KR20230042224A - L-아미노산을 생산하는 재조합 균주 및 이의 구축 방법과 응용 - Google Patents

L-아미노산을 생산하는 재조합 균주 및 이의 구축 방법과 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 L-아미노산을 생성하는 박테리아를 제공하며, 상기 박테리아는 SEQ ID NO:3로 표시되는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 개선되고. SEQ ID NO:31로 표시되는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 개선되고/되거나, SEQ ID NO:57로 표시되는 프로모터 영역 -45bp번째 부위 및 -47bp번째 부위 염기가 돌연변이된다. 또한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터, 재조합 균주, 및 L-아미노산 생산 방법을 더 제공하며, 여기에서 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:3로 표시되는 단백질을 코딩하고 그 334번째 부위 아르기닌이 터미네이터에 의해 치환되거나, SEQ ID NO:31로 표시되는 단백질을 코딩하고 그 592번째 부위 티로신은 페닐알라닌에 의해 치환되거나, SEQ ID NO:57로 표시되는 프로모터 영역 -45bp번째 부위 및 -47bp번째 부위 염기가 돌연변이된다.

Description

L-아미노산을 생산하는 재조합 균주 및 이의 구축 방법과 응용
본 출원은 2020년 10월 15일 중국 국가지식재산권에 출원되고 출원번호가 202011105063.5이고, 발명의 명칭이 "L-아미노산을 생산하는 재조합 균주 및 이의 구축 방법과 응용"인 선행 출원, 2020년 8월 7일 중국 국가지식재산권에 출원되고 출원번호가 202010790887.4이고, 발명의 명칭이 "L-라이신을 생산하는 재조합 균주 및 이의 구축 방법과 응용"인 선행 출원, 2020년 6월 8일 중국 국가지식재산권에 출원되고 출원번호가 202010514037.1이고, 발명의 명칭이 "lysC 유전자가 변형된 재조합 균주 및 이의 구축 방법과 응용"인 선행 출원에 대한 우선권을 주장한다. 상기 세 가지 선행 출원은 전체로서 본 출원에 인용되었다.
본 발명은 유전 공학 및 미생물 기술 분야에 속하며, 보다 상세하게는 L-아미노산을 생산하는 재조합 균주 및 이의 구축 방법과 응용에 관한 것이다.
L-라이신(L-Lysine)은 의약, 식품, 사료 등 다양한 측면에서 적용 범위가 광범위하며, 그 중 사료 첨가제에 사용되는 L-라이신이 전체의 90% 이상을 차지한다. 현재 중국은 L-라이신의 두 번째로 큰 소비 시장이자 L-라이신의 최대 생산국이다.
현재 L-라이신은 주로 직접 발효법으로 생산되고 있으며 직접발효법은 L-라이신 생합성 경로가 완전한 균주를 사용하며, 폐당밀, 전분 가수분해물 등을 기질로 하여 호기성 발효를 통해 생산한다. 해당 방법은 오늘날 전 세계 L-라이신 생산량의 2/3를 차지하고 있으며 공정이 매우 성숙하여 주로 효모, 박테리아, 곰팡이에 존재하며 미생물에 광범위하게 존재한다. 현재, 산업계에서 L-라이신 발효에 사용되는 생산 균종은 주로 코리네박테리움과 브레비박테리움속의 돌연변이 육종 돌연변이 균주이다. 대사 공학과 유전 공학의 발달로 유전자 변이를 제어할 수 있게 됨에 따라, 대사 공학을 이용하여 출발 균주를 형질전환하는 과정에서, 대사 과정 중 L-라이신 생산의 핵심 효소 유전자를 정확히 찾아낸 후, 주요 효소 유전자의 발현을 증가시키고 L-라이신 생산의 개선을 구현할 수 있다.
L-글루탐산은 주로 글루타민산나트륨, 향료, 소금 대체물, 영양 보충제 및 생화학 시약의 생산에 사용된다. L-글루탐산 자체가 약으로 사용될 수 있으며, 뇌에서 단백질과 당의 대사에 참여하고 산화 과정을 촉진한다. 해당 제품은 체내에서 암모니아와 결합하여 무독성 글루타민을 형성하여 혈중 암모니아를 감소시키고 간성 혼수 증상을 완화한다. 과거에는 글루타민산나트륨의 생산이 주로 밀 글루텐(글루텐 단백질)의 가수분해에 의해 이루어졌으나 현재는 미생물 발효에 의한 대규모 생산에 이용되고 있다.
본 발명의 목적은 L-아미노산 생산능을 갖는 신규 균주를 개발하여 L-아미노산을 효율적으로 생산하는 방법을 제공하는 데에 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 연구를 통해 종래 기술에서 발효성 아미노산 생산능이 알려지지 않은 NCgl0609 유전자 및/또는 NCgl1575 유전자를 변형하거나 그 발현을 개선함으로써 고효율의 L-아미노산 생산능을 가질 수 있음을 발견하였다. 또한 본 발명자들은 특정 프로모터 서열을 돌연변이시켜도 해당 미생물의 L-아미노산 생산능을 향상시킬 수 있음을 발견하였다. 이러한 발견에 기초하여, 본 발명이 완성되었다.
본 발명은 L-아미노산을 생성하는 박테리아를 제공한다. 여기에서 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 개선되고/되거나. SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 개선되고/되거나, SEQ ID NO:57로 표시되는 프로모터 영역 -45bp번째 부위 및 -47bp번째 부위 염기가 돌연변이된다. 본 발명은 상기 미생물을 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법을 더 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 발현 개선은 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 향상되거나, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 점 돌연변이를 갖거나, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 점 돌연변이를 가지며 발현이 향상된 것이다.
본 발명의 제1 양상은 L-아미노산을 생성하는 박테리아를 제공한다. 여기에서 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 개선된다. 바람직하게는 상기 L-아미노산은 L-라이신 또는 L-글루탐산이다.
상기 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열은 유전자 NCgl0609 코딩의 단백질이다.
상기 박테리아는 향상된 L-아미노산 생산능을 갖는다.
L-아미노산 생산능을 갖는 박테리아는 배지에서 바람직하게는 0.5g/L 이상, 보다 바람직하게는 1.0g/L 이상의 양으로 목표 L-아미노산을 축적할 수 있는 박테리아일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열과 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코딩할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시방식에 있어서, 상기 발현이 개선된 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 발현 개선은 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 점 돌연변이를 가져, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 334번째 아르기닌이 터미네이터로 치환되는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열은 334번째 부위 아르기닌이 터미네이터에 의해 치환된 후 아미노산 서열이 SEQ ID NO:4로 표시된다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 점 돌연변이가 있는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 1000번째 부위 염기에 돌연변이가 발생하여 형성된 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 1000번째 부위 염기가 사이토신(C)에서 타이민(T)으로 돌연변이된 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 점 돌연변이가 있는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 L-아미노산을 생성하는 박테리아를 더 제공한다. 이는 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 개선된다. 바람직하게는 상기 L-아미노산은 L-라이신이다. 바람직하게는 상기 박테리아는 코리네박테리움속에 속하는 박테리아이다.
상기 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열은 유전자 NCgl1575 코딩의 단백질이다.
상기 미생물은 야생형 또는 모균주에 비해 향상된 L-라이신 생산능을 갖는다.
상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열과 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코딩할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시방식에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:29의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 점 돌연변이를 가져, SEQ ID NO:31의 아미노산 서열의 592번째 티로신이 상이한 아미노산에 의해 치환된다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 592번째 부위 티로신은 페닐알라닌에 의해 치환된다.
본 발명에 있어서, SEQ ID NO:31로 표시되는 아미노산 서열은 592번째 부위 티로신(Y)이 페닐알라닌(F)에 의해 치환된 후 아미노산 서열이 SEQ ID NO:32로 표시된다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 점 돌연변이가 있는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:29로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 1775번째 부위 염기에 돌연변이가 발생하여 형성된 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:29로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 1775번째 부위 염기가 아데닌(A)에서 타이민(T)으로 돌연변이된 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 점 돌연변이가 있는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:30으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 박테리아는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 페키넨스(Corynebacterium pekinense)와 같은 코리네박테리움속에 속하는 미생물일 수 있다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 코리네박테리움속에 속하는 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 YP97158, 기탁번호: CGMCC No.12856, 기탁 일자: 2016년 8월 16일, 기탁 단위: 중국미생물균종기탁관리위원회 일반미생물센터, 베이징 차오양구 베이천서로 1호원 3호(
Figure pct00001
), 전화: 010-64807355이며, 중국 특허 출원 CN106367432A(출원일 2016년 9월 1일, 공개일 2017년 2월 1일)에 기록되었다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 코리네박테리움속에 속하는 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869이다.
폴리뉴클레오티드의 발현은 발현 조절 서열을 치환하거나 돌연변이시키고, 폴리뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입하고, 염색체 삽입 또는 벡터 도입을 거친 폴리뉴클레오티드 카피 수의 증가, 또는 이들의 조합 등의 수단을 통해 향상될 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 발현 조절 서열은 변형될 수 있다. 발현 조절 서열은 이들이 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하고, 예를 들어 프로모터, 터미네이터, 인핸서, 사일런서 등을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 시작 코돈에 변화가 있을 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 카피 수를 증가시키기 위해 염색체의 특정 부위에 혼입될 수 있다. 본원에서 특정한 부위는 예를 들어 트랜스포존 부위 또는 유전자간 부위를 포함할 수 있다. 또한 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 혼입할 수 있으며, 상기 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하여 카피 수를 증가시킨다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 폴리뉴클레오티드 또는 점 돌연변이가 있는 폴리뉴클레오티드를 미생물 염색체의 특정 부위에 혼입함으로써 카피 수를 증가시킨다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 프로모터 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 프로모터 서열을 갖는 점 돌연변이가 있는 폴리뉴클레오티드를 미생물 염색체 상의 특정 부위에 혼입함으로써 상기 핵산 서열을 과발현시킨다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 폴리뉴클레오티드 또는 점 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 혼입하고, 상기 발현 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써 카피 수를 증가시킨다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 프로모터 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 프로모터 서열을 갖는 점 돌연변이가 있는 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 혼입하고, 상기 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하여, 상기 아미노산 서열을 과발현시킨다.
본 발명의 구체적인 일 실시방식에 있어서, 상기 프로모터는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(NCgl0609 유전자)의 프로모터이다.
본 발명의 구체적인 일 실시방식에 있어서, 상기 프로모터는 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(NCgl1575 유전자)의 프로모터이다.
본 발명의 일부 구체적인 실시방식에 있어서, 사용된 벡터는 pK18mobsacB 플라스미드, pXMJ19 플라스미드이다.
본 발명에 있어서, 상기 박테리아는 L-아미노산 생산량 증가와 관련된 다른 개선을 더 가질 수 있다.
본 발명의 제2 양상에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 해당 폴리뉴클레오티드 서열에서 코딩된 아미노산 서열은 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 재조합 벡터를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드의 재조합 균주를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 발현이 개선되며, 상기 개선은 SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 점 돌연변이를 발생시켜, 상기 아미노산 서열 334번째 부위 아르기닌이 터미네이터에 의해 치환된 것을 포함한다.
본 발명에 있어서, SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열은 334번째 부위 아르기닌이 터미네이터에 의해 치환된 후 아미노산 서열이 SEQ ID NO:4로 표시된다.
본 발명에 있어서, SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 본 발명에서 제공하는 돌연변이된 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 1000번째 부위 염기에 돌연변이가 발생하여 형성된 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 1000번째 부위 염기가 사이토신(C)에서 타이민(T)으로 돌연변이된 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 돌연변이된 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 치환된 아미노산 서열은 SEQ ID NO:4로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기에서 592번째 부위 티로신은 상이한 아미노산에 의해 치환된다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 592번째 부위 티로신은 페닐알라닌에 의해 치환된다.
본 발명에 있어서, SEQ ID NO:31로 표시되는 아미노산 서열은 592번째 부위 티로신(Y)이 페닐알라닌(F)에 의해 치환된 후 아미노산 서열이 SEQ ID NO:32로 표시된다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는, SEQ ID NO:31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:29로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:29로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 1775번째 부위 염기에 돌연변이가 발생하여 형성된 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:29로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 1775번째 부위 염기가 아데닌(A)에서 타이민(T)으로 돌연변이된 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:30으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO:32로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 돌연변이는 상기 부위의 염기/뉴클레오티드의 변화를 의미하며, 상기 돌연변이 방법은 돌연변이 유발, PCR 부위 특이적 돌연변이법 및/또는 상동성 재조합 등의 방법 중 적어도 하나에서 선택될 수 있다. 본 발명에서, 바람직하게는 PCR 부위 특이적 돌연변이법 및/또는 상동성 재조합을 채택한다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 플라스미드에 도입하여 구축한 것이다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 플라스미드는 pK18mobsacB 플라스미드이다.
본 발명의 다른 일 실시방식에 있어서, 상기 플라스미드는 pXMJ19 플라스미드이다.
구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드 서열와 상기 플라스미드는 NEBuider 재조합 시스템을 통해 재조합 벡터를 구축할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 균주는 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 재조합 균주의 출발균은 YP97158이다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 재조합 균주의 출발균은 ATCC 13869이다.
본 발명의 제3 양상에 있어서, L-아미노산을 생성하는 재조합 균주의 구축 방법을 더 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 구축 방법은 하기 단계를 포함한다.
숙주 균주 중 SEQ ID NO:1로 표시되는 야생형 NCgl0609의 폴리뉴클레오티드 서열을 형질전환하여 그 1000번째 염기를 돌연변이시켜 돌연변이 NCgl0609 코딩 유전자를 포함하는 재조합 균주를 획득한다.
본 발명이 구축 방법에 있어서, 상기 형질전환은 돌연변이 유발, PCR 부위 특이적 돌연변이법, 및/또는 상동성 재조합 등 방법 중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명이 구축 방법에 있어서, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:1에서 1000번째 염기가 사이토신(C)에서 타이민(T)으로 돌연변이된 것을 의미한다. 구체적으로, 상기 돌연변이 NCgl0609 코딩 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2로 표시된다.
또한 상기 구축 방법은 하기 단계를 포함한다.
(1) SEQ ID NO:1로 표시되는 야생형 NCgl0609 유전자의 뉴클레오티드 서열을 형질전환하여 그 1000번째 염기를 돌연변이시켜 돌연변이 NCgl0609 유전자 폴리뉴클레오티드 서열을 획득한다.
(2) 상기 돌연변이된 폴리뉴클레오티드 서열을 플라스미드에 연결하여 재조합 벡터를 구축한다.
(3) 재조합 벡터를 숙주 균주에 도입하여 상기 돌연변이 NCgl0609 코딩 유전자를 포함하는 재조합 균주를 획득한다.
본 발명의 구축 방법에 있어서, 상기 단계 (1)은, 점 돌연변이의 NCgl0609 유전자 구축을 포함한다. 변형되지 않은 균주의 게놈 서열에 따라 NCgl0609 유전자 단편 증폭을 위한 두 쌍의 프라이머 P1 및 P2, P3 및 P4를 합성하고, PCR 부위 특이적 돌연변이법을 통해 야생형 NCgl0609 유전자 SEQ ID NO:1에 점 돌연변이를 도입하여, 점 돌연변이의 NCgl0609 유전자 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO:2를 획득하며, NCgl0609 C1000T로 표기한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 변형되지 않은 균주의 게놈은 ATCC13032 균주로부터 유래될 수 있으며, 이의 게놈 서열은 NCBI 웹사이트에서 얻을 수 있다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 단계 (1)에서 상기 프라이머는 하기와 같다.
P1: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGGACGGCAAC GTACATAAC3' (SEQ ID NO:5)
P2: 5' GTTGCCGGTGAGTCAAACAGTCATTTTGC 3' (SEQ ID NO:6)
P3: 5' GCAAAATGACTGTTTGACTCACCGGCAAC 3' (SEQ ID NO:7)
P4: 5' CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCGGCTG GAA ATGTGGAG3' (SEQ ID NO:8)
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 PCR 증폭은 다음과 같은 방식으로 수행한다. 즉, 94℃에서 5분 동안 전변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 40초 동안 신장(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과신장한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 중첩 PCR 증폭은 다음과 같은 방식으로 수행한다. 즉, 94℃에서 5분 동안 전변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초 동안 신장(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과신장한다.
본 발명의 구축 방법에 있어서, 상기 단계 (2)는 재조합 플라스미드의 구축을 포함한다. 여기에는 분리 및 정제된 NCgl0609 C1000T 및 pK18mobsacB 플라스미드를 NEBuider 재조합 시스템으로 조립하여 재조합 플라스미드를 획득하는 단계가 포함된다.
본 발명의 구축 방법에 있어서, 상기 단계 (3)은 재조합 균주의 구축을 포함하며, 재조합 플라스미드를 숙주 균주로 형질전환하여 재조합 균주를 획득한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 단계 (3)의 형질전환은 전기형질전환이다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 YP97158이다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 재조합은 상동성 재조합을 통해 구현한다.
본 발명의 제4 양상에 있어서, L-아미노산을 생성하는 재조합 균주의 구축 방법을 더 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 구축 방법은 하기 단계를 포함한다.
NCgl0609 유전자의 업스트림 및 다운스트림 상동성 아암 단편, NCgl0609 유전자 코딩 영역 및 이의 프로모터 영역 서열을 증폭하거나, NCgl0609 또는 NCgl0609 R334* 유전자 코딩 영역 및 이의 프로모터 영역 서열을 증폭한 다음, 상동성 재조합의 방식으로 숙주 균주의 게놈에 NCgl0609 또는 NCgl0609 R334* 유전자를 도입하여, 상기 균주가 NCgl0609 또는 NCgl0609 R334* 유전자를 과발현하게 된다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 업스트림 상동성 아암 단편을 증폭하는 프라이머는 하기와 같다.
P7: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCGTTCTG GACTGAGG 3' (SEQ ID NO:11)
P8: 5' GAGATGATCCTCGCAGCTGGTGCACCGAGAACAGATG 3' (SEQ ID NO:12)
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 다운스트림 상동성 아암 단편을 증폭하는 프라이머는 하기와 같다.
