CN114507273B

CN114507273B - Yh66_07020蛋白及其相关生物材料在提高精氨酸产量中的应用

Info

Publication number: CN114507273B
Application number: CN202210247409.8A
Authority: CN
Inventors: 赵春光; 孟刚; 魏爱英; 贾慧萍; 何淑桢; 蔡卫卫
Original assignee: Ningxia Eppen Biotech Co ltd
Current assignee: Ningxia Eppen Biotech Co ltd
Priority date: 2022-03-14
Filing date: 2022-03-14
Publication date: 2024-05-07
Anticipated expiration: 2042-03-14
Also published as: CN114507273A

Abstract

本发明公开了YH66_07020蛋白及其相关生物材料在提高精氨酸产量中的应用。本发明公开的YH66_07020突变体是将YH66_07020蛋白质第138位氨基酸残基由丙氨酸突变为缬氨酸得到的蛋白质。本发明首先通过对YH66_07020基因进行单点突变得到YH66_07020^C413T，然后通过对构建的YH66_07020或突变基因的过表达重组菌以及YH66_07020敲除重组菌进行发酵培养发现，YH66_07020基因或其突变基因可以调控细菌L‑精氨酸产量。本发明首次发现YH66_07020基因参与精氨酸的生物合成，对于培育符合工业化生产的高产、高质量菌种，以及精氨酸生产具有重大的应用价值。

Description

YH66_07020蛋白及其相关生物材料在提高精氨酸产量中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及YH66_07020蛋白及其相关生物材料在提高精氨酸产量中的应用。

背景技术

L-精氨酸是人体和动物体内的半必需氨基酸，不仅是机体蛋白质的组成成分，而且是多种生物活性物质的合成前体。L-精氨酸参与尿素循环，是生物体尿素循环的一种重要中间代谢物；L-精氨酸还通过一氧化氮途径影响心血管系统、神经系统和免疫系统；L-精氨酸在调控繁殖机能和基因表达方面也具有重要作用。在饥饿、创伤或应急状态下，L-精氨酸就成为一种必需氨基酸。随着人们对L-精氨酸的生物学功能的不断深入研究和了解，L-精氨酸在医药食品工业上具有越来越广泛的用途，尤其在营养调控和内分泌调节方面显现出了广泛的应用前景。

L-精氨酸的生产方法主要有水解法和发酵法。其中，水解法操作费时、收率低，工艺稳定性不好且环境污染严重，不适于大规模生产。但发酵法克服了蛋白质水解提取法所存在的工艺复杂和污染大等缺点，具有广阔的发展前景。

目前已被报道的精氨酸生产菌株主要有钝齿棒状杆菌、谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母、黄色短杆菌等。虽然已被报道的部分精氨酸生产菌株已经具备了较为优良的发酵性能，但是，鉴于精氨酸重要的应用价值和巨大的市场需求，寻求发酵性能更为优良的精氨酸生产菌株仍然是所有研究开发工作的基础，更是各精氨酸生产厂家增加自身市场竞争力的重中之重。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种YH66_07020突变体。

本发明提供的YH66_07020突变体是将YH66_07020蛋白质第138位氨基酸残基由丙氨酸突变为其他氨基酸残基得到的蛋白质；

所述YH66_07020蛋白质为如下A1)-A3)中的任一种：

A1)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

A2)将A1)所示的氨基酸序列经过除第138位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与细菌产精氨酸相关的蛋白质；

A3)来源于细菌且与A1)或A2)具有95％以上同一性且与细菌产精氨酸相关的蛋白质。

上述A2)所述的蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述A3)所述的蛋白质中，这里使用的术语“同一性”指与天然氨基酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同一性的氨基酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述A1)或A2)或A3)所述的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

进一步的，所述YH66_07020突变体是将YH66_07020蛋白质第138位氨基酸残基由丙氨酸突变为缬氨酸得到的蛋白质(对应本发明实施例中的YH66_07020^C413T蛋白质)。

更进一步的，所述YH66_07020突变体(YH66_07020^C413T蛋白质)是SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

本发明的另一个目的是提供与YH66_07020突变体相关的生物材料。

本发明提供的与YH66_07020突变体相关的生物材料为如下B1)至B4)中的任一种：

B1)编码上述YH66_07020突变体的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。

本发明还有一个目的是提供上述YH66_07020蛋白质或与上述YH66_07020蛋白质相关的生物材料或上述YH66_07020突变体或与上述YH66_07020突变体相关的生物材料的新用途。

本发明提供了上述YH66_07020蛋白质或与上述YH66_07020蛋白质相关的生物材料或上述YH66_07020突变体或与上述YH66_07020突变体相关的生物材料在如下X1)至X3)中任一种中的应用：

X1)调控细菌精氨酸产量；

X2)构建产精氨酸工程菌；

X3)制备精氨酸；

与YH66_07020蛋白质相关的生物材料为如下D1)至D4)中的任一种：

D1)编码所述YH66_07020蛋白质的核酸分子；

D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；

D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；

D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物。

上述生物材料或应用中，B1)所述编码YH66_07020突变体的核酸分子为如下C1)或C2)中的任一种：

C1)核苷酸序列为SEQ ID No.3的DNA分子；

C2)将SEQ ID No.3所示的核苷酸序列经过修饰和/或一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的DNA分子具有90％以上的同一性，且具有相同功能的DNA分子。

D1)所述编码YH66_07020蛋白质的核酸分子为如下E1)或E2)中的任一种：

E1)核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子；

E2)将SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经过修饰和/或一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与E1)所示的DNA分子具有90％以上的同一性，且具有相同功能的DNA分子。

其中，SEQ ID No.1所示的DNA分子为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CGMCC No.20516中的YH66_07020基因，其编码的YH66_07020蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。在本发明中通过引入点突变，得到SEQ ID No.3所示的YH66_07020^C413T基因，其编码的YH66_07020^C413T蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码YH66_07020蛋白质或YH66_07020突变体的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码YH66_07020蛋白质或YH66_07020突变体的核苷酸序列90％或者更高同一性的核苷酸，只要编码YH66_07020蛋白质或YH66_07020突变体且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有90％或更高，或91％或更高，或92％或更高，或93％或更高，或94％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min；或，0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述生物材料或应用中，B2)所述含有编码YH66_07020突变体的核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达YH66_07020突变体的DNA，该DNA不但可包括启动YH66_07020突变体基因转录的启动子，还可包括终止YH66_07020突变体基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。D2)所述含有编码YH66_07020蛋白质的核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达YH66_07020蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动YH66_07020基因转录的启动子，还可包括终止YH66_07020基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

上述生物材料或应用中，B3)或D3)所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pK18mobsacB质粒或pXMJ19质粒。

在本发明的一个具体实施例中，所述重组载体为重组载体pK18-YH66_07020^C413T。

在本发明的另一个具体实施例中，所述重组载体为重组载体pK18-YH66_07020OE或重组载体pK18-YH66_07020^C413TOE。

在本发明的又一个具体实施例中，所述重组载体为重组载体pXMJ19-YH66_07020或重组载体pXMJ19-YH66_07020^C413T。

上述生物材料中，B4)或D4)所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。

进一步的，细菌可为任一具有产精氨酸能力的细菌，如来自短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、气杆菌属(Aerobacter)、微球菌属(Micrococcus)、黄杆菌属(Flavobacterium)或芽胞杆菌属(Bacillus)的细菌等。

