CN112646767B - 具有增强的l-谷氨酸生产力的菌株及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了具有增强的L‑谷氨酸生产力的菌株及其构建方法与应用。本发明将谷氨酸棒杆菌中野生型BBD29_00405基因中引入点突变，使SEQ ID NO:1的第597位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)所得到的核苷酸序列。本发明还提供一种重组菌株是将该多核苷酸序列导入产L‑谷氨酸的谷氨酸棒杆菌中获得，重组菌株中包括含有点突变的BBD29_00405基因，所获得的菌株与未改造的菌株相比，有利于生产高浓度的L‑谷氨酸。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及具有增强的L-谷氨酸生产力的菌株及其构建方法与应用。
背景技术
L-谷氨酸，化学名称为L-2-氨基戊二酸,分子式为C5H9O4N，分子量为147.13。L-谷氨酸是非必需氨基酸。在生物有机体中存在的谷氨酸，都属于L-型谷氨酸。且L-谷氨酸是味精的前体物质。味精被食用后，还可在胃中转化为谷氨酸，然后经消化吸收参与蛋白质的合成，并可通过转氨基作用合成其它氨基酸，营养价值较高。除了在食品方面的广泛应用外，还被应用于医药、化妆品及农业生产中。在人体的各大器官中，谷氨酸盐在大脑中的含量最高，同时谷氨酸是参与人脑代谢的唯一一种氨基酸，在神经系统功能的维护有重要作用。所以对神经衰弱者来说，加大谷氨酸摄入量可改善其神经系统的功能。在化妆品行业,谷氨酸可用于合成聚谷氨酸钠。由于该物质具有很强的吸湿性,可被用作润肤剂。谷氨酸也可以与月桂酞氯结合生成一月桂酞基谷氨酸钠，广泛应用于化妆品行业。谷氨酸在农业上主要用于生产杀菌剂，如谷氨酸酮。在施肥的过程中,谷氨酸还可以作为肥料的载体，促进农作物对氮磷钾的吸收。
1956年,从自然界中分离到了一种谷氨酸产生菌,即谷氨酸棒杆菌,这是味精生产史上的重大变革。1957年开始了通过发酵法生产味精的时代。发酵法生产谷氨酸的成功,是整个发酵工业的伟大创举,同时也大大促进了其它发酵产品的研究与生产。对于工业发酵来说，决定发酵生产水平的因素主要有菌种性能、发酵工艺及下游提取工艺等。在这些因素中,菌种的产酸水平是内因,是决定发酵成败的关键。优良菌种的选育依然是高产L-谷氨酸的关键，随着高通量筛选技术的发展，结合传统诱变技术，有助于找到未知性状的高产L-谷氨酸突变株。这些突变株有可能改变L-谷氨酸代谢途径上某一点的活性或者整个途径的重组整合，从而来提高产酸量。
虽然已筛选到一些可以提高L-谷氨酸产量的菌株，但是为了满足日益增加的需求，仍需要找到更多高产L-谷氨酸的突变株。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种多核苷酸及含有该多核苷酸的重组菌株,以及将重组菌株用于改善细菌的L-谷氨酸生产能力。为了实现上述目的，本发明的发明人研究发现，具有L-谷氨酸生产能力的谷氨酸棒杆菌ATCC13869基因组(GenBank：CP016335.1)中BBD29_00405基因(GenBank：ANU32350.1)，可以通过修饰该基因或改善其表达，获得L-谷氨酸产量提高的重组菌株，与未改造的野生型菌株相比，重组菌株的产L-谷氨酸能力更强。
本发明采用如下技术方案实现：
本发明的第一方面，提供了生成L-谷氨酸的细菌，其具有编码如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达。根据本发明，所述改善的表达是所述多核苷酸表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。
所述SEQ ID NO:3的氨基酸序列是基因BBD29_00405编码的蛋白。
所述细菌与未修饰菌株相比具有增强的L-谷氨酸生产能力。
在本发明中，术语“具有L-谷氨酸生产能力的细菌”是指具有在培养基和/或细菌的细胞中以下述程度产生并累积目的L-谷氨酸的能力，使得当细菌在培养基中培养时可以收集L-谷氨酸的细菌。具有L-谷氨酸生产能力的细菌可以是能够以比未修饰菌株可获得的量更大的量在培养基和/或细菌的细胞中积累目的L-谷氨酸的细菌。
术语“未修饰菌株”是指尚未以使得具有特定特征的方式进行修饰的对照菌株。即，未修饰菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株。
在本发明中，除非另有说明，术语“L-谷氨酸”是指游离形式的L-谷氨酸、其盐或其混合物。
所述多核苷酸可以编码与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有约90％或更高、约92％或更高、约95％或更高、约97％或更高、约98％或更高、或约99％或更高的序列同源性的氨基酸序列。如本文中使用的，术语“同源性”指两种多核苷酸或两种多肽模块之间的百分比同一性。可以通过使用本领域中已知的方法测定一种模块和另一种模块之间的序列同源性。例如，可以通过BLAST算法测定此类序列同源性。
可以如下增强多核苷酸的表达：通过取代或突变表达调节序列、对多核苷酸序列引入突变、通过经由染色体插入或载体导入的多核苷酸拷贝数的增加、或其组合等。
可以修饰多核苷酸的表达调节序列。表达调节序列控制与其可操作连接的多核苷酸的表达，并且例如可以包括启动子、终止子、增强子、沉默子等。多核苷酸可以具有起始密码子的变化。可以将多核苷酸掺入染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。在本文，特定的位点可以包括例如转座子位点或基因间位点。另外，可以将多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。
在本发明的一种实施方式中，通过将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。
在本发明的一种实施方式中，通过将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而过表达所述核酸序列。
在本发明的一种实施方式中，将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。
