테리아를 의미한다. L-아미노산 생산 능력을 갖는 박테리아는 미변형 균주에서 획득할 수 있는 양보다 더 많은 양으로 배지 및/또는 박테리아의 세포에서 표적 L-아미노산를 축적할 수 있는 박테리아일 수 있다.

용어 "미변형 균주"는 특정한 특성을 갖는 방식으로 변형되지 않은 대조군 균주를 의미한다. 즉, 미변형 균주의 예시에는 야생형 균주와 모균주가 포함된다.

L-아미노산 생산 능력을 갖는 박테리아는 배지에서 바람직하게는 0.5g/L 이상, 보다 바람직하게는 1.0g/L 이상의 양으로 표적 L-아미노산을 축적할 수 있는 박테리아일 수 있다.

L-아미노산의 예시에는 L-라이신, L-오르니틴, L-아르기닌, L-히스티딘 및 L-시트룰린과 같은 염기성 아미노산; L-이소류신, L-알라닌, L-발린, L-류신 및 글리신과 같은 지방족 아미노산; L-트레오닌 및 L-세린과 같은 히드록시-모노아미노카르복실산인 아미노산; L-프롤린과 같은 환상 아미노산; L-페닐알라닌, L-티로신 및 L-트립토판과 같은 방향족 아미노산; L-시스테인, L-시스틴 및 L-메티오닌과 같은 황 함유 아미노산; L-글루탐산 및 L-아스파르트산과 같은 산성 아미노산; 및 L-글루타민 및 L-아스파라긴과 같은 측쇄에 아미드기를 갖는 아미노산이 포함된다.

L-아미노산의 구체적인 예시에는 L-글루탐산, L-라이신, L-트레오닌, L-아르기닌, L-히스티딘, L-이소류신, L-발린, L-류신, L-페닐알라닌, L-티로신, L-트립토판 및 L-시스테인이 포함된다.

L-아미노산의 보다 구체적인 예시에는 L-글루탐산, L-라이신, L-트레오닌 및 L-트립토판이 포함된다. L-아미노산의 보다 구체적인 예시에는 L-글루탐산, L-라이신이 포함된다.

본 발명에 있어서, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "아미노산"은 L-아미노산을 의미한다. 본 발명에 있어서, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "L-아미노산"은 유리 형태의 L-아미노산, 이의 염 또는 이의 혼합물을 의미한다.

용어 "상동성"은 두 가지 폴리뉴클레오티드 또는 두 가지 폴리펩티드 모듈 사이의 백분율 동일성을 의미한다. 하나의 모듈과 다른 모듈 사이의 서열 상동성은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, BLAST 알고리즘을 통해 이러한 유형의 서열 상동성을 측정할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현은, 발현 조절 서열의 치환 또는 돌연변이, 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 돌연변이 도입, 염색체 삽입 또는 벡터 도입을 통한 폴리뉴클레오티드 카피 수의 증가, 또는 이의 조합 등을 통해 강화될 수 있다.

본 발명에 따라, 상기 돌연변이는 상기 부위의 염기/뉴클레오티드의 변화를 의미하며, 상기 돌연변이 방법은 돌연변이 유발, PCR 부위 특이적 돌연변이법, 및/또는 상동성 재조합 등 방법 중 적어도 하나로부터 선택할 수 있다. 본 발명에 있어서, 바람직하게는 PCR 부위 특이적 돌연변이법 및/또는 상동성 재조합을 채택한다.

본 발명은 폴리뉴클레오티드의 발현 조절 서열을 변형시킬 수 있다. 발현 조절 서열은 그 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하며, 예를 들어 프로모터, 터미네이터, 인핸서, 사일런서 등을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 시작 코돈에 변화가 있을 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 염색체의 특정 부위에 혼입시켜 카피 수를 증가시킬 수 있다. 본원에서 특정한 부위에는 예를 들어 트랜스포존 부위 또는 유전자간 부위가 포함될 수 있다. 또한 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 혼입하고, 상기 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하여, 카피 수를 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 폴리뉴클레오티드 또는 점 돌연변이가 있는 폴리뉴클레오티드를 미생물 염색체의 특정 부위에 혼입함으로써 카피 수를 증가시킨다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 프로모터 서열을 휴대한 폴리뉴클레오티드 또는 프로모터 서열을 휴대한 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드를 미생물의 염색체의 특정 부위에 혼입함으로써 상기 핵산 서열을 과발현시킨다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 폴리뉴클레오티드 또는 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 혼입하고, 상기 발현 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써, 카피 수를 증가시킨다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 프로모터 서열을 휴대한 폴리뉴클레오티드 또는 프로모터 서열을 휴대한 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 혼입하고, 상기 발현 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써 상기 핵산 서열을 과발현시킨다.

용어 "작동 가능한 연결"은 조절 서열과 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 기능성 연결을 의미하며, 이를 통해 조절 서열이 폴리뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 제어한다. 조절 서열은 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 강한 프로모터일 수 있다. 조절 서열은 코리네박테리움속에 속하는 미생물 유래의 프로모터일 수 있거나, 다른 미생물 유래의 프로모터일 수도 있다. 예를 들어, 프로모터는 trc 프로모터, gap 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터, araBAD 프로모터 또는 cj7 프로모터일 수 있다.

용어 "벡터"는 유전자의 조절 서열 및 유전자 서열을 포함하고 적합한 숙주 세포에서 표적 유전자를 발현하도록 구성된 폴리뉴클레오티드 구축체를 의미한다. 또는, 벡터는 상동성 재조합에 사용될 수 있는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축체를 의미할 수도 있으며, 이로써 숙주 세포에 도입되는 벡터로 인해, 숙주 세포의 게놈 중의 내인성 유전자의 조절 서열을 변형시킬 수 있거나, 발현 가능한 표적 유전자를 숙주 게놈의 특정 부위에 삽입할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에서 사용되는 벡터는 벡터의 숙주 세포에 대한 도입 또는 벡터의 숙주 세포의 염색체에 대한 삽입을 확인하기 위한 선별 마커를 더 포함할 수 있다. 선별 마커는 약물 내성, 영양요구성, 세포독성제에 대한 내성, 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선별 가능한 표현형을 부여하는 마커를 포함할 수 있다. 이러한 선별제로 처리하는 환경에서, 선별 마커를 발현하는 세포만이 생존하거나 상이한 표현형 특성을 나타낼 수 있기 때문에, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

본 발명의 일부 구체적인 실시방식에 있어서, 사용된 벡터는 pK18mobsacB 플라스미드, pXMJ19 플라스미드이다.

용어 "형질전환"은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하여, 폴리뉴클레오티드가 게놈 외 요소로서 또는 숙주 세포의 게놈에 삽입됨으로써 복제될 수 있음을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 벡터를 형질전환하는 방법은 핵산을 세포에 도입하는 방법을 포함할 수 있다. 또한 관련 기술에 개시된 바와 같이, 숙주 세포에 따라 전기 펄스 방법을 실시할 수 있다.

본 발명에서, 코리네박테리움속에 속하는 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 페키넨스(Corynebacterium pekinense)일 수 있다.

본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 코리네박테리움속에 속하는 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 YP97158, 기탁 번호 CGMCC 제12856호, 기탁 일자: 2016년 8월 16일, 기탁 기관: 중국미생물균종기탁관리위원회 일반미생물센터, 베이징시 차오양구 베이천서로 1호원 3호, 전화 010-64807355이며, 해당 균주는 중국특허출원 CN106367432A(출원일 2016년 9월 1일, 공개일 2017년 2월 1일)에 기록되어 있다.

본 발명에서, 상기 박테리아는 L-아미노산 생산량 증가와 관련된 다른 개선, 예를 들어 글루탐산 탈수소효소, 아코니트산 수화효소, 시트르산 합성효소, 메틸시트르산 합성효소, 피루브산 카르복실라제, 피루브산 탈수소효소, 피루브산 키나아제, 포스포에놀피루브산 합성효소, 포스포글리세르산 뮤타아제, 포스포글리세르산 키나아제, 글리세르알데하이드-3-인산 탈수소효소, 트리오스 포스페이트 이소머라아제, 과당 비스포스페이트 알돌라아제, 글루코오스 포스페이트 이소머라아제, 6-포스포글루코네이트 탈수효소, 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 알돌라아제, 글루코오스 탈수소효소, 글루코네이트 키나아제, 아스파르트산 키나아제 III, 아스파르트산 세미알데하이드 탈수소효소, 호모세린 키나아제, 트레오닌 합성효소, 디히드로디피콜리네이트 합성효소, 디히드로디피콜리네이트 환원효소, m-디아미노피멜산 탈수소효소, 디아미노피멜산 탈탄산효소 등 효소의 활성 또는 유전자의 강화 또는 감소된 발현을 가지거나, 유전자가 외래 유전자에 의해 치환될 수 있다.

더 나아가, 상기 미생물은 L-라이신 생산량 증가와 관련된 다른 개선, 예를 들어, NADPH 생성과 관련된 유전자(예를 들어, 글로코오스 탈수소효소를 암호화하는 유전자, 글루코네이트 키나아제를 암호화하는 유전자, 글리세르알데하이드-3-인산 탈수소효소를 암호화하는 유전자, 포도당-6-인산 탈수소효소를 암호화하는 유전자, 또는 6-포스포글루코네이트 탈수소효소를 암호화하는 유전자) 및/또는 L-라이신 생합성 또는 분비와 관련된 다른 유전자(예를 들어, 아스파르트산 아미노전이효소를 암호화하는 유전자, 아스파르트산 키나아제를 암호화하는 유전자, 아스파르트산 세미알데하이드 탈수소효소를 암호화하는 유전자, 디히드로디피콜리네이트 합성효소를 암호화하는 유전자, 디히드로디피콜리네이트 환원효소를 암호화하는 유전자, m-디아미노피멜산 탈수소효소를 암호화하는 유전자, 디아미노피멜산 탈탄산효소를 암호화하는 유전자, lysE)의 강화 또는 감소된 발현을 가지거나, 유전자가 외래 유전자에 의해 치환될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 돌연변이는 상기 부위의 염기/뉴클레오티드의 변화를 의미하며, 상기 돌연변이 방법은 돌연변이 유발, PCR 부위 특이적 돌연변이법, 및/또는 상동성 재조합 등 방법 중 적어도 하나로부터 선택할 수 있다. 본 발명에 있어서, 바람직하게는 PCR 부위 특이적 돌연변이법 및/또는 상동성 재조합을 채택한다.

본 발명에 있어서, 당업계에 공지된 배양 조건 하에서 적합한 배지에서 박테리아를 배양할 수 있다. 배지는 탄소원, 질소원, 미량 원소 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 배양에서 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한 배양 시 기포 발생 방지 단계를 포함할 수 있는데, 예를 들어 소포제를 사용해 기포 생성을 방지한다. 그 외, 배양 시 기체를 배양물에 주입하는 단계를 포함할 수 있다. 기체는 배양물의 호기성 조건을 유지할 수 있는 임의의 기체를 포함할 수 있다. 배양에서 배양물의 온도는 20 내지 45℃일 수 있다. 생성된 L-아미노산은 배양물로부터 회수할 수 있다. 즉, 황산이나 염산 등으로 배양물을 처리한 다음, 음이온 교환 크로마토그래피, 농축, 결정화 및 등전침전의 방법의 조합하여 수행한다.

본 발명의 유익한 효과는 하기와 같다.

본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 YP97158을 출발균으로 사용하고, 그 배경 중의 NCgl1089 유전자, NCgl0761 유전자, ptsS 유전자의 약화 또는 녹아웃에 대해, 해당 유전자에 의해 암호화되는 생성물이 L-아미노산의 생산 능력에 영향을 미친다는 것을 발견하였다. 암호화 서열에 점 돌연변이를 도입하거나, 해당 유전자의 카피 수를 증가시키거나 과발현시켜 재조합 균주를 획득하며, 획득된 균주는 현저한 L-아미노산 생산 능력을 가지며, 이는 고농도의 L-아미노산 생산에 도움이 된다.