更进一步的，所述细菌包括但不限于谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、产谷氨酸微球菌(Micrococcus glutamicus)、产氨短杆菌(Brevibacterum ammoniagenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产气气杆菌(Aerobacteraerogenes)。

在本发明的一个具体实施例中，所述微生物为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)CGMCC No.20516，该菌株名称为YPARG01，已于2020年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.20516。

上述应用中，调控为正调控。具体体现为当细菌中YH66_07020蛋白质或YH66_07020突变体含量或活性提高时，所述细菌精氨酸产量提高；当细菌中YH66_07020蛋白质含量或活性降低时，所述细菌精氨酸产量降低。

本发明还有一个目的是提供提高YH66_07020蛋白质或YH66_07020突变体含量和/或活性的物质或提高YH66_07020基因或YH66_07020突变体基因表达量的物质的新用途。

本发明提供了提高YH66_07020蛋白质或YH66_07020突变体含量和/或活性的物质或提高YH66_07020基因或YH66_07020突变体基因表达量的物质在如下Y1)至Y3)中任一种中的应用：

Y1)提高细菌精氨酸产量；

Y2)构建产精氨酸工程菌；

Y3)制备精氨酸。

进一步的，所述提高YH66_07020基因表达量的物质可为YH66_07020基因或含有所述YH66_07020基因的重组载体。

所述提高YH66_07020突变体基因表达量的物质可为YH66_07020突变体基因或含有所述YH66_07020突变体基因的重组载体。

更进一步的，含有所述YH66_07020基因的重组载体具体可为重组载体pK18-YH66_07020OE或重组载体pXMJ19-YH66_07020。

含有所述YH66_07020突变体基因的重组载体具体可为重组载体pK18-YH66_07020^C413TOE或重组载体pXMJ19-YH66_07020^C413T。

本发明还有一个目的是提供一种提高细菌精氨酸产量的方法。

本发明提供的提高细菌精氨酸产量的方法为如下M1)或M2)：

所述M1)包括如下步骤：将细菌基因组中的YH66_07020基因替换为YH66_07020突变体基因，实现细菌精氨酸产量的提高；

所述M2)包括如下步骤：提高细菌中YH66_07020蛋白质或YH66_07020突变体含量和/或活性，或提高细菌中YH66_07020基因或YH66_07020突变体基因表达量，实现细菌精氨酸产量的提高。

本发明还有一个目的是提供一种产精氨酸工程菌的构建方法。

本发明提供的产精氨酸工程菌的构建方法为如下N1)或N2)：

所述N1)包括如下步骤：将细菌基因组中的YH66_07020基因替换为YH66_07020突变体基因，得到所述产精氨酸工程菌；

所述N2)包括如下步骤：提高细菌中YH66_07020蛋白质或YH66_07020突变体含量和/或活性，或提高细菌中YH66_07020基因或YH66_07020突变体基因表达量，得到所述产精氨酸工程菌；

上述任一所述应用或方法中，所述YH66_07020突变体具体为YH66_07020^C413T蛋白质，具体为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

所述YH66_07020突变体基因具体为YH66_07020^C413T基因，具体为SEQ ID No.3所示的DNA分子。

按照上述产精氨酸工程菌的构建方法构建得到的产精氨酸工程菌在制备精氨酸中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明最后一个目的是提供一种制备精氨酸的方法。

本发明提供的制备精氨酸的方法包括如下步骤：发酵培养按照上述产精氨酸工程菌的构建方法构建得到的产精氨酸工程菌，得到所述精氨酸。

所述发酵培养方法可按照现有技术中的常规试验方法进行。也可采用优化和改进后的常规试验方法进行。所述发酵培养采用的培养基如实施例中的表3所示。所述发酵培养条件如实施例中的表4所示。

上述任一所述应用或方法中，所述精氨酸具体为L-精氨酸。

本发明首先通过对YH66_07020基因进行单点突变得到YH66_07020^C413T基因，然后通过对构建的YH66_07020或突变基因的过表达重组菌以及YH66_07020敲除重组菌进行发酵培养发现，YH66_07020基因或其突变基因可以调控细菌L-精氨酸产量。本发明首次发现YH66_07020基因参与精氨酸的生物合成，对于培育符合工业化生产的高产、高质量菌种，以及精氨酸工业化生产具有重大的应用价值。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、构建包含点突变的YH66_07020基因编码区的重组载体

依据NCBI公布的黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC15168基因组序列，设计并合成两对扩增YH66_07020基因编码区的引物，以等位基因置换的方式在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC 20516(经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的YH66_07020基因)的YH66_07020基因编码区(SEQ ID No.1)中引入点突变，所述点突变为将YH66_07020基因的核苷酸序列(SEQ ID No.1)中的第413位胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)，得到SEQ ID No.3所示的DNA分子(突变的YH66_07020基因，名称为YH66_07020^C413T)。

其中，SEQ ID No.1所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质(所述蛋白质名称为蛋白质YH66_07020)。SEQ ID No.3所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ IDNo.4的突变蛋白质(所述突变蛋白质名称为YH66_07020^C413T)。所述突变蛋白质YH66_07020^C413T氨基酸序列(SEQ ID No.4)中的第138位缬氨酸(V)由丙氨酸(A)突变而来。

采用NEBuilder重组技术进行基因定点突变，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)，加红色粗字体的碱基为突变位置：

P1：5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGTACTTCTATCTATTGTTCAC-3'；

P2：5'-CCGTAGCTGCAGGCTGCCCCTCCACGATCTCACGAGC-3'；

P3：5'-GCTCGTGAGATCGTGGAGGGGCAGCCTGCAGCTACGG-3'；

P4：5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCTGCCCATGAGAGCCACAATC-3'。

构建方法：以黄色短杆菌ATCC15168为模板，分别采用引物P1/P2和P3/P4进行PCR扩增，获得两条分别带有突变碱基，大小分别为681bp和600bp的YH66_07020基因编码区的DNA片段(YH66_07020Up和YH66_07020Down)。

PCR扩增体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。

PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，(94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸40s；30个循环)，72℃过度延伸10min。

将上述两条DNA片段(YH66_07020Up和YH66_07020Down)经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，与经过酶切(Xbal I/BamH I)后纯化的pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司，用XbalI/BamH I酶切)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆经PCR鉴定获得阳性重组载体pK18-YH66_07020^C413T，该重组载体上含有卡那霉素抗性标记。将酶切正确的重组载体pK18-YH66_07020^C413T送测序公司测序鉴定，并将含有正确点突变(C-T)的重组载体pK18-YH66_07020^C413T保存备用。

重组载体pK18-YH66_07020^C413T中YH66_07020^C413T Up-Down DNA片段(YH66_07020Up-Down，SEQ ID No.5)的大小为1244bp，由于含有突变位点，导致菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC 20516中YH66_07020基因编码区的第413位胞嘧啶(C)变为胸腺嘧啶(T)，最终导致编码蛋白的第138位丙氨酸(A)变为缬氨酸(V)。

