CN114349831A

CN114349831A - aspA基因突变体、重组菌及制备L-缬氨酸的方法

Info

Publication number: CN114349831A
Application number: CN202111524905.5A
Authority: CN
Inventors: 孟刚; 赵春光; 魏爱英; 毕国栋; 贾慧萍; 杨立鹏
Original assignee: Ningxia Eppen Biotech Co ltd
Current assignee: Ningxia Eppen Biotech Co ltd
Priority date: 2021-12-14
Filing date: 2021-12-14
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2041-12-14
Also published as: CN114349831B

Abstract

本发明公开了aspA基因突变体、重组菌及制备L‑缬氨酸的方法。具体地公开了突变蛋白质aspA^T42S(SEQ ID No.4)及其编码基因。本发明构建了包含点突变(A‑T)的基因工程菌，以及过表达aspA基因或aspA^A124T基因的工程菌。实验表明，aspA基因及其变体参与了L‑缬氨酸的生物合成，对aspA基因编码区进行点突变或在生产菌中过表达aspA基因或其突变基因aspA^A124T，有助于L‑缬氨酸产量及转化率的提高。利用aspA基因及其变体来构建生产L‑缬氨酸的基因工程菌种，可以培育符合工业化生产的高产高质量菌种，对L‑缬氨酸的工业化生产具有重要的意义。

Description

aspA基因突变体、重组菌及制备L-缬氨酸的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及aspA基因突变体、重组菌及制备L-缬氨酸的方法。

背景技术

L-缬氨酸(L-valine)，化学名称为α-氨基异戊酸，是支链氨基酸之一，人和动物自身不能合成。L-缬氨酸是人体八种必需氨基酸之一，具有促进蛋白合成、抑制蛋白分解的作用，增强机体的免疫防护作用，有助于纠正因手术、创伤、感染等引起的负氮平衡。另外，L-缬氨酸还具有抗中枢疲劳的作用，抗外周疲劳作用，延缓运动性疲劳，加快运动后机体的修复，因此在食品和医药行业具有广泛的应用及商业价值。由L-缬氨酸配制的复合支链氨基酸输液在血脑屏障、肝昏迷、慢性肝硬化以及肾功能衰竭的治疗，先天性代谢缺陷病的膳食治疗，败血症及术后糖尿病患者的治疗，加快外科创伤愈合的治疗和肿瘤患者的营养支持治疗中应用广泛。L-缬氨酸在食品工业上主要用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等。L-缬氨酸凝胶具有带正电的端基，是新型低分子量凝胶，不仅可以使纯化和含有无机酸和盐的水溶液成凝胶而且可以使有机溶剂和油成胶状，可以制备形成水凝胶，其在生物医药、组织工程、光化学、电化学、食品工业、化妆品等领域已被广泛应用。L-缬氨酸因其含有特殊的生理功能，市场需求量大，使得L-缬氨酸的生产备受关注。

目前，L-缬氨酸大都采用直接发酵法生产，工业发酵中获得高产的菌种，对于L-缬氨酸的发酵生产来说是至关重要的，是整个L-缬氨酸发酵工业的核心，是决定发酵产品工业价值的重要因素。随着L-缬氨酸的市场需求不断增加，选育高产、稳定的生产菌种，促进L-缬氨酸在微生物体内的积累，进一步提高L-缬氨酸的产量一直是L-缬氨酸发酵工业技术开发和发酵工程化研究的热点，并且也将一直伴随L-缬氨酸发酵工业的发展，对于促进L-缬氨酸产业化的进程具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何利用aspA基因或其突变体aspA^A124T基因构建重组质粒、重组菌和/或提高L-缬氨酸的产量。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质，名称为蛋白质aspA^T42S，所述蛋白质可为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；

A2)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

本发明还提供了核酸分子，名称为aspA^A124T，所述核酸分子aspA^A124T可为下述任一种：

B1)编码所述蛋白质aspA^T42S的核酸分子；

B2)编码序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子；

B3)核苷酸序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子。

SEQ ID No.3所示的DNA分子即为本发明所述aspA^A124T基因。

SEQ ID No.3所示的DNA分子(aspA^A124T基因)编码SEQ ID No.4所示的蛋白质。

所述蛋白质aspA^T42S氨基酸序列(SEQ ID No.4)中的第42位丝氨酸(S)是由苏氨酸(T)突变而来。

本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：

C1)含有所述核酸分子aspA^A124T的表达盒；

C2)含有所述核酸分子aspA^A124T的重组载体、或含有C1)所述表达盒的重组载体；

C3)含有所述核酸分子aspA^A124T的重组微生物、或含有C1)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物。

本发明还提供了D1)-D8)中任一项的下述任一种应用：

F1)D1)-D8)中任一项在调控微生物的L-缬氨酸的产量中的应用；

F2)D1)-D8)中任一项在构建产L-缬氨酸的基因工程菌中的应用；

F3)D1)-D8)中任一项在制备L-缬氨酸中的应用；

其中，所述D1)-D8)为：

D1)所述蛋白质aspA^T42S；

D2)所述核酸分子aspA^A124T；

D3)所述生物材料；

D4)核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子；

D5)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经过修饰和/或一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.1所示的DNA分子具有90％以上的同一性，且具有相同功能的DNA分子；

D6)含有D4)或D5)中所述DNA分子的表达盒；

D7)含有D4)或D5)中所述DNA分子的重组载体、或含有D6)所述表达盒的重组载体；

D8)含有D4)或D5)中所述DNA分子的重组微生物、或含有D6)所述表达盒的重组微生物、或含有D7)所述重组载体的重组微生物。

SEQ ID No.1所示的DNA分子即为本发明所述aspA基因。

SEQ ID No.1所示的DNA分子(aspA基因)编码SEQ ID No.2所示的蛋白质。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本文中，所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本文所述调控微生物的L-缬氨酸的产量可为提高或降低微生物中L-缬氨酸的积累量(即促进或抑制L-缬氨酸的生物合成)。

本发明还提供了一种提高微生物中L-缬氨酸的产量的方法，所述方法包括下述任一种：

E1)提高目的微生物中的所述核酸分子aspA^A124T的表达量或含量，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物；

E2)提高目的微生物中的D4)或D5)所述DNA分子的表达量或含量，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物；

E3)对所述目的微生物中的核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子进行突变(如碱基置换、碱基插入或碱基缺失)，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物。

上述方法中，所述突变可为点突变(point mutation)，即单个核苷酸的突变。

上述方法中，所述点突变可为将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第42位的苏氨酸残基突变为另一种残基。

上述方法中，所述点突变可为将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第42位的苏氨酸突变为丝氨酸，得到氨基酸序列为SEQ ID No.4的突变蛋白质aspA^T42S。

所述突变是指通过定点突变改变基因中的某个或某几个碱基，导致对应的蛋白质氨基酸组成发生改变，产生新的蛋白质或使原蛋白质产生新的功能，即基因定点突变。基因的定点突变技术如寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变或盒式突变等是本领域技术人员所熟知的。

本文所述点突变可为单碱基置换、单碱基插入或单碱基缺失，具体地可为单碱基置换。所述单碱基置换可为等位基因置换。

所述点突变可为将aspA基因(SEQ ID No.1)的第124位腺嘌呤(A)进行核酸改造。

具体地，所述点突变可为将aspA基因(SEQ ID No.1)的第124位腺嘌呤(A)突变为胸腺嘧啶(T)，得到SEQ ID No.3所示的DNA分子。

本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)或病毒载体。具体可为pK18mobsacB或pXMJ19。

本文中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、气杆菌属(Aerobacter)、微球菌属(Micrococcus)、黄杆菌属(Flavobacterium)或芽胞杆菌属(Bacillus)等。

具体地，所述微生物可为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、产谷氨酸微球菌(Micrococcus glutamicus)、产氨短杆菌(Brevibacterum ammoniagenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)或产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)但不限于此。

具体地，所述微生物可为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCCNo.21260，或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC14067。

