JP2024505808A - 増強されたｌ－グルタミン酸生産能を有する菌株及びその構築方法と応用 - Google Patents
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Abstract
増強されたＬ－グルタミン酸生産能を有する菌株及びその構築方法と応用を公開した。コリネバクテリウム・グルタミクム中の野生型ＢＢＤ２９－００４０５遺伝子に点変異を導入し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の５９７番目の塩基グアニン（Ｇ）をアデニン（Ａ）に変異させることによりヌクレオチド配列を得る。また、ポリヌクレオチド配列をＬ－グルタミン酸を生産するコリネバクテリウム・グルタミクムに導入して得される、点変異を含むＢＢＤ２９－００４０５遺伝子を含む組換え菌株も提供されている。得られた菌株は未改造菌株に比べて高濃度のＬ－グルタミン酸の生産に有利である。【選択図】なし
Description
本発明は、遺伝子工学と微生物技術分野に属し、具体的に増強されたＬ－グルタミン酸生産能を有する菌株及びその構築方法と応用に関する。
Ｌ－グルタミン酸は、化学名称がＬ－２－アミノグルタル酸であり、分子式がＣ５Ｈ９Ｏ４Ｎであり、分子量が１４７．１３である。Ｌ－グルタミン酸は、非必須アミノ酸である。生物有機体に存在するグルタミン酸は、いずれもＬ－型グルタミン酸に属する。且つＬ－グルタミン酸は、味の素の前駆物質である。味の素が食されると、胃においてグルタミン酸に変換され、そして消化吸収を経てタンパク質の合成に関与することができ、且つアミノ基転移作用により他のアミノ酸を合成することができ、栄養価が高い。食品に広く応用されているほか、医薬、化粧品及び農業生産にも応用されている。人体の各器官の中で、グルタミン酸塩の脳中は、含有量が最も高く、同時にグルタミン酸は、人の脳代謝に参与する唯一のアミノ酸であり、神経系機能の維持に重要な役割を果たしている。従って、神経衰弱者にとって、グルタミン酸の摂取量を増やすことでその神経系の機能を改善することができる。化粧品業界では、グルタミン酸は、ポリグルタミン酸ナトリウムの合成に用いられてもよい。該物質は、吸湿性が強いため、エモリエント剤として用いられてもよい。グルタミン酸は、ラウリルフタロクロライドと結合してモノラウリルフタログルタミン酸ナトリウムを生成することもでき、化粧品業界に広く応用されている。グルタミン酸は、農業で主に殺菌剤、例えばグルタミン酸ケトンの生産に用いられる。施肥の過程において、グルタミン酸は、肥料のベクターとして、農作物の窒素・リン・カリウムの吸収を促進することができる。
１９５６年に、自然界からグルタミン酸生産菌の一種、即ちコリネバクテリウム・グルタミクムが分離され、これは、味の素の生産史における重要な変革となった。１９５７年に、発酵法による味の素の生産時代が始まった。発酵法によるグルタミン酸生産の成功は、発酵工業全体の偉大な創設であるとともに、他の発酵製品の研究と生産を大いに促進した。工業発酵にとって、発酵生産レベルを決定する要素は、主に菌種の性能、発酵プロセス及び下流抽出プロセスなどがある。これらの要素のうち、菌種の酸生産レベルは、内因であり、発酵の成否を決定する鍵となる。優良菌種のスクリーニング育成は、依然としてＬ－グルタミン酸を高生産する鍵であり、ハイスループットスクリーニング技術の発展に伴い、従来の変異誘導技術と結合して、未知性状のＬ－グルタミン酸を高生産する変異株の発見に有利である。これらの変異株は、Ｌ－グルタミン酸代謝経路上のある点の活性又は経路全体の組換え統合を変化することによって、酸生産量を向上させる可能性がある。
Ｌ－グルタミン酸生産量を向上させることができるいくつかの菌株をすでにスクリーニングしたが、日増しに増加する需求を満たすために、Ｌ－グルタミン酸を高生産するの変異株をより多く見つける必要がある。
既存の技術の不足に対して、本発明は、ポリヌクレオチド及び該ポリヌクレオチドを含む組換え菌株を提供し、及び組換え菌株を細菌のＬ－グルタミン酸生産能力の改善に用いる。上記目的を実現するために、本発明の発明者らは、Ｌ－グルタミン酸生産能力を有するコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ０１６３３５．１）におけるＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＮＵ３２３５０．１）が、該遺伝子を修飾するか又はその発現を改善することにより、Ｌ－グルタミン酸生産量を向上させる組換え菌株を得られ、改造されない野生型菌株と比べて、組換え菌株のＬ－グルタミン酸生産能力がより強いことを発見した。
本発明は、以下の技術案を採用して実現される、
本発明の第一の態様によれば、Ｌ－グルタミン酸生産細菌を提供し、この細菌は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現が改善されている。本発明によれば、前記改善された発現は、前記ポリヌクレオチド発現が増強されていること、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点変異を有していること、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点変異を有し且つ発現が増強されていることである。
本発明の第一の態様によれば、Ｌ－グルタミン酸生産細菌を提供し、この細菌は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現が改善されている。本発明によれば、前記改善された発現は、前記ポリヌクレオチド発現が増強されていること、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点変異を有していること、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点変異を有し且つ発現が増強されていることである。
前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列は、遺伝子ＢＢＤ２９＿００４０５がコードするタンパクである。
前記細菌は、未修飾菌株と比べて増強されたＬ－グルタミン酸生産能力を有する。
本発明において、用語である「Ｌ－グルタミン酸生産能力を有する細菌」とは、細菌が培地で培養される時にＬ－グルタミン酸を収集できるように、培地及び／又は細菌の細胞において以下の程度で目的Ｌ－グルタミン酸を生産、蓄積能力を有する細菌を指す。Ｌ－グルタミン酸生産能力を有する細菌は、未修飾菌株の取得可能な量よりも多い量で培地及び／又は細菌の細胞において目的Ｌ－グルタミン酸を蓄積できる細菌であってもよい。
用語である「未修飾菌株」とは、特定の特徴を有するように修飾されていない対照菌株を指す。即ち、未修飾菌株の例は、野生型菌株と親株を含む。
本発明において、別段の説明がない限り、用語である「Ｌ－グルタミン酸」とは、遊離形態のＬ－グルタミン酸、その塩又はその混合物を指す。
前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列と約９０％以上、約９２％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、又は約９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードすることができる。本明細書で使用されるように、用語である「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチドモジュール間のパーセンテージ同一性を指す。当分野で既知の方法であるモジュールと別のモジュールとの間の配列相同性を測定することができる。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによってこのような配列相同性を測定することができる。
ポリヌクレオチドの発現は、置換又は変異（Ｍｕｔａｔｉｏｎ）による発現調節配列、ポリヌクレオチド配列への変異導入、染色体挿入又はベクターを介して導入されるポリヌクレオチドコピー数の増加、又はその組み合わせなどによって増強されることができる。
ポリヌクレオチドの発現調節配列を修飾してもよい。発現調節配列は、それに操作可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を制御し、且つ例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、サイレンサーなどを含んでもよい。ポリヌクレオチドは、開始コドンの変化を有してもよい。ポリヌクレオチドを染色体の特定の部位に配合することによって、コピー数を増加させてもよい。本明細書において、特定の部位は、例えばトランスポゾン部位又は遺伝子間部位を含んでもよい。また、ポリヌクレオチドを発現ベクターに配合し、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することによって、コピー数を増加させてもよい。
本発明の一つの実施の形態において、ポリヌクレオチド又は点変異を有するポリヌクレオチドを微生物染色体の特定の部位に配合することによって、コピー数を増加させる。
本発明の一つの実施の形態において、プロモーター配列付きポリヌクレオチド又は点変異を有するプロモーター配列付きポリヌクレオチドを微生物染色体の特定の部位に配合することによって、前記核酸配列を過剰発現させる。
本発明の一つの実施の形態において、ポリヌクレオチド又は点変異を有するポリヌクレオチドを発現ベクターに配合し、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することによって、コピー数を増加させる。
本発明の一つの実施の形態において、プロモーター配列付きポリヌクレオチド又は点変異を有するプロモーター配列付きポリヌクレオチドを発現ベクターに配合し、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することによって、前記核酸配列を過剰発現させる。
本発明の一つの具体的な実施の形態において、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列を含んでもよい。
本発明の一つの実施の形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点変異を有していることによって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列の１９９番目のメチオニンは、異なるアミノ酸で置換される。
本発明によれば、好ましくは、１９９番目のメチオニンは、イソロイシンで置換される。
本発明によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列であって、１９９番目のメチオニンがイソロイシンで置換された後のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される。
本発明の一つの実施の形態において、前記点変異を有するポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の５９７番目の塩基の変異により形成される。
本発明によれば、前記変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の５９７番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への変異を含む。
本発明の一つの実施の形態において、前記点変異を有するポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を含む。
本明細書で使用されるように、用語である「操作可能な連結」とは、調節配列とポリヌクレオチド配列との間の機能的連結を指し、それによって調節配列は、ポリヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を制御する。調節配列は、ポリヌクレオチドの発現レベルを向上させることができる強力なプロモーターであってもよい。調節配列は、コリネバクテリウム属に属する微生物由来のプロモーターであってもよく、又は他の微生物由来のプロモーターであってもよい。例えば、プロモーターは、ｔｒｃプロモーター、ｇａｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター又はｃｊ７プロモーターであってもよい。
本発明の一つの具体的な実施の形態において、前記プロモーターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（ＢＢＤ２９＿００４０５）のプロモーターである。
本明細書で使用されるように、用語である「ベクター」とは、遺伝子の調節配列と遺伝子配列を含み且つ適切な宿主細胞において標的遺伝子を発現するように構成されたポリヌクレオチド構築体を指す。又は、ベクターは、相同組換えに利用可能な配列を含むポリヌクレオチド構築体をさらに指してもよく、それによって宿主細胞に導入されたベクターにより、宿主細胞のゲノムにおける内因性遺伝子の調節配列を変更することができ、又は発現可能な標的遺伝子を宿主のゲノムの特定の部位に挿入することができる。この点では、本発明で使用されるベクターは、ベクターの宿主細胞への導入又はベクターの宿主細胞の染色体への挿入を決定する選択マーカーをさらに含んでもよい。選択マーカーは、選択可能な表現型、例えば薬物耐性、栄養欠損型、細胞毒剤に対する耐性、又は表面タンパクの発現を与えるマーカーを含んでもよい。このような選択剤で処理された環境では、選択マーカーを発現させた細胞のみが生存できるか又は異なる表現型性状を示すため、形質転換された細胞を選択してもよい。本明細書に記載のベクターは、当業者に公知のものであり、プラスミド、ファージ（例えば、λファージ又はＭ１３糸状ファージなど）、コスミド（即ちＣｏｓｍｉｄ）又はウィルスベクターを含むが、それらに限定されない。
本発明のいくつかの具体的な実施の形態において、使用されるベクターは、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド、ｐＸＭＪ１９プラスミドである。
本明細書で使用されるように、用語である「形質転換」とは、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することによって、ポリヌクレオチドがゲノム外素子とするか又は宿主細胞に挿入されたゲノムで複製できることを指す。本発明で使用されるベクターを形質転換する方法は、核酸を細胞に導入する方法を含んでもよい。また、関連技術に開示されるように、宿主細胞に応じて電気パルス法を実施することができる。
本明細書において、前記微生物は、酵母、細菌、藻又は真菌であってもよい。
本発明によれば、前記細菌は、コリネバクテリウム属に属する微生物、例えばコリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｈｍａｅ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・ペキネンシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｋｉｎｅｎｓｅ）、ブレビバクテリウム・サッカロリチカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｎｉ）、ブレビバクテリウム・チオゲニタイス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ）などであってもよい。
本発明の一実施形態において、前記コリネバクテリウム属に属する微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９である。
本発明の一実施形態において、前記コリネバクテリウム属に属する微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１であり、２０２０年１１月２３日に中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センターに保存されており、保存住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号、郵便番号：１００１０１、保存機構略称：ＣＧＭＣＣ、生物保存番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０である。
本発明の第二の態様によれば、ポリヌクレオチド配列、該ポリヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列、前記ポリヌクレオチド配列を含む組換えベクター、前記ポリヌクレオチド配列を含む組換え菌株を提供する。
本発明によれば、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記配列の１９９番目のメチオニンは、異なるアミノ酸で置換される。
本発明によれば、好ましくは、１９９番目のメチオニンは、イソロイシンで置換される。
本発明によれば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列であって、１９９番目のメチオニンがイソロイシンで置換され後のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される。
本発明によれば、好ましくは、前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明の一つの実施の形態において、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の５９７番目の塩基の変異により形成される。
本発明によれば、前記変異とは、前記部位の塩基／ヌクレオチドが変化することを指し、前記変異方法は、変異誘導、ＰＣＲ固定点変異法、及び／又は相同組換えなどの方法から少なくとも一つを選択してもよい。本発明において、好ましくは、ＰＣＲ固定点変異法及び／又は相同組換えを採用する。