重组载体pK18-YH66_07020^C413T是将pK18mobsacB载体的Xbal I和/BamH I识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中SEQ ID No.5第37-1206位所示的DNA片段，且保持pK18mobsacB载体的其他序列不变得到的重组载体。

重组载体pK18-YH66_07020^C413T含有SEQ ID No.3所示的突变基因YH66_07020^C413T的第1-961位所示的DNA分子。

实施例2、构建包含基因YH66_07020^C413T的工程菌株

构建方法：将实施例1中的等位替换质粒(pK18-YH66_07020^C413T)通过电击转化入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CGMCC 20516中后，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落分别通过实施例1中的引物P1和通用引物M13R进行鉴定，能扩增出大小为1251bp条带的菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用如下引物(上海invitrogen公司合成)进行PCR鉴定：

P5：5'-AGGGCACGCACCTGCGGATG-3'；

P6：5'-CAGTGTTGGTGTACGGGCGG-3'。

将得到的PCR扩增产物(210bp)通过95℃高温变性10min、冰浴5min后进行SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphis)电泳(以质粒pK18-YH66_07020^C413T扩增片段为阳性对照，黄色短杆菌ATCC15168扩增片段为阴性对照，水作为空白对照)，SSCP电泳的PAGE的制备及电泳条件参见表2，由于片段结构不同，电泳位置不同，因此片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的菌株为等位替换成功的菌株。再次通过引物P5/P6 PCR扩增阳性菌株YH66_07020基因片段，并连接到PMD19-T载体进行测序，通过序列比对，碱基序列发生突变(C-T)的菌株为等位替换成功的阳性菌株，并被命名为YPR-031。

重组菌YPR-031含有SEQ ID No.3所示的突变的基因YH66_07020^C413T。

表1、培养基的组成和培养条件

成分	配方
		蔗糖	10g/L
多聚蛋白胨	10g/L
		牛肉膏	10g/L
酵母粉	5g/L
		尿素	2g/L
氯化钠	2.5g/L
		琼脂粉	20g/L
水
		pH	7.0
培养条件	32℃

表2、SSCP电泳的PAGE的制备及电泳条件

实施例3、构建基因组上过表达YH66_07020基因或YH66_07020^C413T基因的工程菌株

依据NCBI公布的黄色短杆菌ATCC15168基因组序列，设计并合成三对扩增上下游同源臂片段及YH66_07020或YH66_07020^C413T基因编码区及启动子区的引物，以同源重组的方式在谷氨酸棒杆菌CGMCC 20516中引入YH66_07020或YH66_07020^C413T基因。

引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P7：5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGCATGACGGCTGACTGGACTC-3'；

P8：5'-CGATATTTAA CCGTCTCAGGAATCGGACTC CTTAAATGGG-3'；

P9：5'-CCCATTTAAG GAGTCCGATTCCTGAGACGG TTAAATATCG-3'；

P10：5'-CTATGTGAGT AGTCGATTTACTACTCAGCC TTCTTAGACC-3'；

P11：5'-GGTCTAAGAA GGCTGAGTAGTAAATCGACT ACTCACATAG-3'；

P12：5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCTGCATAAGAAACAACCACTT-3'。

构建方法：分别以黄色短杆菌ATCC15168或YPR-031为模板，分别采用引物P7/P8、P9/P10和P11/P12进行PCR扩增，获得上游同源臂片段806bp(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC20516YH66_03350基因及其启动子区或者是与上一个基因的间隔区，序列如SEQ IDNo.6所示)，YH66_07020基因及其启动子片段1080bp(序列如SEQ ID No.7所示)或YH66_07020^C413T基因及其启动子片段1080bp(序列如SEQ ID No.8所示)及下游同源臂片段783bp(对应于谷氨酸棒杆菌CGMCC 20516YH66_03355基因及其与YH66_03350基因的部分间隔区，序列如SEQ ID No.9所示)。PCR反应结束后，对每个模板扩增得到的3个片段采用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳回收。回收后的3个片段与经过Xbal I/BamH I酶切后纯化的pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性整合质粒(重组载体)，分别为pK18-YH66_07020OE、pK18-YH66_07020^C413TOE，该阳性整合质粒上含有卡那霉素抗性标记，可以通过卡那霉素筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。

PCR反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。

PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸60s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

将测序正确的整合质粒(pK18-YH66_07020OE、pK18-YH66_07020^C413TOE)分别电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC 20516，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过P13/P14引物进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小为1380bp片段的菌株为阳性菌株，扩增不到片段的菌株为原菌。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落进一步采用P15/P16引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1420bp片段的菌株为YH66_07020或YH66_07020^C413T基因整合到谷氨酸棒杆菌CGMCC 20516基因组上同源臂YH66_03350和下同源臂YH66_03355的间隔区上的阳性菌株，分别命名为YPR-032(不含突变点)和YPR-033(含突变点)。

重组菌YPR-032含有双拷贝的SEQ ID No.1所示的YH66_07020基因；具体地，重组菌YPR-032是将谷氨酸棒杆菌CGMCC 20516的基因组中上同源臂YH66_03350和下同源臂YH66_03355的间隔区替换为YH66_07020基因，且保持谷氨酸棒杆菌CGMCC 20516的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有双拷贝YH66_07020基因的重组菌可以显著和稳定地提高YH66_07020基因的表达量。

重组菌YPR-033含有SEQ ID No.3所示的突变的YH66_07020^C413T基因；具体地，重组菌YPR-033是将谷氨酸棒杆菌CGMCC 20516的基因组中上同源臂YH66_03350和下同源臂YH66_03355的间隔区替换为YH66_07020^C413T基因，且保持谷氨酸棒杆菌CGMCC 20516的基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。

PCR鉴定引物如下所示：

P13：5'-GTCCGCTCTGTTGGTGTTCA-3'(对应上同源臂YH66_03350的外侧)；

P14：5'-GCAGCCACTGCAGCCTGCAC-3'(对应YH66_07020基因内部)；

P15：5'-ACGGAAGCGGATCCTTCACG-3'(对应YH66_07020基因内部)；

P16：5'-TGGAGGAATATTCGGCCCAG-3'(对应下同源臂YH66_03355的外侧)。

实施例4、构建质粒上过表达YH66_07020基因或YH66_07020^C413T基因的工程菌株

依据NCBI公布的黄色短杆菌ATCC15168基因组序列，设计并合成一对扩增YH66_07020或YH66_07020^C413T基因编码区及启动子区的引物，引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P17：5'-GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCCTGAGACGGTTAAATATCG 3'(带下划线的核苷酸序列为pXMJ19上的序列)；

P18：5'-ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACCTACTCAGCCTTCTTAGACC 3'(带下划线的核苷酸序列为pXMJ19上的序列)。