在本发明的一种实施方式中，将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而过表达所述氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述多核苷酸可以包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的具有点突变，使得SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第199位甲硫氨酸被不同的氨基酸所取代。
根据本发明，优选第199位甲硫氨酸变为异亮氨酸所取代。
根据本发明，SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，其中第199位甲硫氨酸变为异亮氨酸所取代后的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在本发明的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列是由SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第597位碱基发生突变而形成的。
根据本发明，所述突变包括SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第597位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)。
在本发明的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。
如本文中使用的，术语“可操作连接”指调节序列和多核苷酸序列之间的功能性连接，由此调节序列控制多核苷酸序列的转录和/或翻译。调节序列可以是能提高多核苷酸的表达水平的强启动子。调节序列可以是源自属于棒杆菌属的微生物的启动子或者可以是源自其它微生物的启动子。例如，启动子可以是trc启动子、gap启动子、tac启动子、T7启动子、lac启动子、trp启动子、araBAD启动子或cj7启动子。
在本发明的一个具体实施方式中，所述启动子是编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸(BBD29_00405)的启动子。
如本文中使用的，术语“载体”指含有基因的调节序列和基因序列并且配置为在合适的宿主细胞中表达靶基因的多核苷酸构建体。或者，载体又可以指多核苷酸构建体，其含有可用于同源重组的序列，从而由于对宿主细胞导入的载体，可以改变宿主细胞的基因组中的内源基因的调节序列，或者可以将可以表达的靶基因插入宿主的基因组的特定位点中。在这点上，本发明中使用的载体可以进一步包含选择标志物以确定载体对宿主细胞的导入或者载体对宿主细胞的染色体的插入。选择标志物可以包含赋予可选择表型，诸如药物抗性、营养缺陷型、针对细胞毒剂的抗性、或表面蛋白的表达的标志物。在用此类选择剂处理的环境中，由于仅表达选择标志物的细胞可以存活或者显示不同表型性状，可以选择经转化的细胞。
在本发明的一些具体实施方式中，使用的载体是pK18mobsacB质粒，pXMJ19质粒。
如本文中使用的，术语“转化”指将多核苷酸导入宿主细胞中，从而多核苷酸可以作为基因组外元件或者以插入宿主细胞的基因组中能复制。转化本发明中使用的载体的方法可以包括将核酸导入细胞的方法。另外，如相关技术中公开的，可以根据宿主细胞实施电脉冲方法。
根据本发明，所述细菌可以是属于棒杆菌属的微生物，例如嗜乙酰棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、醋谷棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)、美棒杆菌(Corynebacterium callunae)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)、玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)、生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)等。
在本发明的一个实施方案中，所述属于棒杆菌属的微生物是谷氨酸棒杆菌ATCC13869。
在本发明的一个实施方案中，所述属于棒杆菌属的微生物是谷氨酸棒杆菌YPGLU001,已于2020年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏机构简称：CGMCC，生物保藏编号为CGMCC No.21220。
本发明的第二个方面，提供一种多核苷酸序列，由该多核苷酸序列编码的氨基酸序列，包括所述多核苷酸序列的重组载体，含有所述多核苷酸序列的重组菌株。
根据本发明，所述多核苷酸序列包括编码含有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述序列的第199位甲硫氨酸被不同的氨基酸所取代。
根据本发明，优选第199位甲硫氨酸变为异亮氨酸所取代。。
根据本发明，SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，其中第199位甲硫氨酸变为异亮氨酸所取代后的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
根据本发明，优选所述编码含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列含有如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列。
在本发明的一个实施方式中，所述多核苷酸序列是由SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第597位碱基发生突变而形成的。
根据本发明，所述突变是指所述位点的碱基/核苷酸发生变化，所述突变方法可以选自诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。在本发明中，优选采用PCR定点突变法和/或同源重组。
根据本发明，所述突变包括SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第597位鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)。
在本发明的一个实施方式中，所述多核苷酸序列包括SEQ ID NO:2所示的多核苷酸序列。