本発明によれば、前記変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の５９７番目のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への変異を含む。
本発明の一つの実施の形態において、前記ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明によれば、前記アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明によれば、前記組換えベクターは、前記ポリヌクレオチド配列をプラスミドに導入して構築される。
本発明の一つの実施の形態において、前記プラスミドは、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドである。
本発明の別の実施の形態において、前記プラスミドは、ｐＸＭＪ１９プラスミドである。
具体的には、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を介して前記ポリヌクレオチド配列と前記プラスミドを組換えベクターとして構築してもよい。
本発明によれば、前記組換え菌株は、前記ポリヌクレオチド配列を含む。
本発明の一実施形態として、前記組換え菌株の出発菌は、コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００Ｌであり、生物保存番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０である。
本発明の一実施形態として、前記組換え菌株の出発菌は、ＡＴＣＣ １３８６９である。
本発明の第三の態様によれば、上記ポリヌクレオチド配列、該ポリヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列、前記ポリヌクレオチド配列を含む組換えベクター、前記ポリヌクレオチド配列を含む組換え菌株の、Ｌ－グルタミン酸の生産における応用を提供する。
本発明の第四の態様によれば、Ｌ－グルタミン酸を生成する組換え菌株の構築方法をさらに提供する。
本発明によれば、前記構築方法は、
宿主菌株におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子のポリヌクレオチド配列を改造し、その５９７番目の塩基に変異を生じさせ、変異ＢＢＤ２９＿００４０５コード遺伝子を含む組換え菌株を得るステップを含む。
宿主菌株におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子のポリヌクレオチド配列を改造し、その５９７番目の塩基に変異を生じさせ、変異ＢＢＤ２９＿００４０５コード遺伝子を含む組換え菌株を得るステップを含む。
本発明の構築方法によれば、前記改造は、変異誘導、ＰＣＲ固定点変異法、及び／又は相同組換えなどの方法のうちの少なくとも一つを含む。
本発明の構築方法によれば、前記変異とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１における５９７番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への変異を指し、具体的には、前記変異ＢＢＤ２９＿００４０５コード遺伝子を含むポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される。
さらに、前記構築方法は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子のヌクレオチド配列を改造し、その５９７番目の塩基に変異を生じさせ、変異ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子ポリヌクレオチド配列を得るステップ（１）と、
（２）前記変異多核酸配列とプラスミドとを連結して、組換えベクターを構築するステップ（２）と、
（３）前記組換えベクターを宿主菌株に導入し、前記変異ＢＢＤ２９＿００４０５コード遺伝子を含む組換え菌株を得るステップ（３）とを含む。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される野生型ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子のヌクレオチド配列を改造し、その５９７番目の塩基に変異を生じさせ、変異ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子ポリヌクレオチド配列を得るステップ（１）と、
（２）前記変異多核酸配列とプラスミドとを連結して、組換えベクターを構築するステップ（２）と、
（３）前記組換えベクターを宿主菌株に導入し、前記変異ＢＢＤ２９＿００４０５コード遺伝子を含む組換え菌株を得るステップ（３）とを含む。
本発明の構築方法によれば、前記ステップ（１）は、点変異のＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子の構築を含み、即ち、未修飾菌株のゲノム配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子断片を増幅するプライマーＰ１とＰ２及びＰ３とＰ４を２組合成し、ＰＣＲ固定点変異法によって野生型ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に点変異を導入し、点変異ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を得、ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａとする。
本発明の一つの実施の形態において、前記未修飾菌株ゲノムは、ＡＴＣＣ １３８６９菌株に由来してもよく、そのゲノム配列ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ０１６３３５．１は、ＮＣＢＩサイトから取得されてもよい。
本発明の一実施形態において、前記ステップ（１）において、前記プライマーは、以下のとおりである。
Ｐ１： ５’ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴＧＡＣＴＡＴＴＡＡＴＧＴＣＴＣＣＧＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
Ｐ２： ５’ＡＧＡＣＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｐ３： ５’ＴＧＣＣＣＡＧＡＣＣＡＴＡＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＧＴＣＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｐ４： ５’ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＴＡＧＣＣＧＧＣＧＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣＧＧＡＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
本発明の一実施形態において、前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、及び７２℃で４０秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われる。
Ｐ１： ５’ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴＧＡＣＴＡＴＴＡＡＴＧＴＣＴＣＣＧＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
Ｐ２： ５’ＡＧＡＣＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｐ３： ５’ＴＧＣＣＣＡＧＡＣＣＡＴＡＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＧＴＣＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｐ４： ５’ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＴＡＧＣＣＧＧＣＧＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣＧＧＡＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
本発明の一実施形態において、前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、及び７２℃で４０秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われる。
本発明の一実施形態において、前記オーバーラップＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、及び７２℃で１００秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われる。
本発明の構築方法によれば、前記ステップ（２）は、組換えプラスミドの構築を含み、分離精製されたＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７ＡとｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドを、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系により組み立て、組換えプラスミドを得ることを含む。
本発明の構築方法によれば、前記ステップ（３）は、組換え菌株の構築を含み、即ち組換えプラスミドを宿主菌株に形質転換し、組換え菌株を得る。
本発明の一実施形態において、前記ステップ（３）の形質転換は、電気変換法である。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、ＡＴＣＣ １３８６９である。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００Ｌであり、生物保存番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０である。
本発明の一つの実施の形態において、前記組換えは、相同組換えによって実現される。
本発明の第五の態様によれば、Ｌ－グルタミン酸を生成する組換え菌株の構築方法をさらに提供する。
本発明によれば、前記構築方法は、
ＢＢＤ２９＿００４０５の上下流相同アーム断片、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅し、相同組換えの方式で宿主菌株のゲノムにＢＢＤ２９＿００４０５又はＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子を導入し、前記菌株がＢＢＤ２９＿００４０５又はＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子を過剰発現させることを実現するステップを含む。
ＢＢＤ２９＿００４０５の上下流相同アーム断片、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅し、相同組換えの方式で宿主菌株のゲノムにＢＢＤ２９＿００４０５又はＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子を導入し、前記菌株がＢＢＤ２９＿００４０５又はＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子を過剰発現させることを実現するステップを含む。
本発明の一つの実施の形態において、上流相同アーム断片を増幅するプライマーは、以下のとおりである、
Ｐ７： ５’ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＧＡＣＣＣＧＣＴＴＧＣＣＡＴＡＣＧＡＡＧ ３’
Ｐ８： ５’ＣＣＴＡＣＣＡＣＧＡ ＣＧＡＧＣＡＣＴＡＣ ＡＴＣＴＡＣＴＣＡＴ ＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣ ３’
本発明の一つの実施の形態において、下流相同アーム断片を増幅するプライマーは、以下のとおりである、
Ｐ１１： ５’ＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡ ＣＧＣＣＧＧＣＴＡＧ ＴＴＣＧＴＧＧＧＣＡ ＣＴＣＴＧＧＴＴＴＧ ３’
Ｐ１２： ５’ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＡＡＧＡＡＡＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣ ３’
本発明の一つの実施の形態において、前記遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅するプライマーは、以下のとおりである、
Ｐ９： ５’ＧＡＴＴＣＴＴＣＡＧ ＡＴＧＡＧＴＡＧＡＴ ＧＴＡＧＴＧＣＴＣＧ ＴＣＧＴＧＧＴＡＧＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：１３）
Ｐ１０： ５’ＣＡＡＡＣＣＡＧＡＧ ＴＧＣＣＣＡＣＧＡＡ ＣＴＡＧＣＣＧＧＣＧ ＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
本発明の一つの実施の形態において、さらに前記Ｐ７／Ｐ１２をプライマーとし、増幅された上流相同アーム断片、下流相同アーム断片、遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列断片の三つの断片混合物をテンプレートとして増幅し、統合相同アーム断片を得る。
Ｐ７： ５’ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＧＡＣＣＣＧＣＴＴＧＣＣＡＴＡＣＧＡＡＧ ３’
Ｐ８： ５’ＣＣＴＡＣＣＡＣＧＡ ＣＧＡＧＣＡＣＴＡＣ ＡＴＣＴＡＣＴＣＡＴ ＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣ ３’
本発明の一つの実施の形態において、下流相同アーム断片を増幅するプライマーは、以下のとおりである、
Ｐ１１： ５’ＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡ ＣＧＣＣＧＧＣＴＡＧ ＴＴＣＧＴＧＧＧＣＡ ＣＴＣＴＧＧＴＴＴＧ ３’
Ｐ１２： ５’ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＡＡＧＡＡＡＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣ ３’
本発明の一つの実施の形態において、前記遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅するプライマーは、以下のとおりである、
Ｐ９： ５’ＧＡＴＴＣＴＴＣＡＧ ＡＴＧＡＧＴＡＧＡＴ ＧＴＡＧＴＧＣＴＣＧ ＴＣＧＴＧＧＴＡＧＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：１３）
Ｐ１０： ５’ＣＡＡＡＣＣＡＧＡＧ ＴＧＣＣＣＡＣＧＡＡ ＣＴＡＧＣＣＧＧＣＧ ＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
本発明の一つの実施の形態において、さらに前記Ｐ７／Ｐ１２をプライマーとし、増幅された上流相同アーム断片、下流相同アーム断片、遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列断片の三つの断片混合物をテンプレートとして増幅し、統合相同アーム断片を得る。
本発明の一つの実施の形態において、採用されたＰＣＲ系は、ｌ０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ ｍＭ）４ μＬ、Ｍｇ２＋（２５ ｍＭ）４ μＬ、プライマー（１０ μＭ）各２ μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５ Ｕ／μＬ）０．２５ μＬ、総容積５０ μＬであり、ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で１８０秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われる。
本発明の一つの実施の形態において、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を採用し、シャトルプラスミドＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢと統合相同アーム断片を組み立て、統合プラスミドを得る。
本発明の一つの実施の形態において、統合プラスミドを宿主菌株にトランスフェクトし、相同組換えの方式で宿主菌株のゲノムにＢＢＤ２９＿００４０５又はＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子を導入する。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１であり、生物保存番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０である。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、ＡＴＣＣ １３８６９である。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を有する菌株である。