构建方法：分别以黄色短杆菌ATCC15168或YPR-031为模板，以引物P17/P18进行PCR扩增，获得YH66_07020基因及其启动子片段(序列如SEQ ID No.12所示)和YH66_07020^C413T基因及其启动子片段1110bp(序列如SEQ ID No.13所示)，对扩增产物进行电泳并采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收，回收的DNA片段与经EcoR I酶切回收的穿梭质粒pXMJ19用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性过表达质粒pXMJ19-YH66_07020(含有YH66_07020基因)和pXMJ19-YH66_07020^C413T(含有YH66_07020^C413T基因)，将该质粒送测序。因质粒上含有氯霉素抗性标记，可以通过氯霉素来筛选质粒是否转化到菌株中。

将测序正确的pXMJ19-YH66_07020和pXMJ19-YH66_07020^C413T质粒分别电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC 20516中，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过引物M13R(-48)/P18进行PCR鉴定，PCR扩增出含有大小为1149bp片段的菌株为阳性菌株，其被命名为YPR-034(不含突变点)和YPR-035(含突变点)。

重组菌YPR-034含有SEQ ID No.1所示的YH66_07020基因；重组菌YPR-035含有SEQID No.3所示的突变的YH66_07020^C413T基因。

实施例5、构建基因组上缺失YH66_07020基因的工程菌株

根据NCBI公布的黄色短杆菌ATCC15168的基因组序列，合成两对扩增YH66_07020基因编码区两端片段的引物，作为上下游同源臂片段。引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P19：5'-CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG GCAGTCCAGTAGTAGACCAC-3'；

P20：5'-TTGAAGCTTACAACCTAAGACACGCTTACAGAAACCACGC-3'；

P21：5'-GCGTGGTTTC TGTAAGCGTGTCTTAGGTTG TAAGCTTCAA-3'；

P22：5'-CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCACAGCCTTATTAAAATCCTC-3'。

构建方法：以黄色短杆菌ATCC15168为模板，分别以引物P19/P20和P21/P22进行PCR扩增，获得YH66_07020的上游同源臂片段725bp及YH66_07020的下游同源臂片段708bp。对扩增的产物进行电泳并采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化，回收的DNA片段与经过Xbal I/BamH I酶切后纯化的pK18mobsacB质粒(购自Addgene公司)用NEBuilder酶(购自NEB公司)50℃连接30min，连接产物转化后长出的单克隆用M13引物经PCR鉴定获得阳性敲除载体pK18-ΔYH66_07020，该质粒含有整个敲除YH66_07020同源臂片段1393bp(序列如SEQ ID No.14所示)和卡那霉素抗性作为筛选标记，将该质粒送测序。

PCR扩增反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg²⁺(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL。

PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。

将测序正确的敲除质粒pK18-ΔYH66_07020电转化入谷氨酸棒杆菌CGMCC 20516，在培养基中进行培养，培养基成分和培养条件参见表1，对培养产生的单菌落通过如下引物(上海invitrogen公司合成)进行PCR鉴定：

P23：5'-GCAGTCCAGTAGTAGACCAC-3'；

P24：5'-ACAGCCTTATTAAAATCCTC-3'。

上述PCR同时扩增出大小为1319bp及2300bp条带的菌株为阳性菌株，只扩增出大小为2300bp条带的菌株为原菌。阳性菌株在15％蔗糖培养基上筛选后分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，选择在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P23/P24引物进行PCR鉴定，扩增出大小为1319bp条带的菌株为YH66_07020基因编码区被敲除的阳性菌株。再次通过P23/P24引物PCR扩增阳性菌株YH66_07020片段，并连接到pMD19-T载体进行测序，将测序正确的菌株命名为YPR-036。

重组菌YPR-036为将谷氨酸棒杆菌CGMCC 20516基因组上的YH66_07020基因敲除后得到的重组菌。

实施例6、L-精氨酸发酵实验

将上述实施例构建的菌株和原始菌株谷氨酸棒杆菌CGMCC 20516在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐(购自上海百仑生物科技有限公司)中以表3所示的培养基和表4所示的控制工艺进行发酵实验。每个菌株重复三次，结果如表5所示。

结果如表5所示，在谷氨酸棒杆菌中对YH66_07020基因编码区进行点突变YH66_07020^C413T及过表达，有助于L-精氨酸产量及转化率的提高，而对基因进行敲除或弱化，不利于L-精氨酸的积累。

表3、发酵培养基配方(其余为水)

表4、发酵控制工艺

表5、L-精氨酸发酵实验结果

菌株	OD_562nm	L-精氨酸产量(g/L)
			谷氨酸棒杆菌CGMCC 20516	75.0	87.9
YPR-031	78.2	89.8
			YPR-032	78.8	89.0
YPR-033	79.5	89.6
			YPR-034	77.1	89.3
YPR-035	80.1	90.2
			YPR-036	73.8	86.5

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 宁夏伊品生物科技股份有限公司

<120> YH66_07020蛋白及其相关生物材料在提高精氨酸产量中的应用

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 981

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atgggtgcag gttcctgggg aaccacgttg gccaaggtct tctctgatgc tggcaacgct 60

gtgacgttgt gggcgaggcg ggaagagttg gcaagcacca tccgtgacag ccatgaaaac 120

cgtgattatc ttccggggat tacgttgccg gagtcgctgc aggtcacatc atcggcaacg 180

gaggctttag agggcgcagc cattgtggtg ttggcgattc cttcgcaggc gttgcgtggc 240

aatttggcgg agtggaaaga gacgatcccg caggatgcga ccttggtgtc cttggctaaa 300

ggtattgaaa agggcacgca cctgcggatg agtgaagtga tcgcggaggt gacggaagcg 360

gatccttcac gcatcgcggt gttgtcgggg ccaaaccttg ctcgtgagat cgcggagggg 420

cagcctgcag ctacggtgat tgcttgccct gatgaaaacc gagcgaaact tgtgcaggct 480

gcagtggctg cgccgtattt ccgcccgtac accaacactg atgtggtggg caccgaaatc 540

ggtggtgcgt gtaagaacgt catcgcgctg gcctgtggta tttcccacgg ttacggcctg 600

ggtgagaaca ccaatgcatc gttgattact cgtggccttg cagagatcgc acgcctcggt 660

gccacattgg gtgcggatgc gaagactttt tctggccttg cgggaatggg cgacttggtg 720

gctacgtgtt catcaccgct gtcgcgtaac cgcagcttcg gtgagcgttt gggtcagggt 780

gaatccctgg agaaggctcg cgaggcaacc aatggtcagg ttgcggaggg tgttatttcc 840

tcgcagtcga tttttgatct tgccaccaag cttggcgtgg agatgccaat cacccaggct 900

gtctacggtg tgtgccaccg ggatatgaaa gtaactgaca tgattgtggc tctcatgggc 960

aggtctaaga aggctgagta g 981

<210> 2

<211> 326

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Gly Ala Gly Ser Trp Gly Thr Thr Leu Ala Lys Val Phe Ser Asp