根据本发明，所述氨基酸序列包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
根据本发明，所述重组载体是将所述多核苷酸序列导入质粒构建而成。
在本发明的一个实施方式中，所述质粒为pK18mobsacB质粒。
在本发明的另一个实施方式中，所述质粒为pXMJ19质粒。
具体地，可以将所述多核苷酸序列和所述质粒通过NEBuider重组系统构建成重组载体。
根据本发明，所述重组菌株含有所述的多核苷酸序列。
作为本发明的一个实施方案，所述重组菌株的出发菌为谷氨酸棒杆菌YPGLU001，生物保藏编号为CGMCC No.21220。
作为本发明的一个实施方案，所述重组菌株的出发菌为ATCC 13869。
本发明的第三个方面，提供上述多核苷酸序列、由该多核苷酸序列编码的氨基酸序列、包括所述多核苷酸序列的重组载体、含有所述多核苷酸序列的重组菌株在生产L-谷氨酸中的应用。
本发明的第四个方面，还提供一种生成L-谷氨酸的重组菌株的构建方法。
根据本发明，所述构建方法包括如下步骤：
改造宿主菌株中如SEQ ID NO:1所示的野生型BBD29_00405基因的多核苷酸序列，使其第597位碱基发生突变，得到包含突变BBD29_00405编码基因的重组菌株。
根据本发明的构建方法，所述改造包括诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。
根据本发明的构建方法，所述突变是指SEQ ID NO:1中第597位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)；具体地，所述包含突变BBD29_00405编码基因的多核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
进一步地，所述构建方法包括如下步骤：
(1)改造如SEQ ID NO:1所示的野生型BBD29_00405基因的核苷酸序列，使其第597位碱基发生突变，得到突变的BBD29_00405基因多核苷酸序列；
(2)将所述突变的多核酸序列与质粒连接，构建重组载体；
(3)将所述重组载体导入宿主菌株，得到所述包含突变BBD29_00405编码基因的重组菌株。
根据本发明的构建方法，所述步骤(1)包括：点突变的BBD29_00405基因构建：根据未修饰菌株的基因组序列，合成两对扩增BBD29_00405基因片段的引物P1和P2及P3和P4，通过PCR定点突变法在野生型BBD29_00405基因SEQ ID NO:1中引入点突变，得到点突变的BBD29_00405基因核苷酸序列SEQ ID NO:2，记为BBD29_00405G597A。
在本发明的一个实施方式中，所述未修饰菌株基因组可以来源于ATCC13869菌株，其基因组序列GenBank：CP016335.1可以从NCBI网站获取。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)中，所述引物为：
P1:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGATGACTATTAATGTCTCCGA3'(SEQID NO:5)
P2:5'AGACCGGCATCAAGTATGGTCTGGGCA3'(SEQ ID NO:6)
P3:5'TGCCCAGACCATACTTGATGCCGGTCT 3'(SEQ ID NO:7)
P4:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCTAGCCGGCGTAAGGATCCCGGAT3'(SEQ ID NO:8)
在本发明的一个实施方案中，所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸40s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
在本发明的一个实施方案中，所述重叠PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸100s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
根据本发明的构建方法，所述步骤(2)包括重组质粒的构建，包括：将分离纯化后的BBD29_00405G597A和pK18mobsacB质粒，通过NEBuider重组系统组装，获得重组质粒。
根据本发明的构建方法，所述步骤(3)包括重组菌株的构建，将重组质粒转化至宿主菌株，得到重组菌株。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤(3)的转化为电转化法。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是ATCC 13869。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株为谷氨酸棒杆菌YPGLU001，生物保藏编号为CGMCC No.21220。
在本发明的一个实施方式中，所述重组是通过同源重组实现的。
本发明的第五个方面，还提供一种生成L-谷氨酸的重组菌株的构建方法。
根据本发明，所述构建方法包括如下步骤：
扩增BBD29_00405的上下游同源臂片段、BBD29_00405基因编码区及其启动子区序列，以同源重组的方式在宿主菌株的基因组中引入BBD29_00405或BBD29_00405G597A基因，以实现所述菌株过表达BBD29_00405或BBD29_00405G597A基因。
在本发明的一个实施方式中，扩增上游同源臂片段的引物是：
P7：5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGACCCGCTTGCCATACGAAG 3'
P8：5'CAAGTAGTTCGGAGACATTAATAGTCATATCTACTCATCTGAAGAATC3'
在本发明的一个实施方式中，扩增下游同源臂片段的引物是：
P11：5'ATCGGTATCCGGGATCCTTACGCCGGCTAGTTCGTGGGCACTCTGGTTTG 3'
P12：5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCATAAGAAACAACCACTTCC 3'
在本发明的一个实施方式中，扩增所述基因编码区及其启动子区序列的引物是：