本文中，所述重组载体具体可为重组载体pK18-aspA^A124T、pK18-aspAOE、pK18-aspA^A124TOE、pXMJ19-aspA或pXMJ19-aspA^A124T。

所述重组载体pK18-aspA^A124T是将pK18mobsacB载体的Xbal I和/BamH I识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中SEQ ID No.5的第37-1432位所示的DNA片段，保持pK18mobsacB载体的其他序列不变，得到的重组载体。所述重组载体pK18-aspA^A124T含有SEQID No.3所示的突变的基因aspA^A124T的第1-857位所示的DNA分子。

所述重组载体pK18-aspAOE用于将外源基因aspA整合到宿主染色体中，在生产菌中过表达野生型aspA基因。

所述重组载体pK18-aspA^A124TOE用于将外源基因aspA^A124T整合到宿主染色体中，在生产菌中过表达突变型基因aspA^A124T。

所述重组载体pXMJ19-aspA用于将外源基因aspA通过质粒在染色体外表达，进而在生产菌中过表达野生型aspA基因。

所述重组载体pXMJ19-aspA^A124T用于将外源基因aspA^A124T通过质粒在染色体外表达，进而在生产菌中过表达突变型基因aspA^A124T。

所述重组载体pK18-aspA^A124T、pK18-aspAOE、pK18-aspA^A124TOE、pXMJ19-aspA或pXMJ19-aspA^A124T均在本发明的保护范围内。

本文中，所述重组微生物具体可为重组菌YPV-043、YPV-044、YPV-045、YPV-046或YPV-047。

所述重组菌YPV-043是将所述重组载体pK18-aspA^A124T转化入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21260中得到的重组菌，所述重组菌YPV-043含有SEQ ID No.3所示的突变的基因aspA^A124T。

所述重组菌YPV-044含有双拷贝的SEQ ID No.1所示的aspA基因；具体地，重组菌YPV-044是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区替换为aspA基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有双拷贝aspA基因的重组菌可以显著和稳定地提高aspA基因的表达量。重组菌YPV-044为在基因组上过表达野生型aspA基因的工程菌。

所述重组菌YPV-045含有SEQ ID No.3所示的突变的aspA^A124T基因；具体地，重组菌YPV-045是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区替换为aspA^A124T基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。重组菌YPV-045为在基因组上过表达突变型aspA^A124T基因的工程菌。

所述重组菌YPV-046含有SEQ ID No.1所示的aspA基因；重组菌YPV-046为在质粒上过表达野生型aspA基因的工程菌，即由质粒pXMJ19-aspA在染色体外进行过表达。

所述重组菌YPV-047含有SEQ ID No.3所示的突变的aspA^A124T基因。重组菌YPV-047为在质粒上过表达突变型aspA^A124T基因的工程菌，即由质粒pXMJ19-aspA^A124T在染色体外进行过表达。

所述重组菌YPV-043、YPV-044、YPV-045、YPV-046或YPV-047均在本发明的保护范围内。

本发明还提供了一种构建所述重组微生物的方法，所述方法包括至少下述任一种：

F1)将所述核酸分子aspA^A124T导入目的微生物，得到所述重组微生物；

F2)将SEQ ID No.1所示的DNA分子导入目的微生物，得到所述重组微生物；

F3)利用基因编辑手段(如单碱基基因编辑)对SEQ ID No.1所示的DNA分子进行编辑，使目的微生物中含有SEQ ID No.3所示的DNA分子。

所述导入可为通过化学转化法或电击转化法等任何已知的转化方法将携带本发明DNA分子的载体转化宿主菌。导入的DNA分子可以是单拷贝也可以是多拷贝。所述导入可以是将外源基因整合到宿主染色体中，也可以是由质粒在染色体外表达。

本发明还提供了一种制备L-缬氨酸的方法，所述方法包括利用本文中任一所述重组微生物生产L-缬氨酸。

上述方法中，所述方法可为发酵法制备L-缬氨酸，所述重组微生物可为棒杆菌属(Corynebacterium)，具体可为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)及其变体。

在本发明的一个实施方案中，所述重组微生物为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CGMCC No.21260、重组菌YPV-043、YPV-044、YPV-045、YPV-046或YPV-047。

本发明首先以等位基因置换的方式在谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CGMCC No.21260(经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的aspA基因)的aspA基因编码区(SEQ ID No.1)中引入点突变，构建了包含点突变(A-T)的基因工程菌YPV-043。为进一步研究验证在生产菌中过表达野生型aspA基因或其突变基因aspA^A124T可以增加L-缬氨酸的产量，分别将外源基因整合到宿主染色体中或由质粒在染色体外表达，构建了基因组上和质粒上过表达aspA基因或aspA^A124T基因的工程菌YPV-044、YPV-045、YPV-046和YPV-047。实验表明，aspA基因及其变体参与了L-缬氨酸的生物合成，通过对aspA基因进行过表达或敲除、或定点突变(如点突变)可以调控L-缬氨酸在微生物内的积累量。对aspA基因编码区进行点突变或在生产菌中过表达aspA基因或其突变基因aspA^A124T，有助于L-缬氨酸产量及转化率的提高，而对aspA基因进行敲除或弱化，不利于L-缬氨酸的积累。可利用aspA基因及其变体(如aspA^A124T基因)来构建生产L-缬氨酸的基因工程菌种，以促进L-缬氨酸产量提高，培育符合工业化生产的高产、高质量菌种，对L-缬氨酸的工业化生产具有广泛的应用价值和重要的经济意义。

保藏说明

菌种名称：谷氨酸棒杆菌

拉丁名：Corynebacterium glutamicum

菌株编号：YPFV1

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2020年11月30日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.21260

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YPFV1 CGMCCNo.21260是将谷氨酸棒杆菌ATCC15168进行诱变获得，并已于2020年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.21260。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)YPFV1，又称为谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260。

实施例1构建aspA基因突变体及其重组菌

1、构建包含点突变的aspA基因编码区片段的重组载体

根据NCBI数据库公布的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC14067基因组序列，设计并合成两对扩增aspA基因编码区的引物，以等位基因置换的方式在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21260(经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的aspA基因)的aspA基因编码区(SEQ ID No.1)中引入点突变，所述点突变为将aspA基因的核苷酸序列(SEQ ID No.1)中的第124位腺嘌呤(A)突变为胸腺嘧啶(T)，得到SEQ ID No.3所示的DNA分子(突变的aspA基因，名称为aspA^A124T)。

其中，SEQ ID No.1所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质(所述蛋白质名称为蛋白质aspA)。

SEQ ID No.3所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ ID No.4的突变蛋白质(所述突变蛋白质名称为aspA^T42S)。所述突变蛋白质aspA^T42S氨基酸序列(SEQ ID No.4)中的第42位丝氨酸(S)由苏氨酸(T)突变而来。

采用重叠PCR(Overlap PCR)技术进行基因定点突变，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)，加粗字体的碱基为突变位置：

P1:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG ATTGCGGTTG CACCAAGGTT 3'，

P2:

P3:

P4:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC ACGTGGGCTT TCCGCTGAGG 3'。

构建方法：以谷氨酸棒杆菌ATCC14067为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4，进行PCR扩增，获得两条分别带有突变碱基，大小分别为783bp和761bp的aspA基因编码区的DNA片段(aspA Up和aspA Down)。

PCR扩增反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；

PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，(94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸40s；30个循环)，72℃过度延伸10min。

将上述两条DNA片段(aspA Up和aspA Down)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，采用试剂盒对目的条带进行切胶回收，再以上述两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过Overlap PCR扩增，得到大小为1510bp的DNA片段(名称为aspA Up-Down，序列如SEQ IDNo.5所示)。SEQ ID No.5所示的DNA片段中，第37-893位(857bp)为含有突变位点的aspA^A124T基因片段(即SEQ ID No.3的1-857位)。

Overlap PCR扩增反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL；

Overlap PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，(94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸60s；30个循环)，72℃过度延伸10min。