이하에서는 본 발명의 실시예에 대한 설명을 통해 본 발명의 상기 내용 및 기타 특성과 장점을 보다 상세하게 해석하고 설명한다. 이하의 실시예는 본 발명의 기술적 방안을 예시적으로 설명하기 위한 목적으로 사용되며, 이는 청구범위 및 그 등가의 방안에 의해 한정되는 본 발명의 보호범위를 제한하고자 하는 것이 아님에 유의한다.

달리 명시되지 않는 한, 이하의 실시예에 사용된 원료 및 시약은 모두 시판되는 제품이거나 공지된 방법으로 제조할 수 있는 것이다. 수행되는 조작은 모두 당업계에 공지된 것이거나 시판되는 제품의 사용자 지침에 따른 것이다.

하기 실시예에서 상기 균주 배양에 사용된 기본 배지는 조성이 동일하며, 이 기본 배지 조성에 상응하는 필요한 수크로스, 카나마이신 또는 클로람페니콜 등을 첨가한다. 기본 배지 조성은 하기와 같다.

하기 실시예에서 상기 SSCP 전기영동 PAGE의 제조 및 조건은 하기와 같다.

실시예 1

(1) 점 돌연변이의 NCgl1089 유전자 암호화 영역을 포함하는 형질전환 벡터 pK18-NCgl1089^G508A 구축

NCBI에서 공개한 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 서열에 따라, 2쌍의 NCgl1089 유전자 암호화 영역 서열을 증폭하는 프라이머를 설계 및 합성하고, 대립 유전자 치환의 방식으로 균주 YP97158(기탁 번호: CGMCC No.12856, 기탁 날짜: 2016년 8월 16일, 기탁 기관: 중국미생물균종기탁관리위원회 일반미생물센터, 베이징시 차오양구 베이천서로 1호원 3호, 전화: 010-64807355, 중국특허출원 CN106367432A(출원일 2016년 9월 1일, 공개일 2017년 2월 1일)에 기재됨) 배경 중의 NCgl1089 유전자 암호화 영역(SEQ ID NO:1)에 점 돌연변이를 도입하고, 암호화 단백질에 대응하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:3이고, NCgl1089 유전자의 뉴클레오티드 서열 508번째 G가 A(SEQ ID NO:2: NCgl1089^G508A)로 변이되고, 암호화 단백질에 대응하는 아미노산 서열 170번째 글루탐산이 라이신(SEQ ID NO:4:NCgl1089E170K)으로 변이되었다.

프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 invitrogen사 합성).

P1: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCGCGTGGGATCCACGCCAG 3'(SEQ ID NO:5)

P2: 5'CAATGAGGGCTTTCGCCACCTCGCGGGC 3'(SEQ ID NO:6)

P3: 5'GCCCGCGAGGTGGCGAAAGCCCTCATTG 3'(SEQ ID NO:7)

P4: 5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCATGCGTTGGCGATCTTC 3'(SEQ ID NO:8)

구축 방법: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 템플릿으로 사용하며, 각각 프라이머 P1과 P2, P3과 P4로 PCR 증폭을 수행한다.

PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM) 4μL, Mg²⁺(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL.

상기 PCR 증폭은 하기 방식과 같이 수행: 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 40초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신하여, 각각 724bp와 839bp인 두 가지 크기의, NCgl1089 유전자 암호화 영역을 포함하는 DNA 단편(NCgl1089Up 및 NCgl1089Down)을 획득하였다.

상기 두 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 분리 정제한 후, 상기 두 DNA 단편을 템플릿으로 하고, P1과 P4를 프라이머로 사용하여, 중첩 PCR을 통해 약 1535 bp 길이의 단편을 증폭하였다.

PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM) 4μL, Mg²⁺(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL.

상기 PCR 증폭은 하기 방식과 같이 수행: 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 90초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신.

이 DNA 단편(NCgl1089^G508A)은 YP97158 NCgl1089 유전자 암호화 영역의 508번째의 구아닌(G)을 아데닌(A)으로 변이시키고, 최종적으로 암호화 단백질의 170번째 아미노산을 글루탐산(E)에서 라이신(K)으로 변이시킨다.

pK18mobsacB 플라스미드(Addgene사에서 구입)를 Xba I로 효소 절단한 후, 아가로스 겔 전기영동으로 선형화 pK18mobsacB 플라스미드와 NCgl1089^G508A를 분리 정제한 다음, NEBuider 재조합 시스템을 통해 조립하여, 벡터 pK18-NCgl1089^G508A를 획득하며, 상기 플라스미드 상에는 카나마이신 내성 마커가 포함된다. 벡터 pK18-NCgl1089^G508A를 시퀀싱 동정을 위해 시퀀싱 회사로 송부하였으며, 정확한 점 돌연변이(G-A)를 포함하는 벡터 pK18-NCgl1089^G508A는 향후 사용을 위해 보존하였다.

(2) 점 돌연변이의 NCgl1089^G508A를 포함하는 공학 균주 구축

구축 방법: 대립 유전자 치환 플라스미드 pK18-NCgl1089^G508A를 전기천공으로 L-라이신 생산균 특허 균주 YP97158로 형질전환하고(이의 구축 방법은 WO2014121669A1 참조; 시퀀싱을 거쳐 해당 균주 염색체 상에 야생형의 NCgl1089 유전자 암호화 영역이 남아있는지 확인), 배양 생성된 단일 콜로니는 프라이머 P1과 유니버셜 프라이머 M13R로 각각 동정하며, 1542bp 크기의 밴드를 증폭할 수 있는 균주가 양성 균주이다. 양성 균주는 15% 수크로스가 포함된 배지에서 배양하고, 배양 생성된 단일 콜로니는 각각 카나마이신이 포함된 배지와 카나마이신이 포함되지 않은 배지에서 배양하며, 카나마이신이 포함되지 않은 배지에서 성장하고, 카나마이신이 포함된 배지 상에서 성장하지 않은 균주는 하기와 같은 프라이머(상하이 Invitrogen사에서 합성)를 사용하여 PCR 동정을 더 수행한다.

P5: 5'GGTGATTGATGCATTATGCGC 3'(SEQ ID NO:9)

P6: 5'CCTAGCCTTTCACCTCTTCTGT 3'(SEQ ID NO:10)

상기 PCR 증폭 산물은 고온 변성, 빙욕 후 sscp 전기영동을 수행하였고(플라스미드 pK18-NCgl1089^G508A 증폭 단편을 양성 대조군으로, YP97158 증폭 단편을 음성 대조군으로, 물을 블랭크 대조군으로 사용), 단편 구조가 상이하고 전기영동 위치가 상이하기 때문에, 단편 전기영동 위치가 음성 대조군 단편 위치와 일치하지 않으며 양성 대조군 단편 위치와 일치하는 균주는 대립 유전자 치환이 성공한 균주이다. 프라이머 P5와 P6을 이용하여 대립 유전자 치환이 성공한 균주 표적 단편을 다시 PCR 증폭하고, PMD19-T 벡터에 연결하여 시퀀싱하며, 서열 비교를 통해 염기 서열에 돌연변이가 발생한 서열이 균주의 대립유전자 치환 성공을 검증하고, YPL-4-017로 명명하였다.

(3) 게놈 상에 NCgl1089 또는 NCgl1089^G508A 유전자를 과발현하는 공학 균주 구축

NCBI에서 발표한 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 서열에 의거하여, 4쌍의 업다운스트림 상동성 아암 단편 및 NCgl1089 유전자 암호화 영역, NCgl1089^G508A 유전자 암호화 영역, 및 상기 유전자 프로모터 영역 서열을 증폭하는 프라이머를 설계 및 합성하고, 상동성 재조합의 방식으로 균주 YP97158에 NCgl1089 또는 NCgl1089^G508A 유전자를 도입하였다.

프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 invitrogen사 합성).

P7: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCGTTCTGGACTGAGG 3'(SEQ ID NO:11)

P8: 5'CATGAGTATA AAATCACTGT CGTGCACCGAG AACAGATG 3'(SEQ ID NO:12)

P9: 5'CATCTGTTCT CGGTGCACGACAGTGATT TTATACTCAT G 3'(SEQ ID NO:13)

P10: 5'GACGTTTCCA GATGCTCATCACCGAACCC GCTGCACTGT 3'(SEQ ID NO:14)

P11: 5'ACAGTGCAGC GGGTTCGGTGATGAGCATCT GGAAACGTC 3'(SEQ ID NO:15)

P12: 5'CTTGATTTAATTGCGCCATCTCACCTCTTC TGTGGGCACG 3'(SEQ ID NO:16)

P13: 5'CGTGCCCACAGAAGAGGTGAGAT GGCGCAATTA AATCAAG 3'(SEQ ID NO:17)

P14: 5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCTATGACACCTTCAACGGA TC 3'(SEQ ID NO:18)

구축 방법: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 템플릿으로 하여, 각각 프라이머 P7/P8, P9/P10, P13/P14로 PCR 증폭을 수행하여, 업스트림 상동성 아암 단편 805bp, NCgl1089 유전자 프로모터 단편 318bp, 및 다운스트림 상동성 아암 단편 628bp를 획득하고, 다시 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 및 YPL-4-017 균을 템플릿으로 하여, P11/P12를 프라이머로 사용하여, PCR 증폭하여 NCgl1089 또는 NCgl1089^G508A 유전자 단편 694bp를 획득한 후, P9/P12를 프라이머로 사용하고, NCgl1089 유전자 프로모터 단편과 NCgl1089 또는 NCgl1089^G508A를 템플릿으로 사용하여, 자체 프로모터를 휴대한 NCgl1089 또는 NCgl1089^G508A 단편 972bp를 획득한 다음, P7/P14를 프라이머로 사용하여, 업스트림 상동성 단편, 다운스트림 상동성 단편 및 자체 프로모터를 휴대한 NCgl1089 또는 NCgl1089^G508A의 세 단편을 템플릿으로 혼합하여 증폭을 수행하여, 통합 상동성 아암 단편을 획득하였다.

PCR 반응 종료 후, 증폭된 산물을 전기영동으로 회수하고, 칼럼형 DNA 겔 회수 키트(TIANGEN)를 사용하여 필요한 2365bp의 DNA 단편을 회수하고, NEBuider 재조합 시스템과 Xba I 효소 절단으로 회수한 셔틀 플라스미드 PK18mobsacB를 조립하여, 통합 플라스미드 PK18mobsacB-NCgl1089 또는 PK18mobsacB-NCgl1089^G508A를 획득하였다. 플라스미드 상에는 카나마이신 내성 마커가 포함되며, 카나마이신을 통해 플라스미드가 게놈 상에 통합된 재조합체를 선별 획득할 수 있다.

PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM) 4μL, Mg²⁺(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL.

상기 PCR 증폭은 하기 방식과 같이 수행: 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 90초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신.

2개의 통합 플라스미드는 각각 L-라이신 생산균 특허 균주 YP97158에 형질전환하고, 배양 생산된 단일 콜로니는 P15/P16 프라이머를 통해 PCR 동정을 수행하였으며, PCR에 의해 증폭된 크기가 1332bp인 단편을 포함하는 것은 양성 균주이고, 단편이 증폭되지 않은 것은 원균이다. 양성 균주는 15% 수크로스 배지에서 선별한 후 각각 카나마이신을 포함한 배지와 카나마이신을 포함하지 않은 배지에서 성장시켰으며, 카나마이신이 포함되지 않은 배지에서 성장하고, 카나마이신이 포함된 배지 상에서 성장하지 않은 균주는 P17/P18 프라이머로 PCR 동정을 수행하였으며, 크기가 1187bp로 증폭된 균은 YP97158 게놈 상에 유전자가 통합된 균주이며, 이는 각각 YPL-4-018(점 돌연변이 불포함) 및 YPL-4-019(점 돌연변이 포함)로 명명되었다.

