KR101307348B1

KR101307348B1 - Ｌ―글루탐산 고생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주

Info

Publication number: KR101307348B1
Application number: KR1020100108218A
Authority: KR
Inventors: 문민우; 한재춘; 박준석; 박동철
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2010-11-02
Filing date: 2010-11-02
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2030-11-02
Also published as: KR20120046522A

Abstract

본 발명은 L-글루탐산 고생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주 및 이의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 L-글루탐산 고생산능을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주에서 avtA 또는 alaT 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드를 불활성화시킴으로써 L-글루탐산의 생산량은 증가시킴과 동시에 알라닌의 생산은 효과적으로 감소시킨 균주이다. 본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주에서의 발효 부산물인 알라닌의 생산능을 감소시킴으로써 L-글루탐산을 높은 순도로 정제할 수 있을 뿐 만 아니라 L-글루탐산의 회수율을 향상시켜 L-글루탐산의 생산 제조 원가를 크게 낮출 수 있다. 또한, 본 발명은 알라닌 생합성과 관련된 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 두 종류의 유전자 avtA 와 alaT 유전자를 각각 염색체 상에서 제거하는 방법에 의해, 알라닌 생합성에 이용되는 피루브산의 세포내 농도를 증가시키고 이에 대한 대사흐름을 바꿔 궁극적으로 L-글루탐산 생산성 향상에 기여할 수 있는 기회를 제공함으로 생산비용이 절감되는 효과를 제공할 수 있으며, 본 발명에 의해 제조된 L-글루탐산은 수식 과정을 거쳐 감칠맛 성분으로 풍미증진제 및 조미원료로 이용될 수 있다.

Description

Ｌ―글루탐산 고생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주{Mutant Corynebacterium glutamicum Strain with Enhanced L-Glutamic Acid Production}

본 발명은 L-글루탐산 고생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주에 관한 것이다.

L-글루탐산은 미생물 발효에 의해 생산되는 대표적인 아미노산으로, 2008년 현재 전세계 생산량은 210만 톤으로 의약품, 식품, 동물사료 등에 널리 이용되는 아미노산이다.

L-글루탐산의 발효경로를 간단하게 살펴보면, 포도당은 주로 해당경로(EMP)를 거치게 되나 일부는 6탄당 인산경로(HMP)를 거쳐서 2분자의 피루브산(pyruvic acid)으로 대사된다. 그 중 1분자는 CO₂를 고정하여 옥살로아세트산(oxaloacetic acid)으로 되고 다른 1분자는 피루브산으로부터 아세틸코에이(acetyl CoA)와 결합하여 구연산(citric acid)으로 된다. 다시 옥살로아세트산과 구연산은 시트르산 회로(TCA cycle)로 들어가 알파-케토글루타산(α-ketoglutaric acid)이 된다. 여기서, 알파-케토글루타산으로 부터 호박산(succinic acid)으로 산화되는 산화대사 경로가 결여되어 있고 또 이소시트레이트 디히드로겐아제(isocitrate dehydrogenase)와 글루타메이트 디히드로겐아제(glutamate dehydrogenase)가 밀접하게 관여하기 때문에 알파-케토글루타산의 환원적 아미노산화 반응이 능률적으로 진행되어 L-글루탐산이 생성된다.

L-글루탐산를 생산하는 통상적인 방법으로는 주로 브레비박테리움(Brevibacterium) 이나 코리네박테리움 속 및 그 변이주를 포함한 코리네형(cornyeform) 박테리아를 이용해 발효를 통해 생산하며(Amino Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center: 195-215, 1986) 그 외에도 대장균(Escherichia coli), 고초균(Bacillus), 방선균(Streptomyces), 페니실리움(Penicillum) 속 및 크렙시엘라(Klebsiella), 어위니아(Erwinia), 판토에아(Pantoea) 속 등의 미생물을 이용하는 방법 등이 있다(미국 특허 제3,220,929호, 제 6,682,912 호).

한편 L-글루탐산의 생산량을 증가시키기 위한 방법으로, pyc 유전자나 fasR 같은 특정 유전자의 증폭이나(미국특허 제 6,852,516호, 대한민국특허 제7,007,296호), gdh, gltA, icd, pdh 및 argG 유전자의 프로모터(promoter)부위 조작(미국특허 제6,962,805호) 그리고 dtsR1과 pyc 유전자를 동시 파쇄(J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 36:911-921, 2009)함으로 L-글루탐산 생산량을 증가시킨바 있다.