所述DNA片段(aspA Up-Down，SEQ ID No.5)含有突变位点，用于在菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中野生型aspA基因编码区的第124位引入核酸改造，具体可为将124位的腺嘌呤(A)突变为胸腺嘧啶(T)，最终导致编码蛋白的第42位苏氨酸(T)变为丝氨酸(S)。将所述DNA片段(aspA Up-Down)经琼脂糖凝胶电泳分离后进行纯化，与经过酶切(Xbal I/BamH I)后纯化的pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司，用Xbal I/BamH I酶切)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化DH5a(购自TAKARA公司)后长出的单克隆采用PCR法鉴定阳性克隆，经PCR鉴定后获得阳性重组载体pK18-aspA^A124T，该重组载体上含有卡那霉素抗性(Kan^r)标记。将酶切正确的重组载体pK18-aspA^A124T送测序公司测序鉴定，并将含有正确点突变(A-T)的重组载体pK18-aspA^A124T保存备用。

所述重组载体pK18-aspA^A124T是将pK18mobsacB载体的Xbal I和BamH I识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中SEQ ID No.5的第37-1472位所示的DNA片段，保持pK18mobsacB载体的其他序列不变，得到的重组载体。

所述重组载体pK18-aspA^A124T含有SEQ ID No.3所示的突变的基因aspA^A124T的第1-857位所示的DNA分子。

2、构建包含基因aspA^A124T的重组菌

构建方法如下：将实施例1中的等位替换质粒(pK18-aspA^A124T)通过电击转化入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC No.21260中后，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落分别通过实施例1中的引物P1和通用引物M13R进行鉴定，能扩增出1517bp大小条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用如下引物(上海invitrogen公司合成)进行PCR鉴定：

P5:5'CGTAATATGC GTGGGATGGG 3'，

P6:5'ACAGCACCAT CGTGATTTCC 3'。

将得到的PCR扩增产物(265bp)通过95℃高温变性10min、冰浴5min后进行SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphis)电泳(以质粒pK18-aspA^A124T扩增片段为阳性对照，谷氨酸棒杆菌ATCC14067扩增片段为阴性对照，水作为空白对照)，SSCP电泳的PAGE的制备及电泳条件参见表2，由于扩增片段结构不同，电泳位置不同，因此扩增片段电泳位置与阴性对照位置不一致且与阳性对照位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。再次通过引物P5/P6 PCR扩增阳性菌株aspA基因片段，并连接到PMD19-T载体进行测序，通过序列比对，碱基序列发生突变(A-T)的菌株为等位替换成功的阳性菌株，并被命名为YPV-043。

重组菌YPV-043含有SEQ ID No.3所示的突变的基因aspA^A124T。

表1培养基的组成和培养条件

表2 SSCP电泳的PAGE的制备及电泳条件

实施例2构建过表达野生型aspA基因或突变型aspA^A124T基因的工程菌株

为进一步研究验证在生产菌中过表达野生型aspA基因或其突变基因aspA^A124T可以增加L-缬氨酸的产量，分别将外源基因整合到宿主染色体中或由质粒在染色体外表达，构建了基因组上和质粒上过表达aspA基因或aspA^A124T基因的工程菌株。

1、构建基因组上过表达aspA基因或aspA^A124T基因的工程菌株

根据NCBI数据库公布的谷氨酸棒杆菌ATCC14067基因组序列，设计并合成三对扩增上下游同源臂片段及aspA或aspA^A124T基因编码区及启动子区的引物，以同源重组的方式在谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中引入aspA或aspA^A124T基因。

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P7:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG GTAGTGCCGT GCGTACCCCA 3'，

P8:5'GGCTCTACTT GGAGAACTAA CCCAACCCCA ATCGCAATGT 3'，

P9:5'ACATTGCGAT TGGGGTTGGG TTAGTTCTCC AAGTAGAGCC 3'，

P10:5'GTGCGGGTTG GGGTTTTTGA TTTTAACTAC CCCCGAAAAT 3'，

P11:5'ATTTTCGGGG GTAGTTAAAA TCAAAAACCC CAACCCGCAC 3'，

P12:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC GTTGGTTTAG CGGAGCTGCA3'。

重组菌(工程菌株)的构建方法如下：

分别以谷氨酸棒杆菌ATCC14067或重组菌YPV-043为模板，分别以引物P7/P8，P9/P10，P11/P12进行PCR扩增，获得上游同源臂片段795bp(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.21260CEY17_RS02570基因及其CEY17_RS02575的间隔区，序列如SEQ ID No.6所示)，aspA基因及其启动子片段1731bp(序列如SEQ ID No.7所示)或aspA^A124T基因及其启动子片段1731bp(序列如SEQ ID No.8所示)及下游同源臂片段769bp(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.21260CEY17_RS02575基因及其与CEY17_RS02570的间隔区，序列如SEQ ID No.9所示)。PCR反应结束后，对每个模板扩增得到的3个片段采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳回收。回收后的3个片段与经过Xbal I/BamH I酶切后纯化的pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化DH5a(购自TAKARA公司)后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性整合质粒(重组载体)，分别为pK18-aspAOE和pK18-aspA^A124TOE，该阳性整合质粒上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。

PCR反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。

PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸60s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

将测序正确的整合质粒(pK18-aspAOE、pK18-aspA^A124TOE)分别电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过P13/P14引物进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1398bp的片段的为阳性菌株，扩增不到片段的为原菌。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落进一步采用P15/P16引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1399bp的菌为aspA或aspA^A124T基因整合到谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260基因组上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区上的阳性菌株，分别命名为YPV-044(不含突变点)和YPV-045(含突变点)。

重组菌YPV-044含有双拷贝的SEQ ID No.1所示的aspA基因；具体地，重组菌YPV-044是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区替换为aspA基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有双拷贝aspA基因的重组菌可以显著和稳定地提高aspA基因的表达量。重组菌YPV-044为在基因组上过表达野生型aspA基因的工程菌。

重组菌YPV-045含有SEQ ID No.3所示的突变的aspA^A124T基因；具体地，重组菌YPV-045是将谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中上同源臂CEY17_02570和下同源臂CEY17_02575的间隔区替换为aspA^A124T基因，保持谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。重组菌YPV-045为在基因组上过表达突变型aspA^A124T基因的工程菌。

PCR鉴定引物如下所示：

P13:5'CGGTTAGATT TTTTGGCCCC 3'(对应上同源臂CEY17_RS02570的外侧)，

P14:5'CACCGGTGCA TATGTTCATG 3'(对应aspA基因内部)，

P15:5'ACCTCGTTGG TGTTCATGTT 3'(对应aspA基因内部)，

P16:5'TCTGGACTGG GTGTTGCGCT 3'(对应下同源臂CEY17_RS02575的外侧)。

2、构建质粒上过表达aspA基因或aspA^A124T基因的工程菌株

根据NCBI数据库公布的谷氨酸棒杆菌ATCC14067基因组序列，设计并合成一对扩增aspA或aspA^A124T基因编码区及启动子区的引物，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P17:5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCC TTAGTTCTCC AAGTAGAGCC 3'(带下划线的核苷酸序列为pXMJ19上的序列)，

P18:5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAAC TTTTAACTAC CCCCGAAAAT 3'(带下划线的核苷酸序列为pXMJ19上的序列)。

重组菌(工程菌株)的构建方法如下：

分别以谷氨酸棒杆菌ATCC14067和重组菌YPV-043为模板，以引物P17/P18进行PCR扩增，获得aspA基因及其启动子片段(序列如SEQ ID No.10所示)和aspA^A124T基因及其启动子片段1761bp(序列如SEQ ID No.11所示)，对扩增产物进行电泳并采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收，回收的DNA片段与经EcoR I酶切回收的穿梭质粒pXMJ19用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性过表达质粒pXMJ19-aspA(含有aspA基因)和pXMJ19-aspA^A124T(含有aspA^A124T基因)，将该质粒送测序。因质粒上含有氯霉素抗性标记，可以通过氯霉素来筛选质粒是否转化到菌株中。

将测序正确的pXMJ19-aspA和pXMJ19-aspA^A124T质粒分别电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260中，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过引物M13R(-48)/P18进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1800bp片段的为阳性菌株，其被命名为YPV-046(不含突变点)和YPV-047(含突变点)。