P15: 5'TCCAAGGAAGATACACGCC 3'(SEQ ID NO:19)

P16: 5'CTGCGATTCC CAACGCATCT3'(SEQ ID NO:20)

P17: 5'GAGCAGCCAA AACATGCAGC3'(SEQ ID NO:21)

P18: 5'CGTTGGAATC TTGCGTTG 3'(SEQ ID NO:22)

(4) 플라스미드 상에 NCgl1089 또는 NCgl1089^G508A 유전자를 과발현하는 공학 균주 구축

NCBI에서 공개한 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 서열에 따라, 2쌍의 NCgl1089 또는 NCgl1089^G508A 유전자 암호화 영역 및 프로모터 영역 서열을 증폭하는 프라이머를 설계 및 합성하였으며, 프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 invitrogen사에서 합성).

P19: 5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGACAGTGATTTTATACTCATG 3'(SEQ ID NO:23)

P20: 5'GACGTTTCCA GATGCTCATCACCGAACCC GCTGCACTGT 3'(SEQ ID NO:24)

P21: 5'ACAGTGCAGC GGGTTCGGTGATGAGCATCT GGAAACGTC 3'(SEQ ID NO:25)

P22; 5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACTCACCTCTTCTGTGGGCACG 3'(SEQ ID NO:26)

구축 방법: YPL-4-018을 템플릿으로 하고, 프라이머 P19/P20 PCR로 NCgl1089 프로모터 단편 378bp를 획득한 다음, 각각 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032와 YPL-4-017을 템플릿으로 하고, 프라이머 P21/P22 PCR로 NCgl1089 또는 NCgl1089^G508A 유전자 단편 708bp를 획득하며, 다시 상기 프로모터와 유전자 단편을 템플릿으로 하고, 프라이머 P19/P22를 사용하여 중첩 PCR을 거쳐, 자체 프로모터를 휴대한 NCgl1089 또는 NCgl1089^G508A 유전자 단편 1066bp를 획득하였다. 증폭된 산물을 전기영동으로 회수하고, 컬럼 DNA 겔 회수 키트를 사용하여 필요한 1066bp의 DNA 단편을 회수하고, NEBuider 재조합 시스템을 사용하여 EcoR I 효소 절단으로 회수한 셔틀 플라스미드 pXMJ19를 조립하여, 과발현 플라스미드 pXMJ19-NCgl1089 또는 pXMJ19-NCgl1089^G508A를 획득하였다. 플라스미드 상에는 클로람페니콜 내성 마커가 포함되며, 클로람페니콜을 통해 플라스미드를 선별 획득하여 균주에 형질전환할 수 있다.

PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM) 4μL, Mg²⁺(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL.

상기 PCR 증폭은 하기 방식과 같이 수행: 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 90초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신.

pXMJ19-NCgl1089 또는 pXMJ19-NCgl1089^G508A를 각각 L-라이신 생산균 특허 균주 YP97158로 전기형질전환하고, 배양 생성된 단일 콜로니는 M13(-48) 및 P22 프라이머를 사용하여 PCR 동정하였으며, PCR에 의해 증폭된 크기가 1104bp인 단편을 포함하는 것은 형질전환된 균주이고 이는 각각 YPL-4-020(점 돌연변이 불포함) 또는 YPL-4-021(점 돌연변이 포함)로 명명하였다.

(5) 게놈 상에서 NCgl1089 유전자가 결실된 공학 균주 구축

NCBI에서 공개한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 서열에 따르면, 2쌍의 NCgl1089 유전자 암호화 영역 양단 단편을 증폭하는 프라이머를 업다운스트림 상동성 아암 단편으로 합성하였다. 프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 invitrogen사 합성).

P23: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCACCGCATTCCCTTCATGAT 3'(SEQ ID NO:27)

P24: 5'ACGAATCCGCGCCTAGCCTTTTATCTACTTCCAAAAAACTGC 3'(SEQ ID NO:28)

P25: 5'GCAGTTTTTTGGAAGTAGATAAAAGGCTAGGCGCGGATTCGT 3'(SEQ ID NO:29)

P26: 5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCGAGGGAAAGGATATCGA 3'(SEQ ID NO:30)

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 템플릿으로 하여, 각각 프라이머 P23/P24 및 P25/P26으로 PCR 증폭하여, 업스트림 상동성 아암 단편 779bp 및 다운스트림 상동성 아암 단편 800bp를 획득한 다음, 프라이머 P23/P26으로 중첩 PCR을 수행하여, 전체 상동성 아암 단편 1539bp를 획득하였다. PCR 반응 종료 후, 증폭된 산물을 전기영동으로 회수하고, 컬럼형 DNA 겔 회수 키트를 이용하여 필요한 1539bp의 DNA 단편을 회수하고, NEBuider 재조합 시스템을 통해 Xba I 효소 절단으로 회수한 셔틀 플라스미드 pk18mobsacB 플라스미드를 서로 연결하여, 녹아웃 플라스미드를 획득하였다. 해당 플라스미드에는 카나마이신 내성 마커가 포함된다.

녹아웃 플라스미드는 라이신 생산 특허 균주 YP97158로 전기형질전환되고, 배양 생산된 단일 콜로니는 각각 하기와 같은 프라이머(상하이 invitrogen사에서 합성)를 사용하여 PCR 동정을 수행하였다.

P27: 5'CACCGCATTCCCTTCATGAT 3'(SEQ ID NO:31)

P28: 5'CGAGGGAAAGGATATCGA 3'(SEQ ID NO:32)

상기 PCR에 의해 증폭된 1429bp 및 2401bp 크기의 밴드를 갖는 균주는 양성 균주이고, 증폭된 2401bp 크기의 밴드를 갖는 균주는 원균이다. 양성 균주는 15% 수크로스 배지 상에서 스크리닝한 후 각각 카나마이신을 함유한 배지와 카나마이신을 함유하지 않은 배지에서 배양하였으며, 카나마이신을 함유하지 않은 배지 상에서 성장하나, 카나마이신을 함유한 배지 상에서 성장하지 않는 균주는 P27/P28 프라이머를 이용하여 PCR 동정을 더 수행하였고, 증폭된 크기가 1429bp인 밴드의 균주는 NCgl1089 유전자 암호화 영역이 녹아웃된 유전공학 균주로 YPL-4-022로 명명되었다.

(6) L-라이신 발효 실험

실시예에서 구축한 균주 및 원래 균주 YP97158을 BLBIO-5GC-4-H 모델의 발효기(Shanghai bailun biological technology사에서 구입)에서 표 1에서 나타낸 배지 및 표 2에 나타낸 제어 공정으로 발효 실험을 수행하였다. 각 균주는 3회 반복하며, 결과는 표 3과 같다.

표 1 발효 배지 배합

표 2 발효 제어 공정

표3 L-라이신 발효 실험 결과

결과는 표 3과 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 NCgl1089 유전자 과발현, 또는 NCgl1089 유전자 암호화 영역에 대해 수행한 점 돌연변이 NCgl1089^G508A 및 과발현은, L-라이신 생산 향상에 기여한 반면, 유전자에 대한 약화 또는 녹아웃은, L-라이신의 축적에 도움이 되지 않았다.

실시예 2

(1) 점 돌연변이된 NCgl0761 유전자 암호화 영역을 포함하는 형질전환 벡터 pK18-NCgl0761^L31R의 구축

NCBI에서 공개한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 서열에 따라, 2쌍의 NCgl0761 유전자 암호화 영역 서열을 증폭하는 프라이머를 설계 및 합성하고, 대립 유전자 치환의 방식으로 균주 YP97158(기탁 번호: CGMCC No.12856, 기탁 날짜: 2016년 8월 16일, 기탁 기관: 중국과학원미생물연구소, 베이징시 차오양구 베이천서로 1호원 3호, 전화: 010-64807355, 중국특허출원 CN106367432A(출원일 2016년 9월 1일, 공개일 2017년 2월 1일)에 기재됨) 배경 중의 NCgl0761 유전자 암호화 영역(SEQ ID NO:3)에 점 돌연변이를 도입하고, 암호화 단백질에 대응하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:35이고, NCgl0761 유전자의 뉴클레오티드 서열 92번째 T가 G(SEQ ID NO:34)로 변이되고, 암호화 단백질에 대응하는 아미노산 서열 31번째 류신이 아르기닌(SEQ ID NO:36:NCgl0761^L31R)으로 변이되었다. 프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 invitrogen사 합성).

P1: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCTTGCAGCTAACCTATACCCC3'(SEQ ID NO:37)

P2: 5'GCTTTTCAATATAATCACGTCCATCTGAGCCATC3'(SEQ ID NO:38)

P3: 5'GATGGCTCAGATGGACGTGATTATATTGAAAAGC3'(SEQ ID NO:39)

P4: 5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCTCCCAAATAATTGCCGC3'(SEQ ID NO:40)

구축 방법: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 템플릿으로 하여, 각각 프라이머 P1과 P2, P3과 P4로 PCR 증폭을 수행하였다. PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture (각각 2.5mM) 4μL, Mg²⁺(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL이다. 상기 PCR 증폭은 하기 방식과 같이 수행: 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 40초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신하여, 각각 636bp와 681bp인 두 가지 크기의, NCgl0761 유전자 암호화 영역을 포함하는 DNA 단편(NCgl0761 UP 및 NCgl0761 Down)을 획득하였다. 상기 두 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 분리 정제한 후, 상기 두 DNA 단편을 템플릿으로 하고, P1과 P4를 프라이머로 사용하여, 중첩 PCR을 통해 1283bp 길이의 단편을 증폭하였다.

PCR 시스템: 10× Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM) 4μL, Mg²⁺(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL; 상기 PCR 증폭은 하기 방식으로 수행: 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신.

이 DNA 단편은 YP97158 NCgl0761 유전자 암호화 영역의 92번째의 티민(T)을 구아닌(G)으로 변이시키고, 최종적으로 암호화 단백질의 31번째 아미노산을 류신(L)에서 아르기닌(R)으로 변이시켰다. 이 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동 후 정제하고, 이중 효소 절단 후 정제된 pK18mobsacB 플라스미드(Addgene사에서 구입, 각각 Xbal I/BamH I 이중 효소 절단)는 NEBuilder 효소(NEB사에서 구입)를 이용하여 50℃에서 30분 동안 연결하고, 연결 산물의 형질전환 후 성장한 단일 클론을 PCR로 동정하여 양성 벡터 pK18-NCgl0761^L31R을 획득하였으며, 해당 플라스미드 상에는 카나마이신 내성 마커가 포함된다. 효소 절단이 정확한 벡터 pK18-NCgl0761^L31R은 시퀀싱 동정을 위해 시퀀싱 회사로 보냈고, 정확한 점 돌연변이(T-G)를 포함하는 벡터 pK18-NCgl0761^L31R은 향후 사용을 위해 보관하였다.

(2) 점 돌연변이의 pK18-NCgl0761^L31R을 포함하는 공학 균주 구축

구축 방법: 대립 유전자 치환 플라스미드 pK18-NCgl0761^L31R을 전기천공으로 L-라이신 생산균 특허 균주 YP97158로 형질전환하고(이의 구축 방법은 WO2014121669A1 참조; 시퀀싱을 거쳐 해당 균주 염색체 상에 야생형의 NCgl0761 유전자 암호화 영역이 남아있는지 확인), 배양 생성된 단일 콜로니는 프라이머 P1과 유니버셜 프라이머 M13R로 각각 동정하며, 1369bp 크기의 밴드를 증폭할 수 있는 균주가 양성 균주이다. 양성 균주는 15% 수크로스가 포함된 배지에서 배양하고, 배양 생성된 단일 콜로니는 각각 카나마이신이 포함된 배지와 카나마이신이 포함되지 않은 배지에서 배양하며, 카나마이신이 포함되지 않은 배지에서 성장하고, 카나마이신이 포함된 배지 상에서 성장하지 않은 균주는 하기와 같은 프라이머(상하이 Invitrogen사에서 합성)를 사용하여 PCR 동정을 더 수행한다.