코리네형 세균에 의한 L-글루탐산의 생산에 있어서, 누수모델(leak model)에서는 알파-케토글루타산의 산화반응을 통해 석시닐코에이(succinyl-CoA)를 생성하는 옥소글루타레이트 디히로로겐아제 복합체[(oxoglutarate dehydrogenase comlex(ODHC)]의 약한 활성으로, 세포내 알파-케토글루타산(α-ketoglutaric acid)의 농도가 높게 유지되고, L-글루탐산 합성으로 대사흐름(metabolic flux)이 유도된다고 생각해 왔다. 비오틴(biotin) 제한 조건에서는 막(membrane) 투과성이 정상적인 상태에서 보다 높고, 그로 인해 세포내의 L-글루탐산 농도는 낮게 유지되게 되고, 피드백 저해(feedback inhibition)가 해제되어 계속해서 L-글루탐산의 과 생산이 이루어지게 된다고 생각되었다.

최근의 연구에 의해 몇 가지 점에서 대치되는 연구 결과들이 나왔다. 첫째, 상당한 수준의 ODHC(2-oxoglutarate dehydrogenase complex) 활성이 코리네박테리움 글루타미쿰에서 발견되었고, L-글루탐산 생산시에도 시트르산 회로가 완전히 정지 되지 않는다는 것이 밝혀졌다. 둘째, L-글루탐산 생산 조건에서도 이온이나 아미노산 및 유기산들의 투과성이 변하지 않는다는 것이 밝혀졌다. 이로 인해 L-글루탐산 생산과 관련된 대사흐름의 변화에 대해 다시금 주목하게 되었다. 대장균에서도 ODHC 변이주에 의해 L-글루탐산의 과생산이 보고되었다. 코리네형 세균에 있어서 비오틴 제한 조건에서 40-60%의 ODHC활성의 감소가 보고되었으며 ODHC의 활성 감소는 비오틴 제한조건 이외에도 페니실린(penicillin)이나 계면 활성제의 첨가에 의해서도 확인되었다.

이러한 점에서 볼 때 ODHC의 활성 감소가 코리네형 세균에 있어서 필수적인 요소임을 알 수 있다. 최근 연구에 의하면 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 균주에서 유래된 odh A 유전자가 파쇄된 균주에 의해 비오틴 과잉조건에서도 결핍 조건에서와 같은 수준의 L-글루탐산 생산이 보고되었다. 또한 odh A 파쇄주의 지방산 조성도 야생주와 거의 동일함이 밝혀져 L-글루탐산 생산이 막의 구조 변화에 의해서 보다 L-글루탐산 합성으로의 대사흐름의 변화에 의해 유발됨이 알려졌다(Appl. Environ. Microbiol., 73(4): 13081319, 2007). 또한 앞서 기술한 누수모델과 대별되는 기작으로, 기계적 감각통로의 동족체(mechanosensitive channel homolog)로써 L-글루탐산 배출에 중요한 역할을 하는 YggB(Ncgl1221)에 의한 능동수송기작(active transport mechanism)이 보고되면서 이를 활용한 L-글루탐산 생산이 주목을 받고 있다(대한민국 특허 제 7,017,511호).

한편, 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 배양 온도인 30℃ 보다 높은 37℃ 또는 45℃에서 배양 가능하며, L-글루탐산을 생산할 수 있는 균주로서 코리네박테리움 에피센스(C.efficens) YS-314 균주를 자연계에서 분리해 보고한 바 있다(Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 52: 11271131, 2002).

아미노산 생합성 및 분해에 관여하는 아미노트랜스퍼라제(aminotransferase)는 α-아미노산의 α-케토산으로의 전이를 촉매하는 효소로 이들 효소를 아미노기전이효소(transaminase)라 부르며, 일반적으로 다수의 아미노산의 α-아미노기를 α-케토글루타레이트에 보내 NH4⁺로 전환시킨다. 특히 코리네박테리움 글루타미쿰의 알라닌 생합성과 관계된 아미노트랜스퍼라제는 피루브산을 기질로 하여 L-발린에 의존적인 방법으로 L-알라닌과 2-옥소이소발레이트로 전환을 촉매하는 avtA(alanine-valine transaminase) 유전자와 피루브산을 기질로 하여 L-글루탐산에 의존적인 방법으로는 L-알라닌과 2-옥소글루타르산으로 전환반응을 촉매하는 alaT(alanine transaminase) 유전자가 존재하며, 이중 L-알라닌 합성에 주된 반응을 촉매하는 알라닌 아미노트랜스퍼라제는 alaT 이다(Appl. Environ. Microbiol., 74(24): 74577462,2008).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 L-글루탐산을 효율적으로 고생산할 수 있는 L-글루탐산 고생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주를 개발하고자 예의 노력하였다. 그 결과, 유전자 재조합 기술을 이용하여 L-글루탐산 생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 알라닌-발린 트랜스아미나아제(alanine-valine transaminase) 또는 알라닌 아미노트랜스퍼라제(alanine aminotransferase)를 불활성화시킴으로써 알라닌-발린 트랜스아미나아제 또는 알라닌 아미노트랜스퍼라제가 불활성화된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주에서 발효 부산물인 알라닌의 생산은 감소됨과 동시에 L-글루탐산의 생산은 현저하게 증가됨을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 불활성화 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 포함하는 L-글루탐산 고생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 불활성화 알라닌 아미노트랜스퍼라제를 포함하는 L-글루탐산 고생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 불활성화 시키는 단계를 포함하는 L-글루탐산 고생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 알라닌 아미노트랜스퍼라제를 불활성화 시키는 단계를 포함하는 L-글루탐산 고생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 불활성화 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 포함하는 L-글루탐산 고생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주를 배양시키는 단계를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주로부터의 고농도 L-글루탐산 생산방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 불활성화 알라닌 아미노트랜스퍼라제를 포함하는 L-글루탐산 고생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주를 배양시키는 단계를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주로부터의 고농도 L-글루탐산 생산방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 불활성화 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 포함하는 L-글루탐산 고생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 불활성화 알라닌 아미노트랜스퍼라제를 포함하는 L-글루탐산 고생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주를 제공한다.