P11: 5' GGTCAAGGAAGGAGTTGTTGCCAGAATCAGATGGCGCAATTA AATC AAG 3' (SEQ ID NO:15)
P12: 5' CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCTATGAC ACCTTCAACGGATC 3' (SEQ ID NO:16)
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 유전자 코딩 영역 및 이의 프로모터 영역 서열을 증폭하는 프라이머는 하기와 같다.
P9: 5' CATCTGTTCTCGGTGCACCAGCTGCGAGGATCATCTC 3' (SEQ ID NO:13)
P10: 5' GATTTAATTGCGCCATCTGATTCTGGCAACAACTCCTTCCTTGACC 3' (SEQ ID NO:14).
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 전술한 P7-P12를 프라이머로 사용하여, 증폭된 업스트림 상동 단편, 다운스트림 상동 단편 및 자체 프로모터를 갖는 NCgl0609 또는 NCgl0609 R334*의 세 단편을 템플릿으로 혼합하여 증폭함으로써, 통합 상동성 아암 단편을 획득한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 채택된 PCR 시스템은 다음과 같다. 즉, 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM)4μL, Mg2+(25mM)4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL)0.25μL, 총 부피 50μL이다. PCR 증폭 방식은 다음과 같다. 즉, 94℃에서 5분 동안 전변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초 동안 신장(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과신장한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, NEBuider 재조합 시스템을 사용하여, 셔틀 플라스미드 PK18mobsacB를 상하 상동성 아암 단편, 유전자 코딩 영역 및 프로모터 영역 단편으로 조립하여 통합된 플라스미드를 획득한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 통합 플라스미드를 숙주 균주에 형질감염시키고, 상동성 재조합 방식으로 숙주 균주의 게놈에 NCgl0609 또는 NCgl0609R334* 유전자를 도입한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 YP97158이다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 SEQ ID NO:2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 균주이다.
본 발명의 제5 양상에 있어서, L-아미노산을 생성하는 재조합 균주의 구축 방법을 더 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 구축 방법은 하기 단계를 포함한다.
NCgl0609 유전자 코딩 영역 및 프로모터 영역 서열, 또는 NCgl0609 R334* 유전자 코딩 영역 및 프로모터 영역 서열을 증폭하고, 과발현 플라스미드 벡터를 구축하고, 상기 벡터를 숙주 균주로 도입하여, 상기 균주가 NCgl0609 또는 NCgl0609 R334* 유전자를 과발현하도록 구현한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 유전자 코딩 영역 및 이의 프로모터 영역 서열을 증폭하는 프라이머는 하기와 같다.
P17: 5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCAGCTGCGAGG A TCATCTC 3' (SEQ ID NO:21)
P18: 5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACCAACAACTCCTTCCTTGACC3' (SEQ ID NO:22)
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 PCR 시스템은 다음과 같다. 즉, 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM)4μL, Mg2+(25mM)4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL)0.25μL, 총 부피 50μL이다. 상기 PCR 증폭 방식은 다음과 같다. 즉, 94℃에서 5분 동안 전변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초 동안 신장(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과신장한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, NEBuider 재조합 시스템을 사용하여 셔틀 플라스미드 pXMJ19와 자체 프로모터가 있는 NCgl0609 및 NCgl0609 R334* 단편을 조립하여 과발현 플라스미드를 획득한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 YP97158이다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 ATCC 13869이다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 SEQ ID NO:2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 균주이다.
본 발명은 코리네박테리움 재조합 균주의 구축 방법을 더 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 구축 방법은 하기 단계를 포함한다.
숙주 균주 중 SEQ ID NO:29로 표시되는 야생형 NCgl1575의 폴리뉴클레오티드 서열을 형질전환하여 그 1775번째 염기를 돌연변이시켜 돌연변이 NCgl1575 코딩 유전자를 포함하는 코리네박테리움 재조합 균주를 획득한다.
본 발명의 구축 방법에 있어서, 상기 형질전환은 돌연변이 유발, PCR 부위 특이적 돌연변이법, 및/또는 상동성 재조합 등 방법 중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 구축 방법에 있어서, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:29에서 1775번째 염기가 아데닌(A)에서 타이민(T)으로 돌연변이된 것을 의미한다. 구체적으로, 상기 돌연변이 NCgl1575 코딩 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:30으로 표시된다.
또한 상기 구축 방법은 하기 단계를 포함한다.
(1) SEQ ID NO:29로 표시되는 야생형 NCgl1575 유전자의 뉴클레오티드 서열을 형질전환하여 그 1775번째 염기를 돌연변이시켜 돌연변이 NCgl1575 유전자 폴리뉴클레오티드 서열을 획득한다.
(2) 상기 돌연변이된 폴리뉴클레오티드 서열을 플라스미드에 연결하여 재조합 벡터를 구축한다.
(3) 재조합 벡터를 숙주 균주에 도입되어 상기 돌연변이 NCgl1575 코딩 유전자를 포함하는 코리네박테리움 재조합 균주를 획득한다.
본 발명의 구축 방법에 있어서, 상기 단계 (1)은, 점 돌연변이의 NCgl1575 유전자 구축을 포함한다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 서열에 따라 NCgl1575 유전자 단편 증폭을 위한 두 쌍의 프라이머 P1' 및 P2', P3' 및 P4'를 합성하고, PCR 부위 특이적 돌연변이법을 통해 야생형 NCgl1575 유전자 SEQ ID NO:29에 점 돌연변이를 도입하여, 점 돌연변이의 NCgl1575 유전자 뉴클레오티드 서열 SEQ ID NO:30을 획득하며, NCgl1575 A1775T로 표기한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈은 ATCC13032 균주로부터 유래될 수 있으며, 이의 게놈 서열은 NCBI 웹사이트에서 얻을 수 있다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 단계 (1)에서 상기 프라이머는 하기와 같다.
P1’:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGTGCGTTCGTCTGCGGTTTCG 3' (SEQ ID NO:33)
P2’: 5' ATCGACGCCGCCCCATTCACCCTTCTGATG 3' (SEQ ID NO:34)；
P3’: 5' CATCAGAAGGGTGAATGGGGCGGCGTCGAT 3' (SEQ ID NO:35)；
P4’:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCAAGCCTCGACCCCTACATC 3' (SEQ ID NO:36)
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 PCR 증폭은 다음과 같이 수행한다. 즉, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 및 72℃에서 40초 동안 신장(30 사이클)한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 중첩 PCR 증폭은 다음과 같이 수행한다. 즉, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 및 72℃에서 90초 동안 신장(30 사이클)한다.
본 발명의 구축 방법에 있어서, 상기 단계 (2)는 재조합 플라스미드의 구축 단계를 포함한다. 여기에는 분리 및 정제된 NCgl1575 A1775T 및 pK18mobsacB 플라스미드를, NEBuider 재조합 시스템으로 조립하여, 재조합 플라스미드 pK18-NCgl1575 A1775T를 획득하는 단계가 포함된다.
본 발명의 구축 방법에 있어서, 상기 단계 (3)은 재조합 균주의 구축 단계를 포함하며, 이는 재조합 플라스미드 pK18-NCgl1575 A1775T를 숙주 균주로 형질전환하여, 재조합 균주를 획득한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 단계 (3)의 형질전환은 전기형질전환이다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 YP97158이다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 재조합은 상동성 재조합을 통해 구현한다.
본 발명은 코리네박테리움 재조합 균주의 구축 방법을 더 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 구축 방법은 하기 단계를 포함한다.
NCgl1575 유전자의 업스트림 및 다운스트림 상동성 아암, NCgl1575 유전자 코딩 영역 및 이의 프로모터 영역 서열, 또는 NCgl1575 A1775T 유전자 코딩 영역 및 이의 프로모터 영역 서열을 증폭하고, 상동성 재조합 방식으로 숙주 균주의 게놈에 NCgl1575 또는 NCgl1575 A1775T 유전자를 도입하여, 상기 균주가 NCgl1575 또는 NCgl1575 A1775T 유전자를 과발현하도록 구현한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 업스트림 상동성 아암 단편을 증폭하는 프라이머는 하기와 같다.
P7’：5' CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATG
CGTTCTGGACTGAGG 3' (SEQ ID NO:39)
P8’：5' GAAACGGCCTTAAGCTAGGTGCACCGAG AACAGATG 3' (SEQ ID NO:40)。
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 다운스트림 상동성 아암 단편을 증폭하는 프라이머는 하기와 같다.
P11’：5' AACCGGGCGG GAAAAGCTTGATGGCGCAATTAAATCAAG 3' (SEQ ID NO:43)
P12’：5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC GCTAT
GACACCTTCAACGGATC 3' (SEQ ID NO:44).
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 유전자 코딩 영역 및 이의 프로모터 영역 서열을 증폭하는 프라이머는 하기와 같다.
P9’：5' CATCTGTTCTCGGTGCAC CTAGCTTAAG GCCGTTTC 3' (SEQ ID NO:41)
P10’：5' CTTGATTTAATTGCGCCATCAAGCTTTTCC CGCCCGGTT 3' (SEQ ID NO:42).
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 전술한 P7’/P12’를 프라이머로 사용하여, 증폭된 업스트림 상동 단편, 다운스트림 상동 단편 및 자체 프로모터를 갖는 NCgl1575 또는 NCgl1575 A1775T의 세 단편을 템플릿으로 혼합하여 증폭함으로써, 통합 상동성 아암 단편을 획득한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 채택된 PCR 시스템은 다음과 같다. 즉, 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM)4μL, Mg2+(25mM)4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL)0.25μL, 총 부피 50μL이다. PCR 증폭 방식은 다음과 같다. 즉, 94℃에서 5분 동안 전변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 180초 동안 신장(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과신장한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, NEBuider 재조합 시스템을 사용하여, 셔틀 플라스미드 PK18mobsacB와 통합 상동성 아암 단편을 조립하여 통합된 플라스미드를 획득한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 통합 플라스미드를 숙주 균주에 형질감염시키고, 상동성 재조합 방식으로 숙주 균주의 게놈에 NCgl1575 또는 NCgl1575 A1775T 유전자를 도입한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 YP97158이다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 SEQ ID NO:30으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 균주이다.
본 발명은 코리네박테리움 재조합 균주의 구축 방법을 더 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 구축 방법은 하기 단계를 포함한다.
NCgl1575 유전자 코딩 영역 및 프로모터 영역 서열, 또는 NCgl1575 A1775T 유전자 코딩 영역 및 프로모터 영역 서열을 증폭하고, 과발현 플라스미드 벡터를 구축하고, 상기 벡터를 숙주 균주로 도입하여, 상기 균주가 NCgl1575 또는 NCgl1575 A1775T 유전자를 과발현하도록 구현한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 유전자 코딩 영역 및 이의 프로모터 영역 서열을 증폭하는 프라이머는 하기와 같다.
P17’：5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCC CTAGCT
TAAG GCCGTTTC 3' (SEQ ID NO:49)
P18’：5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAAC AAGCTTT
TCC CGCCCGGTT 3' (SEQ ID NO:50).
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 PCR 시스템은 다음과 같다. 즉, 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM)4μL, Mg2+(25mM)4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL)0.25μL, 총 부피 50μL이다. 상기 PCR 증폭 방식은 다음과 같다. 즉, 94℃에서 5분 동안 전변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 120초 동안 신장(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과신장한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, NEBuider 재조합 시스템을 사용하여 셔틀 플라스미드 pXMJ19와 자체 프로모터가 있는 NCgl1575 및 NCgl1575 A1775T 단편을 조립하여 과발현 플라스미드를 획득한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 YP97158이다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 SEQ ID NO:30으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 균주이다.
본 발명의 다른 일 양상은 프로모터 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 여기에는 SEQ ID NO:57로 표시되는 프로모터 영역 -45bp번째 부위 및 -47bp번째 부위 염기가 돌연변이를 일으켜 형성된 뉴클레오티드 서열이 포함된다.
본 발명에 있어서, SEQ ID NO:57로 표시되는 프로모터 영역의 -45bp번째 부위 뉴클레오티드 구아닌(G)이 아데닌(A)으로 돌연변이되고, -47bp번째 부위의 뉴클레오티드 구아닌(G)이 타이민(T)으로 돌연변이된다.
본 발명에 있어서, 상기 프로모터 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다.
(a) SEQ ID NO:58로 표시되는 뉴클레오티드 서열; 또는
(b) SEQ ID NO:58로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95%, 98% 이상 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열이다. (a)에 따른 프로모터의 향상된 활성을 유지하고, -45bp번째 부위가 아데닌(A)으로 유지되고, -47bp번째 부위가 타이민(T)으로 유지된다.
본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 더 제공한다. 여기에는 상기 프로모터 및 상기 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 코딩 서열이 포함된다. 본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 코딩 서열은 lysC 유전자의 코딩 서열이다.
본 발명은 본 발명의 프로모터 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 더 제공한다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 프로모터 뉴클레오티드 서열을 셔틀 플라스미드와 연결하여 상기 재조합 벡터를 구축한다. 본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 셔틀 플라스미드는 pK18mobsacB 플라스미드이다.
본 발명은 상기 프로모터 뉴클레오티드 서열 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 균주를 더 제공한다.
본 발명의 재조합 균주는 SEQ ID NO:58로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 SEQ ID NO:58로 표시되는 뉴클레오티드 서열은 lysC 유전자의 프로모터 영역이다. 또한 상기 SEQ ID NO:58로 표시되는 뉴클레오티드 서열은 lysC 유전자 코딩 서열을 연결한다. 구체적으로, 상기 재조합 균주는 본 발명에 따른 발현 카세트 또는 재조합 벡터를 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 재조합 균주는 발현 카세트 또는 재조합 벡터에서 형질전환하여 획득한다. 본 발명의 재조합 균주는 상기 돌연변이된 프로모터 뉴클레오티드 서열을 숙주 균주에 도입하여 재조합 형성한 것이다. 상기 숙주 균주는 당업계에 공지된 L-아미노산, 특히 L-라이신의 균주, 예를 들어 코리네박테리움 중 적어도 하나로부터 유래한다. 상기 코리네박테리움은 코리네박테리움 글루타미쿰, 브레비박테리움 플라붐, 코리네박테리움 크레나툼, 코리네박테리움 페키넨스일 수 있으며, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰이다. 본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 숙주 균주는 YP97158이다.
본 발명에 따른 재조합 균주는 pK18mobsacB 플라스미드를 벡터로 한 것이다.
본 발명에 따른 재조합 균주는 다른 변형을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 L-라이신을 생산하는 재조합 균주의 구축 방법을 더 제공하며, 여기에는 하기 단계가 포함된다.
(1) SEQ ID NO:57로 표시되는 프로모터 영역을 형질전환하여 -45bp번째 부위 및 -47bp번째 부위에서 돌연변이를 발생시켜, 돌연변이를 포함하는 프로모터 영역의 뉴클레오티드 서열을 획득한다.
본 발명에 있어서, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:57로 표시되는 프로모터 영역의 -45bp번째 부위 뉴클레오티드 구아닌(G)이 아데닌(A)으로 돌연변이되고, -47bp번째 부위의 뉴클레오티드 구아닌(G)이 타이민(T)으로 돌연변이된다. 구체적으로, 상기 돌연변이된 프로모터 영역의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:58로 표시된다. 또한 상기 구축 방법은 하기 단계를 더 포함한다.
(2) 상기 돌연변이된 프로모터 영역 뉴클레오티드 서열을 플라스미드에 연결하여 재조합 벡터를 구축한다.
(3) 상기 재조합 벡터를 숙주 균주에 도입하여, 상기 돌연변이를 포함하는 프로모터 영역의 L-라이신 재조합 균주를 획득한다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (1)에서, 상기 돌연변이를 발생시키는 방법은 돌연변이 유발, PCR 부위 특이적 돌연변이 또는 상동성 재조합을 포함하며, 바람직하게는 PCR 부위 특이적 돌연변이법을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (1)은 하기 단계를 포함한다.
lysC 유전자의 프로모터 영역을 증폭하기 위한 2쌍의 프라이머를 설계한 다음, PCR 기술을 통해 돌연변이된 프로모터 영역 뉴클레오티드 서열을 획득한다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 단계 (1)에서 프라이머는 하기와 같다.
P1’’: 5' CCGGAATTC GACCAAGGATGAGGGCTTTG3'(EcoR I) (SEQ ID NO:59)
P2’’: 5' AGTTACCCGC TCAATTATAC CTTTATAAAC 3' (SEQ ID NO:60)
P3’’: 5' GTTTATAAAG GTATAATTGA GCGGGTAACT 3' (SEQ ID NO:61)
P4’’: 5' ACATGCATGC GCGTACGCGAAGTGGCACAT3'(Sph I) (SEQ ID NO:62)。
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 (1) 단계는 다음 단계를 포함한다. 즉, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 템플릿으로 사용하여, 각각 프라이머 P1'', P2'', P3'' 및 P4''로 PCR 증폭을 수행하여, 2개의 DNA 단편을 획득한다. 상기 2개의 DNA 단편을 템플릿으로 사용하여, P1'' 및 P4''를 프라이머로 하여, 중첩 PCR 증폭(Overlap PCR)을 통해, 본 발명의 프로모터 영역을 포함하는 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:58)의 DNA 단편을 획득한다.
본 발명에 있어서, 단계 (1)에 있어서, 중첩 PCR 증폭(Overlap PCR)을 통해, 획득한 DNA 단편 양단에는 각각 EcoR I 및 Sph I 제한 부위가 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (2)는 다음 단계를 포함한다. 즉, 중첩 PCR 반응 증폭 생성물에 대해 아가로스 겔 전기영동 및 분리 정제를 수행하여, 단편을 이중 분해(EcoR I/Sph I)한 후, 동일한 이중 분해(EcoR I/Sph I) 후의 셔틀 플라스미드와 연결하여, 대립 유전자 치환 재조합 벡터를 획득한다.
본 발명에 있어서, 상기 셔틀 플라스미드는 pK18mobsacB 플라스미드이고, 구축된 재조합 벡터는 pK18-Plys C(G(-45)A,G(-47)T)이다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 재조합 플라스미드는 카나마이신 내성 마커를 갖는다.