P5: 5'GAATGGAATAGGAGAATTGCG 3'(SEQ ID NO:41)

P6: 5'CACCAGGCGTGGAAAGAG 3'(SEQ ID NO:42)

상기 PCR 증폭 산물 267bp는 95℃ 고온 10분 변성, 5분 빙욕 후 SSCP 전기영동을 수행하였고(플라스미드 pK18-NCgl0761^L31R 증폭 단편을 양성 대조군으로, YP97158 증폭 단편을 음성 대조군으로, 물을 블랭크 대조군으로 사용), 단편 구조가 상이하고 전기영동 위치가 상이하기 때문에, 단편 전기영동 위치가 음성 대조군 단편 위치와 일치하지 않으며 양성 대조군 단편 위치와 일치하는 균주는 대립 유전자 치환이 성공한 균주이다. 다시 프라이머 P5/P6 PCR로 양성 균주 NCgl0761 단편을 증폭하고, PMD19-T 벡터에 연결하여 시퀀싱을 수행하였으며, 서열 비교를 통해, 염기 서열에 돌연변이가 발생한(T-G) 균주는 대립 유전자 치환에 성공한 양성 균주로, YPL-4-029로 명명하였다.

(3) 게놈 상에서 NCgl0761 및 NCgl0761^L31R 유전자를 과발현하는 공학 균주 구축

NCBI에서 발표한 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 서열에 의거하여, 3쌍의 업다운스트림 상동성 아암 단편 및 NCgl0761 또는 NCgl0761^L31R 유전자 암호화 영역 및 프로모터 영역 서열을 증폭하는 프라이머를 설계 및 합성하고, 상동성 재조합의 방식으로 균주 YP97158에 NCgl0761 또는 NCgl0761^L31R 유전자를 도입하였다.

프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 invitrogen사 합성).

P7: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCGTTCTGGACTGAGG 3'(SEQ ID NO:43)

P8: 5'CCATCCATACCCCACTACATGTGCACCGAGAACAGATG 3'(SEQ ID NO:44)

P9: 5'CATCTGTTCTCGGTGCACATGTAGTGGGGTATGGATGG 3'(SEQ ID NO:45)

P10: 5'GATTTAATTGCGCCATCTGATTCTGGGTGAGGTTTCCGGCTCAG3'(SEQ ID NO:46)

P11: 5'CTGAGCCGGAAACCTCACCC AGAATCAGATGGCGCAATTAAATC 3'(SEQ ID NO:47)

P12: 5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCTATGACACCTTCAACGGATC 3'(SEQ ID NO:48)

구축 방법: 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 또는 YPL-4-029를 템플릿으로 사용하였고, 각각 프라이머 P7/P8, P9/P10, P11/P12로 PCR 증폭을 수행하여, 업스트림 상동성 아암 단편 802bp, NCgl0761 또는 NCgl0761^L31R 유전자 및 이의 프로모터 단편 737bp 및 다운스트림 상동성 아암 단편 647bp를 획득하였다. PCR 반응 종료 후, 증폭된 3개의 단편에 대해 칼럼형 DNA 겔 회수 키트(TIANGEN)로 각각 전기영동 회수를 수행하였다. 회수된 3개의 단편을 이중 효소 절단 후 정제된 pK18mobsacB 플라스미드(Addgene사에서 구입, 각각 Xbal I/BamH I 이중 효소로 절단)와 NEBuilder 효소(NEB에서 구입)로 50℃에서 30분 동안 연결하고, 연결 산물이 형질전환된 후 성장한 단일 클론은 M13 프라이머로 PCR 동정을 거쳐 양성 통합 플라스미드와 pK18mobsacB-NCgl0761과 pK18mobsacB-NCgl0761^L31R을 획득하였다. 플라스미드 상에는 카나마이신 내성 마커가 포함되며, 카나마이신을 통해 플라스미드가 게놈 상에 통합된 재조합체를 선별 획득할 수 있다.

PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM) 4μL, Mg²⁺(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL. 상기 PCR 증폭은 하기 방식과 같이 수행: 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신.

시퀀싱이 정확한 2개의 통합 플라스미드는 각각 L-라이신 생산균 특허 균주 YP97158에 형질전환하고, 배양 생산된 단일 콜로니는 P13/P14 프라이머를 통해 PCR 동정을 수행하였으며, PCR에 의해 증폭된 크기가 1325bp인 단편을 포함하는 것은 양성 균주이고, 단편이 증폭되지 않은 것은 원균이다. 양성 균주는 15% 수크로스가 포함된 배지에서 배양하고, 배양 생성된 단일 콜로니는 P15/P16 프라이머로 PCR 동정을 더 수행하였으며, 증폭된 크기가 1002bp인 균은 NCgl0761 또는 NCgl0761^L31R 유전자가 YP97158 게놈 상에 통합된 양성 균주이며, 이는 YPL-4-030(점 돌연변이 불포함) 및 YPL-4-031(점 돌연변이 포함)로 명명되었다.

P13: 5'TCCAAGGAAGATACACGCC 3'(SEQ ID NO:49)

P14: 5'GCCTTGTTAATATCTTCCC 3'(SEQ ID NO:50)

P15: 5'GGGAAGATATTAACAAGGC 3'(SEQ ID NO:51)

P16: 5'CGTTGGAATCTTGCGTTG 3'(SEQ ID NO:52)

(4) 플라스미드 상에서 NCgl0761 또는 NCgl0761^L31R 유전자를 과발현하는 공학 균주 구축

NCBI에서 공개한 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 서열에 따라, 1쌍의 NCgl0761 또는 NCgl0761^L31R 유전자 암호화 영역 및 프로모터 영역 서열을 증폭하는 프라이머를 설계 및 합성하였으며, 프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 invitrogen사에서 합성).

P17: 5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCATGTAGTGGGGTATGGATGG 3'(SEQ ID NO:53)

P18: 5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAAC GTGAGGTTTCCGGCTCAG 3'(SEQ ID NO:54)

구축 방법: 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 또는 YPL-4-029를 템플릿으로 사용하였고, 각각 프라이머 P17/P18로 PCR 증폭을 수행하여, NCgl0761 또는 NCgl0761^L31R 유전자 및 이의 프로모터 단편 737bp를 획득하고, 증폭된 산물을 전기영동하고 컬럼형 DNA 겔 회수 키트를 이용하여 정제하며, 회수된 DNA 단편은 EcoR I 효소 절단 회수된 셔틀 플라스미드 pXMJ19와 NEBuilder 효소(NEB사에서 구입)로 50℃에서 30분 동안 연결하고, 연결 산물이 형질전환 후 성장한 단일 클론을 M13 프라이머로 PCR 동정을 거쳐 양성 과발현 플라스미드 pXMJ19-NCgl0761 및 pXMJ19-NCgl0761^L31R을 획득하였고, 해당 플라스미드를 시퀀싱을 위해 보냈다. 플라스미드 상에는 클로람페니콜 내성 마커가 포함되므로, 클로람페니콜을 통해 플라스미드가 균주에 형질전환되었는지 여부를 스크리닝할 수 있다.

PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM)4μL, Mg²⁺(25mM)4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL)0.25μL, 총 부피 50μL.

상기 PCR 증폭은 하기 방식과 같이 수행: 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신.

시퀀싱이 정확한 pXMJ19-NCgl0761 및 pXMJ19-NCgl0761^L31R 플라스미드를 각각 L-라이신 생산균 특허 균주 YP97158로 전기형질전환하고, 배양 생성된 단일 콜로니를 프라이머 M13/P18로 PCR 동정을 수행하였으며, PCR에 의해 증폭된 크기가 745bp인 단편을 포함하는 것은 양성 균주이고, 이는 YPL-4-032(점 돌연변이 불포함) 및 YPL-4-033(점 돌연변이 포함)으로 명명되었다.

(5) 게놈 상에서 NCgl0761 유전자가 결실된 공학 균주 구축

NCBI에서 공개한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 서열에 따르면, 2쌍의 NCgl0761 유전자 암호화 영역 양단 단편을 증폭하는 프라이머를 업다운스트림 상동성 아암 단편으로 합성하였다. 프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 invitrogen사 합성).

P19: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGTATCTGGAGAGAAGAAGGAGC 3'(SEQ ID NO:55)

P20: 5'GCCTTGTTAATATCTTCCCGAATACATGCCGCAATTCTCCTATTC3'(SEQ ID NO:56)

P21: 5'GAGAATTGCGGCATGTATTCGGGAAGATATTAACAAGGC 3'(SEQ ID NO:57)

P22: 5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCCGCAGATTACTAAGGCTG 3'(SEQ ID NO:58)

구축 방법: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 템플릿으로 사용하며, 각각 프라이머 P19와 P20, P21과 P22로 PCR 증폭을 수행하여, 업스트림 상동성 아암 단편 658bp 및 다운스트림 상동성 아암 단편 716bp를 획득하였다. 다시 프라이머 P19/P22으로 중첩 PCR을 수행하여 전체 상동성 아암 단편 1335bp를 획득하였다. 증폭된 산물을 전기영동하여 컬럼형 DNA 겔 회수 키트를 이용하여 정제하며, 회수된 DNA 단편을 이중 효소 절단 후 정제된 pK18mobsacB 플라스미드(Addgene사에서 구입, 각각 Xbal I/BamHI 이중 효소로 절단)와 NEBuilder 효소(NEB사에서 구입)로 50℃에서 30분 동안 연결하고, 연결 산물이 형질전환된 후 성장한 단일 클론을 M13 프라이머로 PCR 동정을 거쳐 양성 녹아웃 벡터 pK18-ΔNCgl0761을 획득하였으며, 해당 플라스미드는 시퀀싱을 위해 보냈다. 해당 플라스미드에는 카나마이신 내성 마커가 선별 마커로 포함된다.

PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM) 4μL, Mg²⁺(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL.

상기 PCR 증폭은 하기 방식과 같이 수행: 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 90초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신.

시퀀싱이 정확한 녹아웃 플라스미드 pK18-ΔNCgl0761을 라이신 생산 특허 균주 YP97158로 전기형질전환하고, 배양 생산된 단일 콜로니를 하기와 같은 프라이머(상하이 invitrogen에서 합성)를 통해 PCR 동정을 수행하였다.

P23: 5'GTATCTGGAGAGAAGAAGGAGC 3'(SEQ ID NO:59)

P24: 5'CCGCAGATTACTAAGGCTG 3'(SEQ ID NO:60)

상기 PCR에 의해 1374bp 및 1520bp 크기의 밴드를 동시에 증폭한 균주는 양성 균주이고, 1520bp 크기의 밴드만 증폭한 균주는 원균이다. 양성 균주는 15% 수크로스 배지 상에서 스크리닝한 후 각각 카나마이신을 함유한 배지와 카나마이신을 함유하지 않은 배지에서 배양하였으며, 카나마이신을 함유하지 않은 배지 상에서 성장하나, 카나마이신을 함유한 배지 상에서 성장하지 않는 균주는 P23/P24 프라이머를 이용하여 PCR 동정을 더 수행하였고, 증폭된 크기가 1374bp인 밴드의 균주는 NCgl0761 유전자 암호화 영역이 녹아웃된 양성 균주이다. 다시 P23/P24 프라이머로 양성 균주 NCgl0761의 단편을 PCR 증폭하고, PMD19-T 벡터에 연결하여 시퀀싱을 수행하였으며, 시퀀싱이 정확한 균주는 YPL-4-034로 명명하였다.

(6) L-라이신 발효 실험

실시예에서 구축한 균주 및 원래 균주 YP97158을 BLBIO-5GC-4-H 모델의 발효기(Shanghai bailun biological technology사에서 구입)에서 표 4에서 나타낸 배지 및 표 5에 나타낸 제어 공정으로 발효 실험을 수행하였다. 각 균주는 3회 반복하며, 결과는 표 6과 같다.

표 4 발효 배지 배합

표 5 발효 제어 공정

표 6 L-라이신 발효 실험 결과

결과는 표 6과 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 NCgl0761 유전자에 대한 과발현, 또는 NCgl0761 유전자 암호화 영역에 대한 점 돌연변이 NCgl0761^L31R 및 과발현은, L-라이신 생산량 및 형질전환율의 향상에 기여하는 반면, 유전자에 대한 약화 또는 녹아웃은 L-라이신 축적에 도움이 되지 않았으며 형질전환율을 감소시켰다.