P9:5'AGGAGTCCGATTCTTCAGATGAGTAGATATGACTATTAATGTCTCCGAACTA 3'(SEQ IDNO:13)
P10:5'ATCCTGGTAACCAAACCAGAGTGCCCACGAACTAGCCGGCGTAAGGATCCCGGA 3'(SEQID NO:14)
在本发明的一个实施方式中，再以前述P7/P12为引物，以扩增的上游同源臂片段、下游同源臂片段、基因编码区及其启动子区序列片段的三个片段混合为模板进行扩增，获得整合同源臂片段。
在本发明的一个实施方式中，所采用的PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTPMixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10μM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸180s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
在本发明的一个实施方式中，采用NEBuider重组系统，将穿梭质粒PK18mobsacB和整合同源臂片段组装，获得整合质粒。
在本发明的一个实施方式中，将整合质粒转染宿主菌株，以同源重组的方式在宿主菌株的基因组中引入BBD29_00405或BBD29_00405G597A基因。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是谷氨酸棒杆菌YPGLU001，生物保藏编号为CGMCC No.21220。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是ATCC 13869。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是携带有SEQ ID NO:2所示多核苷酸序列的菌株。
本发明的第六个方面，还提供一种生产L-谷氨酸的重组菌株的构建方法。
根据本发明，所述构建方法包括如下步骤：
扩增BBD29_00405基因编码区及启动子区序列，或BBD29_00405G597A基因编码区及启动子区序列，构建过表达质粒载体，将所述载体转入宿主菌株中，以实现所述菌株过表达BBD29_00405或BBD29_00405G597A基因。
在本发明的一个实施方式中，扩增所述基因编码区及其启动子区序列的引物是：
P17:5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCATGACTATTAATGTCTCCGA 3'(SEQID NO:21)
P18:5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACCTAGCCGGCGTAAGGATCCCGGAT 3'(SEQ ID NO:22)。
在本发明的一个实施方式中，所述PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTPMixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10μM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸100s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
在本发明的一个实施方式中，采用NEBuider重组系统，将穿梭质粒pXMJ19和带有自身启动子的BBD29_00405或BBD29_00405G597A片段组装，获得过表达质粒。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是谷氨酸棒杆菌YPGLU001，生物保藏编号为CGMCC No.21220。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是ATCC 13869。
在本发明的一个实施方式中，所述宿主菌株是携带有SEQ ID NO:2所示多核苷酸序列的菌株。
本发明获得重组菌株可以单独应用于发酵生产L-谷氨酸中，也可以和其他产L-谷氨酸的细菌混合发酵生产L-谷氨酸。
本发明的另一个方面提供了生产L-谷氨酸的方法，该方法包括培养所述细菌；并且从培养物中获得L-谷氨酸。
可以在本领域中已知的培养条件下在合适的培养基中进行细菌的培养。培养基可以包含：碳源、氮源、微量元素、及其组合。在培养中，可以调节培养物的pH。此外，培养时可以包括防止气泡产生，例如通过使用消泡剂进行气泡产生的防止。此外，培养时可以包括将气体注射入培养物中。气体可以包括能够维持培养物的需氧条件的任何气体。在培养中，培养物的温度可以是20至45℃。可以从培养物回收生成的L-谷氨酸，即用硫酸或氢氯酸等处理培养物，接着进行诸如阴离子交换层析、浓缩、结晶和等电点沉淀的方法的组合。
本发明的有益效果
本发明通过对BBD29_00405基因的敲除，发现该基因编码的产物对L-谷氨酸生产能力产生影响，通过在编码序列引入点突变，或者增加该基因的拷贝数或过表达获得重组菌株，所获得的菌株与未改造的菌株相比，有利于生产高浓度的L-谷氨酸。
生物保藏说明
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏机构简称：CGMCC，保藏日期为2020年11月23日，生物保藏编号为CGMCC No.21220，菌株命名：YPGLU001。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
以下实施例中培养所述菌株使用的基础培养基组成相同，在此基础培养基组成上添加相应需要的蔗糖、卡那霉素或氯霉素等。如果需要固体的，只需要添加2％的琼脂即可，ph7.0，培养温度30度。基础培养基组成如下：
表1基础培养基的组成
| 试剂名称 | 配比 | 发酵罐 |
| 葡萄糖 | g/L | 5.0 |
| 磷酸 | g/L | 0.38 |
| 硫酸镁 | g/L | 1.85 |
| 氯化钾 | g/L | 1.6 |
| 生物素 | μg/L | 550 |
| 维生物素B1 | μg/L | 300 |
| 硫酸亚铁 | mg/L | 10 |
| 硫酸锰 | g/dl | 10 |
| KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | g/L | 2.8 |