本発明の第六の態様によれば、Ｌ－グルタミン酸を生産する組換え菌株の構築方法をさらに提供する。
本発明によれば、前記構築方法は、
ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列、又はＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅し、過剰発現プラスミドベクターを構築し、前記ベクターを宿主菌株に導入し、前記菌株がＢＢＤ２９＿００４０５又はＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子を過剰発現させることを実現するステップを含む。
ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列、又はＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅し、過剰発現プラスミドベクターを構築し、前記ベクターを宿主菌株に導入し、前記菌株がＢＢＤ２９＿００４０５又はＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子を過剰発現させることを実現するステップを含む。
本発明の一つの実施の形態において、前記遺伝子コード領域及びそのプロモーター領域配列を増幅するプライマーは、以下のとおりである、
Ｐ１７： ５’ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣ ＧＴＡＧＴＧＣＴＣＧ ＴＣＧＴＧＧＴＡＧＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）
Ｐ１８： ５’ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＴＡＧＣＣＧＧＣＧ ＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣＧＧＡＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）。
Ｐ１７： ５’ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣ ＧＴＡＧＴＧＣＴＣＧ ＴＣＧＴＧＧＴＡＧＧ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）
Ｐ１８： ５’ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＴＡＧＣＣＧＧＣＧ ＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣＧＧＡＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）。
本発明の一つの実施の形態において、前記ＰＣＲ系は、ｌ０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ ｍＭ）４ μＬ、Ｍｇ２＋（２５ ｍＭ）４ μＬ、プライマー（１０ μＭ）各２ μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５ Ｕ／μＬ）０．２５ μＬ、総容積５０ μＬであり、前記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で１００秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われる。
本発明の一つの実施の形態において、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を採用し、シャトルプラスミドｐＸＭＪ１９と自己プロモーターを持つＢＢＤ２９＿００４０５又はＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ断片を組み立て、過剰発現プラスミドを得る。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１であり、生物保存番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０である。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、ＡＴＣＣ １３８６９である。
本発明の一つの実施の形態において、前記宿主菌株は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を有する菌株である。
本発明で得られた組換え菌株は、単独でＬ－グルタミン酸の発酵生産に応用されてもよく、Ｌ－グルタミン酸を生産する他の細菌と混合してＬ－グルタミン酸を発酵生産してもよい。
本発明の別の態様によれば、Ｌ－グルタミン酸の生産方法を提供し、該方法は、前記細菌を培養し、且つ培養物からＬ－グルタミン酸を得ることを含む。
当分野の既知の培養条件で適切な培地において細菌の培養を行うことができる。培地は、炭素源、窒素源、微量元素、及びその組み合わせを含んでもよい。培養において、培養物のｐＨを調整してもよい。また、培養の際に、気泡の発生を防止することを含んでもよく、例えば消泡剤を用いて気泡の発生を防止する。また、培養の際に、培養物にガスを注入することを含んでもよい。ガスは、培養物の好気条件を維持できる任意のガスを含んでもよい。培養において、培養物の温度は、２０～４５℃であってもよい。生成されたＬ－グルタミン酸を培養物から回収し、即ち硫酸又は塩酸などで培養物を処理し、そして例えばアニオン交換クロマトグラフィー、濃縮、晶析と等電点沈殿の方法を組み合わせて行ってもよい。
本発明は、タンパク質をさらに提供し、名称がタンパク質ＢＢＤ２９＿００４０５Ｍ１９９Ｉであり、前記タンパク質は、
Ａ１）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４であるタンパク質と、
Ａ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示されるアミノ酸配列を、アミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は添加を経て得られた、Ａ１）に示されるタンパク質と８０％以上の同一性を有し且つ同じ機能を有するタンパク質と、
Ａ３）Ａ１）又はＡ２）のＮ端及び／又はＣ端にタグを連結して得られた、同じ機能を有する融合タンパク質とのうちのいずれか一つであってもよい。
Ａ１）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４であるタンパク質と、
Ａ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示されるアミノ酸配列を、アミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は添加を経て得られた、Ａ１）に示されるタンパク質と８０％以上の同一性を有し且つ同じ機能を有するタンパク質と、
Ａ３）Ａ１）又はＡ２）のＮ端及び／又はＣ端にタグを連結して得られた、同じ機能を有する融合タンパク質とのうちのいずれか一つであってもよい。
本発明は、核酸分子をさらに提供し、名称がＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａであり、前記核酸分子ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａは、
Ｂ１）コード前記タンパク質ＢＢＤ２９＿００４０５Ｍ１９９Ｉの核酸分子と、
Ｂ２）コード配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子と、
Ｂ３）ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子とのうちのいずれか一つであってもよい。
Ｂ１）コード前記タンパク質ＢＢＤ２９＿００４０５Ｍ１９９Ｉの核酸分子と、
Ｂ２）コード配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子と、
Ｂ３）ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子とのうちのいずれか一つであってもよい。
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子は、本発明に記載のＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子である。
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子（ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子）は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示されるタンパク質ＢＢＤ２９＿００４０５Ｍ１９９Ｉをコードする。
前記タンパク質ＢＢＤ２９＿００４０５Ｍ１９９１アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３における１９９番目のメチオニン（Ｍ）をイソロイシン（Ｉ）に変化させたものである。
本発明は、生物材料をさらに提供し、前記生物材料は、
Ｃ１）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを含む発現カセットと、
Ｃ２）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを含む組換えベクター、又はＣ１）に記載の発現カセットを含む組換えベクターと、
Ｃ３）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを含む組換え微生物、又はＣ１）に記載の発現カセットを含む組換え微生物、又はＣ２）に記載の組換えベクターを含む組換え微生物とのうちのいずれか一つであってもよい。
Ｃ１）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを含む発現カセットと、
Ｃ２）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを含む組換えベクター、又はＣ１）に記載の発現カセットを含む組換えベクターと、
Ｃ３）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを含む組換え微生物、又はＣ１）に記載の発現カセットを含む組換え微生物、又はＣ２）に記載の組換えベクターを含む組換え微生物とのうちのいずれか一つであってもよい。
本発明は、Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つの以下の応用をさらに提供し、
Ｆ１）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つの微生物のＬ－グルタミン酸の生産量の制御における応用と、
Ｆ２）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つのＬ－グルタミン酸生産の遺伝子工学菌の構築における応用と、
Ｆ３）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つＬ－グルタミン酸の製造における応用と、
ここで、前記Ｄ１）～Ｄ８）は、
Ｄ１）前記タンパク質ＢＢＤ２９＿００４０５Ｍ１９９Ｉ、
Ｄ２）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ、
Ｄ３）前記生物材料、
Ｄ４）ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１であるＤＮＡ分子、
Ｄ５）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるヌクレオチド配列を、修飾及び／又は一つ又は複数のヌクレオチドの置換及び／又は欠失及び／又は添加を経て得られた、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子と９０％以上の同一性を有し、且つ同じ機能を有するＤＮＡ分子、
Ｄ６）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む発現カセット、
Ｄ７）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む組換えベクター、又はＤ６）に記載の発現カセットを含む組換えベクター、
Ｄ８）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む組換え微生物、又はＤ６）に記載の発現カセットを含む組換え微生物、又はＤ７）に記載の組換えベクターを含む組換え微生物である。
Ｆ１）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つの微生物のＬ－グルタミン酸の生産量の制御における応用と、
Ｆ２）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つのＬ－グルタミン酸生産の遺伝子工学菌の構築における応用と、
Ｆ３）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つＬ－グルタミン酸の製造における応用と、
ここで、前記Ｄ１）～Ｄ８）は、
Ｄ１）前記タンパク質ＢＢＤ２９＿００４０５Ｍ１９９Ｉ、
Ｄ２）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ、
Ｄ３）前記生物材料、
Ｄ４）ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１であるＤＮＡ分子、
Ｄ５）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるヌクレオチド配列を、修飾及び／又は一つ又は複数のヌクレオチドの置換及び／又は欠失及び／又は添加を経て得られた、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子と９０％以上の同一性を有し、且つ同じ機能を有するＤＮＡ分子、
Ｄ６）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む発現カセット、
Ｄ７）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む組換えベクター、又はＤ６）に記載の発現カセットを含む組換えベクター、
Ｄ８）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む組換え微生物、又はＤ６）に記載の発現カセットを含む組換え微生物、又はＤ７）に記載の組換えベクターを含む組換え微生物である。
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子は、本発明に記載のＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子である。
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子（ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子）は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３に示されるタンパク質をコードする。
本明細書において、同一性とは、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性を指す。国際インターネット上の相同性検索サイト、例えばＮＣＢＩホームページサイトのＢＬＡＳＴページを用いて、アミノ酸配列の同一性を測定することができる。例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＢＬＡＳＴ２．１では、ｂｌａｓｔｐをプログラムとして使用し、Ｅｘｐｅｃｔ値を１０に設定し、すべてのＦｉｌｔｅｒをＯＦＦに設定し、ＢＬ０ＳＵＭ６２をＭａｔｒｉｘとして使用し、Ｇａｐ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｃｏｓｔ、Ｐｅｒ ｒｅｓｉｄｕｅ ｇａｐ ｃｏｓｔとＬａｍｂｄａ ｒａｔｉｏをそれぞれ１１、１と０．８５（デフォルト値）に設定して１組のアミノ酸配列の同一性を検索して計算することにより、同一性の値（％）を得ることができる。
本明細書において、前記８０％以上の同一性は、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性であってもよい。
本明細書において、前記９０％以上の同一性は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性であってもよい。
本明細書に記載の微生物のＬ－グルタミン酸の生産量の制御は、微生物におけるＬ－グルタミン酸の蓄積量（即ちＬ－グルタミン酸の生物合成を促進又は抑制する）を向上又は低下させることであってもよい。
本発明は、微生物におけるＬ－グルタミン酸の生産量を向上させる方法をさらに提供し、前記方法は、
Ｅ１）目的微生物における前記核酸分子ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａの発現量又は、含有量を向上させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることと、
Ｅ２）を向上させ目的微生物におけるＤ４）又はＤ５）前記ＤＮＡ分子の発現量又は、含有量、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることと、
Ｅ３）前記目的微生物におけるヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１であるＤＮＡ分子を変異させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることとのうちのいずれか一つを含む。