重组菌YPV-046含有SEQ ID No.1所示的aspA基因；重组菌YPV-046为在质粒上过表达野生型aspA基因的工程菌，即由质粒pXMJ19-aspA在染色体外进行过表达。

重组菌YPV-047含有SEQ ID No.3所示的突变的aspA^A124T基因。重组菌YPV-047为在质粒上过表达突变型aspA^A124T基因的工程菌，即由质粒pXMJ19-aspA^A124T在染色体外进行过表达。

实施例3构建基因组上缺失aspA基因的工程菌株

根据NCBI数据库公布的谷氨酸棒杆菌ATCC14067的基因组序列，合成两对扩增aspA基因编码区两端片段的引物，作为上下游同源臂片段。引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P19:5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG CAGTGATGCT ACCGTTCCCA 3'，

P20:5'CAACTTGTGA GAGGCAGTAC TCCAAGATCT CGTCTGATAC 3'，

P21:5'GTATCAGACG AGATCTTGGA GTACTGCCTC TCACAAGTTG 3'，

P22:5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC CCCTCGGCTT CGGTTCCTCC3'。

重组菌(工程菌株)的构建方法如下：

以谷氨酸棒杆菌ATCC14067为模板，分别以引物P19/P20和P21/P22进行PCR扩增，获得aspA的上游同源臂片段793bp及aspA的下游同源臂片段764bp。再用引物P19/P22进行Overlap PCR得到整个同源臂片段1517bp(序列如SEQ ID No.12所示)。对扩增的产物进行电泳并采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，回收的DNA片段与经过Xbal I/BamH I酶切后纯化的pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性敲除载体pK18-ΔaspA，将该质粒送测序。该质粒上含有卡那霉素抗性作为筛选标记。

Overlap PCR扩增反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。

Overlap PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

将测序正确的敲除质粒pK18-ΔaspA电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过如下引物(上海invitrogen公司合成)进行PCR鉴定：

P23:5'CAGTGATGCT ACCGTTCCCA 3'(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260CEY17_08085基因内部)，

P24:5'CCCTCGGCTT CGGTTCCTCC 3'(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260CEY17_08095基因内部)。

上述PCR同时扩增出大小1443bp及3024bp的条带的菌株为阳性菌株，只扩增出3024bp条带的菌株为原菌。阳性菌株在15％蔗糖培养基上筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P23/P24引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1443bp条带的菌株为aspA基因编码区被敲除的阳性菌株aspA。再次通过P23/P24引物PCR扩增阳性菌株aspA片段，并连接到pMD19-T载体进行测序，将测序正确的菌株命名为YPV-048(谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260上的基因组上的aspA基因被敲除)。

实施例4发酵制备L-缬氨酸的方法及aspA基因或aspA^A124T基因在L-缬氨酸生产中的作用

将上述实施例构建的菌株和原始菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(购自上海百仑生物科技有限公司)中以表3所示的培养基和表4所示的控制工艺进行发酵实验，各个菌株的发酵工艺完全相同。每个菌株重复三次，结果如表5所示。

结果如表5所示，在谷氨酸棒杆菌中对aspA基因编码区进行点突变aspA^A124T和/或在生产菌中过表达aspA基因或其突变基因aspA^A124T，有助于L-缬氨酸产量及转化率的提高，而对aspA基因进行敲除或弱化，不利于L-缬氨酸的积累。

表3发酵培养基配方(其余为水)

成分	配方
		硫酸铵	14g/L
磷酸二氢钾	1g/L
		磷酸氢二钾	1g/L
硫酸镁	0.5g/L
		酵母粉	2g/L
硫酸亚铁	18mg/L
		硫酸锰	4.2mg/L
生物素	0.02mg/L
		维生素B1	2mg/L
antifoam(CB-442)消泡剂)	0.5mL/L
		70％葡萄糖(底糖)	40g/L

表4发酵控制工艺

表5 L-缬氨酸发酵实验结果

菌株	OD<sub>610nm</sub>	L-缬氨酸产量(g/L)
			谷氨酸棒杆菌CGMCC No.21260	98.2	84.1
YPV-043	99.3	85.2
			YPV-044	98.5	84.6
YPV-045	99.9	84.8
			YPV-046	99.5	85.2
YPV-047	99.1	85.8
			YPV-048	96.4	83.3

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 宁夏伊品生物科技股份有限公司

<120> aspA基因突变体、重组菌及制备L-缬氨酸的方法

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1581

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）

<400> 1

atgtctaaga cgagcaacaa gtcttcagca gactcaaaga atgacgcaaa agccgaagac 60

attgtgaacg gcgagaacca aatcgccacg aatgagtcgc agtcttcaga cagcgctgca 120

gttacggaac gtgtcgtcga accaaaaacc acggttcaga aaaagttccg aatcgaatcg 180

gatctgcttg gtgaacttca gatcccatcc cacgcatatt acggggtgca cacccttcgt 240

gcggtggaca acttccaaat ctcacgaacc accatcaacc acgtcccaga tttcattcgc 300

ggcatggtcc aggtgaaaaa ggccgcagct ttagcaaacc gccgactgca cacacttcca 360

gcacaaaaag cagaagcaat tgtctgggct tgtgatcaga tcctcattga gggacgctgt 420

atggatcagt tccccatcga tgtgttccag ggtggcgcag gtacctcact gaacatgaac 480

accaacgagg ttgttgccaa ccttgcactt gagttcttag gccatgaaaa gggcgagtat 540

cacatcctgc accccatgga tgatgtgaac atgtcccagt ccaccaacga ttcctaccca 600

actggtttcc gcctgggcat ttacgctgga ctgcagaccc tcatcgctga aattgatgag 660

cttcaggttg cgttccgcca caagggcaat gagtttgtcg acatcatcaa gatgggccgc 720

acccagttgc aggatgctgt tcccatgagc ttgggcgaag agttccgagc attcgcgcac 780

aacctcgcag aagagcagac cgtgctgcgt gaagctgcca accgtctcct cgaggtcaac 840

cttggtgcaa ccgcaatcgg tactggtgtg aacactccag caggctaccg ccaccaggtt 900

gtcgctgctc tgtctgaggt caccggactg gaactaaagt ccgcacgtga tctcattgag 960

gctacctctg acaccggtgc atatgttcat gcgcactccg caatcaagcg tgcagccatg 1020

aaactgtcca agatctgtaa cgatctacgt ctgctgtctt ctggtcctcg tgctggtttg 1080

aacgaaatca acctaccacc acgccaggct ggttcctcca tcatgccagc caaggtcaac 1140

ccagtgatcc cagaagtggt caaccaggtc tgcttcaagg tcttcggtaa cgatctcacc 1200

gtcaccatgg ctgcggaagc tggccagttg cagctcaacg tcatggagcc agtcattggc 1260

gaatccctct tccagtcact gcgcatcctg ggcaatgcag ccaagacttt gcgtgagaag 1320

tgcgtcgtag gaatcaccgc caacgctgat gtttgccgtg cttacgttga taactccatc 1380

ggaattatca cttacctgaa cccattcctg ggccacgaca ttggagatca gatcggtaag 1440

gaagcagccg aaactggtcg accagtgcgt gaactcatcc tggaaaagaa gctcatggat 1500

gaaaagacgc tcgaggcagt cctatccaag gagaacctca tgcacccaat gttccgcgga 1560

aggctctact tggagaacta a 1581

<210> 2

<211> 526

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）

<400> 2

Met Ser Lys Thr Ser Asn Lys Ser Ser Ala Asp Ser Lys Asn Asp Ala

1 5 10 15

Lys Ala Glu Asp Ile Val Asn Gly Glu Asn Gln Ile Ala Thr Asn Glu

20 25 30

Ser Gln Ser Ser Asp Ser Ala Ala Val Thr Glu Arg Val Val Glu Pro

35 40 45

Lys Thr Thr Val Gln Lys Lys Phe Arg Ile Glu Ser Asp Leu Leu Gly

50 55 60

Glu Leu Gln Ile Pro Ser His Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg

65 70 75 80

Ala Val Asp Asn Phe Gln Ile Ser Arg Thr Thr Ile Asn His Val Pro

85 90 95

Asp Phe Ile Arg Gly Met Val Gln Val Lys Lys Ala Ala Ala Leu Ala

100 105 110

Asn Arg Arg Leu His Thr Leu Pro Ala Gln Lys Ala Glu Ala Ile Val

115 120 125

Trp Ala Cys Asp Gln Ile Leu Ile Glu Gly Arg Cys Met Asp Gln Phe

130 135 140

Pro Ile Asp Val Phe Gln Gly Gly Ala Gly Thr Ser Leu Asn Met Asn

145 150 155 160

Thr Asn Glu Val Val Ala Asn Leu Ala Leu Glu Phe Leu Gly His Glu

165 170 175

Lys Gly Glu Tyr His Ile Leu His Pro Met Asp Asp Val Asn Met Ser

180 185 190

Gln Ser Thr Asn Asp Ser Tyr Pro Thr Gly Phe Arg Leu Gly Ile Tyr

195 200 205

Ala Gly Leu Gln Thr Leu Ile Ala Glu Ile Asp Glu Leu Gln Val Ala

210 215 220

Phe Arg His Lys Gly Asn Glu Phe Val Asp Ile Ile Lys Met Gly Arg

225 230 235 240

Thr Gln Leu Gln Asp Ala Val Pro Met Ser Leu Gly Glu Glu Phe Arg

245 250 255

Ala Phe Ala His Asn Leu Ala Glu Glu Gln Thr Val Leu Arg Glu Ala

260 265 270

Ala Asn Arg Leu Leu Glu Val Asn Leu Gly Ala Thr Ala Ile Gly Thr

275 280 285

Gly Val Asn Thr Pro Ala Gly Tyr Arg His Gln Val Val Ala Ala Leu

290 295 300

Ser Glu Val Thr Gly Leu Glu Leu Lys Ser Ala Arg Asp Leu Ile Glu

305 310 315 320

Ala Thr Ser Asp Thr Gly Ala Tyr Val His Ala His Ser Ala Ile Lys

325 330 335

Arg Ala Ala Met Lys Leu Ser Lys Ile Cys Asn Asp Leu Arg Leu Leu

340 345 350

Ser Ser Gly Pro Arg Ala Gly Leu Asn Glu Ile Asn Leu Pro Pro Arg

355 360 365

Gln Ala Gly Ser Ser Ile Met Pro Ala Lys Val Asn Pro Val Ile Pro

370 375 380

Glu Val Val Asn Gln Val Cys Phe Lys Val Phe Gly Asn Asp Leu Thr

385 390 395 400

Val Thr Met Ala Ala Glu Ala Gly Gln Leu Gln Leu Asn Val Met Glu

405 410 415

Pro Val Ile Gly Glu Ser Leu Phe Gln Ser Leu Arg Ile Leu Gly Asn

420 425 430

Ala Ala Lys Thr Leu Arg Glu Lys Cys Val Val Gly Ile Thr Ala Asn

435 440 445

Ala Asp Val Cys Arg Ala Tyr Val Asp Asn Ser Ile Gly Ile Ile Thr

450 455 460

Tyr Leu Asn Pro Phe Leu Gly His Asp Ile Gly Asp Gln Ile Gly Lys

465 470 475 480

Glu Ala Ala Glu Thr Gly Arg Pro Val Arg Glu Leu Ile Leu Glu Lys

485 490 495

Lys Leu Met Asp Glu Lys Thr Leu Glu Ala Val Leu Ser Lys Glu Asn

500 505 510

Leu Met His Pro Met Phe Arg Gly Arg Leu Tyr Leu Glu Asn

515 520 525

<210> 3

<211> 1581

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

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gtttcggaac gtgtcgtcga accaaaaacc acggttcaga aaaagttccg aatcgaatcg 180

gatctgcttg gtgaacttca gatcccatcc cacgcatatt acggggtgca cacccttcgt 240

gcggtggaca acttccaaat ctcacgaacc accatcaacc acgtcccaga tttcattcgc 300

ggcatggtcc aggtgaaaaa ggccgcagct ttagcaaacc gccgactgca cacacttcca 360

gcacaaaaag cagaagcaat tgtctgggct tgtgatcaga tcctcattga gggacgctgt 420

atggatcagt tccccatcga tgtgttccag ggtggcgcag gtacctcact gaacatgaac 480

accaacgagg ttgttgccaa ccttgcactt gagttcttag gccatgaaaa gggcgagtat 540

cacatcctgc accccatgga tgatgtgaac atgtcccagt ccaccaacga ttcctaccca 600

actggtttcc gcctgggcat ttacgctgga ctgcagaccc tcatcgctga aattgatgag 660

cttcaggttg cgttccgcca caagggcaat gagtttgtcg acatcatcaa gatgggccgc 720

acccagttgc aggatgctgt tcccatgagc ttgggcgaag agttccgagc attcgcgcac 780

aacctcgcag aagagcagac cgtgctgcgt gaagctgcca accgtctcct cgaggtcaac 840

cttggtgcaa ccgcaatcgg tactggtgtg aacactccag caggctaccg ccaccaggtt 900

gtcgctgctc tgtctgaggt caccggactg gaactaaagt ccgcacgtga tctcattgag 960

gctacctctg acaccggtgc atatgttcat gcgcactccg caatcaagcg tgcagccatg 1020

aaactgtcca agatctgtaa cgatctacgt ctgctgtctt ctggtcctcg tgctggtttg 1080

aacgaaatca acctaccacc acgccaggct ggttcctcca tcatgccagc caaggtcaac 1140

ccagtgatcc cagaagtggt caaccaggtc tgcttcaagg tcttcggtaa cgatctcacc 1200

gtcaccatgg ctgcggaagc tggccagttg cagctcaacg tcatggagcc agtcattggc 1260

gaatccctct tccagtcact gcgcatcctg ggcaatgcag ccaagacttt gcgtgagaag 1320

tgcgtcgtag gaatcaccgc caacgctgat gtttgccgtg cttacgttga taactccatc 1380

ggaattatca cttacctgaa cccattcctg ggccacgaca ttggagatca gatcggtaag 1440

gaagcagccg aaactggtcg accagtgcgt gaactcatcc tggaaaagaa gctcatggat 1500

gaaaagacgc tcgaggcagt cctatccaag gagaacctca tgcacccaat gttccgcgga 1560

aggctctact tggagaacta a 1581

<210> 4

<211> 526

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

Met Ser Lys Thr Ser Asn Lys Ser Ser Ala Asp Ser Lys Asn Asp Ala

1 5 10 15

Lys Ala Glu Asp Ile Val Asn Gly Glu Asn Gln Ile Ala Thr Asn Glu

20 25 30

Ser Gln Ser Ser Asp Ser Ala Ala Val Ser Glu Arg Val Val Glu Pro

35 40 45

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50 55 60

Glu Leu Gln Ile Pro Ser His Ala Tyr Tyr Gly Val His Thr Leu Arg

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115 120 125

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Pro Ile Asp Val Phe Gln Gly Gly Ala Gly Thr Ser Leu Asn Met Asn

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Thr Asn Glu Val Val Ala Asn Leu Ala Leu Glu Phe Leu Gly His Glu