1 5 10 15

Ala Gly Asn Ala Val Thr Leu Trp Ala Arg Arg Glu Glu Leu Ala Ser

20 25 30

Thr Ile Arg Asp Ser His Glu Asn Arg Asp Tyr Leu Pro Gly Ile Thr

35 40 45

Leu Pro Glu Ser Leu Gln Val Thr Ser Ser Ala Thr Glu Ala Leu Glu

50 55 60

Gly Ala Ala Ile Val Val Leu Ala Ile Pro Ser Gln Ala Leu Arg Gly

65 70 75 80

Asn Leu Ala Glu Trp Lys Glu Thr Ile Pro Gln Asp Ala Thr Leu Val

85 90 95

Ser Leu Ala Lys Gly Ile Glu Lys Gly Thr His Leu Arg Met Ser Glu

100 105 110

Val Ile Ala Glu Val Thr Glu Ala Asp Pro Ser Arg Ile Ala Val Leu

115 120 125

Ser Gly Pro Asn Leu Ala Arg Glu Ile Ala Glu Gly Gln Pro Ala Ala

130 135 140

Thr Val Ile Ala Cys Pro Asp Glu Asn Arg Ala Lys Leu Val Gln Ala

145 150 155 160

Ala Val Ala Ala Pro Tyr Phe Arg Pro Tyr Thr Asn Thr Asp Val Val

165 170 175

Gly Thr Glu Ile Gly Gly Ala Cys Lys Asn Val Ile Ala Leu Ala Cys

180 185 190

Gly Ile Ser His Gly Tyr Gly Leu Gly Glu Asn Thr Asn Ala Ser Leu

195 200 205

Ile Thr Arg Gly Leu Ala Glu Ile Ala Arg Leu Gly Ala Thr Leu Gly

210 215 220

Ala Asp Ala Lys Thr Phe Ser Gly Leu Ala Gly Met Gly Asp Leu Val

225 230 235 240

Ala Thr Cys Ser Ser Pro Leu Ser Arg Asn Arg Ser Phe Gly Glu Arg

245 250 255

Leu Gly Gln Gly Glu Ser Leu Glu Lys Ala Arg Glu Ala Thr Asn Gly

260 265 270

Gln Val Ala Glu Gly Val Ile Ser Ser Gln Ser Ile Phe Asp Leu Ala

275 280 285

Thr Lys Leu Gly Val Glu Met Pro Ile Thr Gln Ala Val Tyr Gly Val

290 295 300

Cys His Arg Asp Met Lys Val Thr Asp Met Ile Val Ala Leu Met Gly

305 310 315 320

Arg Ser Lys Lys Ala Glu

325

<210> 3

<211> 981

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atgggtgcag gttcctgggg aaccacgttg gccaaggtct tctctgatgc tggcaacgct 60

gtgacgttgt gggcgaggcg ggaagagttg gcaagcacca tccgtgacag ccatgaaaac 120

cgtgattatc ttccggggat tacgttgccg gagtcgctgc aggtcacatc atcggcaacg 180

gaggctttag agggcgcagc cattgtggtg ttggcgattc cttcgcaggc gttgcgtggc 240

aatttggcgg agtggaaaga gacgatcccg caggatgcga ccttggtgtc cttggctaaa 300

ggtattgaaa agggcacgca cctgcggatg agtgaagtga tcgcggaggt gacggaagcg 360

gatccttcac gcatcgcggt gttgtcgggg ccaaaccttg ctcgtgagat cgtggagggg 420

cagcctgcag ctacggtgat tgcttgccct gatgaaaacc gagcgaaact tgtgcaggct 480

gcagtggctg cgccgtattt ccgcccgtac accaacactg atgtggtggg caccgaaatc 540

ggtggtgcgt gtaagaacgt catcgcgctg gcctgtggta tttcccacgg ttacggcctg 600

ggtgagaaca ccaatgcatc gttgattact cgtggccttg cagagatcgc acgcctcggt 660

gccacattgg gtgcggatgc gaagactttt tctggccttg cgggaatggg cgacttggtg 720

gctacgtgtt catcaccgct gtcgcgtaac cgcagcttcg gtgagcgttt gggtcagggt 780

gaatccctgg agaaggctcg cgaggcaacc aatggtcagg ttgcggaggg tgttatttcc 840

tcgcagtcga tttttgatct tgccaccaag cttggcgtgg agatgccaat cacccaggct 900

gtctacggtg tgtgccaccg ggatatgaaa gtaactgaca tgattgtggc tctcatgggc 960

aggtctaaga aggctgagta g 981

<210> 4

<211> 326

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

et Gly Ala Gly Ser Trp Gly Thr Thr Leu Ala Lys Val Phe Ser Asp

1 5 10 15

Ala Gly Asn Ala Val Thr Leu Trp Ala Arg Arg Glu Glu Leu Ala Ser

20 25 30

Thr Ile Arg Asp Ser His Glu Asn Arg Asp Tyr Leu Pro Gly Ile Thr

35 40 45

Leu Pro Glu Ser Leu Gln Val Thr Ser Ser Ala Thr Glu Ala Leu Glu

50 55 60

Gly Ala Ala Ile Val Val Leu Ala Ile Pro Ser Gln Ala Leu Arg Gly

65 70 75 80

Asn Leu Ala Glu Trp Lys Glu Thr Ile Pro Gln Asp Ala Thr Leu Val

85 90 95

Ser Leu Ala Lys Gly Ile Glu Lys Gly Thr His Leu Arg Met Ser Glu

100 105 110

Val Ile Ala Glu Val Thr Glu Ala Asp Pro Ser Arg Ile Ala Val Leu

115 120 125

Ser Gly Pro Asn Leu Ala Arg Glu Ile Val Glu Gly Gln Pro Ala Ala

130 135 140

Thr Val Ile Ala Cys Pro Asp Glu Asn Arg Ala Lys Leu Val Gln Ala

145 150 155 160

Ala Val Ala Ala Pro Tyr Phe Arg Pro Tyr Thr Asn Thr Asp Val Val

165 170 175

Gly Thr Glu Ile Gly Gly Ala Cys Lys Asn Val Ile Ala Leu Ala Cys

180 185 190

Gly Ile Ser His Gly Tyr Gly Leu Gly Glu Asn Thr Asn Ala Ser Leu

195 200 205

Ile Thr Arg Gly Leu Ala Glu Ile Ala Arg Leu Gly Ala Thr Leu Gly

210 215 220

Ala Asp Ala Lys Thr Phe Ser Gly Leu Ala Gly Met Gly Asp Leu Val

225 230 235 240

Ala Thr Cys Ser Ser Pro Leu Ser Arg Asn Arg Ser Phe Gly Glu Arg

245 250 255

Leu Gly Gln Gly Glu Ser Leu Glu Lys Ala Arg Glu Ala Thr Asn Gly

260 265 270

Gln Val Ala Glu Gly Val Ile Ser Ser Gln Ser Ile Phe Asp Leu Ala

275 280 285

Thr Lys Leu Gly Val Glu Met Pro Ile Thr Gln Ala Val Tyr Gly Val

290 295 300

Cys His Arg Asp Met Lys Val Thr Asp Met Ile Val Ala Leu Met Gly

305 310 315 320

Arg Ser Lys Lys Ala Glu

325

<210> 5

<211> 1244

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagtact tctatctatt gttcaccagc 60