본 발명의 일 실시방식에 있어서, 상기 단계 (3)의 형질전환은 전기형질전환법이며, 예시적으로 상기 단계 (3)에서 재조합 벡터를 균주 YP97158로 형질전환한다.
본 발명에서 얻은 상기한 다양한 재조합 균주는 L-아미노산의 발효 및 생산에 단독으로 사용하거나 조합하여 사용할 수 있으며, 다른 L-아미노산 생산균과 혼합하여 발효시켜 L-아미노산을 생산할 수도 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 L-아미노산을 생산하는 방법을 제공한다. 해당 방법은 상기 박테리아를 배양하고, 배양물로부터 L-아미노산을 획득하는 단계를 포함한다.
당업계에 공지된 배양 조건 하에서 적합한 배지에서 박테리아를 배양할 수 있다. 배지는 탄소원, 질소원, 미량 원소 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 배양에서 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 배양 시 기포 발생을 방지할 수 있다. 예를 들어 소포제를 사용하여 기포 발생을 방지할 수 있다. 또한 배양 시 기체를 배양물에 주입할 수 있다. 기체는 배양물의 호기성 조건을 유지할 수 있는 임의의 기체를 포함할 수 있다. 배양 과정에서 배양물의 온도는 20 내지 45℃일 수 있다. 배양물로부터 생성된 L-아미노산을 회수할 수 있다. 즉, 황산이나 염산 등으로 처리된 배양물을 이용하여, 음이온 교환 크로마토그래피, 농축, 결정화, 등전침전 등의 방법을 조합하여 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서,
SEQ ID NO:1: NCgl0609 야생형 ORF 서열
GTGTCACACACCGCGTCCACACCGACGCCAGAGGAATACTCCGCGCAGCAACCCAGCACCCAGGGCACTCGCGTTGAGTTCCGCGGCATAACCAAAGTCTTTAGCAACAATAAATCTGCTAAAACCACCGCGCTTGATAATGTCACTCTCACCGTAGAACCCGGTGAGGTAATCGGCATCATCGGTTACTCTGGCGCCGGCAAGTCCACTCTTGTCCGCCTCATCAATGGCCTTGACTCCCCCACGAGCGGTTCGTTGCTGCTCAACGGCACCGACATCGTCGGAATGCCCGAGTCTAAGCTGCGTAAACTGCGCAGTAATATCGGCATGATTTTCCAGCAGTTCAACCTGTTCCAGTCGCGTACTGCGGCTGGAAATGTGGAGTACCCGCTGGAAGTTGCCAAGATGGACAAGGCAGCTCGTAAAGCTCGCGTGCAAGAAATGCTCGAGTTCGTCGGCCTGGGCGACAAAGGCAAAAACTACCCCGAGCAGCTGTCGGGCGGCCAGAAGCAGCGCGTCGGCATTGCCCGTGCACTGGCCACCAATCCAACGCTTTTGCTTGCCGACGAAGCCACCTCCGCTTTGGACCCAGAAACCACCCATGAAGTTCTGGAGCTGCTGCGCAAGGTAAACCGCGAACTGGGCATCACCATCGTTGTGATCACCCACGAAATGGAAGTTGTGCGTTCCATCGCAGACAAGGTTGCTGTGATGGAATCCGGCAAAGTTGTGGAATACGGCAGCGTCTACGAGGTGTTCTCCAATCCACAAACACAGGTTGCTCAAAAGTTCGTGGCCACCGCGCTGCGTAACACCCCAGACCAAGTGGAATCGGAAGATCTGCTTAGCCATGAGGGACGTCTGTTCACCATTGATCTGACTGAAACGTCCGGCTTCTTTGCAGCAACCGCTCGTGCTGCCGAACAAGGTGCTTTTGTCAACATCGTTCACGGTGGCGTGACCACCTTGCAACGCCAATCATTTGGCAAAATGACTGTTCGACTCACCGGCAACACCGCTGCGATTGAAGAGTTCTATCAAACCTTGACCAAGACCACGACCATCAAGGAGATCACCCGATGA
SEQ ID NO:2: NCgl0609 R334* ORF 서열
GTGTCACACACCGCGTCCACACCGACGCCAGAGGAATACTCCGCGCAGCAACCCAGCACCCAGGGCACTCGCGTTGAGTTCCGCGGCATAACCAAAGTCTTTAGCAACAATAAATCTGCTAAAACCACCGCGCTTGATAATGTCACTCTCACCGTAGAACCCGGTGAGGTAATCGGCATCATCGGTTACTCTGGCGCCGGCAAGTCCACTCTTGTCCGCCTCATCAATGGCCTTGACTCCCCCACGAGCGGTTCGTTGCTGCTCAACGGCACCGACATCGTCGGAATGCCCGAGTCTAAGCTGCGTAAACTGCGCAGTAATATCGGCATGATTTTCCAGCAGTTCAACCTGTTCCAGTCGCGTACTGCGGCTGGAAATGTGGAGTACCCGCTGGAAGTTGCCAAGATGGACAAGGCAGCTCGTAAAGCTCGCGTGCAAGAAATGCTCGAGTTCGTCGGCCTGGGCGACAAAGGCAAAAACTACCCCGAGCAGCTGTCGGGCGGCCAGAAGCAGCGCGTCGGCATTGCCCGTGCACTGGCCACCAATCCAACGCTTTTGCTTGCCGACGAAGCCACCTCCGCTTTGGACCCAGAAACCACCCATGAAGTTCTGGAGCTGCTGCGCAAGGTAAACCGCGAACTGGGCATCACCATCGTTGTGATCACCCACGAAATGGAAGTTGTGCGTTCCATCGCAGACAAGGTTGCTGTGATGGAATCCGGCAAAGTTGTGGAATACGGCAGCGTCTACGAGGTGTTCTCCAATCCACAAACACAGGTTGCTCAAAAGTTCGTGGCCACCGCGCTGCGTAACACCCCAGACCAAGTGGAATCGGAAGATCTGCTTAGCCATGAGGGACGTCTGTTCACCATTGATCTGACTGAAACGTCCGGCTTCTTTGCAGCAACCGCTCGTGCTGCCGAACAAGGTGCTTTTGTCAACATCGTTCACGGTGGCGTGACCACCTTGCAACGCCAATCATTTGGCAAAATGACTGTTTGACTCACCGGCAACACCGCTGCGATTGAAGAGTTCTATCAAACCTTGACCAAGACCACGACCATCAAGGAGATCACCCGATGA
SEQ ID NO:3: NCgl0609 야생형 코딩 단백질 아미노산 서열
MSHTASTPTPEEYSAQQPSTQGTRVEFRGITKVFSNNKSAKTTALDNVTLTVEPGEVIGIIGYSGAGKSTLVRLINGLDSPTSGSLLLNGTDIVGMPESKLRKLRSNIGMIFQQFNLFQSRTAAGNVEYPLEVAKMDKAARKARVQEMLEFVGLGDKGKNYPEQLSGGQKQRVGIARALATNPTLLLADEATSALDPETTHEVLELLRKVNRELGITIVVITHEMEVVRSIADKVAVMESGKVVEYGSVYEVFSNPQTQVAQKFVATALRNTPDQVESEDLLSHEGRLFTIDLTETSGFFAATARAAEQG AFVNIVHGGV TTLQRQSFGK MTVRLTGNTA AIEEFYQTLT KTTTIKEITR
SEQ ID NO:4: NCgl0609 R334* 코딩 단백질 아미노산 서열
MSHTASTPTPEEYSAQQPSTQGTRVEFRGITKVFSNNKSAKTTALDNVTLTVEPGEVIGIIGYSGAGKSTLVRLINGLDSPTSGSLLLNGTDIVGMPESKLRKLRSNIGMIFQQFNLFQSRTAAGNVEYPLEVAKMDKAARKARVQEMLEFVGLGDKGKNYPEQLSGGQKQRVGIARALATNPTLLLADEATSALDPETTHEVLELLRKVNRELGITIVVITHEMEVVRSIADKVAVMESGKVVEYGSVYEVFSNPQTQVAQKFVATALRNTPDQVESEDLLSHEGRLFTIDLTETSGFFAATARAAEQG AFVNIVHGGV TTLQRQSFGK MTV
SEQ ID NO:29: NCgl1575 야생형 ORF 서열
ATGGCAGAATCAAACGCTATGGACCGGGCACAAATCTCTGCACTGCTAGATAGAGCACAGCACACAATCAACCTTGCCGAACAAGCAAACAACGTGCTCCGACTGTTGAAAACACCCGGAACGGCCACAGTAGGGGACAACGGGACACTCGGCACCGATACCTATCTGATCCCATCCCGCAACATCACCTGGCCTGACAACCTGTATGTCAACGTCTTTCTAGACGGCATGAATGCAGAAGCCACCCTTACCGATTACGTCGCATCAGTCGCTTCGATCCCACGCCTATGCCAGATCATCAACGAGGGCCAAGGCGGCATGTTCCGCAGACTATTCAACCCCACCAAGGTCCAAGCCGGCGACCAAGCTGTCTTCGACCTCATGGTCAAACTCGACGAGATTTCATCTACCACCCACGAAGTCTCCCGCATGCTCGAGGGCGTCCACGCTGCCCGCACCCGCCAACAACAAGGCGTTGCACTTTTCCCAGGTATTCATGGAGTGGGAGAGCGCTACATCGAACGCGCACAACAGGTACTCGCCTCAGCCCTCGGTATCGCTGGATTCGGTGCCGAACCCTGGGACGGACATACCCTTGCCCAAGCGCGCCGGGTAGTCCAACGCTACGCCCAAGATCCTAACTCCGAATACCGGCTGAAAAGCGAAGCCGAGAAACACCTCACATCCATCAACGAGCTCCGCGTACAGATACTCCTCGAACAACTCCCCGTTGATGCCCTACGCATGGCTACCGACCACCGCCTGCGCTTTGGATCCCTCGATTCCATCCACGTCGCAACCGTCGCCGACGTCCTAAAAACACACACCTCCATCCTCACCACCGTGCAAGGTATCGGCGCCCAAACCGCGGGGCGGATGAAAGCCGCAGCAGAAACACTCAAACAAGAAGCACTACGCCGCCAAAACACCTCCATCGGCGACGAACCTACCCAACCCGCCATGCGTCTAATCAACGTGCTGGCCCGCTTCGACCAAACCGAAACCATCACGCCCGAAGAACGCGCCCGCCGCACCCGCGTCATCGACTACGTAGAACACATACCCCCAAGCCTCGACCCCTACATCGTCATCAACCCAGCAACGCCTGAGTTCAACAACTTCACCGACGACCTCCGCTGGATCGACGCAAACCCCAACCTCTTCCACCCACAAACAATCACCACCCCACCCGCCGACATCTGGGACGACTACATCTCCCGTCCCGCTCACTACCAAGGCCTGCTAGCCACGCTGCTCGGCCGCGACATCGAAGGCGCAGACGAACTCCTCGACGCCACCACCCTCCAAAAAATCAGAGACCTCACCCTCGACAAAACTCATCTCACCGACCTCCACCTCCGCGGATACCAATCATTCGGCGCCCGCTTCGCCATCATCCAAAAGAAAACCCTCCTCGGCGACGACATGGGACTCGGCAAAACAGTCCAAGCCCTCTCCGCAGCTGCACACCTTGCCGCCACCGAAAAAGACTTCCGCACCCTCGTCGTCGTACCCGCATCCGTCATTGTTAACTGGACCCGCGAATGCAAACGCTTCCTCAACCTCCCCGTATTCATCGCCCACGGAGACAACAAACAAGACGCCATCAACGCCTGGTCTAACACCAACGGAATCGCAATCTGCACCTACGACGGCGTCCGCACCATGGACATCCCCGCGCCGGGTCTGGTCATTGCCGATGAAGCCCACCTGATCAAAAACCCCTCCACCAAACGCACCCAAGCACTGCGCAAACTTATCGACGCCGCCCCATACACCCTTCTGATGACCGGCACACCACTAGAAAACAAAGTGGAAGAGTTTGTAAATCTCGTGCGCTACATCCAACCGGAGCTGATCACCCGTGGCATGTCCAAAATGCAGGCCGAGAATTTCCGCGAGCGCATCGCACCAGCCTATCTGCGCAGAAATCAAGCTGATGTGCTTGACGAACTCCCAGAGCGCACCGACTCCATCGACTGGATCGACCTCACCCCAGAAGACCGCAGCGCCTACGACGACCAAGTCCGCCAAGGCAGCTGGATGGGCATGCGCCGCTCCGCCATGCTCTCACCAACACCACGCCTAACTTCCGCAAAAATGCAACGCATCCTAGAACTCTTCGAAGAAGCAGAAGAACACGGCCGCAAAGCCCTCATCTTCACCTACTTCCTCGACGTCCTCGACGAACTGGAAAAGCATCTAGGCGAGCGCGTCATCGGCCGCATTTCCGGCGACGTGCCAGCCACCAAGCGCCAATTGCTTGTCGACGCCCTGTCCCACTCCAAACCCGGATCCGCCCTCATTGCCCAAATCACCGCCGGGGGAGTAGGCCTAAACATCCAATCCGCGAGCCTATGCATTATTTGTGAACCTCAAGTAAAGCCAACCATCGAACAGCAGGCCGTCGCCCGAGTCCACCGCATGGGCCAAACCGCCACCGTCCAAGTCCACCGACTCATCGGCGACGAAACCGCAGACGAACGCATGCTAGAAATCCTGGCAGGCAAAACTCACGTCTTCGACGTCTACGCCCGGCTATCTGAAACCGCAGAGATTCCAGATGCTGTGGATATCACTGAATCACAGCTGGCAGCACGGGTTATTGATGAGGAGCGTGCACGGTTAGGGCTTACTGAATCCACTGGCCCTAAAGATGAAGAAACGGCC TTAAGCTAG
SEQ ID NO:30: NCgl1575 A1775T ORF 서열
ATGGCAGAATCAAACGCTATGGACCGGGCACAAATCTCTGCACTGCTAGATAGAGCACAGCACACAATCAACCTTGCCGAACAAGCAAACAACGTGCTCCGACTGTTGAAAACACCCGGAACGGCCACAGTAGGGGACAACGGGACACTCGGCACCGATACCTATCTGATCCCATCCCGCAACATCACCTGGCCTGACAACCTGTATGTCAACGTCTTTCTAGACGGCATGAATGCAGAAGCCACCCTTACCGATTACGTCGCATCAGTCGCTTCGATCCCACGCCTATGCCAGATCATCAACGAGGGCCAAGGCGGCATGTTCCGCAGACTATTCAACCCCACCAAGGTCCAAGCCGGCGACCAAGCTGTCTTCGACCTCATGGTCAAACTCGACGAGATTTCATCTACCACCCACGAAGTCTCCCGCATGCTCGAGGGCGTCCACGCTGCCCGCACCCGCCAACAACAAGGCGTTGCACTTTTCCCAGGTATTCATGGAGTGGGAGAGCGCTACATCGAACGCGCACAACAGGTACTCGCCTCAGCCCTCGGTATCGCTGGATTCGGTGCCGAACCCTGGGACGGACATACCCTTGCCCAAGCGCGCCGGGTAGTCCAACGCTACGCCCAAGATCCTAACTCCGAATACCGGCTGAAAAGCGAAGCCGAGAAACACCTCACATCCATCAACGAGCTCCGCGTACAGATACTCCTCGAACAACTCCCCGTTGATGCCCTACGCATGGCTACCGACCACCGCCTGCGCTTTGGATCCCTCGATTCCATCCACGTCGCAACCGTCGCCGACGTCCTAAAAACACACACCTCCATCCTCACCACCGTGCAAGGTATCGGCGCCCAAACCGCGGGGCGGATGAAAGCCGCAGCAGAAACACTCAAACAAGAAGCACTACGCCGCCAAAACACCTCCATCGGCGACGAACCTACCCAACCCGCCATGCGTCTAATCAACGTGCTGGCCCGCTTCGACCAAACCGAAACCATCACGCCCGAAGAACGCGCCCGCCGCACCCGCGTCATCGACTACGTAGAACACATACCCCCAAGCCTCGACCCCTACATCGTCATCAACCCAGCAACGCCTGAGTTCAACAACTTCACCGACGACCTCCGCTGGATCGACGCAAACCCCAACCTCTTCCACCCACAAACAATCACCACCCCACCCGCCGACATCTGGGACGACTACATCTCCCGTCCCGCTCACTACCAAGGCCTGCTAGCCACGCTGCTCGGCCGCGACATCGAAGGCGCAGACGAACTCCTCGACGCCACCACCCTCCAAAAAATCAGAGACCTCACCCTCGACAAAACTCATCTCACCGACCTCCACCTCCGCGGATACCAATCATTCGGCGCCCGCTTCGCCATCATCCAAAAGAAAACCCTCCTCGGCGACGACATGGGACTCGGCAAAACAGTCCAAGCCCTCTCCGCAGCTGCACACCTTGCCGCCACCGAAAAAGACTTCCGCACCCTCGTCGTCGTACCCGCATCCGTCATTGTTAACTGGACCCGCGAATGCAAACGCTTCCTCAACCTCCCCGTATTCATCGCCCACGGAGACAACAAACAAGACGCCATCAACGCCTGGTCTAACACCAACGGAATCGCAATCTGCACCTACGACGGCGTCCGCACCATGGACATCCCCGCGCCGGGTCTGGTCATTGCCGATGAAGCCCACCTGATCAAAAACCCCTCCACCAAACGCACCCAAGCACTGCGCAAACTTATCGACGCCGCCCCATTCACCCTTCTGATGACCGGCACACCACTAGAAAACAAAGTGGAAGAGTTTGTAAATCTCGTGCGCTACATCCAACCGGAGCTGATCACCCGTGGCATGTCCAAAATGCAGGCCGAGAATTTCCGCGAGCGCATCGCACCAGCCTATCTGCGCAGAAATCAAGCTGATGTGCTTGACGAACTCCCAGAGCGCACCGACTCCATCGACTGGATCGACCTCACCCCAGAAGACCGCAGCGCCTACGACGACCAAGTCCGCCAAGGCAGCTGGATGGGCATGCGCCGCTCCGCCATGCTCTCACCAACACCACGCCTAACTTCCGCAAAAATGCAACGCATCCTAGAACTCTTCGAAGAAGCAGAAGAACACGGCCGCAAAGCCCTCATCTTCACCTACTTCCTCGACGTCCTCGACGAACTGGAAAAGCATCTAGGCGAGCGCGTCATCGGCCGCATTTCCGGCGACGTGCCAGCCACCAAGCGCCAATTGCTTGTCGACGCCCTGTCCCACTCCAAACCCGGATCCGCCCTCATTGCCCAAATCACCGCCGGGGGAGTAGGCCTAAACATCCAATCCGCGAGCCTATGCATTATTTGTGAACCTCAAGTAAAGCCAACCATCGAACAGCAGGCCGTCGCCCGAGTCCACCGCATGGGCCAAACCGCCACCGTCCAAGTCCACCGACTCATCGGCGACGAAACCGCAGACGAACGCATGCTAGAAATCCTGGCAGGCAAAACTCACGTCTTCGACGTCTACGCCCGGCTATCTGAAACCGCAGAGATTCCAGATGCTGTGGATATCACTGAATCACAGCTGGCAGCACGGGTTATTGATGAGGAGCGTGCACGGTTAGGGCTTACTGAATCCACTGGCC CTAAAGATGA AGAAACGGCC TTAAGCTAG