| 维生素C | mg/L | 0.75 |
| 维生素B12 | μg/L | 2.5 |
| 对氨基苯甲酸 | mg/L | 0.75 |
| 消泡剂 | ml/dl | 0.0015 |
| 甜菜碱 | g/L | 1.5 |
| 甘蔗糖蜜 | ml/L | 7 |
| 玉米浆 | ml/L | 77 |
| 天冬氨酸 | g/L | 1.7 |
| 毛发粉 | g/L | 2 |
实施例1构建包含点突变的BBD29_00405基因编码区的转化载体pK18-YH66_BBD29_00405G597A
依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13869基因组(GenBank：CP016335.1)序列，设计并合成两对扩增BBD29_00405基因(GenBank：AKF27993.1)编码区序列的引物，以等位基因置换的方式在菌株ATCC13869和高产L-谷氨酸的谷氨酸棒杆菌YPGLU001(生物保藏编号为CGMCC No.21220)中引入点突变，对应编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，BBD29_00405基因的核苷酸序列第597位鸟嘌呤(G)变为腺嘌呤(A)(SEQ ID NO：2：BBD29_00405G597A)，对应编码蛋白的氨基酸序列第199位甲硫氨酸(M)变为异亮氨酸(I)(SEQ IDNO：4：BBD29_00405M199I)。引物设计如下(上海invitro gen公司合成)：
P1:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGATGACTATTAATGTCTCCGA3'(SEQID NO:5)
P2:5'AGACCGGCATCAAGTATGGTCTGGGCA3'(SEQ ID NO:6)
P3:5'TGCCCAGACCATACTTGATGCCGGTCT 3'(SEQ ID NO:7)
P4:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCTAGCCGGCGTAAGGATCCCGGAT3'(SEQ ID NO:8)
构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC13869为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4，进行PCR扩增。
PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸40s(30个循环)，72℃过度延伸10min，获得两条大小分别约647bp和927bp，含有BBD29_00405基因编码区的DNA片段(BBD29_00405G597A-Up和BBD29_00405G597A-Down)。
将BBD29_00405G597A-Up和BBD29_00405G597A-Down经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后；再以上述两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过重叠PCR扩增出长约1547bp的BBD29_00405G597A-Up-Down片段。
PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸100s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
此DNA片段导致ATCC13869的诱变菌株谷氨酸棒杆菌YPGLU001(生物保藏编号为CGMCC No.21220)中BBD29_00405基因编码区的第597位的鸟嘌呤(G)变为腺嘌呤(A)，最终导致编码蛋白的第199位氨基酸由甲硫氨酸(M)变为异亮氨酸(I)。
将pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司)用XbaI酶切后，用琼脂糖凝胶电泳分离纯化BBD29_00405G597A-Up-Down和线性化的pK18mobsacB质粒，再通过NEBuider重组系统组装，获得载体pK18-BBD29_00405G597A，该质粒上含有卡那霉素抗性标记。并将载体pK18-BBD29_00405G597A送测序公司测序鉴定，将含有正确点突变(G-A)的载体pK18-BBD29_00405G597A保存备用。
实施例2构建包含点突变的BBD29_00405G597A的工程菌株
构建方法：将等位替换质粒pK18-BBD29_00405G597A通过电击转化入高产L-谷氨酸的谷氨酸棒杆菌YPGLU001(生物保藏编号为CGMCC No.21220，经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的BBD29_00405基因编码区)中；对培养产生的单菌落分别通过引物P1和通用引物M13R进行鉴定，能扩增出大小约1573bp条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养；对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用如下引物(上海invitrogen公司合成)进行PCR鉴定：
P5:5'AGAAGGCAACCTGCGCATGA 3'(SEQ ID NO:9)
P6:5'ATCGGGTTGGAAATCGCAGA 3'(SEQ ID NO:10)
上述PCR扩增产物261bp通过高温变性、冰浴后进行sscp电泳(以质粒pK18-BBD29_00405G597A扩增片段为阳性对照，ATCC13869扩增片段为阴性对照，水作为空白对照)，由于片段结构不同，电泳位置不同，因此片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。以引物P5和P6再次通过PCR扩增等位替换成功的菌株目的片段，并连接到PMD19-T载体测序，通过比对碱基序列确定是否替换成功；并将来自高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌YPGLU001(生物保藏编号为CGMCC No.21220)替换成功的突变株命名为YPG-025。
SSCP电泳PAGE的制备及条件
表2 sscp电泳的PAGE的制备