gacccgctca ttgcacattc tggactcggc gtgtggcgac atttttggat gattcctggc 120

aaattctggg cagcagcggc aggtttccag gaggtttcca tgcgggtggc ttgggacata 180

ggctaacctg agacggttaa atatcgtttt cgaaaggtgg gtttcgcgtg gtttctgtaa 240

gcgtgatggg tgcaggttcc tggggaacca cgttggccaa ggtcttctct gatgctggca 300

acgctgtgac gttgtgggcg aggcgggaag agttggcaag caccatccgt gacagccatg 360

aaaaccgtga ttatcttccg gggattacgt tgccggagtc gctgcaggtc acatcatcgg 420

caacggaggc tttagagggc gcagccattg tggtgttggc gattccttcg caggcgttgc 480

gtggcaattt ggcggagtgg aaagagacga tcccgcagga tgcgaccttg gtgtccttgg 540

ctaaaggtat tgaaaagggc acgcacctgc ggatgagtga agtgatcgcg gaggtgacgg 600

aagcggatcc ttcacgcatc gcggtgttgt cggggccaaa ccttgctcgt gagatcgcgg 660

aggggcagcc tgcagctacg gtgattgctt gccctgatga aaaccgagcg aaacttgtgc 720

aggctgcagt ggctgcgccg tatttccgcc cgtacaccaa cactgatgtg gtgggcaccg 780

aaatcggtgg tgcgtgtaag aacgtcatcg cgctggcctg tggtatttcc cacggttacg 840

gcctgggtga gaacaccaat gcatcgttga ttactcgtgg ccttgcagag atcgcacgcc 900

tcggtgccac attgggtgcg gatgcgaaga ctttttctgg ccttgcggga atgggcgact 960

tggtggctac gtgttcatca ccgctgtcgc gtaaccgcag cttcggtgag cgtttgggtc 1020

agggtgaatc cctggagaag gctcgcgagg caaccaatgg tcaggttgcg gagggtgtta 1080

tttcctcgca gtcgattttt gatcttgcca ccaagcttgg cgtggagatg ccaatcaccc 1140

aggctgtcta cggtgtgtgc caccgggata tgaaagtaac tgacatgatt gtggctctca 1200

tgggcagggt accgagctcg aattcgtaat catggtcata gctg 1244

<210> 6

<211> 806

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagcatg acggctgact ggactcgact 60

tccatacgag gttctggaga agatctccac ccgcatcacc aacgaagttc cagatgtgaa 120

ccgcgtggtt ttggacgtaa cctccaagcc accaggaacc atcgaatggg agtaggcctt 180

aaatgagcct tcgttaagcg gcaatcacct tattggagat tgtcgctttt cccatttctc 240

cgggttttct ggaacttttt gggcgtatgc tgggaatgat tctattattg ccaaatcaga 300

aagcaggaga gacccgatga gcgaaatcct agaaacctat tgggcacccc actttggaaa 360

aaccgaagaa gccacagcac tcgtttcata cctggcacaa gcttccggcg atcccattga 420

ggttcacacc ctgttcgggg atttaggttt agacggactc tcgggaaact acaccgacac 480

tgagattgac ggctacggcg acgcattcct gctggttgca gcgctatccg tgttgatggc 540

tgaaaacaaa gcaacaggtg gcgtgaatct gggtgagctt gggggagctg ataaatcgat 600

ccggctgcat gttgaatcca aggagaacac ccaaatcaac accgcattga agtattttgc 660

gctctcccca gaagaccacg cagcagcaga tcgcttcgat gaggatgacc tgtctgagct 720

tgccaacttg agtgaagagc tgcgcggaca gctggactaa ttgtctccca tttaaggagt 780

ccgattcctg agacggttaa atatcg 806

<210> 7

<211> 1080

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

cccatttaag gagtccgatt cctgagacgg ttaaatatcg ttttcgaaag gtgggtttcg 60

cgtggtttct gtaagcgtga tgggtgcagg ttcctgggga accacgttgg ccaaggtctt 120

ctctgatgct ggcaacgctg tgacgttgtg ggcgaggcgg gaagagttgg caagcaccat 180

ccgtgacagc catgaaaacc gtgattatct tccggggatt acgttgccgg agtcgctgca 240

ggtcacatca tcggcaacgg aggctttaga gggcgcagcc attgtggtgt tggcgattcc 300

ttcgcaggcg ttgcgtggca atttggcgga gtggaaagag acgatcccgc aggatgcgac 360

cttggtgtcc ttggctaaag gtattgaaaa gggcacgcac ctgcggatga gtgaagtgat 420

cgcggaggtg acggaagcgg atccttcacg catcgcggtg ttgtcggggc caaaccttgc 480

tcgtgagatc gcggaggggc agcctgcagc tacggtgatt gcttgccctg atgaaaaccg 540

agcgaaactt gtgcaggctg cagtggctgc gccgtatttc cgcccgtaca ccaacactga 600

tgtggtgggc accgaaatcg gtggtgcgtg taagaacgtc atcgcgctgg cctgtggtat 660

ttcccacggt tacggcctgg gtgagaacac caatgcatcg ttgattactc gtggccttgc 720

agagatcgca cgcctcggtg ccacattggg tgcggatgcg aagacttttt ctggccttgc 780

gggaatgggc gacttggtgg ctacgtgttc atcaccgctg tcgcgtaacc gcagcttcgg 840

tgagcgtttg ggtcagggtg aatccctgga gaaggctcgc gaggcaacca atggtcaggt 900

tgcggagggt gttatttcct cgcagtcgat ttttgatctt gccaccaagc ttggcgtgga 960

gatgccaatc acccaggctg tctacggtgt gtgccaccgg gatatgaaag taactgacat 1020

gattgtggct ctcatgggca ggtctaagaa ggctgagtag taaatcgact actcacatag 1080

<210> 8

<211> 1080

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

cccatttaag gagtccgatt cctgagacgg ttaaatatcg ttttcgaaag gtgggtttcg 60

cgtggtttct gtaagcgtga tgggtgcagg ttcctgggga accacgttgg ccaaggtctt 120

ctctgatgct ggcaacgctg tgacgttgtg ggcgaggcgg gaagagttgg caagcaccat 180

ccgtgacagc catgaaaacc gtgattatct tccggggatt acgttgccgg agtcgctgca 240

ggtcacatca tcggcaacgg aggctttaga gggcgcagcc attgtggtgt tggcgattcc 300

ttcgcaggcg ttgcgtggca atttggcgga gtggaaagag acgatcccgc aggatgcgac 360

cttggtgtcc ttggctaaag gtattgaaaa gggcacgcac ctgcggatga gtgaagtgat 420

cgcggaggtg acggaagcgg atccttcacg catcgcggtg ttgtcggggc caaaccttgc 480

tcgtgagatc gtggaggggc agcctgcagc tacggtgatt gcttgccctg atgaaaaccg 540

agcgaaactt gtgcaggctg cagtggctgc gccgtatttc cgcccgtaca ccaacactga 600

tgtggtgggc accgaaatcg gtggtgcgtg taagaacgtc atcgcgctgg cctgtggtat 660

ttcccacggt tacggcctgg gtgagaacac caatgcatcg ttgattactc gtggccttgc 720

agagatcgca cgcctcggtg ccacattggg tgcggatgcg aagacttttt ctggccttgc 780

gggaatgggc gacttggtgg ctacgtgttc atcaccgctg tcgcgtaacc gcagcttcgg 840

tgagcgtttg ggtcagggtg aatccctgga gaaggctcgc gaggcaacca atggtcaggt 900

tgcggagggt gttatttcct cgcagtcgat ttttgatctt gccaccaagc ttggcgtgga 960

gatgccaatc acccaggctg tctacggtgt gtgccaccgg gatatgaaag taactgacat 1020

gattgtggct ctcatgggca ggtctaagaa ggctgagtag taaatcgact actcacatag 1080

<210> 9

<211> 783

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ggtctaagaa ggctgagtag taaatcgact actcacatag ggtcgggcta gtcattctga 60