(7) 글루탐산 생산 균주에서 NCgl0761 유전자 과발현 도입, 또는 NCgl0761 유전자 암호화 영역에 대한 점 돌연변이 NCgl0761^L31R 및 과발현 수행, 및 발효 실험 수행

실시예 (1)~(5)의 방법에 따라, 동일한 프라이머 및 실험 조건을 사용하여, 코리네박테리움 ATCC13869를 출발균으로 하고, ATCC 13869의 균을 발현균으로 하여, 점 돌연변이 pK18-NCgl0761^L31R을 포함하는 글루탐산 생산 공학 균주(YPG-001), 게놈 상에서 NCgl0761(YPG-002) 또는 NCgl0761^L31R(YPG-003) 유전자를 과발현하는 글루탐산 생산 공학 균주, 플라스미드 상에서 NCgl0761(YPG-004) 또는 NCgl0761^L31R(YPG-005) 유전자를 과발현하는 글루탐산 생산 공학 균주, 및 게놈 상에서 NCgl0761 유전자가 결실된 글루탐산 생산 공학 균주(YPG-006)를 획득하였다.

실시예에서 구축한 균주 및 원래 균주 ATCC 13869를 BLBIO-5GC-4-H 모델의 발효기(Shanghai bailun biological technology사에서 구입)에서 표 7에서 나타낸 배지 및 표 8에 나타낸 제어 공정으로 발효 실험을 수행하였다. 각 균주는 3회 반복하며, 결과는 표 9와 같다.

표 7 발효 배지 배합

표 8 발효 제어 공정

표 9 L-글루탐산 발효 실험 결과

결과는 표 9과 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 NCgl0761 유전자에 대한 과발현, 또는 NCgl0761 유전자 암호화 영역에 대한 점 돌연변이 NCgl0761^L31R 및 과발현은, L-글루탐산 생산량 및 형질전환율의 향상에 기여하는 반면, 유전자에 대한 약화 또는 녹아웃은 L-글루탐산 축적에 도움이 되지 않았으며 형질전환율을 감소시켰다.

실시예 3:

(1) 점 돌연변이의 ptsS 유전자 암호화 영역을 포함하는 형질전환 벡터 pK18-ptsS^M162T 구축

NCBI에서 공개한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 서열에 따라, 2쌍의 ptsS 유전자 암호화 영역 서열을 증폭하는 프라이머를 설계 및 합성하고, 대립 유전자 치환의 방식으로 균주 YP97158(기탁 번호: CGMCC No.12856, 기탁 날짜: 2016년 8월 16일, 기탁 기관: 중국과학원미생물연구소, 베이징시 차오양구 베이천서로 1호원 3호, 전화: 010-64807355, 중국특허출원 CN106367432A(출원일 2016년 9월 1일, 공개일 2017년 2월 1일)에 기재됨) 배경 중의 ptsS 유전자 암호화 영역(SEQ ID NO:61)에 점 돌연변이를 도입하고, 암호화 단백질에 대응하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:63이고, ptsS 유전자의 뉴클레오티드 서열 485번째 티민(T)이 사이토신(C)(SEQ ID NO:62)으로 변이되고, 암호화 단백질에 대응하는 아미노산 서열 162번째 메티오닌이 트레오닌(SEQ ID NO:64:ptsS^M162T)으로 변이되었다. 프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 invitrogen사 합성).

P1: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGACACCTGAAGCACCTGC 3'(SEQ ID NO:65)

P2: 5'GAGATGATCAACCTCACGGCATCTGCGC 3'(SEQ ID NO:66)

P3: 5'GCGCAGATGCCGTGAGGTTGATCATCTC 3'(SEQ ID NO:67)

P4: 5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGATGGACAGGTTTCATTCGC3'(SEQ ID NO:68)

구축 방법: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 템플릿으로 하여, 각각 프라이머 P1과 P2, P3과 P4로 PCR 증폭을 수행하였다. PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture (각각 2.5mM) 4μL, Mg²⁺(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL이다. 상기 PCR 증폭은 하기 방식과 같이 수행: 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 40초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신하여, 각각 666bp와 703bp인 두 가지 크기의, ptsS 유전자 암호화 영역을 포함하는 DNA 단편(ptsS Up 및 ptsS Down)을 획득하였다. 상기 두 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 분리 정제한 후, 상기 두 DNA 단편을 템플릿으로 하고, P1과 P4를 프라이머로 사용하여, Overlap PCR을 통해 1341bp 길이의 단편을 증폭 획득하였다.

PCR 시스템: 10× Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM) 4μL, Mg²⁺(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL; 상기 PCR 증폭은 하기 방식으로 수행: 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 90초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신.

이 DNA 단편은 YP97158ptsS 유전자 암호화 영역의 485번째의 티민(T)을 사이토신(C)으로 변이시키고, 최종적으로 암호화 단백질의 162번째 아미노산을 메티오닌(M)에서 트레오닌(T)으로 변이시켰다. 이 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동 후 정제하고, 이중 효소 절단 후 정제된 pK18mobsacB 플라스미드(Addgene사에서 구입, 각각 Xbal I/BamH I 이중 효소로 절단)는 NEBuilder 효소(NEB사에서 구입)를 이용하여 50℃에서 30분 동안 연결하고, 연결 산물이 형질전환된 후 성장한 단일 클론을 PCR로 동정하여 벡터 pK18-ptsS^M162T를 획득하였으며, 해당 플라스미드 상에는 카나마이신 내성 마커가 포함된다. 효소 절단이 정확한 벡터 pK18-ptsS^M162T는 시퀀싱 동정을 위해 시퀀싱 회사로 보냈고, 정확한 점 돌연변이(T-C)를 포함하는 벡터 pK18-ptsS^M162T는 향후 사용을 위해 보관하였다.

(2) 점 돌연변이 ptsS^M162T를 포함하는 공학 균주 구축

구축 방법: 대립 유전자 치환 플라스미드 pK18-ptsS^M162T를 전기천공으로 L-라이신 생산균 특허 균주 YP97158로 형질전환하고(이의 구축 방법은 WO2014121669A1 참조; 시퀀싱을 거쳐 해당 균주 염색체 상에 야생형의 ptsS 유전자 암호화 영역이 남아있는지 확인), 배양 생성된 단일 콜로니는 프라이머 P1과 유니버셜 프라이머 M13R로 각각 동정하며, 1393bp 크기의 밴드를 증폭할 수 있는 균주가 양성 균주이다. 양성 균주는 15% 수크로스가 포함된 배지에서 배양하고, 배양 생성된 단일 콜로니는 각각 카나마이신이 포함된 배지와 카나마이신이 포함되지 않은 배지에서 배양하며, 카나마이신이 포함되지 않은 배지에서 성장하고, 카나마이신이 포함된 배지 상에서 성장하지 않은 균주는 하기와 같은 프라이머(상하이 Invitrogen사에서 합성)를 사용하여 PCR 동정을 더 수행한다.

P5: 5'CCACATTGGCATTTCGCC 3'(SEQ ID NO:69)

P6: 5'CGCTGATTCCAATCTTGG 3'(SEQ ID NO:70)

상기 PCR 증폭 산물 311bp는 95℃ 고온 10분 변성, 5분 빙욕 후 SSCP 전기영동을 수행하였고(플라스미드 pK18-ptsS^M162T 증폭 단편을 양성 대조군으로, YP97158 증폭 단편을 음성 대조군으로, 물을 블랭크 대조군으로 사용), 단편 구조가 상이하고 전기영동 위치가 상이하기 때문에, 단편 전기영동 위치가 음성 대조군 단편 위치와 일치하지 않으며 양성 대조군 단편 위치와 일치하는 균주는 대립 유전자 치환이 성공한 균주이다. 다시 프라이머 P5/P6 PCR로 양성 균주 ptsS 단편을 증폭하고, PMD19-T 벡터에 연결하여 시퀀싱을 수행하였으며, 서열 비교를 통해, 염기 서열에 돌연변이가 발생한(A-G) 균주는 대립 유전자 치환에 성공한 양성 균주로, YPL-4-035로 명명하였다.

(3) 게놈 상에서 PtsS 또는 PtsS^M162T 유전자를 과발현하는 공학 균주 구축

NCBI에서 발표한 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 서열에 의거하여, 3쌍의 업다운스트림 상동성 아암 단편 및 PtsS 또는 PtsS^M162T 유전자 암호화 영역 및 프로모터 영역 서열을 증폭하는 프라이머를 설계 및 합성하고, 상동성 재조합의 방식으로 균주 YP97158에 PtsS^M162T 유전자를 도입하였다.

프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 invitrogen사 합성).

P7: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCGTTCTGGACTGAGG 3'(SEQ ID NO:71)

P8: 5'GTGACTCTACGCATCTTTGACAGTGCACCG AGAACAGATG 3'(SEQ ID NO:72)

P9: 5'CATCTGTTCTCGGTGCACTGTCAAAGATGCGTA GAGTCAC 3'(SEQ ID NO:73)

P10: 5'CTTGATTTAATTGCGCCATCTGATTCTGGGTCTGTGGATCGTGG TGGTG 3'(SEQ ID NO:74)

P11: 5'CACCACCACGATCCACAGACCCAGAATCAGATGGCGCAATTAAAT CAAG 3'(SEQ ID NO:75)

P12: 5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCTATGACACCTTCAACGGATC 3'(SEQ ID NO:76)

구축 방법: 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 또는 YPL-4-035를 템플릿으로 사용하였고, 각각 프라이머 P7/P8, P9/P10, P11/P12로 PCR 증폭을 수행하여, 업스트림 상동성 아암 단편 802bp, PtsS 또는 PtsS^M162T 유전자 및 이의 프로모터 단편 2354bp 및 다운스트림 상동성 아암 단편 647bp를 획득하였다. PCR 반응 종료 후, 증폭된 3개의 단편에 대해 칼럼형 DNA 겔 회수 키트로 각각 전기영동 회수를 수행하였다. 회수된 3개의 단편을 이중 효소 절단 후 정제된 pK18mobsacB 플라스미드(Addgene사에서 구입, 각각 Xbal I/BamH I 이중 효소로 절단)와 NEBuilder 효소(NEB에서 구입)로 50℃에서 30분 동안 연결하고, 연결 산물이 형질전환된 후 성장한 단일 클론은 PCR 동정을 거쳐 양성 통합 플라스미드와 pK18mobsacB-PtsS 또는 PtsS^M162T 및 pK18mobsacB-PtsS^M162T를 획득하였다. 해당 플라스미드 상에는 카나마이신 내성 마커가 포함되며, 카나마이신을 통해 플라스미드가 게놈 상에 통합된 재조합체를 선별 획득할 수 있다.

PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM)4μL, Mg²⁺(25mM)4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL)0.25μL, 총 부피 50μL. 상기 PCR 증폭은 하기 방식과 같이 수행: 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신.

시퀀싱이 정확한 2개의 통합 플라스미드는 L-라이신 생산균 특허 균주 YP97158에 형질전환하고, 배양 생산된 단일 콜로니는 P13/P14 프라이머를 통해 PCR 동정을 수행하였으며, PCR에 의해 증폭된 1298bp 크기의 단편을 포함하는 것은 양성 균주이고, 단편이 증폭되지 않은 것은 원균이다. 양성 균주는 15% 수크로스가 포함된 배지에서 배양하고, 배양 생성된 단일 콜로니는 P15/P16 프라이머로 PCR 동정을 더 수행하였으며, 증폭된 크기가 1133bp인 균은 PtsS 또는 PtsS^M162T 유전자가 YP97158 게놈 상에 통합된 양성 균주이며, 이는 YPL-4-036(점 돌연변이 불포함) 및 YPL-4-037(점 돌연변이 포함)로 명명되었다.

P13: 5'TCCAAGGAAGATACACGCC 3'(SEQ ID NO:77)

P14: 5'GTGGAAAGATTGTGGTGGC 3'(SEQ ID NO:78)

P15: 5'CATCCAGACTTTGGCGATC 3'(SEQ ID NO:79)

P16: 5'CGTTGGAATCTTGCGTTG 3'(SEQ ID NO:80)

(4) 플라스미드 상에서 PtsS 또는 PtsS^M162T 유전자를 과발현하는 공학 균주 구축

NCBI에서 공개한 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 서열에 따라, 1쌍의 PtsS 또는 PtsS^M162T 유전자 암호화 영역 및 프로모터 영역 서열을 증폭하는 프라이머를 설계 및 합성하였으며, 프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 invitrogen사에서 합성).