Ｅ１）目的微生物における前記核酸分子ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａの発現量又は、含有量を向上させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることと、
Ｅ２）を向上させ目的微生物におけるＤ４）又はＤ５）前記ＤＮＡ分子の発現量又は、含有量、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることと、
Ｅ３）前記目的微生物におけるヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１であるＤＮＡ分子を変異させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることとのうちのいずれか一つを含む。
上記方法において、前記変異は、点変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）、即ち単一ヌクレオチドの変異であってもよい。
上記方法において、前記点変異は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子がコードするアミノ酸配列の１９９番目のアラニン残基を別のアミノ酸残基に変異させるものであってもよい。
上記方法において、前記点変異は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子がコードするアミノ酸配列の１９９番目のアラニンをトレオニンに変異させ、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４である変異タンパク質ＢＢＤ２９＿００４０５Ｍ１９９Ｉを得るものであってもよい。
前記変異とは、固定点変異により遺伝子におけるいずれか一つ又は複数の塩基を変化させることにより、対応するタンパク質アミノ酸組が変化し、新たなタンパク質を生産し又は元のタンパク質に新たな機能を発生させ、即ち遺伝子固定点変異を指す。遺伝子の固定点変異技術、例えばオリゴヌクレオチドプライマーを介した固定点変異、ＰＣＲを介した固定点変異又はカセット変異などは、当業者には周知である。
本明細書に記載の点変異は、一塩基置換、一塩基挿入または一塩基欠失であってもよく、具体的には一塩基置換であってもよい。前記一塩基置換は、対立遺伝子置換であってもよい。
前記点変異は、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）の５９７番目のグアニン（Ｇ）の核酸改造であってもよい。
具体的には、前記点変異は、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）の５９７番目のグアニン（Ｇ）をアデニン（Ａ）に変化させ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子を得るものであってもよい。
本明細書において、前記組換えベクターは、具体的に組換えベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ、ＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿００４０５、ＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ、ｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿００４０５又はｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａであってもよい。
前記組換えベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示される変異の遺伝子ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａの１～１４７３番目に示されるＤＮＡ分子を含み、具体的にはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３１に示されるＤＮＡ断片ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片をｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢベクターのＸｂａ Ｉ認識部位間に挿入し、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢベクターの他の配列をそのまま維持し、得られた組換えベクターである。
前記組換えベクターＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿００４０５は、外来遺伝子ＢＢＤ２９＿００４０５を宿主染色体に統合し、菌生産中に野生型ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子を過剰発現させるために用いられる。
前記組換えベクターＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａは、外来遺伝子ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを宿主染色体に統合し、菌生産中に変異型遺伝子ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを過剰発現させるために用いられる。
前記組換えベクターｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿００４０５は、プラスミドを介して外来遺伝子ＢＢＤ２９＿００４０５を染色体外に発現させ、さらに菌生産中に野生型ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子を過剰発現させるために用いられる。
前記組換えベクターｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａは、プラスミドを介して外来遺伝子ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを染色体外に発現させ、さらに菌生産中に変異型遺伝子ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを過剰発現させるために用いられる。
前記組換えベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ、ＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿００４０５、ＰＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ、ｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿００４０５とｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａは、いずれも本発明の保護範囲内にある。
本明細書において、前記組換え微生物は、具体的に組換え菌ＹＰＧ－０２５、ＹＰＧ－０２６、ＹＰＧ－０２７、ＹＰＧ－０２８又はＹＰＧ－０２９であってもよい。
前記組換え菌ＹＰＧ－０２５は、前記組換えベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａをコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０に形質転換して得られた組換え菌であり、前記組換え菌ＹＰＧ－０２５は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示される変異の遺伝子ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを含む。
前記組換え菌ＹＰＧ－０２６は、２コピーのＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子を含み、２コピーＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子を含む組換え菌は、を顕著かつ安定的に増加させることができるＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子の発現量。組換え菌ＹＰＧ－０２６は、ゲノム上の野生型ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子を過剰発現させる工学的菌である。
前記組換え菌ＹＰＧ－０２７は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示される変異のＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子を含み、組換え菌ＹＰＧ－０２７は、ゲノム上の変異型ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子を過剰発現させる工学的菌である。
組換え菌ＹＰＧ－０２８は、２コピーＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子を含み、組換え菌ＹＰＧ－０２８は、プラスミド上の野生型ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子を過剰発現させる工学的菌であり、即ちプラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿００４０５が染色体外に過剰発現を行う。
組換え菌ＹＰＧ－０２９は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示される変異のＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子を含み、組換え菌ＹＰＧ－０２９は、プラスミド上の変異型ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子を過剰発現させる工学的菌であり、即ちプラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａが染色体外に過剰発現を行う。
前記組換え菌ＹＰＧ－０２５、ＹＰＧ－０２５、ＹＰＧ－０２７、ＹＰＧ－０２７とＹＰＧ－０２９は、いずれも本発明の保護範囲内にある。
本発明は、構前記組換え微生物を構築する方法をさらに提供し、前記方法は、
Ｆ１）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを目的微生物に導入し、前記組換え微生物を得ることと、
Ｆ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子を目的微生物に導入し、前記組換え微生物を得ることと、
Ｆ３）遺伝子編集手段（例えば一塩基の遺伝子編集）を用いてＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子を編集し、目的微生物にＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子を含ませることとのうちの少なくともいずれか一つを含む。
Ｆ１）前記核酸分子ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを目的微生物に導入し、前記組換え微生物を得ることと、
Ｆ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子を目的微生物に導入し、前記組換え微生物を得ることと、
Ｆ３）遺伝子編集手段（例えば一塩基の遺伝子編集）を用いてＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子を編集し、目的微生物にＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子を含ませることとのうちの少なくともいずれか一つを含む。
前記導入は、化学形質転換法又は電気ショック形質転換法などの既知の形質転換方法により本発明ＤＮＡ分子を担持したベクターを宿主菌に形質転換することであってもよい。導入されたＤＮＡ分子は、シングルコピーであってもよくマルチコピーであってもよい。前記導入は、外来遺伝子を宿主染色体に統合してもよく、プラスミドが染色体外に発現してもよい。
本発明は、Ｌ－グルタミン酸の製造方法をさらに提供し、前記方法は、本明細書におけるいずれか一つの前記組換え微生物を用いてＬ－グルタミン酸を生産することを含む。
上記方法において、前記方法は、発酵法によるＬ－グルタミン酸の製造であってもよく、前記組換え微生物は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）であってもよく、具体的にコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）及びその変異体であってもよい。
生物保存の説明
コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｈｉｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センターに保存されており、保存住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号、郵便番号：１００１０１、保存機構略称：ＣＧＭＣＣ、保存日：２０２０年１１月２３日、生物保存番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０、菌株命名：ＹＰＧＬＵ００１。
コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｈｉｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センターに保存されており、保存住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号、郵便番号：１００１０１、保存機構略称：ＣＧＭＣＣ、保存日：２０２０年１１月２３日、生物保存番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０、菌株命名：ＹＰＧＬＵ００１。
以下では、具体的な実施例を結び付けながら本発明の技術案についてさらに詳細に説明する。理解すべきこととして、以下の実施例は、例示的に本発明を説明、解釈するものであり、本発明の保護範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。本発明の上記内容に基づいて実現された技術は、いずれも本発明が保護を意図する範囲内に含まれる。
別段の説明がない限り、以下の実施例で使用される原料と試薬は、いずれも市販品であり、又は既知の方法で製造することができる。以下の実施例に具体的な条件が明記されていない実験方法は、一般的に通常の条件、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらの分子クローニング：実験室マニュアル（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に記載された条件、又は製造メーカが推奨する条件に従う。
別段に定義されていない限り、又は背景によって明確に示されていない限り、本開示におけるすべての技術と科学用語は、本開示の所属分野の普通技術者が一般に理解する同じ意味を有する。
以下の実施例において前記菌株を培養するために使用される基礎培地の組成が同じであり、この上に培地組成に必要のある該当するショ糖、カナマイシン又はクロラムフェニコールなどを添加する。固形物が必要な場合は、寒天を２％添加すればよく、ｐＨ７．０、培養温度３０度である。基礎培地における溶質組成を表１に示し、表１に示される溶質を水に溶かして基礎培地を得る。
下記の実施例におけるコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＹＰＧＬＵ００１ＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０は、２０２０年１１月２３日に中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センター（ＣＧＭＣＣと略称され、住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号、中国科学院微生物研究所）に保存されており、保存番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０である。コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１は、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０とも呼ばれる。
実施例１ 点変異のＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子コード領域を含む形質転換ベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａの構築