tcagcgaatt ccacgttcac atcgccaatt ccagagttca caaccagatt cagcattgga 120

ccttctagat cagcattgtg ggcggtgaga tctccaacat cacagcgcgc tgtgcccaca 180

ccggcggtac aacttaggct cacgggcaca tcatcgggca gggtgaccat gacttcgccg 240

atccctgagg tgatttggat gttttgttcc tgatccaatt gggtgaggtg gctgaaatcg 300

aggttcattt cacccacgcc agaggtgtag ctgctgagga gttcatcgtt ggtggggatg 360

agattgacat cgccgattcc agggtcgtct tcaaagtaga tgggatcgat atttgaaata 420

aacaggcctg cgagggcgct catgacaact ccggtaccaa ctacaccgcc gacaatccat 480

ggccacacat ggcgcttttt ctgaggcttt tgtggaggga cttgtacatc ccaggtgttg 540

tattggtttt gggcaagtgg atcccaatga ggcgcttcgg gggtttgttg cgcgaagggt 600

gcatagtagc cctcaacggg ggtgatagtg cttagatctg gttggggttg tgggtagaga 660

tcttcgtttt tcatggtggc atcctcagaa acagtgaatt cagtggtgag tagtccgcgg 720

ggtggaagtg gttgtttctt atgcagggta ccgagctcga attcgtaatc atggtcatag 780

ctg 783

<210> 10

<211> 1380

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

gtccgctctg ttggtgttca aggcgatggc cgcacctacg gacacccaat cgtgctgcgc 60

ccagtgtctt ccgaagacgc catgacggct gactggactc gacttccata cgaggttctg 120

gagaagatct ccacccgcat caccaacgaa gttccagatg tgaaccgcgt ggttttggac 180

gtaacctcca agccaccagg aaccatcgaa tgggagtagg ccttaaatga gccttcgtta 240

agcggcaatc accttattgg agattgtcgc ttttcccatt tctccgggtt ttctggaact 300

ttttgggcgt atgctgggaa tgattctatt attgccaaat cagaaagcag gagagacccg 360

atgagcgaaa tcctagaaac ctattgggca ccccactttg gaaaaaccga agaagccaca 420

gcactcgttt catacctggc acaagcttcc ggcgatccca ttgaggttca caccctgttc 480

ggggatttag gtttagacgg actctcggga aactacaccg acactgagat tgacggctac 540

ggcgacgcat tcctgctggt tgcagcgcta tccgtgttga tggctgaaaa caaagcaaca 600

ggtggcgtga atctgggtga gcttggggga gctgataaat cgatccggct gcatgttgaa 660

tccaaggaga acacccaaat caacaccgca ttgaagtatt ttgcgctctc cccagaagac 720

cacgcagcag cagatcgctt cgatgaggat gacctgtctg agcttgccaa cttgagtgaa 780

gagctgcgcg gacagctgga ctaattgtct cccatttaag gagtccgatt cctgagacgg 840

ttaaatatcg ttttcgaaag gtgggtttcg cgtggtttct gtaagcgtga tgggtgcagg 900

ttcctgggga accacgttgg ccaaggtctt ctctgatgct ggcaacgctg tgacgttgtg 960

ggcgaggcgg gaagagttgg caagcaccat ccgtgacagc catgaaaacc gtgattatct 1020

tccggggatt acgttgccgg agtcgctgca ggtcacatca tcggcaacgg aggctttaga 1080

gggcgcagcc attgtggtgt tggcgattcc ttcgcaggcg ttgcgtggca atttggcgga 1140

gtggaaagag acgatcccgc aggatgcgac cttggtgtcc ttggctaaag gtattgaaaa 1200

gggcacgcac ctgcggatga gtgaagtgat cgcggaggtg acggaagcgg atccttcacg 1260

catcgcggtg ttgtcggggc caaaccttgc tcgtgagatc gcggaggggc agcctgcagc 1320

tacggtgatt gcttgccctg atgaaaaccg agcgaaactt gtgcaggctg cagtggctgc 1380

<210> 11

<211> 1420

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

acggaagcgg atccttcacg catcgcggtg ttgtcggggc caaaccttgc tcgtgagatc 60

gcggaggggc agcctgcagc tacggtgatt gcttgccctg atgaaaaccg agcgaaactt 120

gtgcaggctg cagtggctgc gccgtatttc cgcccgtaca ccaacactga tgtggtgggc 180

accgaaatcg gtggtgcgtg taagaacgtc atcgcgctgg cctgtggtat ttcccacggt 240

tacggcctgg gtgagaacac caatgcatcg ttgattactc gtggccttgc agagatcgca 300

cgcctcggtg ccacattggg tgcggatgcg aagacttttt ctggccttgc gggaatgggc 360

gacttggtgg ctacgtgttc atcaccgctg tcgcgtaacc gcagcttcgg tgagcgtttg 420

ggtcagggtg aatccctgga gaaggctcgc gaggcaacca atggtcaggt tgcggagggt 480

gttatttcct cgcagtcgat ttttgatctt gccaccaagc ttggcgtgga gatgccaatc 540

acccaggctg tctacggtgt gtgccaccgg gatatgaaag taactgacat gattgtggct 600

ctcatgggca ggtctaagaa ggctgagtag taaatcgact actcacatag ggtcgggcta 660

gtcattctga tcagcgaatt ccacgttcac atcgccaatt ccagagttca caaccagatt 720

cagcattgga ccttctagat cagcattgtg ggcggtgaga tctccaacat cacagcgcgc 780

tgtgcccaca ccggcggtac aacttaggct cacgggcaca tcatcgggca gggtgaccat 840

gacttcgccg atccctgagg tgatttggat gttttgttcc tgatccaatt gggtgaggtg 900

gctgaaatcg aggttcattt cacccacgcc agaggtgtag ctgctgagga gttcatcgtt 960

ggtggggatg agattgacat cgccgattcc agggtcgtct tcaaagtaga tgggatcgat 1020

atttgaaata aacaggcctg cgagggcgct catgacaact ccggtaccaa ctacaccgcc 1080

gacaatccat ggccacacat ggcgcttttt ctgaggcttt tgtggaggga cttgtacatc 1140

ccaggtgttg tattggtttt gggcaagtgg atcccaatga ggcgcttcgg gggtttgttg 1200

cgcgaagggt gcatagtagc cctcaacggg ggtgatagtg cttagatctg gttggggttg 1260

tgggtagaga tcttcgtttt tcatggtggc atcctcagaa acagtgaatt cagtggtgag 1320

tagtccgcgg ggtggaagtg gttgtttctt atgcaacgcc caccacatgg ctaaaaggca 1380

aaggtaagta atggctgctg ctgggccgaa tattcctcca 1420

<210> 12

<211> 1110

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atcccccctg agacggttaa atatcgtttt 60