实施例3构建基因组上过表达BBD29_00405或BBD29_00405G597A基因的工程菌株
依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13869基因组(GenBank：CP016335.1)序列，设计并合成三对扩增上下游同源臂片段及BBD29_00405基因编码区及启动子区序列的引物，以同源重组的方式在菌株谷氨酸棒杆菌YPGLU001(生物保藏编号为CGMCC No.21220)中引入BBD29_00405或BBD29_00405G597A基因。
引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P7：5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGACCCGCTTGCCATACGAAG 3'
P8：5'CAAGTAGTTCGGAGACATTAATAGTCATATCTACTCATCTGAAGAATC3'
P9：5'AGGAGTCCGATTCTTCAGATGAGTAGATATGACTATTAATGTCTCCGAACTA 3'
P10：5'ATCCTGGTAACCAAACCAGAGTGCCCACGAACTAGCCGGCGTAAGGATCCCGGA 3'
P11：5'ATCGGTATCCGGGATCCTTACGCCGGCTAGTTCGTGGGCACTCTGGTTTG 3'
P12：5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCATAAGAAACAACCACTTCC 3'
构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC13869或YPI019为模板，分别以引物P7/P8，P9/P10，P11/P12，进行PCR扩增，获得上游同源臂片段约814bp，BBD29_00405或BBD29_00405G597A基因片段约1532bp及下游同源臂片段约798bp，再以P7/P12为引物，用以上扩增的三个片段混合为模板进行扩增，获得整合同源臂片段3027bp。PCR反应结束后，对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行回收所需要的约3027bp的DNA片段，采用NEBuider重组系统与经Xba I酶切回收的穿梭质粒pk18mobsacB相连接，获得整合质粒pk18mobsacB-BBD29_00405或pk18mobsacB-BBD29_00405G597A，质粒上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。
PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸180s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
将2个整合质粒分别电转化入谷氨酸棒杆菌YPGLU001(生物保藏编号为CGMCCNo.21220)中，对培养产生的单菌落通过P13/P14引物进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小约1706bp的片段的为阳性菌株，扩增不到片段的为原菌。阳性菌株经15％蔗糖筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P15/P16引物进行PCR鉴定，扩增出大小约1758bp的菌为BBD29_00405或BBD29_00405G597A基因整合到菌株谷氨酸棒杆菌YPGLU001(生物保藏编号为CGMCC No.21220)基因组上的菌株，其被命名为YPG-026(不含突变点)和YPG-027(含突变点)。
P13:5'GTCCAAGGTGACGGCCGCAC 3'
P14:5'AGCTTCGCCGATGTTGCGCA 3'
P15:5'AGGTTGCACCCGCCATCGCTGCA3'
P16:5'ATATTCGGCCCAGCAGCAGC 3'
实施例4构建质粒上过表达BBD29_00405或BBD29_00405G597A基因的工程菌株
依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13869基因组(GenBank：CP016335.1)序列，设计并合成一对扩增BBD29_00405基因编码区及启动子区序列的引物，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：
P17：5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCATGACTATTAATGTCTCCGA 3'
P18：5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACCTAGCCGGCGTAAGGATCCCGGAT 3'
构建方法：以ATCC13869或YPG-025为模板，以引物P17/P18进行PCR扩增，获得BBD29_00405或BBD29_00405G597A基因片段约1543bp，对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行回收所需要的1543bp的DNA片段，采用NEBuider重组系统与经EcoRI酶切、回收的穿梭质粒pXMJ19相连接，获得过表达质粒pXMJ19-BBD29_00405或pXMJ19-BBD29_00405G597A。质粒上含有氯霉素抗性标记，可以通过氯霉素筛选获得质粒转化到菌株中。
PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。
所述PCR扩增按如下方式进行：94℃预变性5min，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸100s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
将质粒分别电转化入谷氨酸棒杆菌YPGLU001(生物保藏编号为CGMCC No.21220)中，对培养产生的单菌落通过M13R(-48)和P18引物进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小约1582bp的片段的为转入菌株，其被命名为YPG-028(不含突变点)和YPG-029(含突变点)。