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ０１６３３５．１）配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＫＦ２７９９３．１）コード領域配列を増幅するプライマーを２組設計して合成し、アレル置換の方式で菌株ＡＴＣＣ １３８６９とＬ－グルタミン酸を高生産するコリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１（生物保存番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０である）に点変異を導入し、対応するコードタンパクのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３であり、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子のヌクレオチド配列の５９７番目のグアニン（Ｇ）は、アデニン（Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ）に変化し、対応するコードタンパクのアミノ酸配列の１９９番目のメチオニン（Ｍ）は、イソロイシン（Ｉ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：ＢＢＤ２９＿００４０５Ｍ１９９Ｉ）に変化した。
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ０１６３３５．１）配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＫＦ２７９９３．１）コード領域配列を増幅するプライマーを２組設計して合成し、アレル置換の方式で菌株ＡＴＣＣ １３８６９とＬ－グルタミン酸を高生産するコリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１（生物保存番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０である）に点変異を導入し、対応するコードタンパクのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３であり、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子のヌクレオチド配列の５９７番目のグアニン（Ｇ）は、アデニン（Ａ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ）に変化し、対応するコードタンパクのアミノ酸配列の１９９番目のメチオニン（Ｍ）は、イソロイシン（Ｉ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：ＢＢＤ２９＿００４０５Ｍ１９９Ｉ）に変化した。
野生型ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１であり、そのコードＢＢＤ２９＿００４０５タンパクのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３であり、
ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ変異遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２であり、そのコードＢＢＤ２９＿００４０５Ｍ１９９１変異タンパクのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４である。
ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ変異遺伝子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２であり、そのコードＢＢＤ２９＿００４０５Ｍ１９９１変異タンパクのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４である。
プライマー設計は、以下のとおりである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成され、ここで、下線は、変異塩基である）、
Ｐ１： ５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴＧＡＣＴＡＴＴＡＡＴＧＴＣＴＣＣＧＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
Ｐ２： ５’ ＡＧＡＣＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｐ３： ５’ ＴＧＣＣＣＡＧＡＣＣＡＴＡＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＧＴＣＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｐ４： ５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＴＡＧＣＣＧＧＣＧＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣＧＧＡＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
構築方法：コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９をテンプレートとし、それぞれプライマーＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４で、ＰＣＲ増幅を行った。
Ｐ１： ５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴＧＡＣＴＡＴＴＡＡＴＧＴＣＴＣＣＧＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
Ｐ２： ５’ ＡＧＡＣＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｐ３： ５’ ＴＧＣＣＣＡＧＡＣＣＡＴＡＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＧＴＣＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｐ４： ５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＴＡＧＣＣＧＧＣＧＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣＧＧＡＴ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
構築方法：コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９をテンプレートとし、それぞれプライマーＰ１とＰ２、Ｐ３とＰ４で、ＰＣＲ増幅を行った。
ＰＣＲ系：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ ｍＭ）４ μＬ、Ｍｇ２＋（２５ ｍＭ）４ μＬ、プライマー（１０ ｐＭ）各２ μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５ Ｕ／μＬ）０．２５ μＬ、テンプレートが１ μＬであり、残量が水であり、総容積５０ μＬである。
上記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で４０秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われ、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子コード領域を含む、大きさがそれぞれ約６４７ ｂｐと９２７ ｂｐである２つのＤＮＡ断片（ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ－Ｕｐ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２９）とＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ－Ｄｏｗｎ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３０）を取得した。
ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ－ＵｐとＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ－Ｄｏｗｎをアガロースゲル電気泳動により分離精製した後さらに上記２つのＤＮＡ断片をテンプレートとし、Ｐ１とＰ４をプライマーとし、オーバーラップＰＣＲ増幅により長さ約１５４７ ｂｐのＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片を得、そのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３１である。
ＰＣＲ系：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ ｍＭ）４ μＬ、Ｍｇ２＋（２５ ｍＭ）４ μＬ、プライマー（１０ ｐＭ）各２ μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５ Ｕ／μＬ）０．２５ μＬ、テンプレートが１μＬであり、残量が水であり、総容積が５０ μＬである。
上記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で１００秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われた。
このＤＮＡ断片により、ＡＴＣＣ １３８６９の変異誘導菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１（生物保存番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０である）におけるＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子コード領域の５９７番目のグアニン（Ｇ）をアデニン（Ａ）に変化させ、最終的にコードされたタンパクの１９９番目のアミノ酸は、メチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）に変化させた。
ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社から購入）をＸｂａ Ｉ酵素で切断した後、アガロースゲル電気泳動でＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ－Ｕｐ－Ｄｏｗｎと線形化したｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドを分離精製し、さらにＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系（ＮＥＢ Ｅ５５２０Ｓ）で組み立て、ベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを得、該プラスミドには、カナマイシン抵抗性マーカーが含まれる。そしてベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａをシーケンシング会社に送ってシーケンシング鑑定し、正しい点変異（Ｇ－Ａ）を含むベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを保存して予備した。
組換えベクターｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３１に示されるＤＮＡ断片ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ－Ｕｐ－Ｄｏｗｎ断片をｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢベクターのＸｂａ Ｉ認識部位間に挿入し、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢベクターの他の配列をそのまま維持し、得られた組換えベクターである。
実施例２ 点変異を含むＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａの工学的菌株の構築
構築方法：アイソサイト置換プラスミドｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを電気転換によりＬ－グルタミン酸を高生産するコリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１（生物保存番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０であり、シークエンスにより該菌株染色体上に野生型のＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子コード領域が保留されていることが確認され）に導入し、培養により生じた単一コロニーは、それぞれプライマーＰ１と汎用プライマーＭ１３Ｒにより鑑定され、大きさ約１５５４ ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２）バンドを増幅できた菌株は、陽性菌株である。陽性菌株は、１５％のショ糖を含む培地板上で培養され、培養により生じた単一コロニーは、それぞれカナマイシンを含む培地板とカナマイシンを含まない培地板上で培養され、カナマイシンを含まない培地上で成長するが、カナマイシンを含む培地上で成長しない菌株は、さらに以下のプライマー（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成された）を採用してＰＣＲ鑑定され、
Ｐ５： ５’ ＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＧＣＡＴＧＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
Ｐ６： ５’ ＡＴＣＧＧＧＴＴＧＧＡＡＡＴＣＧＣＡＧＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
汎用プライマーＭ１３Ｒ配列は、Ｍ１３Ｒ：５’ ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＴＧ ＡＣＣ ３’である。
構築方法：アイソサイト置換プラスミドｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを電気転換によりＬ－グルタミン酸を高生産するコリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１（生物保存番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０であり、シークエンスにより該菌株染色体上に野生型のＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子コード領域が保留されていることが確認され）に導入し、培養により生じた単一コロニーは、それぞれプライマーＰ１と汎用プライマーＭ１３Ｒにより鑑定され、大きさ約１５５４ ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２）バンドを増幅できた菌株は、陽性菌株である。陽性菌株は、１５％のショ糖を含む培地板上で培養され、培養により生じた単一コロニーは、それぞれカナマイシンを含む培地板とカナマイシンを含まない培地板上で培養され、カナマイシンを含まない培地上で成長するが、カナマイシンを含む培地上で成長しない菌株は、さらに以下のプライマー（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成された）を採用してＰＣＲ鑑定され、
Ｐ５： ５’ ＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＧＣＡＴＧＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
Ｐ６： ５’ ＡＴＣＧＧＧＴＴＧＧＡＡＡＴＣＧＣＡＧＡ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
汎用プライマーＭ１３Ｒ配列は、Ｍ１３Ｒ：５’ ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＴＧ ＡＣＣ ３’である。
上記ＰＣＲ増幅産物２６１ ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３３）は、高温変性、氷浴後にｓｓｃｐ電気泳動（プラスミドｐＫ１８－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａの増幅断片を陽性対照とし、ＡＴＣＣ １３８６９の増幅断片を陰性対照、水を空白対照とする）を行い、断片構造が異なり、電気泳動位置が異なるため、断片の電気泳動位置が陰性対照断片の位置と一致せず且つ陽性対照断片の位置と一致する菌株を、アイソサイト置換に成功した菌株とする。
アイソサイト置換に成功した菌株の目的断片を、さらにプライマーＰ５とＰ６でＰＣＲ増幅を行い、ＰＭＤ１９－Ｔベクターに連結してシークエンスを行い、塩基配列の比較により置換に成功したかどうかを決定し、高生産型グルタミン酸からのコリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１（生物保存番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０である）置換に成功した変異株をＹＰＧ－０２５と命名した。
組換え菌ＹＰＧ－０２５は、アレル置換の方式でコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０のＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子コード領域（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）に点変異Ｇ５９７Ａを導入し、該遺伝子の５９７番目のＧをＡに変異させ、該遺伝子の他の配列をそのままし、得た点変異（Ｇ－Ａ）を含む遺伝子工学菌ＹＰＧ－０２５である。
コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０と、コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧ－０２５との相違点は、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ２１２２０ゲノムにおけるＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子に置換しただけである。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１とＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２には、５９７番目に位置するヌクレオチドの相違点が１つしか存在しない。
ＳＳＣＰ電気泳動ＰＡＧＥの製造及び条件を表２に示す。
ＳＳＣＰ電気泳動ＰＡＧＥの製造及び条件を表２に示す。
実施例３ ゲノムにおいてＢＢＤ２９＿００４０５又はＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子を過剰発現させる工学的菌株の構築
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ０１６３３５．１）配列に基づいて、上下流相同アーム断片及びＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅するプライマーを３組設計して合成し、相同組換えの方式で菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１（生物保存番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０である）にＢＢＤ２９＿００４０５又はＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子を導入した。
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ０１６３３５．１）配列に基づいて、上下流相同アーム断片及びＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅するプライマーを３組設計して合成し、相同組換えの方式で菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１（生物保存番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０である）にＢＢＤ２９＿００４０５又はＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子を導入した。
プライマー設計は、以下のとおりである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成された）、
Ｐ７： ５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＧＡＣＣＣＧＣＴＴＧＣＣＡＴＡＣＧＡＡＧ ３’
Ｐ８： ５’ ＣＣＴＡＣＣＡＣＧＡ ＣＧＡＧＣＡＣＴＡＣ ＡＴＣＴＡＣＴＣＡＴ ＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣ ３’
Ｐ９： ５’ ＧＡＴＴＣＴＴＣＡＧ ＡＴＧＡＧＴＡＧＡＴ ＧＴＡＧＴＧＣＴＣＧ ＴＣＧＴＧＧＴＡＧＧ ３’
Ｐ１０： ５’ ＣＡＡＡＣＣＡＧＡＧ ＴＧＣＣＣＡＣＧＡＡ ＣＴＡＧＣＣＧＧＣＧ ＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣ ３’
Ｐ１１： ５’ ＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡ ＣＧＣＣＧＧＣＴＡＧ ＴＴＣＧＴＧＧＧＣＡ ＣＴＣＴＧＧＴＴＴＧ ３’
Ｐ１２： ５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＡＡＧＡＡＡＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣ ３’
構築方法：コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９又はＹＰＩ０１９をテンプレートとし、それぞれプライマーＰ７／Ｐ８、Ｐ９／Ｐ１０、Ｐ１１／Ｐ１２でＰＣＲ増幅を行った、上流相同アーム断片約８０６ ｂｐ、ＢＢＤ２９＿００４０５（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３４）又はＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子断片（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６）約１７７７ ｂｐ及び下流相同アーム断片約７８８ ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３７）を得、さらにＰ７／Ｐ１２をプライマーとし、以上の増幅した３つの断片をテンプレートとして混合して増幅し、３２９１ ｂｐの統合相同アーム断片上流－ＢＢＤ２９＿００４０５－下流（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８）又は統合相同アーム断片上流－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ－下流（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３９）を得た。ＰＣＲ反応終了後、増幅産物を電気泳動により回収し、カラム型ＤＮＡゲル回収キットを用いて必要な約３２９１ ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を採用しＸｂａ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドｐｋｌ８ｍｏｂｓａｃＢと連結し、統合プラスミド（即ち組換えベクター）ｐｋｌ８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿００４０５又はｐｋｌ８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを得、プラスミドには、カナマイシン抵抗性マーカーが含まれ、カナマイシンスクリーニングによりプラスミドがゲノムに統合された組換え子を得ることができる。
Ｐ７： ５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＧＡＣＣＣＧＣＴＴＧＣＣＡＴＡＣＧＡＡＧ ３’
Ｐ８： ５’ ＣＣＴＡＣＣＡＣＧＡ ＣＧＡＧＣＡＣＴＡＣ ＡＴＣＴＡＣＴＣＡＴ ＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣ ３’
Ｐ９： ５’ ＧＡＴＴＣＴＴＣＡＧ ＡＴＧＡＧＴＡＧＡＴ ＧＴＡＧＴＧＣＴＣＧ ＴＣＧＴＧＧＴＡＧＧ ３’
Ｐ１０： ５’ ＣＡＡＡＣＣＡＧＡＧ ＴＧＣＣＣＡＣＧＡＡ ＣＴＡＧＣＣＧＧＣＧ ＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣ ３’
Ｐ１１： ５’ ＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡ ＣＧＣＣＧＧＣＴＡＧ ＴＴＣＧＴＧＧＧＣＡ ＣＴＣＴＧＧＴＴＴＧ ３’
Ｐ１２： ５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＡＡＧＡＡＡＣＡＡＣＣＡＣＴＴＣＣ ３’
構築方法：コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９又はＹＰＩ０１９をテンプレートとし、それぞれプライマーＰ７／Ｐ８、Ｐ９／Ｐ１０、Ｐ１１／Ｐ１２でＰＣＲ増幅を行った、上流相同アーム断片約８０６ ｂｐ、ＢＢＤ２９＿００４０５（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３４）又はＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子断片（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６）約１７７７ ｂｐ及び下流相同アーム断片約７８８ ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３７）を得、さらにＰ７／Ｐ１２をプライマーとし、以上の増幅した３つの断片をテンプレートとして混合して増幅し、３２９１ ｂｐの統合相同アーム断片上流－ＢＢＤ２９＿００４０５－下流（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８）又は統合相同アーム断片上流－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ－下流（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３９）を得た。ＰＣＲ反応終了後、増幅産物を電気泳動により回収し、カラム型ＤＮＡゲル回収キットを用いて必要な約３２９１ ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を採用しＸｂａ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドｐｋｌ８ｍｏｂｓａｃＢと連結し、統合プラスミド（即ち組換えベクター）ｐｋｌ８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿００４０５又はｐｋｌ８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを得、プラスミドには、カナマイシン抵抗性マーカーが含まれ、カナマイシンスクリーニングによりプラスミドがゲノムに統合された組換え子を得ることができる。
ｐｋｌ８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿００４０５は、統合相同アーム断片上流－ＢＢＤ２９＿００４０５－下流（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８）をシャトルプラスミドｐｋｌ８ｍｏｂｓａｃＢのＸｂａ Ｉ酵素切断部位間に挿入して得られた組換えベクターである。
ｐｋｌ８ｍｏｂｓａｃＢ－ＢＢＤ２９＿００４０５は、統合相同アーム断片上流－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ－下流（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３９）をシャトルプラスミドｐｋｌ８ｍｏｂｓａｃＢのＸｂａ Ｉ酵素切断部位間に挿入して得られた組換えベクターである。
ＰＣＲ系：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ ｍＭ）４ μＬ、Ｍｇ２＋（２５ ｍＭ）４μＬ、プライマー（１０ｐＭ）各２μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２５μＬ、テンプレート１μＬがであり、残量が水であり、総容積が５０μＬである。
上記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で１８０秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われた。
２つの統合プラスミドをそれぞれ電気転換によりコリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１（生物保存番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０である）に導入し、培養により生じた単一コロニーは、Ｐ１３／Ｐ１４プライマーＰＣＲで鑑定され、ＰＣＲが増幅できた大きさ約１９７０ ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４０）の断片を含むのは、陽性菌株であり、断片を増幅できなかったのは、原菌である。陽性菌株は、１５％のショ糖スクリーニングを経てた後に、それぞれカナマイシンを含む培地板とカナマイシンを含まない培地板上で培養され、カナマイシンを含まない培地上で成長するが、カナマイシンを含む培地上で成長しない菌株は、さらにＰ１５／Ｐ１６プライマーを採用してＰＣＲ鑑定され、増幅できた大きさ約１７５８ ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４１）の菌は、ＢＢＤ２９＿００４０５又はＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子を菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１（生物保存番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０である）ゲノムに統合した菌株であり、ＹＰＧ－０２６（変異点を除く）とＹＰＧ－０２７（変異点を含む）と命名された。
Ｐ１３： ５’ ＧＴＣＣＡＡＧＧＴＧＡＣＧＧＣＣＧＣＡＣ ３’
Ｐ１４： ５’ ＡＧＣＴＴＣＧＣＣＧＡＴＧＴＴＧＣＧＣＡ ３’
Ｐ１５： ５’ ＡＧＧＴＴＧＣＡＣＣＣＧＣＣＡＴＣＧＣＴＧＣＡ ３’
Ｐ１６： ５’ ＡＴＡＴＴＣＧＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣ ３’
組換え菌ＹＰＧ－０２６は、統合相同アーム断片上流－ＢＢＤ２９＿００４０５－下流（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８）を菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１ゲノムに統合して得られた２コピーのＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子を含む組換え菌であり、２コピーＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子を含む組換え菌は、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子の発現量を顕著かつ安定的に増加させることができる。
Ｐ１３： ５’ ＧＴＣＣＡＡＧＧＴＧＡＣＧＧＣＣＧＣＡＣ ３’
Ｐ１４： ５’ ＡＧＣＴＴＣＧＣＣＧＡＴＧＴＴＧＣＧＣＡ ３’
Ｐ１５： ５’ ＡＧＧＴＴＧＣＡＣＣＣＧＣＣＡＴＣＧＣＴＧＣＡ ３’
Ｐ１６： ５’ ＡＴＡＴＴＣＧＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣ ３’
組換え菌ＹＰＧ－０２６は、統合相同アーム断片上流－ＢＢＤ２９＿００４０５－下流（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３８）を菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１ゲノムに統合して得られた２コピーのＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子を含む組換え菌であり、２コピーＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子を含む組換え菌は、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子の発現量を顕著かつ安定的に増加させることができる。
組換え菌ＹＰＧ０２７は、統合相同アーム断片上流－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ－下流（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３９）を菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１ゲノムに統合して得られたＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ変異遺伝子を含む組換え菌である。
実施例４ プラスミドにおいてＢＢＤ２９＿００４０５又はＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子を過剰発現させる工学的菌株の構築
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ０１６３３５．１）配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅するプライマーを１組設計して合成し、プライマー設計は、以下のとおりである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成された）、
Ｐ１７： ５’ ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＴＡＧＴＧＣＴＣＧＴＣＧＴＧＧＴＡＧＧ ３’
Ｐ１８： ５’ ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＴＡＧＣＣＧＧＣＧＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣＧＧＡＴ ３’