SEQ ID NO:31: NCgl1575 야생형 코딩 단백질 서열
MAESNAMDRAQISALLDRAQHTINLAEQANNVLRLLKTPGTATVGDNGTLGTDTYLIPSRNITWPDNLYVNVFLDGMNAEATLTDYVASVASIPRLCQIINEGQGGMFRRLFNPTKVQAGDQAVFDLMVKLDEISSTTHEVSRMLEGVHAARTRQQQGVALFPGIHGVGERYIERAQQVLASALGIAGFGAEPWDGHTLAQARRVVQRYAQDPNSEYRLKSEAEKHLTSINELRVQILLEQLPVDALRMATDHRLRFGSLDSIHVATVADVLKTHTSILTTVQGIGAQTAGRMKAAAETLKQEALRRQNTSIGDEPTQPAMRLINVLARFDQTETITPEERARRTRVIDYVEHIPPSLDPYIVINPATPEFNNFTDDLRWIDANPNLFHPQTITTPPADIWDDYISRPAHYQGLLATLLGRDIEGADELLDATTLQKIRDLTLDKTHLTDLHLRGYQSFGARFAIIQKKTLLGDDMGLGKTVQALSAAAHLAATEKDFRTLVVVPASVIVNWTRECKRFLNLPVFIAHGDNKQDAINAWSNTNGIAICTYDGVRTMDIPAPGLVIADEAHLIKNPSTKRTQALRKLIDAAPYTLLMTGTPLENKVEEFVNLVRYIQPELITRGMSKMQAENFRERIAPAYLRRNQADVLDELPERTDSIDWIDLTPEDRSAYDDQVRQGSWMGMRRSAMLSPTPRLTSAKMQRILELFEEAEEHGRKALIFTYFLDVLDELEKHLGERVIGRISGDVPATKRQLLVDALSHSKPGSALIAQITAGGVGLNIQSASLCIICEPQVKPTIEQQAVARVHRMGQTATVQVHRLIGDETADERMLEILAGKTHVFDVYARLSETAEIPDAVDIT ESQLAARVID EERARLGLTE STGPKDEETA LS
SEQ ID NO:32: NCgl1575 Y592F 코딩 단백질 서열
MAESNAMDRAQISALLDRAQHTINLAEQANNVLRLLKTPGTATVGDNGTLGTDTYLIPSRNITWPDNLYVNVFLDGMNAEATLTDYVASVASIPRLCQIINEGQGGMFRRLFNPTKVQAGDQAVFDLMVKLDEISSTTHEVSRMLEGVHAARTRQQQGVALFPGIHGVGERYIERAQQVLASALGIAGFGAEPWDGHTLAQARRVVQRYAQDPNSEYRLKSEAEKHLTSINELRVQILLEQLPVDALRMATDHRLRFGSLDSIHVATVADVLKTHTSILTTVQGIGAQTAGRMKAAAETLKQEALRRQNTSIGDEPTQPAMRLINVLARFDQTETITPEERARRTRVIDYVEHIPPSLDPYIVINPATPEFNNFTDDLRWIDANPNLFHPQTITTPPADIWDDYISRPAHYQGLLATLLGRDIEGADELLDATTLQKIRDLTLDKTHLTDLHLRGYQSFGARFAIIQKKTLLGDDMGLGKTVQALSAAAHLAATEKDFRTLVVVPASVIVNWTRECKRFLNLPVFIAHGDNKQDAINAWSNTNGIAICTYDGVRTMDIPAPGLVIADEAHLIKNPSTKRTQALRKLIDAAPFTLLMTGTPLENKVEEFVNLVRYIQPELITRGMSKMQAENFRERIAPAYLRRNQADVLDELPERTDSIDWIDLTPEDRSAYDDQVRQGSWMGMRRSAMLSPTPRLTSAKMQRILELFEEAEEHGRKALIFTYFLDVLDELEKHLGERVIGRISGDVPATKRQLLVDALSHSKPGSALIAQITAGGVGLNIQSASLCIICEPQVKPTIEQQAVARVHRMGQTATVQVHRLIGDETADERMLEILAGKTHVFDVYARLSETAEIPDAVDIT ESQLAARVID EERARLGLTE STGPKDEETA LS
SEQ ID NO:57: 야생형 프로모터 서열
ttcagggtag ttgactaaag agttgctcgc gaagtagcac ctgtcacttt tgtctcaaatattaaatcga atatcaatat atggtctgtt tattggaacg cgtcccagtg gctgagacgcatccgctaaa gccccaggaa ccctgtgcag aaagaaaaca ctcctctggc taggtagacacagtttataa aggtagagtt gagcgggtaa ctgtcagcac gtagatcgaa aggtgcacaaag
SEQ ID NO:58: 돌연변이 후의 프로모터 서열
ttcagggtag ttgactaaag agttgctcgc gaagtagcac ctgtcacttt tgtctcaaatattaaatcga atatcaatat atggtctgtt tattggaacg cgtcccagtg gctgagacgcatccgctaaa gccccaggaa ccctgtgcag aaagaaaaca ctcctctggc taggtagacacagtttataa aggtataatt gagcgggtaa ctgtcagcac gtagatcgaa aggtgcacaaag
용어 정의:
본 발명에서 용어 "L-아미노산 생산능을 갖는 박테리아"는 배지 및/또는 박테리아가 있는 세포에서 후술하는 정도로 목적 L-아미노산을 생산하여 축적할 수 있는 능력을 가지며, 박테리아가 배지에서 배양될 때 L-아미노산을 생산하는 박테리아를 수집할 수 있음을 의미한다. L-아미노산 생산능을 갖는 박테리아는 변형되지 않은 균주에서 획득할 수 있는 양보다 더 많은 양으로 배지 및/또는 박테리아의 세포에 목적 L-아미노산을 축적할 수 있는 박테리아이다.
L-아미노산의 예시에는 L-라이신, L-오르니틴, L-아르기닌, L-히스티딘, L-시트룰린과 같은 염기성 아미노산, L-이소류신, L-알라닌, L-발린, L-류신 및 글리신과 같은 지방족 아미노산, L-트레오닌 및 L-세린과 같은 하이드록시-모노아미노카르복실산의 아미노산, L-프롤린과 같은 고리형 아미노산, L-페닐알라닌, L-티로신, L-트립토판과 같은 방향족 아미노산, L-시스테인, L-시스틴, L-메티오닌과 같은 황 함유 아미노산, L-글루탐산, L-아스파르트산과 같은 산성 아미노산, 및 L-글루타민, L-아스파라긴과 같은 측쇄에 아미드가 있는 아미노산이 포함된다. L-아미노산의 구체적인 예시에는 L-글루탐산, L-라이신, L-트레오닌, L-아르기닌, L-히스티딘, L-이소류신, L-발린, L-류신, L-페닐알라닌, L-티로신, L-트립토판과 L-시스테인이 포함된다. L-아미노산의 보다 구체적인 예시에는 L-글루탐산, L-라이신, L-트레오닌 및 L-트립토판이 포함된다. L-아미노산의 보다 구체적인 예시에는 L-글루탐산, L-라이신이 포함된다.
본 발명에서 달리 명시되지 않는 한, 용어 "아미노산"은 L-아미노산을 의미한다. 본 발명에서 달리 명시되지 않는 한, 용어 "L-아미노산"은 유리 형태의 L-아미노산, 이의 염 또는 이들의 혼합물을 의미한다.
용어 "변형되지 않은 균주"는 구체적으로 특정한 특성을 갖는 방식으로 변형되지 않은 대조군 균주를 의미한다. 즉, 변형되지 않은 균주의 예시에는 야생형 균주와 모균주가 포함된다.
용어 "상동성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 모듈 사이의 백분율 동일성을 의미한다. 당업계에 공지된 방법을 사용하여 하나의 모듈과 다른 모듈 사이의 서열 상동성을 측정할 수 있다. 예를 들어, BLAST 알고리즘을 통해 이러한 서열 상동성을 측정할 수 있다.
용어 "작동 가능한 연결"은 조절 서열과 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 기능성 연결을 의미하며, 조절 서열이 폴리뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 제어한다. 조절 서열은 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 향상시킬 수 있는 강력한 프로모터일 수 있다. 조절 서열은 코리네박테리움속에 속하는 미생물 유래의 프로모터이거나 다른 미생물 유래의 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 trc 프로모터, gap 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터, araBAD 프로모터 또는 cj7 프로모터일 수 있다.
용어 "벡터"는 유전자의 조절 서열 및 유전자 서열을 포함하고 적합한 숙주 세포에서 표적 유전자를 발현하도록 구성된 폴리뉴클레오티드 구축물을 의미한다. 또는 벡터는 폴리뉴클레오티드 구축물을 의미할 수도 있으며, 여기에는 상동성 재조합에 사용될 수 있는 서열이 포함되므로, 숙주 세포에 대한 벡터의 도입으로 인해, 숙주 세포의 게놈에서 내인성 유전자의 조절 서열이 변형될 수 있거나, 발현 가능한 표적 유전자를 숙주 게놈의 특정 부위에 삽입할 수 있다. 이러한 점에서, 본 발명에서 사용되는 벡터는 벡터의 숙주 세포로의 도입 또는 벡터의 숙주 세포의 염색체로의 삽입을 확인하기 위한 선별 마커를 더 포함할 수 있다. 선별 마커는 약물 내성, 영양 결실형, 세포독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질 발현과 같은 선별 가능한 표현형을 부여하는 마커를 포함할 수 있다. 이러한 선별제로 처리하는 환경에서, 선별 마커를 발현하는 세포만이 생존하거나 상이한 표현형 특성을 나타낼 수 있기 때문에 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형질전환"은 폴리뉴클레오티드가 유전자외 요소로 사용되거나 숙주 세포의 게놈 내로 삽입되어 복제될 수 있도록 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 것을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 벡터를 형질전환하는 방법은 핵산을 세포에 도입하는 방법을 포함할 수 있다. 또한, 관련 기술에 개시된 바와 같이, 숙주 세포에 따라 전기 펄스 방식을 실시할 수 있다.
본 발명의 유익한 효과는 다음과 같다.
본 발명에서는 NCgl0609 유전자 또는 NCgl1575 유전자를 약화시키거나 녹아웃시킴으로써, 상기 유전자 코딩의 산물이 아미노산 생산능에 영향을 미치는 것을 확인하였으며, 코딩 서열에 점 돌연변이를 도입하거나, 해당 유전자의 카피 수를 증가시키거나 과발현시켜 재조합 균주를 획득하며, 수득된 균주는 야생형 균주에 비해 고농도의 아미노산 생산에 유리하다. 그러나 lysC 유전자의 프로모터 영역에 점 돌연변이를 도입하여 재조합 균주를 획득하며, 수득한 균주는 돌연변이되지 않은 균주에 비해, L-라이신의 생산량을 대폭 증가시킬 수 있고, 생산 효율을 더욱 향상시킬 수 있으며, 생산 비용을 절감하여 대중화가 용이하다.
이하에서는 구체적인 실시예를 참조하여 본 발명의 기술적 해결책을 보다 상세하게 설명한다. 이하에 나열된 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하고 해석하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 보호 범위를 제한하는 것으로 해석할 수 없는 점에 유의한다. 본 발명의 상기 내용으로 구현되는 기술은 모두 본 발명에서 보호하고자 하는 범위 내에 속한다. 달리 명시되지 않는 한, 이하의 실시예에 사용된 원료 및 시약은 모두 시판되는 제품이거나, 공지된 방법으로 제조할 수 있으며, 수행된 조작은 모두 당업계에 공지된 것이거나 시판되는 제품의 사용자 지침에 따라 수행할 수 있는 것이다.
하기 실시예에서 배양에 사용된 균주에 사용된 기본 배지는 성분이 동일하며, 해당 기본 배지 성분 상에 상응하는 필요한 수크로스, 카나마이신 또는 클로람페니콜 등을 첨가한다. 기본 배지는 다음과 같이 구성된다.
Figure pct00002
하기 실시예에서 SSCP 전기영동 PAGE의 제조 및 조건은 다음과 같다.
Figure pct00003
하기 실시예에서, L-라이신의 발효 배지 및 발효 공정은 표 1 및 2와 같다.
표 1 L-라이신 발효 배지 배합
Figure pct00004
표 2 L-라이신의 발효 제어 공정
Figure pct00005
하기 실시예에서, L-글루탐산의 발효 배지 및 발효 공정은 표 3 및 4와 같다.
표 3 L-글루탐산 발효 배지 배합
Figure pct00006
표 4 L-글루탐산의 발효 제어 공정
Figure pct00007
실시예 1 점 돌연변이된 NCgl0609 유전자 코딩 영역을 포함하는 형질전환 벡터 pk18-NCgl0609 R334*의 구축
NCBI에서 공표한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 서열에 따라, NCgl0609 유전자 코딩 영역을 증폭하기 위한 2쌍의 프라이머를 설계 및 합성하였으며, 대립유전자 치환 방식으로 균주 YP97158[기탁번호: CGMCC No.12856, 기탁일자: 2016년 8월 16일, 기탁장소: 중국과학원미생물학연구소, 베이징 차오양구 베이천서로 1호원 3호, 전화: 010-64807355, 중국특허출원 CN106367432A(출원일 2016년 9월 1일, 공개일자 2017년 2월 1일)에 기록, 시퀀싱을 거쳐 해당 균주 염색체 상에 야생형 NCgl0609 유전자가 남아 있음을 확인] 배경에 NCgl0609 유전자 코딩 영역(SEQ ID NO:1, 해당 코딩 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:3)에 점 돌연변이를 도입하고, NCgl0609 유전자의 뉴클레오티드 서열 1000번째 부위 C가 T(SEQ ID NO:2)로 변경되고, 해당 코딩 단백질의 아미노산 서열 334번째 부위 아르기닌이 터미네이터(SEQ ID NO:4, NCgl0609 R334*)로 변경되었다. 프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 invitrogen에서 합성).
P1: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGGACGGCAAC GTACATAAC3'(SEQ ID NO:5)
P2: 5' GTTGCCGGTGAGTCAAACAGTCATTTTGC 3' (SEQ ID NO:6)
P3: 5' GCAAAATGACTGTTTGACTCACCGGCAAC 3' (SEQ ID NO:7)
P4: 5' CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCGGCTG GAA ATGTGGAG3' (SEQ ID NO:8)
구축 방법: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 템플릿으로 하여, 각각 프라이머 P1 및 P2, P3 및 P4로 PCR 증폭을 수행한다. PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM)4μL, Mg2+(25mM)4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL)0.25μL, 총 부피 50μL이다. 상기 PCR 증폭은 다음과 같은 방식으로 수행한다. 94℃에서 5분 동안 전변성, (94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 40초 동안 신장, 30사이클), 72℃에서 10분 동안 과신장하여 크기가 각각 698bp 및 648bp이고, NCgl0609 유전자 코딩 영역을 포함하는 DNA 단편(NCgl0609 Up과 NCgl0609 Down)을 획득한다. 상기 2개의 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 분리 정제한 후, 다시 상기 2개의 DNA 단편을 템플릿으로 사용하고, P1 및 P4를 프라이머로 사용하여, Overlap PCR을 통해 길이 1317bp의 단편으로 증폭하였다.
PCR 시스템은 다음과 같다. 즉, 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM)4μL, Mg2+(25mM)4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL)0.25μL, 총 부피 50μL이다. 상기 PCR 증폭 방식은 다음과 같다. 즉, 94℃에서 5분 동안 전변성, (94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초 동안 신장, 30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과신장한다. 이 DNA 단편은 YP97158 NCgl0609 유전자 코딩 영역의 1000번째 부위의 사이토신(C)을 타이민(T)으로 변경시키며, 최종적으로 코딩 단백질의 334번째 부위 아미노산이 아르기닌(R)에서 터미네이터로 변경된다. 이 DNA 단편은 아가로스 겔 전기영동 후 정제를 수행하며, 이중 분해 후 정제된 pK18mobsacB 플라스미드(Addgene사에서 구매, 각각 Xbal I/BamH I 이중 분해 사용)와 NEBuilder 효소(NEB사에서 구매)로 50℃에서 30분 동안 연결하며, 연결 생성물은 형질전환 후 성장한 단일클론이 PCR을 거쳐 양성 벡터 pk18-NCgl0609 R334*를 획득한다. 해당 플라스미드 상에는 카나마이신 내성 마커를 포함한다. 분해가 정확한 벡터 pk18-NCgl0609 R334*를 시퀀싱사에 보내 시퀀싱 식별을 수행하고, 정확한 점 돌연변이(C-T)를 포함하는 벡터 pk18-NCgl0609 R334*는 향후 사용을 위해 보관한다.