实施例5构建基因组上缺失BBD29_00405基因的工程菌株
依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13869基因组(GenBank：CP016335.1)序列，合成两对扩增BBD29_00405基因编码区两端片段的引物，作为上下游同源臂片段。引物设计如下(上海英俊公司合成)：
P19：5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGATCTGGGGGTGAGCGCGGAT 3'
P20：AGGAAAATAACGCATCCATCTGCCCCTTTACAAATCCACCGCAAACACTGGGAT 3'
P21：TGGATTTGTAAAGGGGCAGATGGATGCGTTATTTTCCTTCACTTTTCGTATCCA 3'
P22：5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGTCTGGCGCATCGAACAGGTCGAAGGA 3'
以谷氨酸棒杆菌ATCC13869为模板，分别以引物P19/P20及P21/P22，进行PCR扩增，获得上游同源臂片段709bp及下游同源臂片段734bp。再用引物P19/P22进行OVER PCR得到整个同源臂片段1405bp。PCR反应结束后，对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行回收所需要的1405bp的DNA片段，并通过NEBuider重组系统与经Xba I酶切回收的穿梭质粒pk18mobsacB质粒相连接，获得敲除质粒。该质粒上含有卡那霉素抗性标记。
将敲除质粒电转化入谷氨酸棒杆菌YPGLU001(生物保藏编号为CGMCC No.21220)中，对培养产生的单菌落分别通过如下引物(上海英俊公司合成)进行PCR鉴定：
P23:5'ACCGGCGCAGATGCCAACGC 3'
P24:5'GCTTGATGAAGGCTCCAG 3'
上述PCR扩增出大小约1638bp及约3156bp的条带的菌株为阳性菌株，只扩增出3156bp条带的菌株为出发菌。阳性菌株在15％蔗糖培养基上筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P23/P24引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1638bp条带的菌株为BBD29_00405基因编码区被敲除的基因工程菌株，其被命名为YPG-030。
实施例6L-谷氨酸发酵实验
将实施例2-5构建的菌株和原始谷氨酸棒杆菌YPGLU001(生物保藏编号为CGMCCNo.21220)在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(购自上海百仑生物科技有限公司)中以表3所示的培养基和表4所示发酵控制工艺进行发酵实验。每个菌株重复三次，结果如表5所示。
表3发酵培养基配方
| 试剂名称 | 配比 |
| 葡萄糖 | 5.0g/L |
| 磷酸 | 0.38g/L |
| 硫酸镁 | 1.85g/L |
| 氯化钾 | 1.6g/L |
| 生物素 | 550μg/L |
| 维生物素B1 | 300μg/L |
| 硫酸亚铁 | 10mg/L |
| 硫酸锰 | 10g/dL |
| KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | 2.8g/L |
| 维生素C | 0.75mg/L |
| 维生素B12 | 2.5μg/L |
| 对氨基苯甲酸 | 0.75mg/L |
| 消泡剂 | 0.0015mL/dL |
| 甜菜碱 | 1.5g/L |
| 甘蔗糖蜜 | 7mL/L |
| 玉米浆 | 77mL/L |
| 天冬氨酸 | 1.7g/L |
| 毛发粉 | 2g/L |
表4发酵控制工艺
表5L-谷氨酸发酵实验结果
结果如表5所示，在产L-谷氨酸的工程菌谷氨酸棒杆菌YPGLU001(生物保藏编号为CGMCC No.21220)中，对BBD29_00405基因编码区进行点突变BBD29_00405G597A都有助于L-谷氨酸产量的提高；过表达BBD29_00405、BBD29_00405G597A有助提高L-谷氨酸的产量，而对BBD29_00405基因敲除，不利于L-谷氨酸的积累。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 宁夏伊品生物科技股份有限公司
<120> 具有增强的L-谷氨酸生产力的菌株及其构建方法与应用
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1473
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 1
atgactatta atgtctccga actacttgcc aaagtcccca cgggtctact gattggtgat 60
tcctgggtgg aagcatccga gggcggtact ttcgatgtgg aaaacccagc gacgggtgaa 120
acaatcgcaa cgctcgcgtc tgctacttcc gaggatgcac tggctgctct tgatgctgca 180
tgcgctgttc aggccgagtg ggctaggacg ccagcgcgcg agcgttctaa tattttacga 240
cgcggtttcg agctcgtcgc ggaacgtgca gaagagttcg ccaccctcat gaccttggaa 300
atgggcaaac ctttggctga agctcgcggc gaagtcacct acggcaacga attcctgcgc 360
tggttctctg aggaagcagt ccgcctctac ggccgctacg gtgctacccc agaaggcaac 420
ctgcgcatga tgaccacccg caaaccagtt ggcccctgcc tgttgatcac cccatggaac 480
ttcccactag caatggccac ccgtaaggtt gcacccgcca tcgctgcagg ttgtgtcatg 540