165 170 175

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180 185 190

Gln Ser Thr Asn Asp Ser Tyr Pro Thr Gly Phe Arg Leu Gly Ile Tyr

195 200 205

Ala Gly Leu Gln Thr Leu Ile Ala Glu Ile Asp Glu Leu Gln Val Ala

210 215 220

Phe Arg His Lys Gly Asn Glu Phe Val Asp Ile Ile Lys Met Gly Arg

225 230 235 240

Thr Gln Leu Gln Asp Ala Val Pro Met Ser Leu Gly Glu Glu Phe Arg

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260 265 270

Ala Asn Arg Leu Leu Glu Val Asn Leu Gly Ala Thr Ala Ile Gly Thr

275 280 285

Gly Val Asn Thr Pro Ala Gly Tyr Arg His Gln Val Val Ala Ala Leu

290 295 300

Ser Glu Val Thr Gly Leu Glu Leu Lys Ser Ala Arg Asp Leu Ile Glu

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<212> DNA

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<400> 5

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagattg cggttgcacc aaggttgacc 60

tcgaggagac ggttggcagc ttcacgcagc acggtctgct cttctgcgag gttgtgcgcg 120

aatgctcgga actcttcgcc caagctcatg ggaacagcat cctgcaactg ggtgcggccc 180

atcttgatga tgtcgacaaa ctcattgccc ttgtggcgga acgcaacctg aagctcatca 240

atttcagcga tgagggtctg cagtccagcg taaatgccca ggcggaaacc agttgggtag 300

gaatcgttgg tggactggga catgttcaca tcatccatgg ggtgcaggat gtgatactcg 360

cccttttcat ggcctaagaa ctcaagtgca aggttggcaa caacctcgtt ggtgttcatg 420

ttcagtgagg tacctgcgcc accctggaac acatcgatgg ggaactgatc catacagcgt 480

ccctcaatga ggatctgatc acaagcccag acaattgctt ctgctttttg tgctggaagt 540

gtgtgcagtc ggcggtttgc taaagctgcg gcctttttca cctggaccat gccgcgaatg 600

aaatctggga cgtggttgat ggtggttcgt gagatttgga agttgtccac cgcacgaagg 660

gtgtgcaccc cgtaatatgc gtgggatggg atctgaagtt caccaagcag atccgattcg 720

attcggaact ttttctgaac cgtggttttt ggttcgacga cacgttccga aactgcagcg 780

ctgtctgaag actgcgactc attcgtggcg atttggttct cgccgttcac aatgtcttcg 840

gcttttgcgt cattctttga gtctgctgaa gacttgttgc tcgtcttaga catgtactgc 900

ctctcacaag ttgaaggaaa tcacgatggt gctgtggatt atcctacgta cttgtaagag 960

gcagtgtggg actaccccac tacattttcg ggggtagtta aaactagatg cgggcgatgc 1020

ggatttcaga agccaggatg gcttcagcgc cgagtccagc aagcttatcc atgatggcgt 1080

tagctgacct gcgtggcacc atggcgcgta cagcaaccca gttgtcgcgt gccagtgggg 1140

ataccgttgg gccggatagg cctggggtta ctgcagtggc agcgtccagg ttgtcgcggt 1200

cgacgttgta atccagcatg aggaagttct gcgcgtgcaa aattccctgg atgcggcgaa 1260

gcaggatctg ctgctctggg gtgacctttt catccttgcg gccaacaatg acagcctcag 1320

aggtacacag aacctcgccg aaaggtgcaa gaccttgctg acgcagcgtg cggccggtgg 1380

atacaacatc ggcgatggca tctgcgacac caagcttgat ggatacctct actgcaccgt 1440

cgaggcggag cacctcagcg gaaagcccac gtgggtaccg agctcgaatt cgtaatcatg 1500

gtcatagctg 1510

<210> 6

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggtag tgccgtgcgt accccattag 60