본 발명자들은 L-글루탐산을 효율적으로 고생산할 수 있는 L-글루탐산 고생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주를 개발하고자 예의 노력하였으며, 그 결과, L-글루탐산 생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 알라닌-발린 트랜스아미나아제(alanine-valine transaminase) 또는 알라닌 아미노트랜스퍼라제(alanine aminotransferase)를 불활성화 시킴으로써 알라닌-발린 트랜스아미나아제 또는 알라닌 아미노트랜스퍼라제가 불활성화된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주에서 발효 부산물인 알라닌의 생산은 감소됨과 동시에 L-글루탐산의 생산은 현저하게 증가됨을 규명하였다.

본 발명자들은 유전자 재조합 기술을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 불활성화 시키는 경우 알라닌의 합성을 감소시킬 뿐 만 아니라 주요 기질로 이용되는 피루브산의 알라닌 생합성에 대한 이용을 저해해 L-글루탐산 등의 아미노산 생합성을 위한 기질로 이용되게 하고 궁극적으로 L-글루탐산의 생합성을 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 또한 알라닌 아미노트랜스퍼라아제를 불활성화 시키는 경우 알라닌의 생합성은 감소될 뿐 만 아니라 주요 기질로 이용되는 피루부산의 알라닌 생합성에 대한 이용을 저해해 L-글루탐산 등의 아미노산 합성을 위한 기질로 이용되게 하고, 또 다른 기질인 L-글루탐산의 분해를 막아 세포내 L-글루탐산의 농도를 높일 수 있음을 규명하였다.

코리네박테리움 글루타미쿰 균주는 알라닌 생합성에 관계된 두 종류의 아미노트랜스퍼라아제를 이용하여 알라닌을 생합성 하며, 상기 두 종류의 아미노트랜스퍼라아제는 알라닌-발린 트랜스아미나아제와 알라닌 아미노트랜스퍼라아제로 구성된다.

알라닌-발린 트랜스아미나아제는 피루브산을 기질로 하여 L-발린에 의존적으로 L-알라닌과 2-옥소이소발레이트로 전환을 촉매하는 효소이고, 알라닌 아미노트랜스퍼라아제는 피루브산을 기질로 하여 L-글루탐산에 의존적으로 L-알라닌과 2-옥소글루타르산으로 전환시키는 효소이다.

본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서의 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 불활성화시킴으로써 피루브산을 기질로 하는 L-발린에 의존적인 알라닌의 생합성 경로를 차단하여 알라닌의 합성을 현저히 감소시킬 뿐 만 아니라 균주내 증가된 피루브산을 L-글루탐산의 생산에 이용하게 하는 대사흐름 변경을 통하여 L-글루탐산의 생산량을 매우 우수하게 증가시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서의 알라닌 아미노트랜스퍼라제를 불활성화시킴으로써 피루브산을 기질로 하는 L-글루탐산에 의존적인 알라닌의 생합성 경로를 차단하여 알라닌의 합성은 현저히 감소될 뿐 만 아니라 알라닌 생합성에 이용되지 않는 L-글루탐산은 축적되고 균주내 증가된 피루브산을 L-글루탐산의 생산에 이용하게 하는 대사흐름 변경을 통하여 궁극적으로 L-글루탐산의 생산량을 매우 우수하게 증가시킬 수 있는 효과를 발휘를 한다.

본 발명에서 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주를 표현하면서 사용하는 용어 “불활성화”는 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드를 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 단백질의 발현을 억제시키는 것을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주는 avtA 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 알라닌-발린 트랜스아미나아제가 불활성화 된 균주이며, 보다 바람직하게는 avtA 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 완전 또는 부분 결실을 통하여 알라닌-발린 트랜스아미나아제가 불활성화 된 균주이고, 가장 바람직하게는 avtA 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 부분 결실을 통하여 알라닌-발닌 트랜스아미나아제가 불활성화 된 균주이다.