P17: 5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCTGTCA AAGATG CGTAGAGTCAC 3'(SEQ ID NO:81)

P18: 5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACGTCTGTGGATCGTGGTGGTG3'(SEQ ID NO:82)

구축 방법: ATCC13032 및 YPL-4-035를 템플릿으로 사용하였고, 프라이머 P17/P18로 PCR 증폭을 수행하여, PtsS 또는 PtsS^M162T 유전자 및 이의 프로모터 단편 2354bp를 획득하고, 증폭된 산물을 전기영동하고 컬럼형 DNA 겔 회수 키트를 이용하여 정제하며, 회수된 DNA 단편은 EcoR I 효소 절단 회수된 셔틀 플라스미드 pXMJ19와 NEBuilder 효소(NEB사에서 구입)로 50℃에서 30분 동안 연결하고, 연결 산물이 형질전환된 후 성장한 단일 클론을 M13 프라이머로 PCR 동정을 거쳐 양성 과발현 플라스미드 pXMJ19-PtsS 및 pXMJ19-PtsS^M162T를 획득하였고, 해당 플라스미드를 시퀀싱을 위해 보냈다. 플라스미드 상에는 클로람페니콜 내성 마커가 포함되므로, 클로람페니콜을 통해 플라스미드가 균주에 형질전환되었는지 여부를 스크리닝할 수 있다.

PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM) 4μL, Mg²⁺(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL.

상기 PCR 증폭은 하기 방식과 같이 수행: 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신.

시퀀싱이 정확한 pXMJ19-PtsS 및 pXMJ19-PtsS^M162T 플라스미드를 L-라이신 생산균 특허 균주 YP97158로 전기형질전환하고, 배양 생성된 단일 콜로니를 프라이머 M13/P18로 PCR 동정을 수행하였으며, PCR에 의해 증폭된 크기가 2362bp인 단편을 포함하는 것은 양성 균주이고, 이는 YPL-4-038(점 돌연변이 불포함) 및 YPL-4-039(점 돌연변이 포함)으로 명명되었다.

(5) 게놈 상에서 PtsS 유전자가 결실된 공학 균주 구축

NCBI에서 공개한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 서열에 따르면, 2쌍의 PtsS 유전자 암호화 영역 양단 단편을 증폭하는 프라이머를 업다운스트림 상동성 아암 단편으로 합성하였다. 프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 invitrogen사 합성).

P19: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGCCGTTAT C AAT CAAGCGC3'(SEQ ID NO:83)

P20: 5'CGCCAAAGTCTGGATGATGGTGGAAAGATTGTGGTGGC 3'(SEQ ID NO:84)

P21: 5'GCCACCACAATCTTTCCACCATCATCCAGACTTTGGCGATCC 3'(SEQ ID NO:85)

P22: 5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCAGTA AA CGGTTCTGATGC3'(SEQ ID NO:86)

구축 방법: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 템플릿으로 사용하며, 각각 프라이머 P19와 P20, P21과 P22로 PCR 증폭을 수행하여, 업스트림 상동성 아암 단편 794bp 및 다운스트림 상동성 아암 단편 703bp를 획득하였다. 다시 프라이머 P19/P22으로 OVERLAP PCR을 수행하여 전체 상동성 아암 단편 1459bp를 획득하였다. 증폭된 산물을 전기영동하여 컬럼형 DNA 겔 회수 키트를 이용하여 정제하며, 회수된 DNA 단편을 이중 효소 절단 후 정제된 pK18mobsacB 플라스미드(Addgene사에서 구입, 각각 Xbal I/BamHI 이중 효소로 절단)와 NEBuilder 효소(NEB사에서 구입)로 50℃에서 30분 동안 연결하고, 연결 산물이 형질전환된 후 성장한 단일 클론을 M13 프라이머로 PCR 동정을 거쳐 양성 녹아웃 벡터 pK18-△PtsS를 획득하였으며, 해당 플라스미드는 시퀀싱을 위해 보냈다. 해당 플라스미드에는 카나마이신 내성 마커가 선별 마커로 포함된다.

PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM) 4μL, Mg²⁺(25mM) 4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL) 0.25μL, 총 부피 50μL. 상기 PCR 증폭은 하기 방식과 같이 수행: 94℃에서 5분 동안 사전 변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 90초 동안 연신(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과연신.

시퀀싱이 정확한 녹아웃 플라스미드 pK18-△PtsS를 라이신 생산 특허 균주 YP97158로 전기형질전환하고, 배양 생산된 단일 콜로니를 하기와 같은 프라이머(상하이 invitrogen에서 합성)를 통해 PCR 동정을 수행하였다.

P23: 5'TGTCAAAGATGCGTAGAGTCAC 3'(SEQ ID NO:87)

P24: 5'GGTTTCATTCGCTTTCCG 3'(SEQ ID NO:88)

상기 PCR에 의해 758bp 및 2249bp 크기의 밴드를 동시에 증폭한 균주는 양성 균주이고, 2249bp 크기의 밴드만 증폭한 균주는 원균이다. 양성 균주는 15% 수크로스 배지 상에서 스크리닝한 후 각각 카나마이신을 함유한 배지와 카나마이신을 함유하지 않은 배지에서 배양하였으며, 카나마이신을 함유하지 않은 배지 상에서 성장하나, 카나마이신을 함유한 배지 상에서 성장하지 않는 균주는 P23/P24 프라이머를 이용하여 PCR 동정을 더 수행하였고, 증폭된 크기가 758bp인 밴드의 균주는 PtsS 유전자 암호화 영역이 녹아웃된 양성 균주이다. 다시 P23/P24 프라이머로 양성 균주 PtsS 단편을 PCR 증폭하고, PMD19-T 벡터에 연결하여 시퀀싱을 수행하였으며, 시퀀싱이 정확한 균주는 YPL-4-040으로 명명하였다.

(6) L-라이신 발효 실험

실시예에서 구축한 균주 및 원래 균주 YP97158을 BLBIO-5GC-4-H 모델의 발효기(Shanghai bailun biological technology사에서 구입)에서 표 10에서 나타낸 배지 및 표 11에 나타낸 제어 공정으로 발효 실험을 수행하였다. 각 균주는 3회 반복하며, 결과는 표 12와 같다.

표 10 발효 배지 배합

표 11 발효 제어 공정

표 12 L-라이신 발효 실험 결과

결과는 표 12와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 PtsS 유전자 암호화 영역에 대한 점 돌연변이 PtsS^M162T 및 과발현은, L-라이신 생산량 및 형질전환율의 향상에 기여하는 반면, 유전자에 대한 약화 또는 녹아웃은, L-라이신의 축적에 도움이 되지 않았고, 동시에 형질전환율을 감소시켰다.

(7) 글루탐산 생산 균주에서 PtsS 유전자 과발현 도입, 또는 PtsS 유전자 암호화 영역에 대한 점 돌연변이 ptsS^M162T 및 과발현 수행, 및 발효 실험 수행

본 실시예 (1)~(5)의 방법에 따라, 동일한 프라이머 및 실험 조건을 사용하고, 코리네박테리움 ATCC13869를 출발균으로 하고, ATCC 13869의 균을 발현균으로 하여, 점 돌연변이의 ptsS^M162T를 포함하는 글루탐산 생산 공학 균주, 게놈 상에 ptsS 및 ptsS^M162T 유전자를 과발현하는 글루탐산 생산 공학 균주, 플라스미드 상에 ptsS 및 ptsS^M162T 유전자를 과발현하는 글루탐산 생산 공학 균주, 및 게놈 상에 ptsS 유전자를 결실시키는 글루탐산 생산 공학 균주를 획득하였다.

실시예에서 구축한 균주 및 원래 균주 ATCC 13869를 BLBIO-5GC-4-H 모델의 발효기(Shanghai bailun biological technology사에서 구입)에서 표 13에서 나타낸 배지 및 표 14에 나타낸 제어 공정으로 발효 실험을 수행하였다. 각 균주는 3회 반복하며, 결과는 표 15와 같다.

표 13 발효 배지 배합

표 14 발효 제어 공정

표 15 L-글루탐산 발효 실험 결과

결과는 표 15와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 PtsS 유전자 암호화 영역에 대한 점 돌연변이 PtsS^M162T 및/또는 과발현은, L-글루탐산 생산량 및 형질전환율의 향상에 기여하는 반면, 유전자에 대한 약화 또는 녹아웃은, L-글루탐산의 축적에 도움이 되지 않았고, 동시에 형질전환율을 감소시켰다.

상기에서는 본 발명의 실시방식에 대해 설명하였다. 그러나 본 발명은 상술한 실시방식에 한정되지 않는다. 본 발명의 사상과 원칙 내에서 수행된 모든 수정, 동등한 치환, 개선 등은 모두 본 발명의 보호 범위 내에 속한다.