실시예 2 점 돌연변이를 포함하는 NCgl0609 R334*의 조작 균주의 구축
구축 방법: 대립 유전자 치환 플라스미드 pk18-NCgl0609 R334*를 전기충격에 의해 L-라이신 생산균주 YP97158로 형질전환하였다(이의 구축 방법은 WO2014121669A1 참조; 시퀀싱을 거쳐 해당 균주 염색체 상에 야생형 NCgl0609 유전자 코딩 영역이 남아 있음을 확인). 배양 생성된 단일 콜로니는 각각 프라이머 P1 및 범용 프라이머 M13R을 통해 동정하였으며, 1375bp 크기 밴드를 증폭할 수 있는 균주가 양성 균주이다. 양성 균주는 15% 수크로스가 포함된 배지에서 배양하며, 배양 생성된 단일 콜로니는 각각 카나마이신이 포함된 배지와 카나마이신이 포함되지 않은 배지에서 배양한다. 카나마이신이 포함되는 않은 배지에서는 성장하나, 카나마이신이 포함된 배지에서는 성장하지 않는 균주는 다음 프라이머(상하이 Invitrogen사에서 합성)를 사용해 PCR 동정을 추가로 수행한다.
P5: 5' CTAGCCGGTTCCAGTCAG 3' (SEQ ID NO:9)
P6: 5' GGACGTCTGTTCACCATTG 3' (SEQ ID NO:10)
상기 PCR 증폭 생성물 264bp는 95℃ 고온에서 10분 동안 변성시키고, 5분 동안 얼음욕에서 처리한 후 sscp 전기영동(플라스미드 pk18-NCgl0609 R334* 증폭 단편을 양성 대조군으로, YP97158 증폭 단편을 음성 대조군으로, 물을 블랭크 대조군으로 사용)을 수행한다. 단편 구조와 전기영동 위치가 다르기 때문에, 단편 전기영동 위치가 음성 대조군 단편 위치와 일치하지 않고 양성 대조군 단편 위치와 일치하는 균주는 대립 유전자 치환이 성공한 균주이다. 다시 프라이머 P5/P6 PCR를 통해 양성 균주 NCgl0609의 단편을 증폭하고, PMD19-T 벡터에 연결하여 시퀀싱을 수행하여 서열을 비교하고 염기 서열에 돌연변이(C-T)가 발생한 균주는 대립 유전자 치환이 성공한 양성 균주이며, YPL-4-041로 명명한다.
실시예 3 게놈 상에서 NCgl0609 및 NCgl0609 R334* 유전자를 과발현하는 조작 균주의 구축
NCBI에서 발표한 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 서열에 따라, 3쌍의 업스트림 및 다운스트림 상동성 아암 단편 및 NCgl0609 또는 NCgl0609 R334* 유전자 코딩 영역 및 프로모터 영역 서열을 증폭하는 프라이머를 설계 및 합성하고, 상동성 재조합의 방식으로 균주 YP97158에 NCgl0609 또는 NCgl0609 R334* 유전자를 도입한다.
프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 invitrogen에서 합성).
P7: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCGTTCTGGACTGAGG3' (SEQ ID NO:11)
P8: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCGTTCTGGACTGAGG3' (SEQ ID NO:12)
P9: 5' CATCTGTTCTCGGTGCACCAGCTGCGAGGATCATCTC 3' (SEQ ID NO:13)
P10: 5' GATTTAATTGCGCCATCTGATTCTGGCAACAACTCCTTCCTTGACC 3' (SEQ ID NO:14)
P11: 5' GGTCAAGGAAGGAGTTGTTGCCAGAATCAGATGGCGCAATTA AATC AAG 3' (SEQ ID NO:15)
P12: 5' CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGCTATGAC ACCTTCAACGGATC 3' (SEQ ID NO:16)
구축 방법: 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 또는 YPL-4-041을 템플릿으로 사용하고, 각각 프라이머 P7/P8, P9/P10, P11/P12를 PCR 증폭하여, 업스트림 상동성 아암 단편 768bp, NCgl0609 또는 NCgl0609 R334* 유전자 및 이의 프로모터 단편 1626bp 및 다운스트림 상동성 아암 단편 623bp를 획득한다. PCR 반응 종료 후, 증폭된 3개의 단편을 칼럼 DNA 겔 회수 키트를 이용하여 전기영동하여 회수한다. 회수된 3개의 단편과 이중 분해 후 정제된 pK18mobsacB 플라스미드(Addgene사에서 구입, 각각 Xbal I/BamH I로 이중 분해)와 NEBuilder 효소(NEB에서 구입)로 50℃에서 30분 동안 연결하고, 연결 생성물이 형질전환 후 성장한 단일 클론을 PCR로 확인하여 양성 통합 플라스미드를 획득한다. 해당 플라스미드 상에는 카나마이신 내성 마커가 포함되며, 카나마이신 선별을 통해 플라스미드가 게놈 상에 통합된 재조합체를 획득할 수 있다.
PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM)4μL, Mg2+(25mM)4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL)0.25μL, 총 부피 50μL이다. 상기 PCR 증폭은 다음과 같이 수행한다. 94℃에서 5분 동안 전변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초 동안 신장(30 사이클) , 72℃에서 10분 동안 과신장한다. 정확하게 시퀀싱된 통합 플라스미드를 L-라이신 생산 균주 YP97158에 전기형질전환하고, 배양 생산된 단일 콜로니를 P13/P14 프라이머로 PCR 동정을 수행하며, 1317bp 크기를 포함하는 PCR 증폭 단편은 양성 균주이고, 증폭되지 않는 단편은 원래 균이다. 양성 균주를 15% 수크로스가 함유된 배지에서 배양하고, 배양 생성된 단일 콜로니를 P15/P16 프라이머를 이용하여 PCR로 추가 동정하며, 1352bp 크기의 증폭된 균은 NCgl0609 또는 NCgl0609 R334* 유전자가 YP97158 게놈에 통합된 양성 균주이고, 이는 YPL-4-042(돌연변이 점 없음) 및 YPL-4-043(돌연변이 점 있음)으로 명명한다.
P13: 5' TCCAAGGAAGATACACGCC 3' (SEQ ID NO:17)
P14: 5' CGAAATGGAAGTTGTGCG 3' (SEQ ID NO:18)
P15: 5' CGATGATGCCGATTACCTC 3' (SEQ ID NO:19)
P16: 5' CGTTGGAATCTTGCGTTG 3' (SEQ ID NO:20)
실시예 4 플라스미드 상에서 NCgl0609 또는 NCgl0609 R334* 유전자를 과발현하는 조작 균주의 구축
NCBI에서 발표한 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 서열에 따라, 한 쌍의 NCgl0609 또는 NCgl0609 R334* 유전자 코딩 영역 및 프로모터 영역 서열을 증폭시키는 프라이머를 설계 및 합성하며, 프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 invitrogen사에서 합성).
P17: 5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCAGCTGCGAGGATCATCTC3' (SEQ ID NO:21)
P18: 5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACCAACAACTCCTTCCTTGACC3' (SEQ ID NO:22)
구축 방법: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 및 YPL-4-041을 템플릿으로 각각 사용하고, 프라이머 P17/P18로 PCR 증폭을 수행하여, NCgl0609와 NCgl0609 R334* 유전자 및 이의 프로모터 단편 1582bp를 획득한다. 증폭 생성물에 대해 전기영동을 수행하고 칼럼 DNA 겔 회수 키트로 정제하며, 회수된 DNA 단편을 EcoR I 분해 회수한 셔틀 플라스미드 pXMJ19와 NEBuilder 효소(NEB사에서 구입)를 이용해 50℃에서 30분 동안 연결한다. 연결 생성물을 형질전환시킨 후 성장한 단일 클론은 M13 프라이머로 PCR 동정을 거쳐 양성 과발현 플라스미드 pXMJ19-NCgl0609 및 pXMJ19-NCgl0609 R334*를획득하고, 해당 플라스미드를 시퀀싱을 위해 보낸다. 플라스미드 상에는 클로람페니콜 내성 마커가 포함되어 있기 때문에, 클로람페니콜을 통해 플라스미드가 균주로 형질전환되는지 여부를 스크리닝할 수 있다.
PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM)4μL, Mg2+(25mM)4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL)0.25μL, 총 부피 50μL이다.
상기 PCR 증폭은 다음과 같이 수행한다. 94℃에서 5분 동안 전변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초 동안 신장(30 사이클) , 72℃에서 10분 동안 과신장한다.
정확하게 시퀀싱된 pXMJ19- NCgl0609와 pXMJ19-NCgl0609 R334* 플라스미드를 각각 L-라이신 생산 균주 YP97158로 전기형질전환하고, 배양 생산된 단일 콜로니는 프라이머 M13F/P18을 통해 PCR 동정을 수행하고, PCR 증폭된 크기 1585bp 단편을 포함한 것은 양성 균주이며, 이를 YPL-4-044(돌연변이 점 없음)와 YPL-4-045(돌연변이 점 있음)로 명명한다.
실시예 5 게놈 상에서 NCgl0609 유전자가 결실된 조작 균주의 구축
NCBI에서 공개한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 서열에 따르면, 2쌍의 NCgl0609 유전자 코딩 영역의 양단 단편을 증폭하는 프라이머를 합성하여, 업스트림 및 다운스트림 상동성 아암 단편으로 사용한다. 프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 Invitrogen에서 합성).
P19: 5' CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGAATGGGATGGGTCG3' (SEQ ID NO:23)
P20: 5' CATCATCGGTTACTCTGGCCGAAATGGAAGTTGTGCG 3' (SEQ ID NO:24)
P21: 5' CGCACAACTTCCATTTCGGCCAGAGTAACCGATGATG 3' (SEQ ID NO:25)
P22:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCAACAACTCCTTCCTTGACC3' (SEQ ID NO:26)
구축 방법: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 템플릿으로 하여, 각각 프라이머 P19/P20 및 P21/P22로 PCR 증폭을 수행하여, 업스트림 상동성 아암 단편 661bp 및 다운스트림 상동성 아암 단편 692bp를 획득한다. 다시 프라이머 P19/P22로 OVERLAP PCR을 수행하여 전체 상동성 아암 단편 1334bp를 획득한다. 증폭된 생성물에 대해 전기영동을 수행하고 칼럼 DNA 겔 회수 키트를 이용하여 정제하며, 회수된 DNA 단편은 이중 분해 및 정제된 pK18mobsacB 플라스미드(Addgene사에서 구입, 각각 Xbal I/BamHI로 이중 분해)와 NEBuilder 효소(NEB사에서 구입)로 50℃에서 30분 동안 연결하며, 연결 생성물이 형질전환된 후 성장한 단일 클론을 M13 프라이머로 PCR로 동정하여 양성 녹아웃 벡터 pK18-ΔNCgl0609를 획득하며, 해당 플라스미드를 시퀀싱을 위해 이송한다. 해당 플라스미드는 선별 마커로 카나마이신 내성을 포함한다.
PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM)4μL, Mg2+(25mM)4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL)0.25μL, 총 부피 50μL이다.
상기 PCR 증폭은 다음과 같이 수행한다. 94℃에서 5분 동안 전변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 90초 동안 신장(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과신장한다.
시퀀싱이 정확한 녹아웃 플라스미드 pK18-ΔNCgl0609를 라이신 생산 균주 YP97158로 전기형질전환하고, 배양 생산된 단일 콜로니를 다음 프라이머(상하이 Invitrogen사에서 합성)를 사용하여 PCR 동정을 수행한다.
P23: 5' AATGAATGG GATGGGTCG 3' (SEQ ID NO:27)
P24: 5' CAACAACT CCT TCCTTGACC 3' (SEQ ID NO:28)
상기 PCR은 크기 1334bp 및 1788bp의 밴드를 가진 균주를 동시에 증폭한 것은 양성 균주이고, 1788bp 밴드만 증폭한 균주는 원래 균이다. 양성 균주는 15% 수크로스 배지에서 선별한 후 카나마이신이 포함된 배지와 카나마이신이 포함되지 않은 배지에서 각각 배양하며, 카나마이신이 함유되지 않은 배지에서 성장하나, 카나마이신이 함유된 배지에서는 성장하지 않는 균주는 P23/P24 프라이머를 사용하여 PCR 동정을 추가로 수행하고, 1334bp의 밴드 크기로 증폭된 균주는 NCgl0609 유전자 코딩 영역이 녹아웃된 양성 균주이다. 다시 P23/P24 프라이머를 통해 양성 균주 NCgl0609 단편을 PCR 증폭하고, PMD19-T 벡터에 연결하여 시퀀싱을 수행하며, 시퀀싱이 정확한 균주를 YPL-4-046으로 명명한다.
실시예 6 L-라이신 발효 실험
실시예 2-5에서 구축한 균주 및 원균주 YP97158을 BLBIO-5GC-4-H형 발효기(Shanghai Bailun Biotechnology사에서 구입)에서 표 1과 같은 배지와 표 2와 같은 제어 공정으로 발효 실험을 수행한다. 각 균주는 3회 반복하였으며, 그 결과는 표 5와 같다.
표 5 L-라이신 발효 실험 결과
Figure pct00008
결과는 표 5와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 NCgl0609 유전자 코딩 영역에 대해 점 돌연변이 NCgl0609 R334* 및 과발현을 수행하면, L-라이신 생산량 및 성장 속도 향상에 도움이 되나, 유전자를 약화시키거나 녹아웃시켜 L-라이신의 축적에는 도움이 되지 않고, 동시에 균주의 성장 속도를 저하시킬 수 있다.
실시예 7 글루탐산 생산 균주에 NCgl0609 유전자 과발현을 도입하거나, NCgl0609 유전자 코딩 영역에 대해 점 돌연변이 NCgl0609 R334* 및 과발현을 수행하고, 발효 실험을 수행
실시예 1-5의 방법에 따라, 동일한 프라이머 및 실험 조건을 사용하여, 코리네박테리움 ATCC13869를 출발균으로, ATCC 13869의 균을 발현균으로 사용하여, 점 돌연변이의 NCgl0609 R334*를 포함하는 글루탐산 생산 조작 균주 YPG-013, 게놈에서 NCgl0609 및 NCgl0609 R334* 유전자를 과발현하는 글루탐산 생산 조작 균주 YPG-014 및 YPG-015, 플라스미드에서 NCgl0609 및 NCgl0609 R334* 유전자를 과발현하는 글루탐산 생산 조작 균주 YPG -016 및 YPG-017, 및 게놈에서 NCgl0609 유전자가 결실된 글루탐산 생산 조작 균주 YPG-018를 획득한다.
실시예에서 구축한 균주 및 원균주 ATCC 13869의 균을 발현균으로 BLBIO-5GC-4-H형 발효기(Shanghai Bailun Biotechnology사에서 구입)에서 표 3과 같은 배지와 표 4와 같은 제어 공정으로 발효 실험을 수행한다. 각 균주는 3회 반복하였으며, 그 결과는 표 6과 같다.
표 6 L-글루탐산 발효 실험 결과
Figure pct00009
결과는 표 6과 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 NCgl0609 유전자 코딩 영역에 대해 점 돌연변이 NCgl0609 R334* 및 과발현을 수행하면, L-글루탐산 생산량 및 성장 속도 향상에 도움이 되나, 유전자를 약화시키거나 녹아웃시켜 L-글루탐산의 축적에는 도움이 되지 않고, 동시에 균주의 성장 속도를 저하시킬 수 있다.
실시예 8 점 돌연변이의 NCgl1575 유전자 코딩 영역을 포함하는 형질전환 벡터 pK18-NCgl1575 A1775T 구축
NCBI에서 공개한 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 서열에 따라, 2쌍의 NCgl1575 유전자 코딩 영역 서열을 증폭시키는 프라이머를 설계 및 합성하고, 대립유전자 치환 방식으로 YP97158(시퀀싱을 거쳐 해당 균주 염색체 상에 야생형 NCgl1575 유전자가 남아 있음을 확인) 배경의 NCgl1575 유전자 코딩 영역(SEQ ID NO:29)에 점 돌연변이를 도입하며, 해당 코딩 단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:31이고, NCgl1575 유전자의 뉴클레오티드 서열 1775번째 부위 A가 T(SEQ ID NO:30: NCgl1575 A1775T)로 변경되고, 해당 코딩 단백질의 아미노산 서열 592번째 부위 티로신이 페닐알라닌(SEQ ID NO:32：NCgl1575 Y592F)으로 변경된다.
프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 invitrogen에서 합성).
P1’:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG TGCGTTCGTCTGCGGTTTCG 3' (SEQ ID NO:33)
P2’: 5' ATCGACGCCGCCCCATTCACCCTTCTGATG 3' (SEQ ID NO:34)
P3’: 5' CATCAGAAGGGTGAATGGGGCGGCGTCGAT 3' (SEQ ID NO:35)
P4’:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC AAGCCTCGACCCCTACATC 3' (SEQ ID NO:36)
구축 방법: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 템플릿으로, 각각 프라이머 P1' 및 P2', P3' 및 P4'로 PCR 증폭한다.
PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM)4μL, Mg2+(25mM)4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL)0.25μL, 총 부피 50μL이다.
상기 PCR 증폭은 하기의 방식으로 수행한다. 94℃에서 5분 동안 전변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 40초 동안 신장(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과신장하여, 2개의 크기가 각각 766bp와 759bp이며, NCgl1575 유전자 코딩 영역을 포함하는 DNA 단편(NCgl1575 Up 및 NCgl1575 Down)을 획득한다.
상기 2개의 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 분리 정제한 후, 다시 상기 2개의 DNA 단편을 템플릿으로 사용하고, P1' 및 P4'를 프라이머로 사용하여, 중첩 PCR을 통해 길이 1495bp의 단편으로 증폭하였다.
PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM)4μL, Mg2+(25mM)4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL)0.25μL, 총 부피 50μL이다.
상기 PCR 증폭은 다음과 같이 수행한다. 94℃에서 5분 동안 전변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 90초 동안 신장(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과신장한다.