aaagtgaaaa ttcactgatt ctagccagtc acgctgggaa tcattacatg ggccttcttc 120

gatcattcca tgatcgacaa gaaaagcctc acgttcatca ggttgtaaat aggggacagt 180

agacattaat tacacctaaa aagaaaaggg cccccatgag gcgcatcgtt gagaggcgtt 240

gggggtgctg ttggcttcta cgatatatct aattttgcct gatgtgtcag tagctcgaac 300

gtcactttca cttgtcgtct gaagtttcga tgtttctgca ccataaacgg tgtttatgaa 360

ttatcccccc ctctaccccc cgggggtgag gttttcgctg agaaggctgg cttcaaacgg 420

gggctggaca cgtacgcgga gatggcgacg cgttctgtca cgaatcgtgc gttgcgtgct 480

ggccattccg ccacccaagc cagatccagg tcatgagggc taccaggcca cacagaagca 540

gcgctaccta gaacgccaga tcagggcgtc gaaacggatg gaagctgcag ccatcgaccc 600

tagagacatt gacaccgcaa aacagcgcat acgggcatac caggcaaaac tacgcgacca 660

catcaaacag cacgacctgc caaggcgcag acaccgagaa cagattaaaa tgcgctaaag 720

aagttaacat catgctgcca ccgcccaagc gggaaacatt gcgattgggg ttgggttagt 780

tctccaagta gagcc 795

<210> 7

<211> 1731

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

acattgcgat tggggttggg ttagttctcc aagtagagcc ttccgcggaa cattgggtgc 60

atgaggttct ccttggatag gactgcctcg agcgtctttt catccatgag cttcttttcc 120

aggatgagtt cacgcactgg tcgaccagtt tcggctgctt ccttaccgat ctgatctcca 180

atgtcgtggc ccaggaatgg gttcaggtaa gtgataattc cgatggagtt atcaacgtaa 240

gcacggcaaa catcagcgtt ggcggtgatt cctacgacgc acttctcacg caaagtcttg 300

gctgcattgc ccaggatgcg cagtgactgg aagagggatt cgccaatgac tggctccatg 360

acgttgagct gcaactggcc agcttccgca gccatggtga cggtgagatc gttaccgaag 420

accttgaagc agacctggtt gaccacttct gggatcactg ggttgacctt ggctggcatg 480

atggaggaac cagcctggcg tggtggtagg ttgatttcgt tcaaaccagc acgaggacca 540

gaagacagca gacgtagatc gttacagatc ttggacagtt tcatggctgc acgcttgatt 600

gcggagtgcg catgaacata tgcaccggtg tcagaggtag cctcaatgag atcacgtgcg 660

gactttagtt ccagtccggt gacctcagac agagcagcga caacctggtg gcggtagcct 720

gctggagtgt tcacaccagt accgattgcg gttgcaccaa ggttgacctc gaggagacgg 780

ttggcagctt cacgcagcac ggtctgctct tctgcgaggt tgtgcgcgaa tgctcggaac 840

tcttcgccca agctcatggg aacagcatcc tgcaactggg tgcggcccat cttgatgatg 900

tcgacaaact cattgccctt gtggcggaac gcaacctgaa gctcatcaat ttcagcgatg 960

agggtctgca gtccagcgta aatgcccagg cggaaaccag ttgggtagga atcgttggtg 1020

gactgggaca tgttcacatc atccatgggg tgcaggatgt gatactcgcc cttttcatgg 1080

cctaagaact caagtgcaag gttggcaaca acctcgttgg tgttcatgtt cagtgaggta 1140

cctgcgccac cctggaacac atcgatgggg aactgatcca tacagcgtcc ctcaatgagg 1200

atctgatcac aagcccagac aattgcttct gctttttgtg ctggaagtgt gtgcagtcgg 1260

cggtttgcta aagctgcggc ctttttcacc tggaccatgc cgcgaatgaa atctgggacg 1320

tggttgatgg tggttcgtga gatttggaag ttgtccaccg cacgaagggt gtgcaccccg 1380

taatatgcgt gggatgggat ctgaagttca ccaagcagat ccgattcgat tcggaacttt 1440

ttctgaaccg tggtttttgg ttcgacgaca cgttccgtaa ctgcagcgct gtctgaagac 1500

tgcgactcat tcgtggcgat ttggttctcg ccgttcacaa tgtcttcggc ttttgcgtca 1560

ttctttgagt ctgctgaaga cttgttgctc gtcttagaca tgtactgcct ctcacaagtt 1620

gaaggaaatc acgatggtgc tgtggattat cctacgtact tgtaagaggc agtgtgggac 1680

taccccacta cattttcggg ggtagttaaa atcaaaaacc ccaacccgca c 1731

<210> 8

<211> 1731

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

acattgcgat tggggttggg ttagttctcc aagtagagcc ttccgcggaa cattgggtgc 60

atgaggttct ccttggatag gactgcctcg agcgtctttt catccatgag cttcttttcc 120

aggatgagtt cacgcactgg tcgaccagtt tcggctgctt ccttaccgat ctgatctcca 180

atgtcgtggc ccaggaatgg gttcaggtaa gtgataattc cgatggagtt atcaacgtaa 240

gcacggcaaa catcagcgtt ggcggtgatt cctacgacgc acttctcacg caaagtcttg 300

gctgcattgc ccaggatgcg cagtgactgg aagagggatt cgccaatgac tggctccatg 360

acgttgagct gcaactggcc agcttccgca gccatggtga cggtgagatc gttaccgaag 420

accttgaagc agacctggtt gaccacttct gggatcactg ggttgacctt ggctggcatg 480

atggaggaac cagcctggcg tggtggtagg ttgatttcgt tcaaaccagc acgaggacca 540

gaagacagca gacgtagatc gttacagatc ttggacagtt tcatggctgc acgcttgatt 600

gcggagtgcg catgaacata tgcaccggtg tcagaggtag cctcaatgag atcacgtgcg 660

gactttagtt ccagtccggt gacctcagac agagcagcga caacctggtg gcggtagcct 720

gctggagtgt tcacaccagt accgattgcg gttgcaccaa ggttgacctc gaggagacgg 780

ttggcagctt cacgcagcac ggtctgctct tctgcgaggt tgtgcgcgaa tgctcggaac 840

tcttcgccca agctcatggg aacagcatcc tgcaactggg tgcggcccat cttgatgatg 900

tcgacaaact cattgccctt gtggcggaac gcaacctgaa gctcatcaat ttcagcgatg 960

agggtctgca gtccagcgta aatgcccagg cggaaaccag ttgggtagga atcgttggtg 1020

gactgggaca tgttcacatc atccatgggg tgcaggatgt gatactcgcc cttttcatgg 1080

cctaagaact caagtgcaag gttggcaaca acctcgttgg tgttcatgtt cagtgaggta 1140

cctgcgccac cctggaacac atcgatgggg aactgatcca tacagcgtcc ctcaatgagg 1200

atctgatcac aagcccagac aattgcttct gctttttgtg ctggaagtgt gtgcagtcgg 1260

cggtttgcta aagctgcggc ctttttcacc tggaccatgc cgcgaatgaa atctgggacg 1320

tggttgatgg tggttcgtga gatttggaag ttgtccaccg cacgaagggt gtgcaccccg 1380

taatatgcgt gggatgggat ctgaagttca ccaagcagat ccgattcgat tcggaacttt 1440

ttctgaaccg tggtttttgg ttcgacgaca cgttccgaaa ctgcagcgct gtctgaagac 1500

tgcgactcat tcgtggcgat ttggttctcg ccgttcacaa tgtcttcggc ttttgcgtca 1560

ttctttgagt ctgctgaaga cttgttgctc gtcttagaca tgtactgcct ctcacaagtt 1620

gaaggaaatc acgatggtgc tgtggattat cctacgtact tgtaagaggc agtgtgggac 1680

taccccacta cattttcggg ggtagttaaa atcaaaaacc ccaacccgca c 1731

<210> 9

<211> 769

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

attttcgggg gtagttaaaa tcaaaaaccc caacccgcac atttttagat ttctattttg 60

tgtacatagg gttcggaaca aagcttaaac catccccaat tgaaatgtcg ttacacaccc 120

acatgtttga agtggagcaa accgaaaacc agttttcccc aacggcagcc gccccccacg 180

ttgaaccttc gaaatagtag gcaacaccat caagcggatc ttcatcaagc gaaatagtga 240

ttgactcttc accgttccgc ttacaaactg cgttagtgtc gctattttcc acccacttgt 300

cacactcgta cccgttttca tttagccatt tttcggcatg tcctattttc tcgaaccggg 360

caggagcgtc agggcttccg cagcccgcta gtagtagtcc ggctgcaatg atgcttaatg 420

tttttttcat gaattaaaca tagtactttg ctggtaaaaa tattggagaa ccccactggc 480

ctacatggtc agtgggggca tttttgcgtt tcacccctca aaaatcatca ccacacttgc 540

gggatttccc cctgatttcc cccactccca caccattccc agtggacagt gtggacgtat 600

tggacacatt aaacacattg cgaccaggta aaacgtcatg accaggtatc gtcaatgttc 660

ttgatgaatt tccgcaccgc aggattatca ttcgaggtgg aataaatagc ctgcagctcc 720

gctaaaccaa cgggtaccga gctcgaattc gtaatcatgg tcatagctg 769

<210> 10

<211> 1761

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 10

gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccttag ttctccaagt agagccttcc 60

gcggaacatt gggtgcatga ggttctcctt ggataggact gcctcgagcg tcttttcatc 120

catgagcttc ttttccagga tgagttcacg cactggtcga ccagtttcgg ctgcttcctt 180

accgatctga tctccaatgt cgtggcccag gaatgggttc aggtaagtga taattccgat 240

ggagttatca acgtaagcac ggcaaacatc agcgttggcg gtgattccta cgacgcactt 300

ctcacgcaaa gtcttggctg cattgcccag gatgcgcagt gactggaaga gggattcgcc 360

aatgactggc tccatgacgt tgagctgcaa ctggccagct tccgcagcca tggtgacggt 420

gagatcgtta ccgaagacct tgaagcagac ctggttgacc acttctggga tcactgggtt 480

gaccttggct ggcatgatgg aggaaccagc ctggcgtggt ggtaggttga tttcgttcaa 540

accagcacga ggaccagaag acagcagacg tagatcgtta cagatcttgg acagtttcat 600

ggctgcacgc ttgattgcgg agtgcgcatg aacatatgca ccggtgtcag aggtagcctc 660

aatgagatca cgtgcggact ttagttccag tccggtgacc tcagacagag cagcgacaac 720

ctggtggcgg tagcctgctg gagtgttcac accagtaccg attgcggttg caccaaggtt 780

gacctcgagg agacggttgg cagcttcacg cagcacggtc tgctcttctg cgaggttgtg 840

cgcgaatgct cggaactctt cgcccaagct catgggaaca gcatcctgca actgggtgcg 900

gcccatcttg atgatgtcga caaactcatt gcccttgtgg cggaacgcaa cctgaagctc 960

atcaatttca gcgatgaggg tctgcagtcc agcgtaaatg cccaggcgga aaccagttgg 1020

gtaggaatcg ttggtggact gggacatgtt cacatcatcc atggggtgca ggatgtgata 1080

ctcgcccttt tcatggccta agaactcaag tgcaaggttg gcaacaacct cgttggtgtt 1140

catgttcagt gaggtacctg cgccaccctg gaacacatcg atggggaact gatccataca 1200

gcgtccctca atgaggatct gatcacaagc ccagacaatt gcttctgctt tttgtgctgg 1260

aagtgtgtgc agtcggcggt ttgctaaagc tgcggccttt ttcacctgga ccatgccgcg 1320

aatgaaatct gggacgtggt tgatggtggt tcgtgagatt tggaagttgt ccaccgcacg 1380

aagggtgtgc accccgtaat atgcgtggga tgggatctga agttcaccaa gcagatccga 1440

ttcgattcgg aactttttct gaaccgtggt ttttggttcg acgacacgtt ccgtaactgc 1500

agcgctgtct gaagactgcg actcattcgt ggcgatttgg ttctcgccgt tcacaatgtc 1560

ttcggctttt gcgtcattct ttgagtctgc tgaagacttg ttgctcgtct tagacatgta 1620

ctgcctctca caagttgaag gaaatcacga tggtgctgtg gattatccta cgtacttgta 1680

agaggcagtg tgggactacc ccactacatt ttcgggggta gttaaaagtt ttggcggatg 1740

agagaagatt ttcagcctga t 1761

<210> 11

<211> 1761

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 11

gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccttag ttctccaagt agagccttcc 60