중국미생물균종기탁관리위원회 일반미생물센터 CGMCC12856 20160816

SEQUENCE LISTING <110> NINGXIA EPPEN BIOTECH CO., LTD. <120> Recombinant strain for producing L-amino acid and construction method and use thereof <130> CPWO20411700 <160> 88 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 654 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 atgagcatct ggaaacgtct gttagtgcag tacccgcgct tcgccgacac cctcacagcc 60 ggccaaccca tcacgctcga ggaattagca accccggaag tgatcttgga agctgttgcc 120 aaaggccaag aaattttcgg cattgagcag ccaaaacatg cagcacaact ctggtttcac 180 tccctgtgca ccgcaattgt cggccccgcc gtcaccgcca tggtggaatt cgatgtcatc 240 cccagcctcg acatacgtcg aggtcagctg cataacatcg acggttactg gttcggcttc 300 aggccggagg agatgcttgt cgacgcctcc ctccacctgt cgggcaccca attcggcgag 360 agtatccgcg tggtgattga tgcattatgc gctgccacgg atctgcgacc ggcacccctg 420 tgggcggttg cctcagatgc gttgggaatc gcagctagcg gcgcaggtgt cgaggccttt 480 gaagaagaac atgcccgcga ggtggcggaa gccctcattg aaggaatgaa tagtgtgaac 540 tcagttccat cgccgcggtt taacgacgac gattatttca ttcgagctgg atgctgcatg 600 attttccact caccacgagc 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ccatctgagc catc 34 <210> 39 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 39 gatggctcag atggacgtga ttatattgaa aagc 34 <210> 40 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 40 cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccct cccaaataat tgccgc 56 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 41 gaatggaata ggagaattgc g 21 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 42 caccaggcgt ggaaagag 18 <210> 43 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 43 cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagaatg cgttctggac tgagg 55 <210> 44 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 44 cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagaatg cgttctggac tgagg 55 <210> 45 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 45 catctgttct cggtgcacat gtagtggggt 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<220> <223> Artificial Sequence <400> 53 gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccatgt agtggggtat ggatgg 56 <210> 54 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 54 atcaggctga aaatcttctc tcatccgcca aaacgtgagg tttccggctc ag 52 <210> 55 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 55 cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggtat ctggagagaa gaaggagc 58 <210> 56 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 56 gccttgttaa tatcttcccg aatacatgcc gcaattctcc tattc 45 <210> 57 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 57 gagaattgcg gcatgtattc gggaagatat taacaaggc 39 <210> 58 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 58 cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtaccccc gcagattact aaggctg 57 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 59 gtatctggag agaagaagga gc 22 <210> 60 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 60 ccgcagatta ctaaggctg 19 <210> 61 <211> 1986 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 61 atggaccata aggacctcgc gcaacgcatc ctgcgcgaca ttggcggcga agacaacatt 60 gtcgccgccg cacactgtgc aacgcgttta cgcctcgtgc tcaaagacac caaggatgtg 120 gatcgccaaa gtctggatga tgatccagat ctgaaaggca cgtttgaaac gggtggtatg 180 ttccagatca tcgtcgggcc aggcgatgtg gatcatgttt tcaaagaact cgatgacgca 240 acctccaaag acatcgctgt gtccacagag cagctcaaag atgttgtggc taacaacgcc 300 aactggttca gccgtgctgt gaaggtattg gcggacattt tcgtcccgct gattccaatc 360 ttggttggtg gcggtctgct catggctatc aacaatgtgt tggttgcgca ggatctgttc 420 ggtccgcaat cactggtgga gatgttccct cagatcagcg gtgttgctga gatgatcaac 480 ctcatggcat ctgcgccgtt cgcgttcttg ccagtgttgg ttggtttcac cgcaaccaag 540 cgtttcggcg gcaatgagtt cctgggcgcc ggtattggta tggcgatggt gttcccgagc 600 ttggtgaacg gctacgacgt ggccgccacc atggctgcgg gcgaaatgcc aatgtggtcc 660 ctgtttggtt tagatgttgc ccaagccggt taccagggca ccgtgcttcc tgtgctggtg 720 gtttcttgga ttctggcaac gatcgagaag ttcctgcaca agcgactcaa gggcactgca 780 gacttcctga tcactccagt gctgacgttg ctgctcaccg gattccttac attcatcgcc 840 attggcccag caatgcgctg ggtgggcgat gtgctggcac acggtctaca gggactttat 900 gatttcggtg gtccagtcgg cggtctgctc ttcggtctgg tctactcacc aatcgtcatc 960 actggtctgc accagtcctt cccgccaatt gagctggagc tgtttaacca gggtggatcc 1020 ttcatcttcg caacggcatc tatggctaat atcgcccagg gtgcggcatg tttggcagtg 1080 ttcttcctgg cgaagagtga aaagctcaag ggccttgcag gtgcttcagg tgtctccgct 1140 gttcttggta ttacggagcc tgcgatcttc ggtgtgaacc ttcgcctgcg ctggccgttc 1200 ttcatcggta tcggtaccgc agctatcggt ggcgctttga ttgcactctt taatatcaag 1260 gcagttgcgt tgggcgctgc aggtttcttg ggtgttgttt ctattgatgc tccagatatg 1320 gtcatgttct tggtgtgtgc agttgttacc ttcttcatcg cattcggcgc agcgattgct 1380 tatggccttt acttggttcg ccgcaacggc agcattgatc cagatgcaac cgctgctcca 1440 gtgcctgcag gaacgaccaa agccgaagca gaagcacccg cagaattttc aaacgattcc 1500 accatcatcc aggcaccttt gaccggtgaa gctattgcac tgagcagcgt cagcgatgcc 1560 atgtttgcca gcggaaagct tggctcgggc gttgccatcg tcccaaccaa ggggcagtta 1620 gtttctccgg tgagtggaaa gattgtggtg gcattcccat ctggccatgc tttcgcagtt 1680 cgcaccaagg ctgaggatgg ttccaatgtg gatatcttga tgcacattgg tttcgacaca 1740 gtaaacctca acggcacgca ctttaacccg ctgaagaagc agggcgatga agtcaaagca 1800 ggggagctgc tgtgtgaatt cgatattgat gccattaagg ctgcaggtta tgaggtaacc 1860 acgccgattg ttgtttcgaa ttacaagaaa accggacctg taaacactta cggtttgggc 1920 gaaattgaag cgggagccaa cctgctcaac gtcgcaaaga aagaagcggt gccagcaaca 1980 ccataa 1986 <210> 62 <211> 1986 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 62 atggaccata aggacctcgc gcaacgcatc ctgcgcgaca ttggcggcga agacaacatt 60 gtcgccgccg cacactgtgc aacgcgttta cgcctcgtgc tcaaagacac caaggatgtg 120 gatcgccaaa gtctggatga tgatccagat ctgaaaggca cgtttgaaac gggtggtatg 180 ttccagatca tcgtcgggcc aggcgatgtg gatcatgttt tcaaagaact cgatgacgca 240 acctccaaag acatcgctgt gtccacagag cagctcaaag atgttgtggc taacaacgcc 300 aactggttca gccgtgctgt gaaggtattg gcggacattt tcgtcccgct gattccaatc 360 ttggttggtg gcggtctgct catggctatc aacaatgtgt tggttgcgca ggatctgttc 420 ggtccgcaat cactggtgga gatgttccct cagatcagcg gtgttgctga gatgatcaac 480 ctcacggcat ctgcgccgtt cgcgttcttg ccagtgttgg ttggtttcac cgcaaccaag 540 cgtttcggcg gcaatgagtt cctgggcgcc ggtattggta tggcgatggt gttcccgagc 600 ttggtgaacg gctacgacgt ggccgccacc atggctgcgg gcgaaatgcc aatgtggtcc 660 ctgtttggtt tagatgttgc ccaagccggt taccagggca ccgtgcttcc tgtgctggtg 720 gtttcttgga ttctggcaac gatcgagaag ttcctgcaca agcgactcaa gggcactgca 780 gacttcctga tcactccagt gctgacgttg ctgctcaccg gattccttac attcatcgcc 840 attggcccag caatgcgctg ggtgggcgat gtgctggcac acggtctaca gggactttat 900 gatttcggtg gtccagtcgg cggtctgctc ttcggtctgg tctactcacc aatcgtcatc 960 actggtctgc accagtcctt cccgccaatt gagctggagc tgtttaacca gggtggatcc 1020 ttcatcttcg caacggcatc tatggctaat atcgcccagg gtgcggcatg tttggcagtg 1080 ttcttcctgg cgaagagtga aaagctcaag ggccttgcag gtgcttcagg tgtctccgct 1140 gttcttggta ttacggagcc tgcgatcttc ggtgtgaacc ttcgcctgcg ctggccgttc 1200 ttcatcggta tcggtaccgc agctatcggt ggcgctttga ttgcactctt taatatcaag 1260 gcagttgcgt tgggcgctgc aggtttcttg ggtgttgttt ctattgatgc tccagatatg 1320 gtcatgttct tggtgtgtgc agttgttacc ttcttcatcg cattcggcgc agcgattgct 1380 tatggccttt acttggttcg ccgcaacggc agcattgatc cagatgcaac cgctgctcca 1440 gtgcctgcag gaacgaccaa agccgaagca gaagcacccg cagaattttc aaacgattcc 1500 accatcatcc aggcaccttt gaccggtgaa gctattgcac tgagcagcgt cagcgatgcc 1560 atgtttgcca gcggaaagct tggctcgggc gttgccatcg tcccaaccaa ggggcagtta 1620 gtttctccgg tgagtggaaa gattgtggtg gcattcccat ctggccatgc tttcgcagtt 1680 cgcaccaagg ctgaggatgg ttccaatgtg gatatcttga tgcacattgg tttcgacaca 1740 gtaaacctca acggcacgca ctttaacccg ctgaagaagc agggcgatga agtcaaagca 1800 ggggagctgc tgtgtgaatt cgatattgat gccattaagg ctgcaggtta tgaggtaacc 1860 acgccgattg ttgtttcgaa ttacaagaaa accggacctg taaacactta cggtttgggc 1920 gaaattgaag cgggagccaa cctgctcaac gtcgcaaaga aagaagcggt gccagcaaca 1980 ccataa 1986 <210> 63 <211> 661 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 63 Met Asp His Lys Asp Leu Ala Gln Arg Ile Leu Arg Asp Ile Gly Gly 1 5 10 15 Glu Asp Asn Ile Val Ala Ala Ala His Cys Ala Thr Arg Leu Arg Leu 20 25 30 Val Leu Lys Asp Thr Lys Asp Val Asp Arg Gln Ser Leu Asp Asp Asp 35 40 45 Pro Asp Leu Lys Gly Thr Phe Glu Thr Gly Gly Met Phe Gln Ile Ile 50 55 60 Val Gly Pro Gly Asp Val Asp His Val Phe Lys Glu Leu Asp Asp Ala 65 70 75 80 Thr Ser Lys Asp Ile Ala Val Ser Thr Glu Gln Leu Lys Asp Val Val 85 90 95 Ala Asn Asn Ala Asn Trp Phe Ser Arg Ala Val Lys Val Leu Ala Asp 100 105 110 Ile Phe Val Pro Leu Ile Pro Ile Leu Val Gly Gly Gly Leu Leu Met 115 120 125 Ala Ile Asn Asn Val Leu Val Ala Gln Asp Leu Phe Gly Pro Gln Ser 130 135 140 Leu Val Glu Met Phe Pro Gln Ile Ser Gly Val Ala Glu Met Ile Asn 145 150 155 160 Leu Met Ala Ser Ala Pro Phe Ala Phe Leu Pro Val Leu Val Gly Phe 165 170 175 Thr Ala Thr Lys Arg Phe Gly Gly Asn Glu Phe Leu Gly Ala Gly Ile 180 185 190 Gly Met Ala Met Val Phe Pro Ser Leu Val Asn Gly Tyr Asp Val Ala 195 200 205 Ala Thr Met Ala Ala Gly Glu Met Pro Met Trp Ser Leu Phe Gly Leu 210 215 220 Asp Val Ala Gln Ala Gly Tyr Gln Gly Thr Val Leu Pro Val Leu Val 225 230 235 240 Val Ser Trp Ile Leu Ala Thr Ile Glu Lys Phe Leu His Lys Arg Leu 245 250 255 Lys Gly Thr Ala Asp Phe Leu Ile Thr Pro Val Leu Thr Leu Leu Leu 260 265 270 Thr Gly Phe Leu Thr Phe Ile Ala Ile Gly Pro Ala Met Arg Trp Val 275 280 285 Gly Asp Val Leu Ala His Gly Leu Gln Gly Leu Tyr Asp Phe Gly Gly 290 295 300 Pro Val Gly Gly Leu Leu Phe Gly Leu Val Tyr Ser Pro Ile Val Ile 305 310 315 320 Thr Gly Leu His Gln Ser Phe Pro Pro Ile Glu Leu Glu Leu Phe Asn 325 330 335 Gln Gly Gly Ser Phe Ile Phe Ala Thr Ala Ser Met Ala Asn Ile Ala 340 345 350 Gln Gly Ala Ala Cys Leu Ala Val Phe Phe Leu Ala Lys Ser Glu Lys 355 360 365 Leu Lys Gly Leu Ala Gly Ala Ser Gly Val Ser Ala Val Leu Gly Ile 370 375 380 Thr Glu Pro Ala Ile Phe Gly Val Asn Leu Arg Leu Arg Trp Pro Phe 385 390 395 400 Phe Ile Gly Ile Gly Thr Ala Ala Ile Gly Gly Ala Leu Ile Ala Leu 405 410 415 Phe Asn Ile Lys Ala Val Ala Leu Gly Ala Ala Gly Phe Leu Gly Val 420 425 430 Val Ser Ile Asp Ala Pro Asp Met Val Met Phe Leu Val Cys Ala Val 435 440 445 Val Thr Phe Phe Ile Ala Phe Gly Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Tyr 450 455 460 Leu Val Arg Arg Asn Gly Ser Ile Asp Pro Asp Ala Thr Ala Ala Pro 465 470 475 480 Val Pro Ala Gly Thr Thr Lys Ala Glu Ala Glu Ala Pro Ala Glu Phe 485 490 495 Ser Asn Asp Ser Thr Ile Ile Gln Ala Pro Leu Thr Gly Glu Ala Ile 500 505 510 Ala Leu Ser Ser Val Ser Asp Ala Met Phe Ala Ser Gly Lys Leu Gly 515 520 525 Ser Gly Val Ala Ile Val Pro Thr Lys Gly Gln Leu Val Ser Pro Val 530 535 540 Ser Gly Lys Ile Val Val Ala Phe Pro Ser Gly His Ala Phe Ala Val 545 550 555 560 Arg Thr Lys Ala Glu Asp Gly Ser Asn Val Asp Ile Leu Met His Ile 565 570 575 Gly Phe Asp Thr Val Asn Leu Asn Gly Thr His Phe Asn Pro Leu Lys 580 585 590 Lys Gln Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Glu Leu Leu Cys Glu Phe Asp 595 600 605 Ile Asp Ala Ile Lys Ala Ala Gly Tyr Glu Val Thr Thr Pro Ile Val 610 615 620 Val Ser Asn Tyr Lys Lys Thr Gly Pro Val Asn Thr Tyr Gly Leu Gly 625 630 635 640 Glu Ile Glu Ala Gly Ala Asn Leu Leu Asn Val Ala Lys Lys Glu Ala 645 650 655 Val Pro Ala Thr Pro 660 <210> 64 <211> 661 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 64 Met Asp His Lys Asp Leu Ala Gln Arg Ile Leu Arg Asp Ile Gly Gly 1 5 10 15 Glu Asp Asn Ile Val Ala Ala Ala His Cys Ala Thr Arg Leu Arg Leu 20 25 30 Val Leu Lys Asp Thr Lys Asp Val Asp Arg Gln Ser Leu Asp Asp Asp 35 40 45 Pro Asp Leu Lys Gly Thr Phe Glu Thr Gly Gly Met Phe Gln Ile Ile 50 55 60 Val Gly Pro Gly Asp Val Asp His Val Phe Lys Glu Leu Asp Asp Ala 65 70 75 80 Thr Ser Lys Asp Ile Ala Val Ser Thr Glu Gln Leu Lys Asp Val Val 85 90 95 Ala Asn Asn Ala Asn Trp Phe Ser Arg Ala Val Lys Val Leu Ala Asp 100 105 110 Ile Phe Val Pro Leu Ile Pro Ile Leu Val Gly Gly Gly Leu Leu Met 115 120 125 Ala Ile Asn Asn Val Leu Val Ala Gln Asp Leu Phe Gly Pro Gln Ser 130 135 140 Leu Val Glu Met Phe Pro Gln Ile Ser Gly Val Ala Glu Met Ile Asn 145 150 155 160 Leu Thr Ala Ser Ala Pro Phe Ala Phe Leu Pro Val Leu Val Gly Phe 165 170 175 Thr Ala Thr Lys Arg Phe Gly Gly Asn Glu Phe Leu Gly Ala Gly Ile 180 185 190 Gly Met Ala Met Val Phe Pro Ser Leu Val Asn Gly Tyr Asp Val Ala 195 200 205 Ala Thr Met Ala Ala Gly Glu Met Pro Met Trp Ser Leu Phe Gly Leu 210 215 220 Asp Val Ala Gln Ala Gly Tyr Gln Gly Thr Val Leu Pro Val Leu Val 225 230 235 240 Val Ser Trp Ile Leu Ala Thr Ile Glu Lys Phe Leu His Lys Arg Leu 245 250 255 Lys Gly Thr Ala Asp Phe Leu Ile Thr Pro Val Leu Thr Leu Leu Leu 260 265 270 Thr Gly Phe Leu Thr Phe Ile Ala Ile Gly Pro Ala Met Arg Trp Val 275 280 285 Gly Asp Val Leu Ala His Gly Leu Gln Gly Leu Tyr Asp Phe Gly Gly 290 295 300 Pro Val Gly Gly Leu Leu Phe Gly Leu Val Tyr Ser Pro Ile Val Ile 305 310 315 320 Thr Gly Leu His Gln Ser Phe Pro Pro Ile Glu Leu Glu Leu Phe Asn 325 330 335 Gln Gly Gly Ser Phe Ile Phe Ala Thr Ala Ser Met Ala Asn Ile Ala 340 345 350 Gln Gly Ala Ala Cys Leu Ala Val Phe Phe Leu Ala Lys Ser Glu Lys 355 360 365 Leu Lys Gly Leu Ala Gly Ala Ser Gly Val Ser Ala Val Leu Gly Ile 370 375 380 Thr Glu Pro Ala Ile Phe Gly Val Asn Leu Arg Leu Arg Trp Pro Phe 385 390 395 400 Phe Ile Gly Ile Gly Thr Ala Ala Ile Gly Gly Ala Leu Ile Ala Leu 405 410 415 Phe Asn Ile Lys Ala Val Ala Leu Gly Ala Ala Gly Phe Leu Gly Val 420 425 430 Val Ser Ile Asp Ala Pro Asp Met Val Met Phe Leu Val Cys Ala Val 435 440 445 Val Thr Phe Phe Ile Ala Phe Gly Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Tyr 450 455 460 Leu Val Arg Arg Asn Gly Ser Ile Asp Pro Asp Ala Thr Ala Ala Pro 465 470 475 480 Val Pro Ala Gly Thr Thr Lys Ala Glu Ala Glu Ala Pro Ala Glu Phe 485 490 495 Ser Asn Asp Ser Thr Ile Ile Gln Ala Pro Leu Thr Gly Glu Ala Ile 500 505 510 Ala Leu Ser Ser Val Ser Asp Ala Met Phe Ala Ser Gly Lys Leu Gly 515 520 525 Ser Gly Val Ala Ile Val Pro Thr Lys Gly Gln Leu Val Ser Pro Val 530 535 540 Ser Gly Lys Ile Val Val Ala Phe Pro Ser Gly His Ala Phe Ala Val 545 550 555 560 Arg Thr Lys Ala Glu Asp Gly Ser Asn Val Asp Ile Leu Met His Ile 565 570 575 Gly Phe Asp Thr Val Asn Leu Asn Gly Thr His Phe Asn Pro Leu Lys 580 585 590 Lys Gln Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Glu Leu Leu Cys Glu Phe Asp 595 600 605 Ile Asp Ala Ile Lys Ala Ala Gly Tyr Glu Val Thr Thr Pro Ile Val 610 615 620 Val Ser Asn Tyr Lys Lys Thr Gly Pro Val Asn Thr Tyr Gly Leu Gly 625 630 635 640 Glu Ile Glu Ala Gly Ala Asn Leu Leu Asn Val Ala Lys Lys Glu Ala 645 650 655 Val Pro Ala Thr Pro 660 <210> 65 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 65 cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggaca cctgaagcac ctgc 54 <210> 66 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 66 gagatgatca acctcacggc atctgcgc 28 <210> 67 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 67 gcgcagatgc cgtgaggttg atcatctc 28 <210> 68 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 68 cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccga tggacaggtt tcattcgc 58 <210> 69 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 69 ccacattggc atttcgcc 18 <210> 70 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 70 cgctgattcc aatcttgg 18 <210> 71 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 71 cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagaatg cgttctggac tgagg 55 <210> 72 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 72 gtgactctac gcatctttga cagtgcaccg agaacagatg 40 <210> 73 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 73 catctgttct cggtgcactg tcaaagatgc gtagagtcac 40 <210> 74 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 74 cttgatttaa ttgcgccatc tgattctggg tctgtggatc gtggtggtg 49 <210> 75 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 75 caccaccacg atccacagac ccagaatcag atggcgcaat taaatcaag 49 <210> 76 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 76 cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccgc tatgacacct tcaacggatc 60 <210> 77 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 77 tccaaggaag atacacgcc 19 <210> 78 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 78 gtggaaagat tgtggtggc 19 <210> 79 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 79 catccagact ttggcgatc 19 <210> 80 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 80 cgttggaatc ttgcgttg 18 <210> 81 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 81 gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atcccctgtc aaagatgcgt agagtcac 58 <210> 82 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 82 atcaggctga aaatcttctc tcatccgcca aaacgtctgt ggatcgtggt ggtg 54 <210> 83 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 83 cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggccg ttatcaatca agcgc 55 <210> 84 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 84 cgccaaagtc tggatgatgg tggaaagatt gtggtggc 38 <210> 85 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 85 gccaccacaa tctttccacc atcatccaga ctttggcgat cc 42 <210> 86 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 86 cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccgc agtaaacggt tctgatgc 58 <210> 87 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 87 tgtcaaagat gcgtagagtc ac 22 <210> 88 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 88 ggtttcattc gctttccg 18