이 DNA 단편(NCgl1575 A1775T)은 YP97158 NCgl1575 유전자 코딩 영역의 1775번째 부위의 아데닌(A)을 타이민(T)으로 변경하고, 최종적으로 코딩 단백질의 592번째 부위 아미노산을 티로신(Y)에서 페닐알라닌(F)으로 변경한다.
아가로스 겔 전기영동에 의해 분리 정제된 NCgl1575 A1775T 및 Xba I 분해에 의해 회수된 pK18mobsacB 플라스미드(Addgene사에서 구입)를 NEBuider 재조합 시스템으로 조립하여 벡터 pK18-NCgl1575 A1775T를 획득하며, 해당 플라스미드에는 카나마이신 내성 마커가 포함된다. 벡터 pK18-NCgl1575 A1775T를 시퀀싱 식별을 위해 시퀀싱 회사로 보내고, 정확한 점 돌연변이(A-T)를 포함하는 벡터 pK18-NCgl1575 A1775T는 향후 사용을 위해 보존한다.
실시예 9 점 돌연변이의 NCgl1575 A1775T를 포함하는 조작 균주의 구축
구축 방법: 대립 유전자 치환 플라스미드 pK18-NCgl1575 A1775T를 전기천공법에 의해 L-라이신 생산 균주 YP97158로 형질전환하였고, 배양 생산된 단일 콜로니를 각각 프라이머 P1' 및 범용 프라이머 M13R로 동정하였고, 1502bp 크기 밴드를 증폭시킬 수 있는 균주는 양성 균주이다. 양성 균주는 15% 수크로스가 포함된 배지에서 배양하며, 배양 생성된 단일 콜로니는 각각 카나마이신이 포함된 배지와 카나마이신이 포함되지 않은 배지에서 배양한다. 카나마이신이 포함되는 않은 배지에서는 성장하나, 카나마이신이 포함된 배지에서는 성장하지 않는 균주는 다음 프라이머(상하이 Invitrogen사에서 합성)를 사용해 PCR 동정을 추가로 수행한다.
P5’: 5' CACATC AGCTTGATTT CTGC 3' (SEQ ID NO:37)
P6’: 5' GGTCATTGCC GATGAAGCCC 3' (SEQ ID NO:38)
상기 PCR 증폭 생성물 256bp는 고온에서 변성시키고, 얼음욕에서 처리한 후 sscp 전기영동(플라스미드 pK18-NCgl1575 A1775T 증폭 단편을 양성 대조군으로, YP97158 증폭 단편을 음성 대조군으로, 물을 블랭크 대조군으로 사용)을 수행한다. 단편 구조와 전기영동 위치가 다르기 때문에, 단편 전기영동 위치가 음성 대조군 단편 위치와 일치하지 않고 양성 대조군 단편 위치와 일치하는 균주는 대립 유전자 치환이 성공한 균주이다. 프라이머 P5'와 P6'으로 다시 PCR을 통해 대립유전자 치환에 성공한 균주 표적 단편을 증폭하고 PMD19-T 벡터에 연결하여 시퀀싱하고, 서열 비교를 통해 염기 서열에 돌연변이를 발생시키는 서열에 대해 균주의 대립유전자 치환 성공을 확인하고, YPL-4-023으로 명명한다.
실시예 10 게놈에서 NCgl1575 또는 NCgl1575 A1775T 유전자를 과발현하는 조작 균주의 구축
NCBI에서 발표한 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 서열에 따라, 3쌍의 업스트림 및 다운스트림 상동성 아암 단편 및 NCgl1575 또는 NCgl1575 A1775T 유전자 코딩 영역 및 프로모터 영역 서열을 증폭하는 프라이머를 설계 및 합성하고, 상동성 재조합의 방식으로 균주 YP97158에 NCgl1575 또는 NCgl1575 A1775T 유전자를 도입한다.
프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 invitrogen에서 합성).
P7’：5' CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATG
CGTTCTGGACTGAGG 3' (SEQ ID NO:39)
P8’：5' GAAACGGCCTTAAGCTAGGTGCACCGAG AACAGATG 3' (SEQ ID NO:40)
P9’：5' CATCTGTTCTCGGTGCAC CTAGCTTAAG GCCGTTTC 3' (SEQ ID NO:41)
P10’：5' CTTGATTTAATTGCGCCATCAAGCTTTTCC CGCCCGGTT 3' (SEQ ID NO:42)
P11’：5' AACCGGGCGG GAAAAGCTTGATGGCGCAATTAAATCAAG 3' (SEQ ID NO:43)
P12’：5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC GCTAT
GACACCTTCAACGGATC 3' (SEQ ID NO:44)
구축 방법: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 또는 YPL-4-023을 템플릿으로 사용하고, 프라이머 P7'/P8', P9'/P10', P11'/P12'로 각각 PCR 증폭을 수행하여, 업스트림 상동성 아암 단편 802bp, NCgl1575 유전자 및 이의 프로모터 단편 2737bp, 또는 NCgl1575 A1775T 유전자 및 이의 프로모터 단편 2737bp, 다운스트림 상동성 아암 단편 647bp를 획득한다. 다시 P7'/P12'를 프라이머로 사용하여, 상기 증폭된 3개 단편(업스트림 상동성 아암 단편, NCgl1575 유전자 및 이의 프로모터 단편, 다운스트림 상동성 아암 단편, 또는 업스트림 상동성 아암 단편, NCgl1575 A1775T 유전자 및 이의 프로모터 단편, 다운스트림 상동성 아암 단편)을 템플릿으로 혼합하여 증폭시켜, 통합 상동성 아암 단편 4111bp를 획득한다.
PCR 반응 종료 후, 증폭된 생성물에 대해 전기영동을 수행하여 회수하고, 칼럼 DNA 겔 회수 키트(TIANGEN)를 이용하여 필요한 4111bp의 DNA 단편을 회수하며, NEBBuider 재조합 시스템을 사용하여 Xba I 분해 회수된 셔틀 플라스미드 PK18mobsacB를 연결하여, 통합 플라스미드 PK18mobsacB-NCgl1575 또는 PK18mobsacB-NCgl1575 A1775T를 획득한다. 플라스미드 상에는 카나마이신 내성 마커가 포함되며, 카나마이신 선별을 통해 플라스미드가 게놈 상에 통합된 재조합체를 획득할 수 있다.
PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM)4μL, Mg2+(25mM)4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL)0.25μL, 총 부피 50μL이다.
상기 PCR 증폭은 다음과 같이 수행한다. 94℃에서 5분 동안 전변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 180초 동안 신장(30 사이클), 72℃에서 10분 동안 과신장한다.
2개의 통합 플라스미드를 L-라이신 생산 균주 YP97158에 각각 전기형질전환하고, 배양 생산된 단일 콜로니를 P13'/P14' 프라이머로 PCR 동정을 수행하며, 1778bp 크기를 포함하는 PCR 증폭 단편은 양성 균주이고, 증폭되지 않는 단편은 원래 균이다. 양성 균주는 15% 수크로스 배지에서 선별한 후 각각 카나마이신이 포함된 배지와 카나마이신이 포함되지 않은 배지에서 배양하며, 카나마이신이 포함되지 않은 배지에서는 성장하나, 카나마이신이 포함된 배지에서는 성장하지 않는 균주는 P15'/P16' 프라이머를 이용하여 PCR 동정을 추가로 수행하고, 크기가 1756bp인 균을 증폭시키는 NCgl1575 또는 NCgl1575 A1775T 유전자는 YP97158 게놈 상의 균주에 통합하고, 이를 각각 YPL-4-024(돌연변이 점 없음) 및 YPL-4-025(돌연변이 점 있음)로 명명한다.
P13’: 5' TCCAAGGAAGATACACGCC 3' (SEQ ID NO:45)
P14’: 5' CTTCTGATGA CCGGCACACC 3' (SEQ ID NO:46)
P15’: 5' TAGTCGATGA CGCGGGTGCG 3' (SEQ ID NO:47)
P16’: 5' CGTTGGAATCTTGCGTTG 3' (SEQ ID NO:48)
실시예 11 플라스미드에서 NCgl1575 또는 NCgl1575 A1775T 유전자를 과발현하는 조작 균주의 구축
NCBI에서 발표한 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 서열에 따라, 한 쌍의 NCgl1575 또는 NCgl1575 A1775T 유전자 코딩 영역 및 프로모터 영역 서열을 증폭시키는 프라이머를 설계 및 합성하며, 프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 invitrogen사에서 합성).
P17’：5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCC CTAGCT
TAAG GCCGTTTC 3' (SEQ ID NO:49)
P18’：5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAAC AAGCTTT
TCC CGCCCGGTT 3' (SEQ ID NO:50)
구축 방법: 각각 ATCC13032와 YPL-4-023을 템플릿으로 사용하고, 프라이머 P17'/P18'을 이용하여 PCR 증폭을 수행하여, NCgl1575 또는 NCgl1575 A1775T 유전자 및 이의 프로모터 단편 2749bp를 획득하고, 증폭 생성물을 전기영동하여 회수하고, 칼럼 DNA 겔 회수 키트로 필요한 2749bp의 DNA 단편을 회수하며, NEBuider 재조합 시스템을 사용하여 EcoR I 분해 회수된 셔틀 플라스미드 pXMJ19와 연결하여, 과발현 플라스미드 pXMJ19-NCgl1575 및 pXMJ19-NCgl1575 A1775T를 획득한다. 플라스미드 상에는 클로람페니콜 내성 마커가 포함되며, 클로람페니콜 스크리닝을 통해 플라스미드가 균주로 형질전환되는 것을 획득할 수 있다.
PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM)4μL, Mg2+(25mM)4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL)0.25μL, 총 부피 50μL이다.
상기 PCR 증폭은 다음과 같이 수행한다. 94℃에서 5분 동안 전변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 120초 동안 신장(30 사이클) , 72℃에서 10분 동안 과신장한다.
pXMJ19-NCgl1575와 pXMJ19-NCgl1575 A1775T 플라스미드를 각각 L-라이신 생산 균주 YP97158로 전기형질전환하고, 배양 생산된 단일 콜로니는 M13(-48)과 P18’ 프라이머를 통해 PCR 동정을 수행하고, PCR 증폭된 크기 2752bp 단편을 포함한 것은 도입 균주이며, 이를 YPL-4-026(돌연변이 점 없음)와 YPL-4-027(돌연변이 점 있음)로 명명한다.
실시예 12 게놈에서 NCgl1575 유전자가 결실된 조작 균주를 구축
NCBI에서 공개한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 서열에 따르면, 2쌍의 NCgl1575 유전자 코딩 영역의 양단 단편을 증폭하는 프라이머를 합성하여, 업스트림 및 다운스트림 상동성 아암 단편으로 사용한다. 프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 Invitrogen에서 합성).
P19’：5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGACCG
GCGCAG ATGCCAACGC 3' (SEQ ID NO:51)
P20’：CCCAGAACTGAAGGTCTAATTGCCTAAGG CCGGAATT 3' (SEQ ID NO:52)
P21’：AATTCCGGCCTTAGGCAATTAGACCTTC AGTTCTGGG 3' (SEQ ID NO:53)
P22’：5' CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC GCT
TGATGAA GGCTCCAG 3' (SEQ ID NO:54)
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 템플릿으로 사용하여, 각각 프라이머 P19'/P20' 및 P21'/P22'로 PCR 증폭을 수행하고, 업스트림 상동성 아암 단편 775bp 및 다운스트림 상동성 아암 단편 807bp를 획득한 다음, 프라이머 P19'/ P22'로 중첩 PCR을 수행하여 전체 상동성 아암 단편 1545bp를 획득한다. PCR 반응 종료 후, 증폭된 생성물에 대해 전기영동 및 회수를 수행하고, 칼럼 DNA 겔 회수 키트로 필요한 1545bp의 DNA 단편을 회수하고, NEBuider 재조합 시스템을 통해 Xba I 분해 회수한 셔틀 플라스미드 pk18mobsacB 플라스미드와 연결하여 녹아웃 플라스미드를 획득한다. 해당 플라스미드는 카나마이신 내성 마커를 포함한다.
녹아웃 플라스미드를 라이신 생산 균주 YP97158로 전기형질전환하고, 배양 생산된 단일 콜로니를 다음 프라이머(상하이 상하이 Invitrogen에서 합성)로 PCR 동정을 수행한다.
P23’: 5' ACCGGCGCAG ATGCCAACGC 3' (SEQ ID NO:55)
P24’: 5' GCTTGATGAA GGCTCCAG 3' (SEQ ID NO:56)
상기 PCR은 크기 1471bp 및 4150bp의 밴드를 가진 균주를 증폭한 것은 양성 균주이고, 4150bp 밴드만 증폭한 균주는 원래 균이다. 양성 균주는 15% 수크로스 배지에서 선별한 후 카나마이신이 포함된 배지와 카나마이신이 포함되지 않은 배지에서 각각 배양하며, 카나마이신이 함유되지 않은 배지에서 성장하나, 카나마이신이 함유된 배지에서는 성장하지 않는 균주는 P23'/P24' 프라이머를 사용하여 PCR 동정을 추가로 수행하고, 1471bp의 밴드 크기로 증폭된 균주는 NCgl1575 유전자 코딩 영역이 녹아웃된 유전 공학 균주이며, YPL-4-028로 명명한다.
실시예 13 L-라이신 발효 실험
실시예 9-12에서 구축한 균주 및 원균주 YP97158을 BLBIO-5GC-4-H형 발효기(Shanghai Bailun Biotechnology사에서 구입)에서 표 1과 같은 배지와 표 2와 같은 제어 공정으로 발효 실험을 수행한다. 각 균주는 3회 반복하였으며, 그 결과는 표 7과 같다.
표 7 L-라이신 발효 실험 결과
Figure pct00010
결과는 표 7과 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 NCgl1575 유전자 과발현, 또는 NCgl1575 유전자 코딩 영역에 대해 점 돌연변이 NCgl1575 A1775T 및 과발현을 수행하면, L-라이신 생산량 개선에 도움이 되나, 유전자를 약화시키거나 녹아웃시키는 것은 L-라이신의 축적에 도움이 되지 않는다.
실시예 14 점 돌연변이의 lysC 유전자 프로모터 영역을 포함하는 형질전환 벡터 pK18-PlysC(G(-45)A,G(-47)T)의 구축
NCBI에서 공개한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 서열에 따라, 2쌍의 lysC 유전자 프로모터 영역 서열을 증폭하기 위한 프라이머를 설계 및 합성하고, 대립유전자 치환 방식으로 균주 YP97158 배경 중의 lysC 유전자 프로모터 영역(SEQ ID NO:57)에 점 돌연변이를 도입하고, lysC 유전자 프로모터 영역 뉴클레오티드 서열의 -45bp번째 부위 G를 A로 변경하고, -47bp번째 부위 G를 T(SEQ ID NO:58)로 변경한다.
프라이머 설계는 하기와 같다(상하이 invitrogen에서 합성).
P1’’: 5' CCGGAATTCG ACCAAGGATG AGGGCTTTG 3'(EcoR I) (SEQ ID NO:59)
P2’’: 5' AGTTACCCGC TCAATTATAC CTTTATAAAC 3' (SEQ ID NO:60)
P3’’: 5' GTTTATAAAG GTATAATTGAGCGGGTAACT 3' (SEQ ID NO:61)
P4’’: 5' ACATGCATGCGCGTACGCGAAGTGGCACAT 3'(Sph I) (SEQ ID NO:62)
구축 방법: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 템플릿으로 하여, 각각 프라이머 P1'' 및 P2'', P3'' 및 P4''로 PCR 증폭을 수행한다. PCR 시스템: 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM)4μL, Mg2+(25mM)4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL)0.25μL, 총 부피 50μL이다. 상기 PCR 증폭은 다음과 같은 방식으로 수행한다. 94℃에서 5분 동안 전변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 40초 동안 신장, 30사이클, 72℃에서 10분 동안 과신장하여 점 돌연변이를 포함하는, 길이가 각각 729bp 및 760bp인 2개의 DNA 단편(lysC 프로모터 Up 및 lysC 프로모터 Down 단편)을 획득한다. 상기 2개의 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 분리 정제한 후, 다시 정제한 2개의 DNA 단편을 템플릿으로 사용하고, P1'' 및 P4''를 프라이머로 사용하여, Overlap PCR을 통해 길이가 약 1459bp의 단편으로 증폭한다(Up-Down 단편). PCR 시스템은 다음과 같다. 즉, 10×Ex Taq Buffer 5μL, dNTP Mixture(각각 2.5mM)4μL, Mg2+(25mM)4μL, 프라이머(10pM) 각각 2μL, Ex Taq(5U/μL)0.25μL, 총 부피 50μL이다. 상기 PCR 증폭 방식은 다음과 같다. 즉, 94℃에서 5분 동안 전변성, 94℃에서 30초 동안 변성, 52℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 90초 동안 신장, 30 사이클, 72℃에서 10분 동안 과신장한다. 상기 Up-Down 단편은 아가로즈 겔 전기영동으로 분리 정제하였으며, 해당 단편은 lysC 유전자 프로모터 영역 및 이 업스트림 및 다운스트림 서열을 포함하고, 단편 양단은 각각 EcoR I 및 Sph I 제한 부위를 포함한다. 이 DNA 단편은 YP97158 lysC 유전자 프로모터 영역의 -45bp번째 부위의 뉴클레오티드 구아닌(G)을 아데닌(A)으로 변경하고, -47bp번째 부위의 뉴클레오티드 구아닌(G)을 타이민(T)으로 변경한다. 단편을 이중 분해(EcoR I/Sph I)한 후 정제 및 회수하고, 동일하게 이중 분해(EcoR I/Sph I)한 셔틀 플라스미드 pK18mobsacB(Addgene사에서 구입)와 연결하여, 대립 유전자 치환 플라스미드 pK18-PlysC(G(-45)A,G(-47)T)를 획득한다. 해당 플라스미드에는 카나마이신 내성 마커가 포함된다. 또한 벡터 pK18-PlysC(G(-45)A,G(-47)T)는 시퀀싱 동정을 위해 시퀀싱 회사로 보내고, 정확한 점 돌연변이를 포함하는 벡터 pK18-PlysC(G(-45)A,G(-47)T)는 이후 사용할 수 있도록 보관한다.