또한, 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주는 alaT 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 알라닌 아미노트랜스퍼라제가 불활성화 된 균주이며, 보다 바람직하게는 alaT 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 완전 또는 부분 결실을 통하여 알라닌 아미노트랜스퍼라제가 불활성화 된 균주이고, 가장 바람직하게는 alaT 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 부분 결실을 통하여 알라닌 아미노트랜스퍼라제가 불활성화 된 균주이다.

본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로부터 L-글루탐산 생산을 고효율 및 대량으로 생산하기 위하여 알라닌-발린 트랜스아미나아제 또는 알라닌 아미노트랜스퍼라제가 불활성화된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주를 이용함으로써, 코리네박테리움 글루타미쿰으로 L-글루탐산을 생산 및 회수하는데 있어서 부산물인 알라닌의 생산을 현저하게 감소시킬 뿐 만 아니라 L-글루탐산을 고생산하여 매우 효율적으로 수득할 수 있는 균주이다.

본 발명의 명세서에서 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주를 표현하면서 사용하는 표현 “알라닌의 생산능의 감소”는 야생형 또는 알라닌-발린 트랜스아미나아제 또는 알라닌 아미노트랜스퍼라제 활성을 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주로부터 생산되는 알라닌의 생산량보다 감소된 양을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명에서의 알라닌-발린 트랜스아미나아제 또는 알라닌 아미노트랜스퍼라제가 불활성화된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주는 균주 배양액 1ℓ 당 38-50 g의 L-글루탐산을 생산할 수 있으며, 보다 바람직하게는 39-45 g의 L-글루탐산을 생산할 수 있고, 가장 바람직하게는 41-43 g의 L-글루탐산을 생산할 수 있다.

본 발명은 야생형(wild type) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주를 모균주로 하여 알라닌-발린 트랜스아미나아제 또는 알라닌 아미노트랜스퍼라제를 불활성화 시킨 균주이며, 알라닌-발린 트랜스아미나아제 또는 알라닌 아미노트랜스퍼라제를 발현 또는 효소 활성을 포함하고 있는 야생형 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주라면 모균주로 제한 없이 이용이 가능하다.

본 발명자들은 유전자 재조합(재조합 플라스미드) 기술을 이용하여 제조한 알라닌-발린 트랜스아미나아제 또는 알라닌 아미노트랜스퍼라제를 불활성화 시킨 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주들 중 부산물인 알라닌을 최소로 생산할 뿐 만 아니라 L-글루탐산을 고생산할 수 있는 불활성화 알라닌-발린 트랜스아미나아제 또는 불활성화 알라닌 아미노트랜스퍼라제를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주를 각각 DSB41002 및 DSB41003이라 명명하고, 국제미생물기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자은행에 2010년 10월 27일자로 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC11797BP 및 KCTC11798BP를 각각 부여받았다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 불활성화 알라닌-발린 트랜스아미나아제를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주는 기탁번호 KCTC11797BP인 균주이다.

또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 불활성화 알라닌 아미노트랜스퍼라제를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주는 기탁번호 KCTC11798BP인 균주이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 알라닌-발린 트랜스아미나아제(alanine-valine transaminase)를 불활성화시키는 단계를 포함하는 L-글루탐산 고생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 알라닌 아미노트랜스퍼라제(alanine aminotransferase)를 불활성화시키는 단계를 포함하는 L-글루탐산 고생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주 제조방법을 제공한다.

본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 및 변이 균주의 전배양 또는 종배양 하는데 있어서 공지된 배양 방법을 통해 배양할 수 있다.

배지로는 천연배지 또는 합성배지를 사용할 수 있으며, 배지의 탄소원으로는 예를 들어, 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤, 녹말 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두 케이크, 우레아, 티오우레아, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소-함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이러한 성분에 한정되는 것은 아니다.

배지에 포함되는 무기염으로는 마그네슘, 망간, 포타슘, 칼슘, 철 등의 포스페이트, 나이트레이트, 카보네이트, 클로라이드 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

상기 탄소원, 질소원 및 무기염의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가될 수 있다.

본 발명은 공지된 유전자 재조합 방법에 의하여 야생형 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주를 알라닌-발린 트랜스아미나아제 또는 알라닌 아미노트랜스퍼라제를 불활성화 시키는 것이 가능하다. 알라닌 생합성에 관련된 아미노트랜스퍼라제를 암호화 하는 두 개의 유전자 avtA 및 alaT를 염색체상에서 각각 결실시키기 위해 제조한 재조합 플라스미드 pAV와 pAT를 이용한다(참조: 도 2 및 도 3).