Claims (10)

1. L-아미노산을 생산하는 미생물 또는 박테리아에 있어서,
   SEQ ID NO:3 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 개선된 발현, 및/또는 SEQ ID NO:35 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 개선된 발현, 및/또는 SEQ ID NO:63 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 개선된 발현을 갖고;
   바람직하게는, 상기 개선된 발현은 상기 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 강화된 것이거나, 상기 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 점 돌연변이를 갖는 것이거나, 상기 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 점 돌연변이를 갖고 발현이 강화된 것인 것을 특징으로 하는 미생물 또는 박테리아.
2. 제1항에 있어서,
   SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 점 돌연변이는, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 170번째 글루탐산이 상이한 아미노산에 의해 치환되도록 만들고; 바람직하게는 170번째 글루탐산이 라이신에 의해 치환되고;
   SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 점 돌연변이는, SEQ ID NO:35의 아미노산 서열의 31번째 류신이 상이한 아미노산에 의해 치환되도록 만들고; 바람직하게는 31번째 류신이 아르기닌에 의해 치환되고;
   SEQ ID NO:63의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 점 돌연변이는, SEQ ID NO:63의 아미노산 서열의 162번째 메티오닌이 상이한 아미노산에 의해 치환되도록 만들고; 바람직하게는 162번째 메티오닌이 트레오닌에 의해 치환되는 것을 특징으로 하는 미생물 또는 박테리아.
3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
   SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:33의 뉴클레오티드 서열을 포함하고; SEQ ID NO:63의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:61의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 또는 박테리아.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열의 508번째 염기에서 돌연변이가 발생하여 형성된 것이고; 바람직하게는, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 508번째 염기가 구아닌(G)에서 아데닌(A)으로 돌연변이된 것을 포함하고; 바람직하게는, 상기 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고;
   상기 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:33으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 92번째 염기에 돌연변이가 발생하여 형성된 것이고; 바람직하게는, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:33으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 92번째 염기가 티민(T)에서 구아닌(G)으로 돌연변이되고; 바람직하게는, 상기 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:34로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고;
   상기 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:61로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 485번째 염기에 돌연변이가 발생하여 형성된 것이고; 바람직하게는, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:61로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 485번째 염기가 티민(T)에서 사이토신(C)으로 돌연변이되고; 바람직하게는, 상기 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:62로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 또는 박테리아.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰이고, 바람직하게는 YP97158 또는 ATCC 13869인 것을 특징으로 하는 미생물 또는 박테리아.
6. 폴리뉴클레오티드 서열에 있어서,
   SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기에서 170번째 글루탐산이 상이한 아미노산에 의해 치환되고; 바람직하게는 170번째 글루탐산이 라이신에 의해 치환되고; 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:4로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 508번째 염기에 돌연변이가 발생하여 형성된 것이고; 바람직하게는 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 508번째 염기가 구아닌(G)에서 아데닌(A)으로 돌연변이된 것이고; 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고;
   및/또는,
   SEQ ID NO:35로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기에서 31번째 류신이 상이한 아미노산에 의해 치환되고; 바람직하게는 31번째 류신이 아르기닌에 의해 치환되고; 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:33으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 92번째 염기에서 돌연변이가 발생하여 형성된 것이고; 바람직하게는 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:33으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 92번째 염기가 티민(T)에서 구아닌(G)으로 돌연변이된 것이고; 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:34로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고;
   및/또는,
   SEQ ID NO:63로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 162번째 메티오닌이 상이한 아미노산에 의해 치환되고; 162번째 메티오닌이 트레오닌에 의해 치환되고; 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:64로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:61로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 485번째 염기에서 돌연변이가 발생하여 형성된 것이고; 바람직하게는, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:61로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 485번째 염기가 티민(T)에서 사이토신(C)으로 돌연변이된 것이고; 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:62로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 또는 박테리아.
7. SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:36 또는 SEQ ID NO:64로 표시되는 것을 특징으로 하는 아미노산 서열.
8. 제6항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
9. 제6항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
10. L-아미노산을 생산하는 방법에 있어서,
    상기 방법은 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 미생물 또는 박테리아 또는 제9항에 따른 재조합 균주를 배양하고, 상기 배양물로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하고; 바람직하게는 상기 L-아미노산은 L-글루탐산 또는 L-라이신인 방법.