gtgctcaagc cagctcgcct gaccccgctg acctcccagt attttgccca gaccatgctt 600
gatgccggtc ttccagcagg tgtcctcaat gtggtctccg gtgcttccgc ctctgcgatt 660
tccaacccga ttatggaaga cgatcgcctt cgtaaagtct cattcaccgg ctccacccca 720
gttggccagc agctgctcaa aaaggctgcc gataaagttc tgcgcacctc catggaactc 780
ggcggcaacg cacctttcat tgtcttcgag gacgccgacc tagatctcgc gatcgaaggt 840
gccatgggcg caaaaatgcg caacatcggc gaagcttgca ccgcagccaa ccgtttccta 900
gtccacgaat ccgtcgccga tgaattcggc cgacgcttcg cagcccgcct cgaggaacaa 960
gtcctaggca acggcctcga cgaaggcgtc accgtaggcc cattggttga ggaaaaagca 1020
cgaaacagcg ttgcatcgct tgtcgacgcc gccgtctccg aaggtgccac cgtcctcacc 1080
ggtggcaagg ccggcacagg tgcaggctac ttctacgaac caacggtgct cacgggagtt 1140
tcaacagatg cagccatcct gaacgaagag atcttcggtc ccgtcgcacc gatcgtcacc 1200
ttctctgatg aagctgaagc tctgcgccta gccaattcca ccgaatacgg cctggcctcc 1260
tacgtgttca cccaagacac ctcacgcatc ttccgcgtct ccgacggcct cgagttcggc 1320
ctagtgggcg tcaactccgg tgtcatctct aacgccgctg caccttttgg tggcgtaaaa 1380
caatccggaa tgggccgcga aggtggtctc gaaggaattg aagagtacac ctccgtgcag 1440
tacatcggta tccgggatcc ttacgccggc tag 1473
<210> 2
<211> 1473
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 2
atgactatta atgtctccga actacttgcc aaagtcccca cgggtctact gattggtgat 60
tcctgggtgg aagcatccga gggcggtact ttcgatgtgg aaaacccagc gacgggtgaa 120
acaatcgcaa cgctcgcgtc tgctacttcc gaggatgcac tggctgctct tgatgctgca 180
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tcaacagatg cagccatcct gaacgaagag atcttcggtc ccgtcgcacc gatcgtcacc 1200
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Leu Ile Gly Asp Ser Trp Val Glu Ala Ser Glu Gly Gly Thr Phe Asp
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Ala Glu Trp Ala Arg Thr Pro Ala Arg Glu Arg Ser Asn Ile Leu Arg
65 70 75 80
Arg Gly Phe Glu Leu Val Ala Glu Arg Ala Glu Glu Phe Ala Thr Leu
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Claims (8)
1.一种L-谷氨酸生产能力提高的细菌，其特征在于，具有编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达，所述改善的表达是编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的，编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的点突变，使得SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第199位甲硫氨酸被异亮氨酸所取代，所述细菌的出发菌是生物保藏编号为CGMCC No.21220的谷氨酸棒杆菌YPGLU001。
2.如权利要求1所述的细菌，其特征在于，编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1或2所述的细菌，其特征在于，所述具有点突变的多核苷酸是由SEQ IDNO:1所示多核苷酸序列第597位碱基发生突变而形成的。
4.如权利要求3所述的细菌，其特征在于，所述具有点突变的多核苷酸如SEQ ID NO:2所示。
5.一种提高细菌L-谷氨酸产量的方法，其特征在于，所述方法包括：培养权利要求1-4任一项所述的细菌，并从所述培养物中回收L-谷氨酸。
6.一种多核苷酸在提高细菌L-谷氨酸产量中的应用，其特征在于，在细菌中将所述多核苷酸过表达，所述细菌的出发菌是生物保藏编号为CGMCC No. 21220的谷氨酸棒杆菌YPGLU001，所述多核苷酸为编码如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的多核苷酸。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述多核苷酸是由SEQ ID NO:1所示多核苷酸序列第597位碱基发生突变而形成的。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述多核苷酸如SEQ ID NO:2所示。
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