構築方法：ＡＴＣＣ １３８６９又はＹＰＧ－０２５をテンプレートとし、プライマーＰ１７／Ｐ１８でＰＣＲ増幅を行い、ＢＢＤ２９＿００４０５を含むＤＮＡ分子（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４２）又はＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを含むＤＮＡ分子（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４３）を約１８０７ ｂｐ得、増幅産物を電気泳動により回収し、カラム型ＤＮＡゲル回収キットを用いて必要な１８０７ ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を採用しＥｃｏＲ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドｐＸＭＪ１９（ＢｉｏＶｅｃｔｏｒ ＮＴＣＣ ＢｉｏｖｅｃｔｏｒｐＸＭＪ１９）と連結し、過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿００４０５又はｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを得た。プラスミドには、クロラムフェニコール耐性マーカーが含まれ、クロラムフェニコールスクリーニングにより得られたプラスミドを菌株に形質転換することができる。
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ０１６３３５．１）配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子コード領域及びプロモーター領域配列を増幅するプライマーを１組設計して合成し、プライマー設計は、以下のとおりである（上海ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司により合成された）、
Ｐ１７： ５’ ＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＴＡＧＴＧＣＴＣＧＴＣＧＴＧＧＴＡＧＧ ３’
Ｐ１８： ５’ ＡＴＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＴＡＧＣＣＧＧＣＧＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣＧＧＡＴ ３’
構築方法：ＡＴＣＣ １３８６９又はＹＰＧ－０２５をテンプレートとし、プライマーＰ１７／Ｐ１８でＰＣＲ増幅を行い、ＢＢＤ２９＿００４０５を含むＤＮＡ分子（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４２）又はＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを含むＤＮＡ分子（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４３）を約１８０７ ｂｐ得、増幅産物を電気泳動により回収し、カラム型ＤＮＡゲル回収キットを用いて必要な１８０７ ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系を採用しＥｃｏＲ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドｐＸＭＪ１９（ＢｉｏＶｅｃｔｏｒ ＮＴＣＣ ＢｉｏｖｅｃｔｏｒｐＸＭＪ１９）と連結し、過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿００４０５又はｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを得た。プラスミドには、クロラムフェニコール耐性マーカーが含まれ、クロラムフェニコールスクリーニングにより得られたプラスミドを菌株に形質転換することができる。
ＰＣＲ系：１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ ｍＭ）４ μＬ、Ｍｇ２＋（２５ ｍＭ）４ μＬ、プライマー（１０ ｐＭ）各２ μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ（５ Ｕ／μＬ）０．２５ μＬ、テンプレートが１μＬであり、残量が水であり、総容積が５０ μＬである。
前記上記ＰＣＲ増幅は、９４℃で５分間の予備変性、９４℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニール、７２℃で１００秒間の伸長（３０サイクル）、７２℃で１０分間の過剰伸長の方式で行われた。
組換えベクターｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿００４０５は、ＢＢＤ２９＿００４０５を含むＤＮＡ分子（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４２）をシャトルプラスミドｐＸＭＪ１９のＥｃｏＲ Ｉ酵素切断部位間に挿入して得られた組換えベクターである。
組換えベクターｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａは、ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを含むＤＮＡ分子（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４３）をシャトルプラスミドｐＸＭＪ１９のＥｃｏＲ Ｉ酵素切断部位間に挿入して得られた組換えベクターである。
プラスミドをそれぞれ電気転換によりコリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１（生物保存番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０である）に導入し、培養により生じた単一コロニーは、Ｍ１３Ｒ（－４８）とＰ１８プライマーでＰＣＲ鑑定され、ＰＣＲ増幅できた大きさ約１８４６ ｂｐの断片（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４４）を含むのは、転入菌株であり、ＹＰＧ－０２８（変異点を除く）とＹＰＧ－０２９（変異点を含む）と命名された。
Ｍ１３Ｒ（－４８）配列は、以下のとおりである、
５’ ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ ＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣ ＡＧＧＡ ３’
組換え菌ＹＰＧ－０２８は、２コピーＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子を含み、組換え菌ＹＰＧ－０２８は、プラスミド上の野生型ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子を過剰発現させる工学的菌であり、即ちプラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿００４０５が染色体外に過剰発現を行う。
５’ ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣ ＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣ ＡＧＧＡ ３’
組換え菌ＹＰＧ－０２８は、２コピーＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子を含み、組換え菌ＹＰＧ－０２８は、プラスミド上の野生型ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子を過剰発現させる工学的菌であり、即ちプラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿００４０５が染色体外に過剰発現を行う。
組換え菌ＹＰＧ－０２９は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示される変異のＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子を含み、組換え菌ＹＰＧ－０２９は、プラスミド上の変異型ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子を過剰発現させる工学的菌であり、即ちプラスミドｐＸＭＪ１９－ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａが染色体外に過剰発現を行う。
実施例５ ゲノムにおいてＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子を欠失させた工学的菌株の構築
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ０１６３３５．１）配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子コード領域両端の断片を増幅するプライマーを２組合成し、上下流相同アーム断片とする。プライマー設計は、以下のとおりである（上海英俊公司により合成された）、
Ｐ１９： ５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＧＴＣＴＧＧＧＧＧＴＧＡＧＣＧＣＧＧＡＴ ３’
Ｐ２０： ＡＧＧＡＡＡＡＴＡＡＣＧＣＡＴＣＣＡＴＣＴＧＣＣＣＣＴＴＴＡＣＡＡＡＴＣＣＡＣＣＧＣＡＡＡＣＡＣＴＧＧＧＡＴ ３’
Ｐ２１： ＴＧＧＡＴＴＴＧＴＡＡＡＧＧＧＧＣＡＧＡＴＧＧＡＴＧＣＧＴＴＡＴＴＴＴＣＣＴＴＣＡＣＴＴＴＴＣＧＴＡＴＣＣＡ ３’
Ｐ２２： ５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＴＣＴＧＧＣＧＣＡＴＣＧＡＡＣＡＧＧＴＣＧＡＡＧＧＡ ３’
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９をテンプレートとし、それぞれプライマーＰ１９／Ｐ２０及びＰ２１／Ｐ２２で、ＰＣＲ増幅を行い、上流相同アーム断片７０９ ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４５）及び下流相同アーム断片７３４ ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４６）を得た。さらにプライマーＰ１９／Ｐ２２でＯＶＥＲＰＣＲして相同アーム断片１４０５ ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４７）全体を得た。ＰＣＲ反応終了後、増幅産物を電気泳動により回収し、カラム型ＤＮＡゲル回収キットを用いて必要な１４０５ ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系によってＸｂａ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドｐｋｌ８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドと連結し、ノックアウトプラスミドを得た。該プラスミドには、カナマイシン抵抗性マーカーが含まれた。
ＮＣＢＩにより公表されたコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ０１６３３５．１）配列に基づいて、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子コード領域両端の断片を増幅するプライマーを２組合成し、上下流相同アーム断片とする。プライマー設計は、以下のとおりである（上海英俊公司により合成された）、
Ｐ１９： ５’ ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＧＴＣＴＧＧＧＧＧＴＧＡＧＣＧＣＧＧＡＴ ３’
Ｐ２０： ＡＧＧＡＡＡＡＴＡＡＣＧＣＡＴＣＣＡＴＣＴＧＣＣＣＣＴＴＴＡＣＡＡＡＴＣＣＡＣＣＧＣＡＡＡＣＡＣＴＧＧＧＡＴ ３’
Ｐ２１： ＴＧＧＡＴＴＴＧＴＡＡＡＧＧＧＧＣＡＧＡＴＧＧＡＴＧＣＧＴＴＡＴＴＴＴＣＣＴＴＣＡＣＴＴＴＴＣＧＴＡＴＣＣＡ ３’
Ｐ２２： ５’ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＴＣＴＧＧＣＧＣＡＴＣＧＡＡＣＡＧＧＴＣＧＡＡＧＧＡ ３’
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９をテンプレートとし、それぞれプライマーＰ１９／Ｐ２０及びＰ２１／Ｐ２２で、ＰＣＲ増幅を行い、上流相同アーム断片７０９ ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４５）及び下流相同アーム断片７３４ ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４６）を得た。さらにプライマーＰ１９／Ｐ２２でＯＶＥＲＰＣＲして相同アーム断片１４０５ ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４７）全体を得た。ＰＣＲ反応終了後、増幅産物を電気泳動により回収し、カラム型ＤＮＡゲル回収キットを用いて必要な１４０５ ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＮＥＢｕｉｄｅｒ組換え系によってＸｂａ Ｉ酵素切断により回収されたシャトルプラスミドｐｋｌ８ｍｏｂｓａｃＢプラスミドと連結し、ノックアウトプラスミドを得た。該プラスミドには、カナマイシン抵抗性マーカーが含まれた。
ノックアウトプラスミドを電気変換によりコリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１（生物保存番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０である）に導入し、培養により生じた単一コロニーは、それぞれ以下のプライマー（上海英俊公司により合成された）によってＰＣＲ鑑定された、
Ｐ２３： ５’ ＧＴＣＴＧＧＧＧＧＴＧＡＧＣＧＣＧＧＡＴ ３’
Ｐ２４： ５’ ＣＴＣＴＧＧＣＧＣＡＴＣＧＡＡＣＡＧＧＴＣＧＡＡＧＧＡ ３’
上記ＰＣＲ増幅できた大きさ約１３３１ ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４９）及び約２８０４ ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４８）のバンドの菌株は、陽性菌株であり、２８０４ ｂｐバンドのみ増幅できた菌株は、出発菌である。陽性菌株は、１５％のショ糖培地上でスクリーニングされた後に、それぞれカナマイシンを含む培地板とカナマイシンを含まない培地板上で培養され、カナマイシンを含まない培地上で成長するが、カナマイシンを含む培地上で成長しない菌株は、さらにＰ２３／Ｐ２４プライマーを採用してＰＣＲ鑑定され、増幅できた大きさ１３３１ ｂｐバンドの菌株は、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子コード領域がノックアウトされた遺伝子工学的菌株であり、ＹＰＧ－０３０と命名された。
Ｐ２３： ５’ ＧＴＣＴＧＧＧＧＧＴＧＡＧＣＧＣＧＧＡＴ ３’
Ｐ２４： ５’ ＣＴＣＴＧＧＣＧＣＡＴＣＧＡＡＣＡＧＧＴＣＧＡＡＧＧＡ ３’
上記ＰＣＲ増幅できた大きさ約１３３１ ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４９）及び約２８０４ ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４８）のバンドの菌株は、陽性菌株であり、２８０４ ｂｐバンドのみ増幅できた菌株は、出発菌である。陽性菌株は、１５％のショ糖培地上でスクリーニングされた後に、それぞれカナマイシンを含む培地板とカナマイシンを含まない培地板上で培養され、カナマイシンを含まない培地上で成長するが、カナマイシンを含む培地上で成長しない菌株は、さらにＰ２３／Ｐ２４プライマーを採用してＰＣＲ鑑定され、増幅できた大きさ１３３１ ｂｐバンドの菌株は、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子コード領域がノックアウトされた遺伝子工学的菌株であり、ＹＰＧ－０３０と命名された。
組換え菌ＹＰＧ－０３０は、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０上のゲノムにおけるＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子がノックアウトされた。
実施例６ Ｌ－グルタミン酸発酵実験
実施例２～５で構築された菌株ＹＰＧ－０２５、ＹＰＧ－０２６、ＹＰＧ－０２７、ＹＰＧ－０２８、ＹＰＧ－０２９、ＹＰＧ－０３０とオリジナルコリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１（生物保存番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０である）をＢＬＢＩＯ－５ＧＣ－４－Ｈ型番の発酵槽（上海百崙生物科技有限公司から購入された）で、表３に示される培地と表４に示される発酵制御プロセスに従って発酵実験を行い、発酵産物を収集した。
実施例２～５で構築された菌株ＹＰＧ－０２５、ＹＰＧ－０２６、ＹＰＧ－０２７、ＹＰＧ－０２８、ＹＰＧ－０２９、ＹＰＧ－０３０とオリジナルコリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１（生物保存番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０である）をＢＬＢＩＯ－５ＧＣ－４－Ｈ型番の発酵槽（上海百崙生物科技有限公司から購入された）で、表３に示される培地と表４に示される発酵制御プロセスに従って発酵実験を行い、発酵産物を収集した。
接種完了の初期時刻で、系における菌濃度は、１５ ｇ／Ｌである。発酵中に、５０～５５％のブドウ糖水溶液を補充することによって系の糖度（残糖）を制御した。