gcggaacatt gggtgcatga ggttctcctt ggataggact gcctcgagcg tcttttcatc 120

catgagcttc ttttccagga tgagttcacg cactggtcga ccagtttcgg ctgcttcctt 180

accgatctga tctccaatgt cgtggcccag gaatgggttc aggtaagtga taattccgat 240

ggagttatca acgtaagcac ggcaaacatc agcgttggcg gtgattccta cgacgcactt 300

ctcacgcaaa gtcttggctg cattgcccag gatgcgcagt gactggaaga gggattcgcc 360

aatgactggc tccatgacgt tgagctgcaa ctggccagct tccgcagcca tggtgacggt 420

gagatcgtta ccgaagacct tgaagcagac ctggttgacc acttctggga tcactgggtt 480

gaccttggct ggcatgatgg aggaaccagc ctggcgtggt ggtaggttga tttcgttcaa 540

accagcacga ggaccagaag acagcagacg tagatcgtta cagatcttgg acagtttcat 600

ggctgcacgc ttgattgcgg agtgcgcatg aacatatgca ccggtgtcag aggtagcctc 660

aatgagatca cgtgcggact ttagttccag tccggtgacc tcagacagag cagcgacaac 720

ctggtggcgg tagcctgctg gagtgttcac accagtaccg attgcggttg caccaaggtt 780

gacctcgagg agacggttgg cagcttcacg cagcacggtc tgctcttctg cgaggttgtg 840

cgcgaatgct cggaactctt cgcccaagct catgggaaca gcatcctgca actgggtgcg 900

gcccatcttg atgatgtcga caaactcatt gcccttgtgg cggaacgcaa cctgaagctc 960

atcaatttca gcgatgaggg tctgcagtcc agcgtaaatg cccaggcgga aaccagttgg 1020

gtaggaatcg ttggtggact gggacatgtt cacatcatcc atggggtgca ggatgtgata 1080

ctcgcccttt tcatggccta agaactcaag tgcaaggttg gcaacaacct cgttggtgtt 1140

catgttcagt gaggtacctg cgccaccctg gaacacatcg atggggaact gatccataca 1200

gcgtccctca atgaggatct gatcacaagc ccagacaatt gcttctgctt tttgtgctgg 1260

aagtgtgtgc agtcggcggt ttgctaaagc tgcggccttt ttcacctgga ccatgccgcg 1320

aatgaaatct gggacgtggt tgatggtggt tcgtgagatt tggaagttgt ccaccgcacg 1380

aagggtgtgc accccgtaat atgcgtggga tgggatctga agttcaccaa gcagatccga 1440

ttcgattcgg aactttttct gaaccgtggt ttttggttcg acgacacgtt ccgaaactgc 1500

agcgctgtct gaagactgcg actcattcgt ggcgatttgg ttctcgccgt tcacaatgtc 1560

ttcggctttt gcgtcattct ttgagtctgc tgaagacttg ttgctcgtct tagacatgta 1620

ctgcctctca caagttgaag gaaatcacga tggtgctgtg gattatccta cgtacttgta 1680

agaggcagtg tgggactacc ccactacatt ttcgggggta gttaaaagtt ttggcggatg 1740

agagaagatt ttcagcctga t 1761

<210> 12

<211> 1517

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 12

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagcagt gatgctaccg ttcccaagcc 60

gacaaagatg agcaggatct gcttcttacc aaaacggtcg gccgcccatc ccgcgaacac 120

acgagccacg gttgcgccga taacaaagga gctggccgca aatccgccag cggtctctga 180

aacggcgaag ctttccatcg catacagcgc catgactgtg atcaggaagt agaaacttag 240

gtactgggtc aagttgacga gccagcccaa aataaacact ggagtgaaca gtgccgttgg 300

ttgcgatggg tgtggtttta tgtccgttct tgcggtgacc gccacgcagt cctcctatgt 360

tgttgattgg ccaaattgca aaaattcaat agatacttta agtattatca tattgcattg 420

tacaaaagtg caggtgaaaa ggtcatccaa tgtcttgaga aacctaatcg cattcaaaat 480

agattcatgt cacaaaatgc tttttgcttt tcgacggctg cgcccgatca aaacaacctc 540

aacgtgttgc cccaccccct tcgcaccgtc ccatatgacc gaaaatcgat ttactgggaa 600

gtttcggcca tatagtctgc tccgcgtgta gtcgcgtaaa aaatctcgcc gactcatcca 660

gcgatatcaa tctcttaaac aggcgcctgc tgaattcacc cacgaaaaaa cctgggcaac 720

caggtgagat gaactctcaa cctaattgcc caggtatcag acgagatctt ggagtactgc 780

ctctcacaag ttgaaggaaa tcacgatggt gctgtggatt atcctacgta cttgtaagag 840

gcagtgtggg actaccccac tacattttcg ggggtagtta aaactagatg cgggcgatgc 900

ggatttcaga agccaggatg gcttcagcgc cgagtccagc aagcttatcc atgatggcgt 960

tagctgacct gcgtggcacc atggcgcgta cagcaaccca gttgtcgcgt gccagtgggg 1020

ataccgttgg gccggatagg cctggggtta ctgcagtggc agcgtccagg ttgtcgcggt 1080

cgacgttgta atccagcatg aggaagttct gcgcgtgcaa aattccctgg atgcggcgaa 1140

gcaggatctg ctgctctggg gtgacctttt catccttgcg gccaacaatg acagcctcag 1200

aggtacacag aacctcgccg aaaggtgcaa gaccttgctg acgcagcgtg cggccggtgg 1260

atacaacatc ggcgatggca tctgcgacac caagcttgat ggatacctct actgcaccgt 1320

cgaggcggag cacctcagcg gaaagcccac gtgctgcgag gtcatcgcga acaaggttgg 1380

ggtaagaggt agcgatgcgc ttgccgtcga gcttttcgat gctccactct tcatcagctg 1440

gtgctgcgta acggaaagtg gaggaaccga agccgagggg ggtaccgagc tcgaattcgt 1500

aatcatggtc atagctg 1517

Claims

1.蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；

2.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为下述任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)编码序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子；

B3)核苷酸序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子。

3.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：

C1)含有权利要求2所述核酸分子的表达盒；

C2)含有权利要求2所述核酸分子的重组载体、或含有C1)所述表达盒的重组载体；

C3)含有权利要求2所述核酸分子的重组微生物、或含有C1)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物。

4.D1)-D8)中任一项的下述任一种应用：

F1)D1)-D8)中任一项在调控微生物的L-缬氨酸的产量中的应用；

F2)D1)-D8)中任一项在构建产L-缬氨酸的基因工程菌中的应用；

F3)D1)-D8)中任一项在制备L-缬氨酸中的应用；

其中，所述D1)-D8)为：

D1)权利要求1所述的蛋白质；

D2)权利要求2所述的核酸分子；

D3)权利要求3所述的生物材料；

D4)核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子；

D6)含有D4)或D5)中所述DNA分子的表达盒；

5.一种提高微生物中L-缬氨酸的产量的方法，其特征在于，所述方法包括下述任一种：

E1)提高目的微生物中的权利要求2所述核酸分子的表达量或含量，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物；

E2)提高目的微生物中的权利要求4中D4)或D5)所述DNA分子的表达量或含量，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物；

E3)对所述目的微生物中的核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子进行突变，得到L-缬氨酸的产量高于所述目的微生物的微生物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述突变为点突变。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述点突变为将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第42位的苏氨酸残基突变为另一种残基。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述点突变为将SEQ ID No.1所示DNA分子编码的氨基酸序列的第42位的苏氨酸突变为丝氨酸，得到氨基酸序列为SEQ ID No.4的突变蛋白质。

9.一种构建权利要求3或4中所述重组微生物的方法，其特征在于，所述方法包括至少下述任一种：

F1)将权利要求2所述的核酸分子导入目的微生物，得到所述重组微生物；

F3)利用基因编辑手段对SEQ ID No.1所示的DNA分子进行编辑，使目的微生物中含有SEQ ID No.3所示的DNA分子。

10.一种制备L-缬氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求3或4中所述的重组微生物生产L-缬氨酸。