본 발명에서 야생형 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 형질전환 시키는 단계는 공지된 방법을 통하여 실시될 수 있다. 예컨대, 전기 천공 방법 (van der Rest et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 541-545, 1999) 등에 의해 실시될 수 있다.

또한, 본 발명은 형질전환이 되지 않은 야생형 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로부터 형질 전환된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주를 분리 및 수득하는 단계를 포함한다.

상기 본 발명에서 형질전환이 되지 않은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로부터 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주를 분리 및 수득하는 단계를 실시하는데 있어서 선택 표지된 벡터를 이용할 수 있다.

또한, 본 발명에서 이용하는 벡터는 플라스미드 또는 파지(phage)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 이용하는 선택 표지는 당업계에서 통상적으로 이용되는 카나마이신, 클로람페니콜 같은 항생제 내성 유전자와 고초균 유래 SacB 유전자의 산물인 레반슈크라제(levansucrase)를 포함한다.

본 발명은 상기 불활성화 알라닌-발린 트랜스아미나아제 또는 불활성화 알라닌 아미노트랜스퍼라제를 포함하는 L-글루탐산 고생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주와 동일한 균주를 제조하는 방법이므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 불활성화 알라닌-발린 트랜스아미나아제(alanine-valine transaminase)를 포함하는 L-글루탐산 고생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배양시키는 단계; 및 (b) 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 및 균주 배양액으로부터 L-글루탐산을 수득하는 단계를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로부터의 고농도 L-글루탐산 생산방법을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 불활성화 알라닌 아미노트랜스퍼라제(alanine aminotransferase)를 포함하는 L-글루탐산 고생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배양시키는 단계; 및 (b) 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 및 균주 배양액으로부터 L-글루탐산을 수득하는 단계를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로부터의 고농도 L-글루탐산 생산방법을 포함한다.

본 발명의 명세서에서 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로부터 L-글루탐산을 생산하는 방법을 표현하면 사용하는 표현 “고농도”는 야생형 또는 알라닌-발린 트랜스아미나아제 또는 알라닌 아미노트랜스퍼라제 활성을 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 또는 배양액에 포함된 L-글루탐산의 농도보다 높은 농도를 의미한다. 바람직하게는, 표현 “고농도”는 균주 배양액 1 ℓ 당 38 g 이상의 L-글루탐산 농도를 의미하며, 보다 바람직하게는 균주 배양액 1 ℓ 당 38-50 g의 L-글루탐산 농도를 의미한다.

본 발명은 상기 불활성화 알라닌-발린 트랜스아미나아제 또는 불활성화 알라닌 아미노트랜스퍼라제를 포함하는 L-글루탐산 고생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주와 동일한 균주 및 균주제조 방법을 이용하여 L-글루탐산을 생산하는 방법이므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 L-글루탐산 고생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주 및 이의 제조방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명은 L-글루탐산 고생산능을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주에서 avtA 또는 alaT 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드를 불활성화시킴으로써 L-글루탐산의 생산량은 증가시킴과 동시에 알라닌의 생산은 효과적으로 감소시킨 균주이다.

(ⅲ) 본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주에서의 발효 부산물인 알라닌의 생산능을 감소시킴으로써 L-글루탐산을 높은 순도로 정제할 수 있을 뿐 만 아니라 L-글루탐산의 회수율을 향상시켜 L-글루탐산의 생산 제조 원가를 크게 낮출 수 있다.

(ⅳ) 또한, 본 발명은 알라닌 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 두 종류의 유전자 avtA 와 alaT 유전자를 각각 염색체 상에서 제거하는 방법에 의해, 알라닌 생합성에 이용되는 피루브산의 세포내 농도를 증가시키고 이에 대한 대사흐름을 바꿔 궁극적으로 L-글루탐산 생산성 향상에 기여할 수 있는 기회를 제공함으로 생산비용이 절감되는 효과를 제공할 수 있으며, 본 발명에 의해 제조된 L-글루탐산은 수식 과정을 거쳐 감칠맛 성분으로 풍미증진제 및 조미원료로 이용될 수 있다.

도 1은 L-글루탐산을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 균주의 발효 종료액에 대한 아미노산과 유기산을 분석한 결과이다. 아스파테이트, 알라닌, 발린,
도 2는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 유래 균주에서 avtA 유전자를 파쇄하기 위해 제조한 pAV 벡터의 지도이다.
도 3은 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 유래 균주에서 alaT 유전자를 파쇄하기 위해 제조한 pAT 벡터의 지도이다.
도 4는 재조합 플라스미드 pAV를 이용해 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 유래 균주의 염색체 상에서 avtA 유전자를 결실시켜 제조한 코리네박테리움 글루타미쿰 DSB41002 균주를 확인한 전기영동 이미지이다. 레인1은 사이즈 마커 이고, 레인2는 모주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 유래 균주의 avtA 유전자를 포함한 PCR 산물의 크기를 나타낸다. 레인3과 4는 avtA 유전자의 orf가 일부 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰 DSB41002 균주의 avtA 유전자를 나타낸다.
도 5는 재조합 플라스미드 pAT를 이용해 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 유래 균주의 염색체 상에서 alaT 유전자를 결실시켜 제조한 코리네박테리움 글루타미쿰 DSB41003 균주를 확인한 전기영동 이미지이다. 레인1은 사이즈 마커이고, 레인2는 모주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 유래 균주의 alaT 유전자를 포함한 PCR 산물의 크기를 나타낸다. 레인3 내지 5는 alaT 유전자의 일부 orf가 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰 DSB41003 균주의 alaT 유전자를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1 : 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 균주의 발효 종료액 부산물 분석