各菌株は３回繰り返し、結果を表５に示す。
上記発酵培地は、表３に示される溶質を水に溶解して得られた発酵培地である。
結果は、表５に示すように、Ｌ－グルタミン酸を生産する工学的菌コリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１（生物保存番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０である）において、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子コード領域に対して点変異ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを行うことにより、Ｌ－グルタミン酸生産量の向上に有利であり、ＢＢＤ２９＿００４０５、ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを過剰発現させることにより、ｌ一グルタミン酸の生産量の向上に有利であるが、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子をノックアウトすることにより、Ｌ－グルタミン酸の蓄積に不利である。
以上本発明の実施方式について説明した。しかし、本発明は、上記実施方式に限定されるものではない。本発明の精神と原則において、いかなる修正、同等置換、改善などは、いずれも本発明の保護範囲内に含まれるべきである。
本発明は、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子のノックアウトにより、該遺伝子のコードする産物がＬ－グルタミン酸生産能力に影響を与え、コード配列に点変異を導入し、又は該遺伝子のコピー数を増加又は過剰発現させて組換え菌株を得ることにより、得られた菌株が未改造の菌株と比べて、高濃度のグルタミン酸を生産するのに有利であることを発見した。本発明によるＣＴＤ－２２５６Ｐ１５．２又はそのコードするマイクロペプチドＰＡＣＭＰの阻害剤は、腫瘍細胞又は腫瘍組織に作用することにより、腫瘍細胞の増殖を著しく抑制し、腫瘍細胞のアポトーシスを増加させ、腫瘍体積を減少させることができ、優れた抗腫瘍効果を有する。本発明による新規抗腫瘍薬物組合せ案は、ＣＴＤ－２２５６Ｐ１５．２またはそのコードするマイクロペプチドＰＡＣＭＰ阻害剤と他の抗腫瘍剤とを併用することにより、抗腫瘍剤の腫瘍細胞に対する殺傷効果を著しく増強し、腫瘍細胞の化学療法耐性を低下させ、腫瘍の臨床治療効果を向上させることができる。ＣＴＤ－２２５６Ｐ１５．２は化学療法耐性の腫瘍組織と細胞系で高発現し、しかもその高発現は腫瘍患者の無疾患進行生存期と全体生存期と明らかに負の相関がある。本発明によるＣＴＤ２２５６Ｐ１５．２遺伝子の発現レベルは、腫瘍患者の化学療法に対する感受性及び予後を予測するための分子指標として用いられてもよく、腫瘍患者の臨床化学療法投与を効果的に指導し、治療予後を評価するための新たな基準を切り開いた。
具体的には、本発明は、まずアレル置換の方式でコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２１２２０のＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子コード領域（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）に点変異を導入し、点変異（Ｇ－Ａ）を含む遺伝子工学的菌ＹＰＧ－０２５を構築した。菌生産中に野生型ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子又はその変異遺伝子ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを過剰発現させるそれぞれ外来遺伝子を宿主染色体に統合し又はプラスミド染色が体外に発現させ、ゲノム上とプラスミド上においてＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子又はＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子を過剰発現させる工学的菌ＹＰＧ－０２６、ＹＰＧ－０２７、ＹＰＧ－０２８とＹＰＧ－０２９を構築した。実験によると、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子及びその変異体は、Ｌ－グルタミン酸の生物合成に関与しており、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝の過剰発現又はノックアウト、又は固定点変異（例えば点変異）を行うことにより、Ｌ－グルタミン酸の微生物における蓄積量を制御することができる。ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子コード領域に対して点変異又は菌生産中にＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子又はその変異遺伝子ＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａを過剰発現させることにより、Ｌ－グルタミン酸生産量及び形質転換率の向上に有利であるが、ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子に対してノックアウト又は弱化を行うことは、Ｌ－グルタミン酸の蓄積に不利である。ＢＢＤ２９＿００４０５遺伝子及びその変異体（例えばＢＢＤ２９＿００４０５Ｇ５９７Ａ遺伝子）を利用してＬ－グルタミン酸を生産する遺伝子工学的菌種を構築し、Ｌ－グルタミン酸生産量の向上を促進することができ、工業化生産に適合する高生産、高品質の菌種を育成し、Ｌ－グルタミン酸の工業化生産に対して広範な応用価値と重要な経済意義を持つ。
菌種名：コリネバクテリウム・グルタミクム：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、菌株番号：ＹＰＧＬＵ００１、受託番号：ＣＧＭＣＣ ２１２２０
Claims (20)
- Ｌ－グルタミン酸生産細菌であって、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現が改善されており、
好ましくは、前記改善された発現は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現が増強されていること、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点変異を有していること、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが点変異を有し且つ発現が増強されていることである、ことを特徴とするＬ－グルタミン酸生産細菌。 - ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの点変異により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列の１９９番目のメチオニンは、異なるアミノ酸で置換され、好ましくは、１９９番目のメチオニンは、イソロイシンで置換される、ことを特徴とする請求項１に記載の細菌。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の細菌。
- 前記点変異を有するポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の５９７番目の塩基の変異により形成され、
好ましくは、前記変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の５９７番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への変異を含み、
好ましくは、前記点変異を有するポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の細菌。 - 前記細菌は、コリネバクテリウム属細菌であり、好ましくは、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｒｎ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・ペキネンシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｋｉｎｅｎｓｅ）、ブレビバクテリウム・サッカロリチカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、ブレビバクテリウム・チオゲニタイス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｉｏｇｅｎｉｔａｉｉｓ）であり、好ましくは、生物保存番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ． ２１２２０であるコリネバクテリウム・グルタミクムＹＰＧＬＵ００１、又はコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ １３８６９である、ことを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の細菌。
- 請求項１～５のいずれか１項に記載の細菌を培養し、前記培養物からＬ－グルタミン酸を回収することを含む、Ｌ－グルタミン酸の生産方法。
- ポリヌクレオチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドをコードすることを含み、ここで、１９９番目のメチオニンは、異なるアミノ酸で置換され、好ましくは、１９９番目のメチオニンは、イソロイシンで置換され、
好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：４に示されるアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドをコードすることを含み、
好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の５９７番目の塩基の変異により形成され、好ましくは、前記変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるポリヌクレオチド配列の５９７番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への変異であり、
好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とするポリヌクレオチド。 - アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：４に示される、ことを特徴とするタンパク。
- 請求項７に記載のポリヌクレオチド及び／又は請求項８に記載のタンパクを含む組換えベクター、発現カセット、トランスジェニック細胞系と／組換え菌。
- 請求項７に記載のポリヌクレオチド、請求項８に記載のタンパク、請求項９に記載の組換えベクター、発現カセット、トランスジェニック細胞系と／組換え菌の、Ｌ－グルタミン酸の生産における応用。
- 前記タンパク質は、
Ａ１）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４であるタンパク質と、
Ａ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に示されるアミノ酸配列を、アミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は添加を経て得られた、Ａ１）に示されるタンパク質と８０％以上の同一性を有し且つ同じ機能を有するタンパク質と、
Ａ３）Ａ１）又はＡ２）のＮ端及び／又はＣ端にタグを連結して得られた、同じ機能を有する融合タンパク質とのうちのいずれか一つである、ことを特徴とするタンパク質。 - 前記核酸分子は、
Ｂ１）請求項１１に記載のタンパク質をコードする核酸分子と、
Ｂ２）コード配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子と、
Ｂ３）ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子とのうちのいずれか一つである、ことを特徴とする核酸分子。 - 前記生体材料は、
Ｃ１）請求項１２に記載の核酸分子を含む発現カセットと、
Ｃ２）請求項１２に記載の核酸分子を含む組換えベクター、又はＣ１）に記載の発現カセットを含む組換えベクターと、
Ｃ３）請求項１２に記載の核酸分子を含む組換え微生物、又はＣ１）に記載の発現カセットを含む組換え微生物、又はＣ２）に記載の組換えベクターを含む組換え微生物とのうちのいずれか一つである、ことを特徴とする生物材料。 - ＦＩ）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つの微生物のＬ－グルタミン酸の生産量の制御における応用と、
Ｆ２）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つのＬ－グルタミン酸生産の遺伝子工学菌の構築における応用と、
Ｆ３）Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つのＬ－グルタミン酸の製造における応用とのうちのいずれか一つにおけるＤ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つの応用であって、
ここで、前記Ｄ１）～Ｄ８）は、
Ｄ１）請求項１１に記載のタンパク質、
Ｄ２）請求項１２に記載の核酸分子、
Ｄ３）請求項１３に記載の生物材料、
Ｄ４）ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１であるＤＮＡ分子、
Ｄ５）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるヌクレオチド配列を、修飾及び／又は一つ又は複数のヌクレオチドの置換及び／又は欠失及び／又は添加を経て得られた、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子と９０％以上の同一性を有し、且つ同じ機能を有するＤＮＡ分子、
Ｄ６）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む発現カセット、
Ｄ７）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む組換えベクター、又はＤ６）に記載の発現カセットを含む組換えベクター、
Ｄ８）Ｄ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子を含む組換え微生物、又はＤ６）に記載の発現カセットを含む組換え微生物、又はＤ７）に記載の組換えベクターを含む組換え微生物である、Ｄ１）～Ｄ８）のうちのいずれか一つの応用。 - 微生物におけるＬ－グルタミン酸の生産量を向上させる方法であって、
Ｅ１）目的微生物における請求項１２に記載の核酸分子の発現量又は、含有量を向上させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることと、
Ｅ２）目的微生物における請求項１４におけるＤ４）又はＤ５）に記載のＤＮＡ分子の発現量又は、含有量を向上させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることと、
Ｅ３）前記目的微生物におけるヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １であるＤＮＡ分子を変異させ、Ｌ－グルタミン酸の生産量が前記目的微生物よりも高い微生物を得ることとのうちのいずれか一つを含む、ことを特徴とする微生物におけるＬ－グルタミン酸の生産量を向上させる方法。 - 前記変異は、点変異である、ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
- 前記点変異は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子がコードするアミノ酸配列の１９９番目のメチオニン残基を別のアミノ酸残基に変異させることである、ことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
- 前記点変異は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子がコードするアミノ酸配列の１９９番目のアラニンをイソロイシンに変異させ、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４である変異タンパク質を得ることである、ことを特徴とする請求項１６又は１７に記載の方法。
- 請求項１３又は１４に記載の組換え微生物を構築する方法であって、
Ｆ１）請求項１２に記載の核酸分子を目的微生物に導入し、前記組換え微生物を得ることと、
Ｆ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子を目的微生物に導入し、前記組換え微生物を得ることと、
Ｆ３）遺伝子編集手段を用いてＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示されるＤＮＡ分子を編集し、目的微生物にＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に示されるＤＮＡ分子を含ませることとのうちの少なくともいずれか一つを含む、ことを特徴とする請求項１３又は１４に記載の組換え微生物を構築する方法。 - 請求項１３又は１４に記載の組換え微生物を用いてＬ－グルタミン酸を生産することを含む、ことを特徴とするＬ－グルタミン酸の製造方法。
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