실시예 15 점 돌연변이를 포함하는 PlysC(G(-45)A,G(-47)T)의 조작 균주 구축
대립 유전자 치환 플라스미드 pK18-PlysC(G(-45)A,G(-47)T)를 전기천공법에 의해 L-라이신 생산 균주 YP97158로 형질전환하였고, 배양 생산된 단일 콜로니를 각각 프라이머 P1'' 및 범용 프라이머 M13F로 동정하였고, 1500bp 크기 밴드를 증폭시킬 수 있는 균주는 양성 균주이다. 양성 균주는 15% 수크로스가 포함된 배지에서 배양하며, 배양 생성된 단일 콜로니는 각각 카나마이신이 포함된 배지와 카나마이신이 포함되지 않은 배지에서 배양한다. 카나마이신이 포함되는 않은 배양 배지에서는 성장하나, 카나마이신이 포함된 배지에서는 성장하지 않는 균주는 다음 프라이머(상하이 Invitrogen사에서 합성)를 사용해 PCR 동정을 추가로 수행한다.
P5’’: 5' ATCAATATATGGTCTGTTTA 3' (SEQ ID NO:63)
P6’’: 5' CTTGGTGGCAACGATCCGTT 3' (SEQ ID NO:64)
상기 PCR 증폭 생성물은 고온에서 변성시키고, 얼음욕에서 처리한 후 sscp 전기영동(플라스미드 pK18-PlysC(G(-45)A,G(-47)T) 증폭 단편을 양성 대조군으로, YP97158 증폭 단편을 음성 대조군으로, 물을 블랭크 대조군으로 사용)을 수행한다. 단편 구조와 전기영동 위치가 다르기 때문에, 단편 전기영동 위치가 음성 대조군 단편 위치와 일치하지 않고 양성 대조군 단편 위치와 일치하는 균주는 대립 유전자 치환이 성공한 균주이다. 다시 PCR을 통해 양성 균주 표적 단편을 증폭하고 PMD19-T 벡터에 연결하여 시퀀싱하고, 서열 비교를 통해 염기 서열에 돌연변이를 발생시키는 서열에 대해 균주의 대립유전자 치환 성공을 확인하고, YPL-4-009로 명명한다.
실시예 16 L-라이신 발효 실험
실시예 15에서 구축한 균주 YPL-4-009 및 원균주 YP97158을 BLBIO-5GC-4-H형 발효기(Shanghai Bailun Biotechnology사에서 구입)에서 표 1과 같은 배지와 표 2와 같은 제어 공정으로 발효 실험을 수행한다. 각 균주는 3회 반복하였으며, 그 결과는 표 8과 같다.
표 8 L-라이신 발효 실험 결과
Figure pct00011
상기 형질전환율 = 라이신 총 질량 / 포도당 총 소모량 * 100%
결과는 표 8과 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 lysC 유전자 프로모터에 대해 점 돌연변이 PlysC(G(-45)A,G(-47)T)를 수행하면, L-라이신 생산량 증가에 도움이 된다.
상기에서는 본 발명의 실시방식을 설명하였다. 그러나 본 발명은 상술한 실시방식에 한정되지 않는다. 본 발명의 사상 및 원리 내에서 이루어진 모든 수정, 동등한 교체, 개선 등은 본 발명의 보호 범위 내에 포함된다.
중국미생물균종기탁관리위원회 일반미생물센터 CGMCC12856 20160816
SEQUENCE LISTING <110> INNER MONGOLIA EPPEN BIOTECH CO., LTD. <120> RECOMBINANT STRAIN FOR PRODUCING L-AMINO ACID, CONSTRUCTION METHOD THEREFOR, AND APPLICATION THEREOF <130> CPWO20411699 <160> 64 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1083 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 gtgtcacaca ccgcgtccac accgacgcca gaggaatact ccgcgcagca acccagcacc 60 cagggcactc gcgttgagtt ccgcggcata accaaagtct ttagcaacaa taaatctgct 120 aaaaccaccg cgcttgataa tgtcactctc accgtagaac ccggtgaggt aatcggcatc 180 atcggttact ctggcgccgg caagtccact cttgtccgcc tcatcaatgg ccttgactcc 240 cccacgagcg gttcgttgct gctcaacggc accgacatcg tcggaatgcc cgagtctaag 300 ctgcgtaaac tgcgcagtaa tatcggcatg attttccagc agttcaacct gttccagtcg 360 cgtactgcgg ctggaaatgt ggagtacccg ctggaagttg ccaagatgga caaggcagct 420 cgtaaagctc gcgtgcaaga aatgctcgag ttcgtcggcc tgggcgacaa aggcaaaaac 480 taccccgagc agctgtcggg cggccagaag cagcgcgtcg gcattgcccg tgcactggcc 540 accaatccaa cgcttttgct tgccgacgaa gccacctccg ctttggaccc agaaaccacc 600 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tgcgcagtaa tatcggcatg attttccagc agttcaacct gttccagtcg 360 cgtactgcgg ctggaaatgt ggagtacccg ctggaagttg ccaagatgga caaggcagct 420 cgtaaagctc gcgtgcaaga aatgctcgag ttcgtcggcc tgggcgacaa aggcaaaaac 480 taccccgagc agctgtcggg cggccagaag cagcgcgtcg gcattgcccg tgcactggcc 540 accaatccaa cgcttttgct tgccgacgaa gccacctccg ctttggaccc agaaaccacc 600 catgaagttc tggagctgct gcgcaaggta aaccgcgaac tgggcatcac catcgttgtg 660 atcacccacg aaatggaagt tgtgcgttcc atcgcagaca aggttgctgt gatggaatcc 720 ggcaaagttg tggaatacgg cagcgtctac gaggtgttct ccaatccaca aacacaggtt 780 gctcaaaagt tcgtggccac cgcgctgcgt aacaccccag accaagtgga atcggaagat 840 ctgcttagcc atgagggacg tctgttcacc attgatctga ctgaaacgtc cggcttcttt 900 gcagcaaccg ctcgtgctgc cgaacaaggt gcttttgtca acatcgttca cggtggcgtg 960 accaccttgc aacgccaatc atttggcaaa atgactgttt gactcaccgg caacaccgct 1020 gcgattgaag agttctatca aaccttgacc aagaccacga ccatcaagga gatcacccga 1080 tga 1083 <210> 3 <211> 360 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 Met Ser His Thr Ala 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aagccgcagc agaaacactc 900 aaacaagaag cactacgccg ccaaaacacc tccatcggcg acgaacctac ccaacccgcc 960 atgcgtctaa tcaacgtgct ggcccgcttc gaccaaaccg aaaccatcac gcccgaagaa 1020 cgcgcccgcc gcacccgcgt catcgactac gtagaacaca tacccccaag cctcgacccc 1080 tacatcgtca tcaacccagc aacgcctgag ttcaacaact tcaccgacga cctccgctgg 1140 atcgacgcaa accccaacct cttccaccca caaacaatca ccaccccacc cgccgacatc 1200 tgggacgact acatctcccg tcccgctcac taccaaggcc tgctagccac gctgctcggc 1260 cgcgacatcg aaggcgcaga cgaactcctc gacgccacca ccctccaaaa aatcagagac 1320 ctcaccctcg acaaaactca tctcaccgac ctccacctcc gcggatacca atcattcggc 1380 gcccgcttcg ccatcatcca aaagaaaacc ctcctcggcg acgacatggg actcggcaaa 1440 acagtccaag ccctctccgc agctgcacac cttgccgcca ccgaaaaaga cttccgcacc 1500 ctcgtcgtcg tacccgcatc cgtcattgtt aactggaccc gcgaatgcaa acgcttcctc 1560 aacctccccg tattcatcgc ccacggagac aacaaacaag acgccatcaa cgcctggtct 1620 aacaccaacg gaatcgcaat ctgcacctac gacggcgtcc gcaccatgga catccccgcg 1680 ccgggtctgg tcattgccga tgaagcccac ctgatcaaaa 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ccggctgaaa 660 agcgaagccg agaaacacct cacatccatc aacgagctcc gcgtacagat actcctcgaa 720 caactccccg ttgatgccct acgcatggct accgaccacc gcctgcgctt tggatccctc 780 gattccatcc acgtcgcaac cgtcgccgac gtcctaaaaa cacacacctc catcctcacc 840 accgtgcaag gtatcggcgc ccaaaccgcg gggcggatga aagccgcagc agaaacactc 900 aaacaagaag cactacgccg ccaaaacacc tccatcggcg acgaacctac ccaacccgcc 960 atgcgtctaa tcaacgtgct ggcccgcttc gaccaaaccg aaaccatcac gcccgaagaa 1020 cgcgcccgcc gcacccgcgt catcgactac gtagaacaca tacccccaag cctcgacccc 1080 tacatcgtca tcaacccagc aacgcctgag ttcaacaact tcaccgacga cctccgctgg 1140 atcgacgcaa accccaacct cttccaccca caaacaatca ccaccccacc cgccgacatc 1200 tgggacgact acatctcccg tcccgctcac taccaaggcc tgctagccac gctgctcggc 1260 cgcgacatcg aaggcgcaga cgaactcctc gacgccacca ccctccaaaa aatcagagac 1320 ctcaccctcg acaaaactca tctcaccgac ctccacctcc gcggatacca atcattcggc 1380 gcccgcttcg ccatcatcca aaagaaaacc ctcctcggcg acgacatggg actcggcaaa 1440 acagtccaag ccctctccgc agctgcacac cttgccgcca ccgaaaaaga cttccgcacc 1500 ctcgtcgtcg tacccgcatc cgtcattgtt aactggaccc gcgaatgcaa acgcttcctc 1560 aacctccccg tattcatcgc ccacggagac aacaaacaag acgccatcaa cgcctggtct 1620 aacaccaacg gaatcgcaat ctgcacctac gacggcgtcc gcaccatgga catccccgcg 1680 ccgggtctgg tcattgccga tgaagcccac ctgatcaaaa acccctccac caaacgcacc 1740 caagcactgc gcaaacttat cgacgccgcc ccattcaccc ttctgatgac cggcacacca 1800 ctagaaaaca aagtggaaga gtttgtaaat ctcgtgcgct acatccaacc ggagctgatc 1860 acccgtggca tgtccaaaat gcaggccgag aatttccgcg agcgcatcgc accagcctat 1920 ctgcgcagaa atcaagctga tgtgcttgac gaactcccag agcgcaccga ctccatcgac 1980 tggatcgacc tcaccccaga agaccgcagc gcctacgacg accaagtccg ccaaggcagc 2040 tggatgggca tgcgccgctc cgccatgctc tcaccaacac cacgcctaac ttccgcaaaa 2100 atgcaacgca tcctagaact cttcgaagaa gcagaagaac acggccgcaa agccctcatc 2160 ttcacctact tcctcgacgt cctcgacgaa ctggaaaagc atctaggcga gcgcgtcatc 2220 ggccgcattt ccggcgacgt gccagccacc aagcgccaat tgcttgtcga cgccctgtcc 2280 cactccaaac ccggatccgc cctcattgcc caaatcaccg ccgggggagt aggcctaaac 2340 atccaatccg cgagcctatg cattatttgt gaacctcaag taaagccaac catcgaacag 2400 caggccgtcg cccgagtcca ccgcatgggc caaaccgcca ccgtccaagt ccaccgactc 2460 atcggcgacg aaaccgcaga cgaacgcatg ctagaaatcc tggcaggcaa aactcacgtc 2520 ttcgacgtct acgcccggct atctgaaacc gcagagattc cagatgctgt ggatatcact 2580 gaatcacagc tggcagcacg ggttattgat gaggagcgtg cacggttagg gcttactgaa 2640 tccactggcc ctaaagatga agaaacggcc ttaagctag 2679 <210> 31 <211> 892 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 31 Met Ala Glu Ser Asn Ala Met Asp Arg Ala Gln Ile Ser Ala Leu Leu 1 5 10 15 Asp Arg Ala Gln His Thr Ile Asn Leu Ala Glu Gln Ala Asn Asn Val 20 25 30 Leu Arg Leu Leu Lys Thr Pro Gly Thr Ala Thr Val Gly Asp Asn Gly 35 40 45 Thr Leu Gly Thr Asp Thr Tyr Leu Ile Pro Ser Arg Asn Ile Thr Trp 50 55 60 Pro Asp Asn Leu Tyr Val Asn Val Phe Leu Asp Gly Met Asn Ala Glu 65 70 75 80 Ala Thr Leu Thr Asp Tyr Val Ala Ser Val Ala Ser Ile Pro Arg Leu 85 90 95 Cys Gln Ile Ile Asn Glu Gly Gln Gly Gly Met Phe Arg Arg Leu Phe 100 105 110 Asn Pro Thr Lys Val Gln Ala Gly Asp Gln Ala Val Phe Asp Leu Met 115 120 125 Val Lys Leu Asp Glu Ile Ser Ser Thr Thr His Glu Val Ser Arg Met 130 135 140 Leu Glu Gly Val His Ala Ala Arg Thr Arg Gln Gln Gln Gly Val Ala 145 150 155 160 Leu Phe Pro Gly Ile His Gly Val Gly Glu Arg Tyr Ile Glu Arg Ala 165 170 175 Gln Gln Val Leu Ala Ser Ala Leu Gly Ile Ala Gly Phe Gly Ala Glu 180 185 190 Pro Trp Asp Gly His Thr Leu Ala Gln Ala Arg Arg Val Val Gln Arg 195 200 205 Tyr Ala Gln Asp Pro Asn Ser Glu Tyr Arg Leu Lys Ser Glu Ala Glu 210 215 220 Lys His Leu Thr Ser Ile Asn Glu Leu Arg Val Gln Ile Leu Leu Glu 225 230 235 240 Gln Leu Pro Val Asp Ala Leu Arg Met Ala Thr Asp His Arg Leu Arg 245 250 255 Phe Gly Ser Leu Asp Ser Ile His Val Ala Thr Val Ala Asp Val Leu 260 265 270 Lys Thr His Thr Ser Ile Leu Thr Thr Val Gln Gly Ile Gly Ala Gln 275 280 285 Thr Ala Gly Arg Met Lys Ala Ala Ala Glu Thr Leu Lys Gln Glu Ala 290 295 300 Leu Arg Arg Gln Asn Thr Ser Ile Gly Asp Glu Pro Thr Gln Pro Ala 305 310 315 320 Met Arg Leu Ile Asn Val Leu Ala Arg Phe Asp Gln Thr Glu Thr Ile 325 330 335 Thr Pro Glu Glu Arg Ala Arg Arg Thr Arg Val Ile Asp Tyr Val Glu 340 345 350 His Ile Pro Pro Ser Leu Asp Pro Tyr Ile Val Ile Asn Pro Ala Thr 355 360 365 Pro Glu Phe Asn Asn Phe Thr Asp Asp Leu Arg Trp Ile Asp Ala Asn 370 375 380 Pro Asn Leu Phe His Pro Gln Thr Ile Thr Thr Pro Pro Ala Asp Ile 385 390 395 400 Trp Asp Asp Tyr Ile Ser Arg Pro Ala His Tyr Gln Gly Leu Leu Ala 405 410 415 Thr Leu Leu Gly Arg Asp Ile Glu Gly Ala Asp Glu Leu Leu Asp Ala 420 425 430 Thr Thr Leu Gln Lys Ile Arg Asp Leu Thr Leu Asp Lys Thr His Leu 435 440 445 Thr Asp Leu His Leu Arg Gly Tyr Gln Ser Phe Gly Ala Arg Phe Ala 450 455 460 Ile Ile Gln Lys Lys Thr Leu Leu Gly Asp Asp Met Gly Leu Gly Lys 465 470 475 480 Thr Val Gln Ala Leu Ser Ala Ala Ala His Leu Ala Ala Thr Glu Lys 485 490 495 Asp Phe Arg Thr Leu Val Val Val Pro Ala Ser Val Ile Val Asn Trp 500 505 510 Thr Arg Glu Cys Lys Arg Phe Leu Asn Leu Pro Val Phe Ile Ala His 515 520 525 Gly Asp Asn Lys Gln Asp Ala Ile Asn Ala Trp Ser Asn Thr Asn Gly 530 535 540 Ile Ala Ile Cys Thr Tyr Asp Gly Val Arg Thr Met Asp Ile Pro Ala 545 550 555 560 Pro Gly Leu Val Ile Ala Asp Glu Ala His Leu Ile Lys Asn Pro Ser 565 570 575 Thr Lys Arg Thr Gln Ala Leu Arg Lys Leu Ile Asp Ala Ala Pro Tyr 580 585 590 Thr Leu Leu Met Thr Gly Thr Pro Leu Glu Asn Lys Val Glu Glu Phe 595 600 605 Val Asn Leu Val Arg Tyr Ile Gln Pro Glu Leu Ile Thr Arg Gly Met 610 615 620 Ser Lys Met Gln Ala Glu Asn Phe Arg Glu Arg Ile Ala Pro Ala Tyr 625 630 635 640 Leu Arg Arg Asn Gln Ala Asp Val Leu Asp Glu Leu Pro Glu Arg Thr 645 650 655 Asp Ser Ile Asp Trp Ile Asp Leu Thr Pro Glu Asp Arg Ser Ala Tyr 660 665 670 Asp Asp Gln Val Arg Gln Gly Ser Trp Met Gly Met Arg Arg Ser Ala 675 680 685 Met Leu Ser Pro Thr Pro Arg Leu Thr Ser Ala Lys Met Gln Arg Ile 690 695 700 Leu Glu Leu Phe Glu Glu Ala Glu Glu His Gly Arg Lys Ala Leu Ile 705 710 715 720 Phe Thr Tyr Phe Leu Asp Val Leu Asp Glu Leu Glu Lys His Leu Gly 725 730 735 Glu Arg Val Ile Gly Arg Ile Ser Gly Asp Val Pro Ala Thr Lys Arg 740 745 750 Gln Leu Leu Val Asp Ala Leu Ser His Ser Lys Pro Gly Ser Ala Leu 755 760 765 Ile Ala Gln Ile Thr Ala Gly Gly Val Gly Leu Asn Ile Gln Ser Ala 770 775 780 Ser Leu Cys Ile Ile Cys Glu Pro Gln Val Lys Pro Thr Ile Glu Gln 785 790 795 800 Gln Ala Val Ala Arg Val His Arg Met Gly Gln Thr Ala Thr Val Gln 805 810 815 Val His Arg Leu Ile Gly Asp Glu Thr Ala Asp Glu Arg Met Leu Glu 820 825 830 Ile Leu Ala Gly Lys Thr His Val Phe Asp Val Tyr Ala Arg Leu Ser 835 840 845 Glu Thr Ala Glu Ile Pro Asp Ala Val Asp Ile Thr Glu Ser Gln Leu 850 855 860 Ala Ala Arg Val Ile Asp Glu Glu Arg Ala Arg Leu Gly Leu Thr Glu 865 870 875 880 Ser Thr Gly Pro Lys Asp Glu Glu Thr Ala Leu Ser 885 890 <210> 32 <211> 892 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 32 Met Ala Glu Ser Asn Ala Met Asp Arg Ala Gln Ile Ser Ala Leu Leu 1 5 10 15 Asp Arg Ala Gln His Thr Ile Asn Leu Ala Glu Gln Ala Asn Asn Val 20 25 30 Leu Arg Leu Leu Lys Thr Pro Gly Thr Ala Thr Val Gly Asp Asn Gly 35 40 45 Thr Leu Gly Thr Asp Thr Tyr Leu Ile Pro Ser Arg Asn Ile Thr Trp 50 55 60 Pro Asp Asn Leu Tyr Val Asn Val Phe Leu Asp Gly Met Asn Ala Glu 65 70 75 80 Ala Thr Leu Thr Asp Tyr Val Ala Ser Val Ala Ser Ile Pro Arg Leu 85 90 95 Cys Gln Ile Ile Asn Glu Gly Gln Gly Gly Met Phe Arg Arg Leu Phe 100 105 110 Asn Pro Thr Lys Val Gln Ala Gly Asp Gln Ala Val Phe Asp Leu Met 115 120 125 Val Lys Leu Asp Glu Ile Ser Ser Thr Thr His Glu Val Ser Arg Met 130 135 140 Leu Glu Gly Val His Ala Ala Arg Thr Arg Gln Gln Gln Gly Val Ala 145 150 155 160 Leu Phe Pro Gly Ile His Gly Val Gly Glu Arg Tyr Ile Glu Arg Ala 165 170 175 Gln Gln Val Leu Ala Ser Ala Leu Gly Ile Ala Gly Phe Gly Ala Glu 180 185 190 Pro Trp Asp Gly His Thr Leu Ala Gln Ala Arg Arg Val Val Gln Arg 195 200 205 Tyr Ala Gln Asp Pro Asn Ser Glu Tyr Arg Leu Lys Ser Glu Ala Glu 210 215 220 Lys His Leu Thr Ser Ile Asn Glu Leu Arg Val Gln Ile Leu Leu Glu 225 230 235 240 Gln Leu Pro Val Asp Ala Leu Arg Met Ala Thr Asp His Arg Leu Arg 245 250 255 