하기 표 1에 표기한 발효배지로부터 배양온도 30-32℃, 교반속도 200-400 rpm, 통기량은 0.5-1.5 vvm, 배양 중 pH는 6.5-7.5로 조절하는 조건에서 25-30시간 동안 배양한 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 균주 발효 종료액을 다양한 위치에서 샘플링 하여 골고루 혼합하였다. 이를 12,000 rpm에서 5분 동안 원심분리 한 후 상등액을 여과하고, 적정한 비율로 희석한 뒤 아미노산과 유기산 분석을 실시하였다. 아미노산 분석은 아미노산 분석기를 사용하였으며, 유기산 분석은 Biorad HPX 87H 컬럼과 이동상으로 4 mM H₂SO₄를 사용하였으며, 분석조건은 컬럼 온도는 65℃ 및 유속은 1분당 0.6 ㎖로 흘려준 뒤 UV 검출기를 이용해 214 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정결과 도 1에서 나타낸 바와 같이 발효 부산물로 알라닌의 함량이 약 0.29%로 가장 높게 측정되었으며 락테이트가 0.27%, 아세테이트가 0.20%로 분석되었다.

배지	배지조성
발효배지	전처리 당밀 6.6%, 원당 용해액 2.3%, H₃PO₄(75%) 0.147%, 티아민-HCl 0.203mg, 비오틴 0.114 mg, CSL 0.041%, 계면활성제 0.2% 및 추가원당 30.5%

실시예 2 : avtA 유전자 파쇄 벡터의 제조

avtA 유전자(GenBank: AY238316) 파쇄를 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 유래 균주의 염색체 DNA를 분리 및 정제 한 뒤 주형으로 사용하여 하기 표 2의 avtA-A 및 avtA-B 프라이머 세트와 avtA-C 및 avtA-D 프라이머 세트를 각각 이용하여 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초로 30 사이클로 반복하여 증폭하였다. PCR 산물은 통상의 방법으로 전기영동 하여 각각 약 600 bp의 밴드를 확인하였다. 정제된 각각의 PCR 산물은 다시 크로스오버 중합효소연쇄반응(crossover polymerase chain reaction(PCR))을 위한 주형으로 사용해 avtA-A와 avtA-D 프라이머로 크로스오버 PCR 기법(Bacteriol., 179: 6228-6237,1997)으로 다시 한 번 증폭 시켰다. avtA 유전자가 634 bp 결손된 형태의 약 1.2 kb PCR 산물은 정제한 뒤 HindⅢ와 BamHI 제한효소(Takara, 일본)로 절단하였고, 동일한 제한효소로 절단한 pK19mobSacB 벡터(Gene, 145: 69-73, 1994)에 클로닝하여 avtA 유전자 파쇄용 pAV 벡터를 제조하였다(도 2).

프라이머	서열
avtA-A	5’-ATT CAA GCT TGA CTG TGG TGT TGG CTT C-3’
avtA-B	5’-CCC ATC CAC TAA ACT TAA ACA TCA GGG TTG GTG TCT ACG-3’
avtA-C	5’-TGT TTA AGT TTA GTG GAT GGG CCT GAA ATC GGG CTT GGC-3’
avtA-D	5’-ATT CGG ATC CGC CCT TGT GGA TGT GCT C-3’

실시예 3 : alaT 유전자 파쇄벡터의 제조

alaT 유전자(GenBank: AY238317) 파쇄를 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 유래 균주의 염색체 DNA를 분리 정제한 뒤 기질로 하여 하기 표 3의 프라이머 alaT -A 및 alaT-B 프라이머 세트와 alaT-C, alaT-D 프라이머 세트를 각각 이용해 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초로 30 사이클 반복 증폭하였다. 정제된 각각의 PCR 산물은 다시 주형으로 사용해 alaT-A 및 alaT-D 프라이머를 이용해 크로스오버 PCR 기법으로 다시 한 번 증폭 시켰다. alaT 유전자가 595 bp 결손된 형태의 약 1.2 kb PCR 산물은 정제한 뒤 Pst I 제한효소(Takara, 일본)로 절단하였고, 동일한 제한효소로 절단한 pK19mobSacB 벡터에 클로닝 하여 alaT 유전자 파쇄를 위한 pAT 벡터를 제조하였다(도3).