Phe Gly Ser Leu Asp Ser Ile His Val Ala Thr Val Ala Asp Val Leu 260 265 270 Lys Thr His Thr Ser Ile Leu Thr Thr Val Gln Gly Ile Gly Ala Gln 275 280 285 Thr Ala Gly Arg Met Lys Ala Ala Ala Glu Thr Leu Lys Gln Glu Ala 290 295 300 Leu Arg Arg Gln Asn Thr Ser Ile Gly Asp Glu Pro Thr Gln Pro Ala 305 310 315 320 Met Arg Leu Ile Asn Val Leu Ala Arg Phe Asp Gln Thr Glu Thr Ile 325 330 335 Thr Pro Glu Glu Arg Ala Arg Arg Thr Arg Val Ile Asp Tyr Val Glu 340 345 350 His Ile Pro Pro Ser Leu Asp Pro Tyr Ile Val Ile Asn Pro Ala Thr 355 360 365 Pro Glu Phe Asn Asn Phe Thr Asp Asp Leu Arg Trp Ile Asp Ala Asn 370 375 380 Pro Asn Leu Phe His Pro Gln Thr Ile Thr Thr Pro Pro Ala Asp Ile 385 390 395 400 Trp Asp Asp Tyr Ile Ser Arg Pro Ala His Tyr Gln Gly Leu Leu Ala 405 410 415 Thr Leu Leu Gly Arg Asp Ile Glu Gly Ala Asp Glu Leu Leu Asp Ala 420 425 430 Thr Thr Leu Gln Lys Ile Arg Asp Leu Thr Leu Asp Lys Thr His Leu 435 440 445 Thr Asp Leu His Leu Arg Gly Tyr Gln Ser Phe Gly Ala Arg Phe Ala 450 455 460 Ile Ile Gln Lys Lys Thr Leu Leu Gly Asp Asp Met Gly Leu Gly Lys 465 470 475 480 Thr Val Gln Ala Leu Ser Ala Ala Ala His Leu Ala Ala Thr Glu Lys 485 490 495 Asp Phe Arg Thr Leu Val Val Val Pro Ala Ser Val Ile Val Asn Trp 500 505 510 Thr Arg Glu Cys Lys Arg Phe Leu Asn Leu Pro Val Phe Ile Ala His 515 520 525 Gly Asp Asn Lys Gln Asp Ala Ile Asn Ala Trp Ser Asn Thr Asn Gly 530 535 540 Ile Ala Ile Cys Thr Tyr Asp Gly Val Arg Thr Met Asp Ile Pro Ala 545 550 555 560 Pro Gly Leu Val Ile Ala Asp Glu Ala His Leu Ile Lys Asn Pro Ser 565 570 575 Thr Lys Arg Thr Gln Ala Leu Arg Lys Leu Ile Asp Ala Ala Pro Phe 580 585 590 Thr Leu Leu Met Thr Gly Thr Pro Leu Glu Asn Lys Val Glu Glu Phe 595 600 605 Val Asn Leu Val Arg Tyr Ile Gln Pro Glu Leu Ile Thr Arg Gly Met 610 615 620 Ser Lys Met Gln Ala Glu Asn Phe Arg Glu Arg Ile Ala Pro Ala Tyr 625 630 635 640 Leu Arg Arg Asn Gln Ala Asp Val Leu Asp Glu Leu Pro Glu Arg Thr 645 650 655 Asp Ser Ile Asp Trp Ile Asp Leu Thr Pro Glu Asp Arg Ser Ala Tyr 660 665 670 Asp Asp Gln Val Arg Gln Gly Ser Trp Met Gly Met Arg Arg Ser Ala 675 680 685 Met Leu Ser Pro Thr Pro Arg Leu Thr Ser Ala Lys Met Gln Arg Ile 690 695 700 Leu Glu Leu Phe Glu Glu Ala Glu Glu His Gly Arg Lys Ala Leu Ile 705 710 715 720 Phe Thr Tyr Phe Leu Asp Val Leu Asp Glu Leu Glu Lys His Leu Gly 725 730 735 Glu Arg Val Ile Gly Arg Ile Ser Gly Asp Val Pro Ala Thr Lys Arg 740 745 750 Gln Leu Leu Val Asp Ala Leu Ser His Ser Lys Pro Gly Ser Ala Leu 755 760 765 Ile Ala Gln Ile Thr Ala Gly Gly Val Gly Leu Asn Ile Gln Ser Ala 770 775 780 Ser Leu Cys Ile Ile Cys Glu Pro Gln Val Lys Pro Thr Ile Glu Gln 785 790 795 800 Gln Ala Val Ala Arg Val His Arg Met Gly Gln Thr Ala Thr Val Gln 805 810 815 Val His Arg Leu Ile Gly Asp Glu Thr Ala Asp Glu Arg Met Leu Glu 820 825 830 Ile Leu Ala Gly Lys Thr His Val Phe Asp Val Tyr Ala Arg Leu Ser 835 840 845 Glu Thr Ala Glu Ile Pro Asp Ala Val Asp Ile Thr Glu Ser Gln Leu 850 855 860 Ala Ala Arg Val Ile Asp Glu Glu Arg Ala Arg Leu Gly Leu Thr Glu 865 870 875 880 Ser Thr Gly Pro Lys Asp Glu Glu Thr Ala Leu Ser 885 890 <210> 33 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 33 cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagtgcg ttcgtctgcg gtttcg 56 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 34 atcgacgccg ccccattcac ccttctgatg 30 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 35 catcagaagg gtgaatgggg cggcgtcgat 30 <210> 36 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 36 cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccaa gcctcgaccc ctacatc 57 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 37 cacatcagct tgatttctgc 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 38 ggtcattgcc gatgaagccc 20 <210> 39 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 39 cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagaatg cgttctggac tgagg 55 <210> 40 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 40 gaaacggcct taagctaggt gcaccgagaa cagatg 36 <210> 41 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 41 catctgttct cggtgcacct agcttaaggc cgtttc 36 <210> 42 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 42 cttgatttaa ttgcgccatc aagcttttcc cgcccggtt 39 <210> 43 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 43 aaccgggcgg gaaaagcttg atggcgcaat taaatcaag 39 <210> 44 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 44 cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccgc tatgacacct tcaacggatc 60 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 45 tccaaggaag atacacgcc 19 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 46 cttctgatga ccggcacacc 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 47 tagtcgatga cgcgggtgcg 20 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 48 cgttggaatc ttgcgttg 18 <210> 49 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 49 gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccctag cttaaggccg tttc 54 <210> 50 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 50 atcaggctga aaatcttctc tcatccgcca aaacaagctt ttcccgcccg gtt 53 <210> 51 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 51 cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagaccg gcgcagatgc caacgc 56 <210> 52 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 52 cccagaactg aaggtctaat tgcctaaggc cggaatt 37 <210> 53 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 53 aattccggcc ttaggcaatt agaccttcag ttctggg 37 <210> 54 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 54 cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccgc ttgatgaagg ctccag 56 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 55 accggcgcag atgccaacgc 20 <210> 56 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 56 gcttgatgaa ggctccag 18 <210> 57 <211> 242 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 57 ttcagggtag ttgactaaag agttgctcgc gaagtagcac ctgtcacttt tgtctcaaat 60 attaaatcga atatcaatat atggtctgtt tattggaacg cgtcccagtg gctgagacgc 120 atccgctaaa gccccaggaa ccctgtgcag aaagaaaaca ctcctctggc taggtagaca 180 cagtttataa aggtagagtt gagcgggtaa ctgtcagcac gtagatcgaa aggtgcacaa 240 ag 242 <210> 58 <211> 242 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 58 ttcagggtag ttgactaaag agttgctcgc gaagtagcac ctgtcacttt tgtctcaaat 60 attaaatcga atatcaatat atggtctgtt tattggaacg cgtcccagtg gctgagacgc 120 atccgctaaa gccccaggaa ccctgtgcag aaagaaaaca ctcctctggc taggtagaca 180 cagtttataa aggtataatt gagcgggtaa ctgtcagcac gtagatcgaa aggtgcacaa 240 ag 242 <210> 59 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 59 ccggaattcg accaaggatg agggctttg 29 <210> 60 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 60 agttacccgc tcaattatac ctttataaac 30 <210> 61 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 61 gtttataaag gtataattga gcgggtaact 30 <210> 62 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 62 acatgcatgc gcgtacgcga agtggcacat 30 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 63 atcaatatat ggtctgttta 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artifical sequence <400> 64 cttggtggca acgatccgtt 20

Claims (17)

  1. L-아미노산을 생성하는 박테리아에 있어서,
    SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 개선되고/되거나. SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 개선되고/되거나, SEQ ID NO:57로 표시되는 프로모터 영역 -45bp번째 부위 및 -47bp번째 부위 염기가 돌연변이되고;
    바람직하게는, 상기 개선된 발현은 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 향상되거나, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 점 돌연변이가 있거나, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 점 돌연변이가 있고 발현이 향상된 것이고;
    바람직하게는, 상기 개선된 발현은 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 향상되거나, SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 점 돌연변이가 있거나, SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 점 돌연변이가 있고 발현이 향상된 것인 것을 특징으로 하는 박테리아.
  2. 제1항에 있어서,
    SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 점 돌연변이는, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열의 334번째 부위 아르기닌이 터미네이터에 의해 치환되거나;
    또는, SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 점 돌연변이는, SEQ ID NO:31의 아미노산 서열의 592번째 부위 티로신이 상이한 아미노산에 의해 치환되고, 바람직하게는 592번째 부위 티로신은 페닐알라닌에 의해 치환되는 것을 특징으로 하는 박테리아.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나;
    또는, SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:29의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리아.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 코딩하는 점 돌연변이가 있는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 1000번째 부위 염기에서 돌연변이가 발생하여 형성된 것이고; 바람직하게는, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:1로 표시된 폴리뉴클레오티드 서열 1000번째 부위 염기가 사이토신(C)에서 타이민(T)으로 돌연변이되고; 바람직하게는, 상기 점 돌연변이가 있는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나;
    또는, 상기 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 코딩하는 점 돌연변이가 있는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:29로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 1775번째 부위 염기에서 돌연변이가 발생하여 형성된 것이고; 바람직하게는, 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:29로 표시된 폴리뉴클레오티드 서열 1775번째 부위 염기가 아데닌(A)에서 타이민(T)으로 돌연변이되고; 바람직하게는, 상기 점 돌연변이가 있는 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:30으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리아.
  5. 제1항 내지 제4항에 있어서,
    SEQ ID NO:57로 표시되는 프로모터 영역의 -45bp번째 부위 뉴클레오티드 구아닌(G)은 아데닌(A)으로 돌연변이되고, -47bp번째 부위의 뉴클레오티드 구아닌(G)은 타이민(T)으로 돌연변이되고;
    바람직하게는, 상기 프로모터 뉴클레오티드 서열은,
    (a) SEQ ID NO:58로 표시되는 뉴클레오티드 서열; 또는
    (b) SEQ ID NO:58로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95%, 98% 이상 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열 - (a)에 따른 프로모터의 향상된 활성을 유지하고, -45bp번째 부위가 아데닌(A)으로 유지되고, -47bp번째 부위가 타이민(T)으로 유지됨 - 을 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리아.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)이고, 바람직하게는 YP97158 또는 ATCC 13869인 것을 특징으로 하는 박테리아.
  7. 폴리뉴클레오티드 서열에 있어서,
    SEQ ID NO:3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 이의 334번째 부위 아르기닌이 터미네이터에 의해 치환되고,
    바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:4로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
    바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 1000번째 부위 염기에 돌연변이가 발생하여 형성된 것이고,
    바람직하게는 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 485번째 부위 염기가 사이토신(C)에서 타이민(T)으로 돌연변이된 것을 포함하고,
    바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  8. 폴리뉴클레오티드 서열에 있어서,
    SEQ ID NO:31로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기에서 592번째 부위 티로신이 상이한 아미노산에 의해 치환되고, 바람직하게는 592번째 부위 티로신이 페닐알라닌에 의해 치환되고;
    바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:32로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고;
    바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:29로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 1775번째 부위 염기에서 돌연변이가 발생하여 형성된 것이고;바람직하게는 상기 돌연변이는 SEQ ID NO:29로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열 1775번째 부위 염기가 아데닌(A)에서 타이민(T)으로 돌연변이되고;
    바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:30으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 서열.
  9. 아미노산 서열에 있어서,
    상기 서열은 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:32로 표시되는 것을 특징으로 하는 아미노산 서열.
  10. 제7항 또는 제8항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  11. 제7항 또는 제8항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
  12. 프로모터 뉴클레오티드 서열에 있어서,
    SEQ ID NO:57로 표시되는 프로모터 영역 -45bp번째 부위 및 -47bp번째 부위 염기가 돌연변이를 일으켜 형성된 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
    바람직하게는 SEQ ID NO:57로 표시되는 프로모터 영역의 -45bp번째 부위 뉴클레오티드 구아닌(G)이 아데닌(A)으로 돌연변이되고, -47bp번째 부위의 뉴클레오티드 구아닌(G)이 타이민(T)으로 돌연변이되는 프로모터 뉴클레오티드 서열.
  13. 제12항에 있어서,
    (a) SEQ ID NO:58로 표시되는 뉴클레오티드 서열; 또는
    (b) SEQ ID NO:58로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95%, 98% 이상 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열 - (a)에 따른 프로모터의 향상된 활성을 유지하고, -45bp번째 부위가 아데닌(A)으로 유지되고, -47bp번째 부위가 타이민(T)으로 유지됨 - 을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로모터 뉴클레오티드 서열.
  14. 발현 카세트에 있어서,
    제12항 또는 제13항에 따른 프로모터 뉴클레오티드 서열 및 상기 프로모터 뉴클레오티드 서열 뒤에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하고; 바람직하게는 상기 코딩 서열은 lysC 유전자의 코딩 서열인 발현 카세트.
  15. 재조합 벡터에 있어서,
    제12항 또는 제13항에 따른 프로모터 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
    바람직하게는 상기 프로모터 뉴클레오티드 서열과 셔틀 플라스미드가 서로 연결되어 상기 재조합 벡터를 구축하고; 바람직하게는 상기 셔틀 플라스미드는 pK18mobsacB 플라스미드인 재조합 벡터.
  16. 재조합 균주에 있어서,
    제12항 또는 제13항에 따른 프로모터 뉴클레오티드 서열 또는 제15항에 따른 재조합 벡터를 포함하고; 바람직하게는 SEQ ID NO:58로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 바람직하게는 상기 재조합 균주는 SEQ ID NO:58로 표시되는 뉴클레오티드 서열 연결 lysC 유전자 코딩 서열을 포함하는 재조합 균주.
  17. L-아미노산 생산 방법에 있어서,
    상기 방법은, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 박테리아 또는 제11항 또는 제16항에 따른 재조합 균주를 배양하고, 상기 배양물로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는 방법.
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