프라이머	염기 서열
alaT -A	5’-ATT CCT GCA GGC AAG TAG CCT GGG TAT TC-3’
alaT -B	5’- CCC ATC CAC TAA ACT TAA ACA CCT TCA TCT TCT CCG ACT G-3’
alaT -C	5’- TGT TTA AGT TTA GTG GAT GGG ATC CAC GAC GAC ACC CAA C-3’
alaT -D	5’-ATT CCT GCA GCC TTC GCC CAC TTT CGC C-3’

실시예 4 : 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 유래 균주의 형질전환 및 결손 변이주 제조

코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 유래 균주의 형질전환을 위한 방법으로 van der Rest 등의 방법을 기본으로 수식한 일렉트로컴피턴트 셀(electrocompetent cell) 제조법을 사용하였다.

상기 제조 방법은 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 유래 균주에 적용한 방법으로 다음과 같다: 2% 포도당이 첨가된 2YT 배지(트립톤 16 g/ℓ, 효모추출물 10 g/ℓ, 염화나트륨 5 g/ℓ) 100 ㎖에서 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 유래 균주를 1차 배양하고, 포도당을 제외한 동일 배지에 1 mg/㎖ 농도의 이소니코틴산 히드라진(isonicotinic acid hydrazine) 및 2.5% 글라이신(glycine)을 첨가하였다. 그 다음, OD₆₁₀값이 0.3이 되게 종배양액을 접종한 후, 18℃, 180 rpm으로 12-16시간 배양하여 OD₆₁₀값이 1.2-1.4가 되도록 하였다. 얼음에서 30분간 방치 한 후, 4℃, 4000 rpm으로 15분간 원심분리 하였다. 그 뒤 상등액을 버리고 침전된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 유래 균주를 10 % 글리세롤 용액으로 4회 세척하고, 최종적으로 10 % 글리세롤 용액 0.5 ㎖에 재현탁 하였다. 일렉트로포레이션(Electroporation)은 바이오-라드(Bio-Rad) 일렉트로포레이터(electroporator)를 사용하였다. 일렉트로포레이션 큐벳(0.2 mm)에 상기 방법으로 제조한 컴피턴트 셀(competent cell)을 넣고 위에서 제조한 재조합 플라스미드(pAV 및 pAT)를 각각 첨가한 후, 2.5 kV, 200Ω 및 12.5㎌의 조건으로 전기충격을 가하였다. 전기충격이 끝난 즉시 재생(Regeneration) 배지(Brain Heart infusion 18.5 g/ℓ, 소비톨 0.5 M) 1 ㎖을 첨가하고 46℃에서 6분간 열처리하였다. 그 후 실온에서 식힌 뒤 15 ㎖ 캡 튜브로 옮겨 30℃에서 2시간 배양하고 선별 배지(트립톤 5 g/ℓ, NaCl 5 g/ℓ, 효모추출물 2.5 g/ℓ, Brain Heart infusion powder 18.5 g/ℓ, 아가 15 g/ℓ, 소비톨 91 g/ℓ, 카나마이신(kanamycine) 20 ㎍/ℓ)에 도말 하였다. 30℃에서 72시간 배양해 생성된 콜로니는 BHI 배지에서 정지기까지 배양하여 2차 재조합을 유도했으며 10^-5-10^-7까지 희석하여 항생제가 없는 평판(10% sucrose 함유)에 도말하여 카나마이신 내성도가 없고 10% 수크로오스가 포함된 배지에서 성장성이 있는 균주를 선별 하였다. 얻어진 콜로니를 상기 avtA-A와 avtA-D 프라이머 세트를 사용해 avtA 유전자가 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰 DSB41002 균주를 확인하였으며(도 4), alaT-A와 alaT-D 유전자를 사용해 alaT 유전자가 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰 DSB41003 균주를 확인하였다(도 5).

실시예 5 : 최소배지를 이용한 생육저해 확인

상기 실시예 4에서 제조된 avtA 및 alaT 유전자 결손주(코리네박테리움 글루타미쿰 DSB41002 및 DSB41003)와 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 균주를 최소배지(포도당 20 g/ℓ, MgSO4 7H₂O 0.5 g/ℓ, FeSO₄7H₂O 20 mg/ℓ, MnSO₄5H₂O 20 mg/ℓ, urea 2.5 g/ℓ,(NH4)₂SO₄5 g/ℓ, KH₂PO₄1.5 g/ℓ, K₂HPO₄1.5 g/ℓ, 티아민-HCl 200 ㎍/ℓ, 비오틴 200 ㎍/ℓ, 니코티네이트 200 ㎍/ℓ, 리보플라빈 200 ㎍/ℓ, 시아노코발아민(cyanocobalamine) 100 ㎍/ℓ)에 도말하여 30℃에서 24시간 배양하여 생육 정도를 측정하였다. 아래 표 4에 표기한 바와 같이 알라닌이 첨가되지 않은 최소배지에서 코리네박테리움 글루타미쿰 DSB41003 균주의 생육이 상당히 저해를 받는 것으로 보아 기존에 보고된 것처럼 알라닌 생합성의 주된 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자가 alaT 임을 확인하였다.

균주 배지	KCTC 11558BP	DSB41002	DSB41003
최소배지	++++	+++	+
최소배지+알라닌(1mM)	++++	++++	+++

실시예 6 : 플라스크를 이용한 L-글루탐산 역가 실험

상기 실시예 4에서 제조된 코리네박테리움 글루타미쿰 DSB41002와 DSB41003 균주에 대한 L-글루탐산 생산성을 평가하기 위해 역가 배지에서 생산성을 알아보았다. 대조군으로는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 균주를 사용하였다. 먼저 활성 평판배지에 접종하여 30℃에서 24시간 배양한 뒤 플라스크 종배지 10 ㎖(100 ㎖ 플라스크)에 1 루프(loop) 접종하여 30℃에서 160 rpm으로 8시간 배양하였다. 그 뒤 역가배지 10 ㎖에 상기 종배지 배양액을 100 ㎕ 접종하여 30℃에서 160 rpm으로 20-22시간 배양하였다. 이때 소모되는 당 농도를 측정하여 최종 0.5-1.0%의 잔당이 남은 상태에서 배양을 중지하여 배양액중의 L-글루탐산의 양을 측정하였다.

배지	배지조성
활성 평판배지	비프추출물 10 g/ℓ, 펩톤 10 g/ℓ, 효모추출물 5 g/ℓ, NaCl 2.5 g/ℓ, 아가(agar) 20 g/ℓ
종배지	포도당 40 g/ℓ, MgSO₄·7H₂O 0.4 g/ℓ, FeSO₄·7H₂O 10 mg/ℓ, MnSO₄·5H₂O 10 mg/ℓ, KH₂PO₄1 g/ℓ, urea 4 g/ℓ, 티아민(thiamine)-HCl 200 ㎍/ℓ, 비오틴 50 ㎍/ℓ, CSL 5 g/ℓ, pH 7.0
역가배지	포도당 70 g/ℓ, MgSO₄·7H₂O 0.4 g/ℓ, FeSO₄·7H₂O 10 mg/ℓ, MnSO₄·5H₂O 10 mg/ℓ, (NH₄)₂SO₄30 g/ℓ, KH₂PO₄1 g/ℓ, 티아민-HCl 200 ㎍/ℓ, 비오틴 2 ㎍/ℓ, CSL 5 g/ℓ, CaCO₃50 g/ℓ, pH 8.0

하기 표 6에서 보는 바와 같이 코리네박테리움 글루타미쿰 DSB41002와 DSB41003 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 균주 보다 높은 생산성을 보였다.

균주	L-글루탐산 생산량(g/ℓ)
코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP	35
코리네박테리움 글루타미쿰 DSB41002	41
코리네박테리움 글루타미쿰 DSB41003	43

한편, 발효 부산물인 알라닌을 최소로 생산하면서 L-글루탐산을 고생산할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주를 분리하여 각각 DSB41002(avtA 변이주) 및 DSB41003(alaT 변이주)이라 명명하고, 국제미생물기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자은행에 2010년 10월 27일자로 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC11797BP 및 KCTC11798BP를 각각 부여받았다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC11797

20101027

한국생명공학연구원

KCTC11798

20101027

Claims

불활성화 알라닌-발린 트랜스아미나아제(alanine-valine transaminase)를 포함하는 L-글루탐산 생산능을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 변이 균주.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 avtA 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 알라닌-발린 트랜스아미나아제가 불활성화 된 균주인 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 야생형 코리네박테리움 속 변이 균주와 비교하여 알라닌의 생산능이 감소된 균주인 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 균주 배양액 1ℓ 당 38-50 g의 L-글루탐산을 생산할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 기탁번호 KCTC11797BP인 균주인 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주.
삭제
알라닌-발린 트랜스아미나아제(alanine-valine transaminase)를 불활성화 시키는 단계를 포함하는 L-글루탐산 생산능을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주 제조방법.
삭제
(a) 불활성화 알라닌-발린 트랜스아미나아제(alanine-valine transaminase)를 포함하는 L-글루탐산 생산능을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주를 배양시키는 단계; 및 (b) 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주 및 균주 배양액으로부터 L-글루탐산을 수득하는 단계를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주로부터의 L-글루탐산 생산방법.
삭제