cgaaaggtgg gtttcgcgtg gtttctgtaa gcgtgatggg tgcaggttcc tggggaacca 120

cgttggccaa ggtcttctct gatgctggca acgctgtgac gttgtgggcg aggcgggaag 180

agttggcaag caccatccgt gacagccatg aaaaccgtga ttatcttccg gggattacgt 240

tgccggagtc gctgcaggtc acatcatcgg caacggaggc tttagagggc gcagccattg 300

tggtgttggc gattccttcg caggcgttgc gtggcaattt ggcggagtgg aaagagacga 360

tcccgcagga tgcgaccttg gtgtccttgg ctaaaggtat tgaaaagggc acgcacctgc 420

ggatgagtga agtgatcgcg gaggtgacgg aagcggatcc ttcacgcatc gcggtgttgt 480

cggggccaaa ccttgctcgt gagatcgcgg aggggcagcc tgcagctacg gtgattgctt 540

gccctgatga aaaccgagcg aaacttgtgc aggctgcagt ggctgcgccg tatttccgcc 600

cgtacaccaa cactgatgtg gtgggcaccg aaatcggtgg tgcgtgtaag aacgtcatcg 660

cgctggcctg tggtatttcc cacggttacg gcctgggtga gaacaccaat gcatcgttga 720

ttactcgtgg ccttgcagag atcgcacgcc tcggtgccac attgggtgcg gatgcgaaga 780

ctttttctgg ccttgcggga atgggcgact tggtggctac gtgttcatca ccgctgtcgc 840

gtaaccgcag cttcggtgag cgtttgggtc agggtgaatc cctggagaag gctcgcgagg 900

caaccaatgg tcaggttgcg gagggtgtta tttcctcgca gtcgattttt gatcttgcca 960

ccaagcttgg cgtggagatg ccaatcaccc aggctgtcta cggtgtgtgc caccgggata 1020

tgaaagtaac tgacatgatt gtggctctca tgggcaggtc taagaaggct gagtaggttt 1080

tggcggatga gagaagattt tcagcctgat 1110

<210> 13

<211> 1110

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atcccccctg agacggttaa atatcgtttt 60

cgaaaggtgg gtttcgcgtg gtttctgtaa gcgtgatggg tgcaggttcc tggggaacca 120

cgttggccaa ggtcttctct gatgctggca acgctgtgac gttgtgggcg aggcgggaag 180

agttggcaag caccatccgt gacagccatg aaaaccgtga ttatcttccg gggattacgt 240

tgccggagtc gctgcaggtc acatcatcgg caacggaggc tttagagggc gcagccattg 300

tggtgttggc gattccttcg caggcgttgc gtggcaattt ggcggagtgg aaagagacga 360

tcccgcagga tgcgaccttg gtgtccttgg ctaaaggtat tgaaaagggc acgcacctgc 420

ggatgagtga agtgatcgcg gaggtgacgg aagcggatcc ttcacgcatc gcggtgttgt 480

cggggccaaa ccttgctcgt gagatcgtgg aggggcagcc tgcagctacg gtgattgctt 540

gccctgatga aaaccgagcg aaacttgtgc aggctgcagt ggctgcgccg tatttccgcc 600

cgtacaccaa cactgatgtg gtgggcaccg aaatcggtgg tgcgtgtaag aacgtcatcg 660

cgctggcctg tggtatttcc cacggttacg gcctgggtga gaacaccaat gcatcgttga 720

ttactcgtgg ccttgcagag atcgcacgcc tcggtgccac attgggtgcg gatgcgaaga 780

ctttttctgg ccttgcggga atgggcgact tggtggctac gtgttcatca ccgctgtcgc 840

gtaaccgcag cttcggtgag cgtttgggtc agggtgaatc cctggagaag gctcgcgagg 900

caaccaatgg tcaggttgcg gagggtgtta tttcctcgca gtcgattttt gatcttgcca 960

ccaagcttgg cgtggagatg ccaatcaccc aggctgtcta cggtgtgtgc caccgggata 1020

tgaaagtaac tgacatgatt gtggctctca tgggcaggtc taagaaggct gagtaggttt 1080

tggcggatga gagaagattt tcagcctgat 1110

<210> 14

<211> 1393

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggcag tccagtagta gaccactttg 60

gttcggtcga gcacagggta agtaaccttg ccgatcagct tgcccagacg gatgtcgtag 120

ccagtttctt caaggatttc acgggccgcg gtggtcggaa tagactcgcc gggatcgact 180

ttgcccttgg ccagggacca gtcatcatag tgcgggcggt ggatgacagc gacctcgatg 240

ctgtccaggt tggtgatgtc gccgcgccac agtactgcac ctgctgcaag agttgggcgg 300

gtgaattcct cagtgggacg cgccgggatc tgttgcaggc gaccgttgat cagcatggct 360

gaatcttggt ctttgtccac ctcatgaggc ttattgttct tatttgccat tgggtgcgat 420

tcacctttcg cgttgtggtg cacacagttc ttggtagaaa ccagattaaa aacgcgcaca 480

taagtgaatg aaaaactact tctatctatt gttcaccagc gacccgctca ttgcacattc 540

tggactcggc gtgtggcgac atttttggat gattcctggc aaattctggg cagcagcggc 600

aggtttccag gaggtttcca tgcgggtggc ttgggacata ggctaacctg agacggttaa 660

atatcgtttt cgaaaggtgg gtttcgcgtg gtttctgtaa gcgtgtctta ggttgtaagc 720

ttcaatgctg tgagcaactc taattccgga aaagtccgcg tcgcagtcgt ttatggtggt 780

cgcagttctg agcactccgt ctcctgcgtc tccgctggtg ccatcatggc ccatcttgat 840

cctgagaagt acgatgtgat ccccgtcggc attactgtcg acggtgcgtg ggttgttggt 900

gaaaccgatc cgcagaagct aactctcatc gatcgcacta tgcctgaggt ggagcatcgt 960

gaagaagttc gcccaagcct ggatcccgca caccgtggag agttccactt ttccgatggc 1020

agcctgtatg ccaccgctga tgtgattttc cctgtgctgc atggtcgttt tggtgaagac 1080

ggtactgtgc agggtctgtt tgcactgtct gatattccgg tcgttggccc aggtgtgctg 1140

gcctctgctg cgggaatgga caaggaatac actaagaagc tcatggcagc ggaaggcctg 1200

cccgttggcc gtgaggtgat tctacgtgat cgtaccgagc tgaccgaggc agaaaagaac 1260

ctgctgggcc tgcctgtatt tgtgaagcct gcgcgtggtg gctcatcgat tggtatctct 1320

cgtgttactg cgtgggagga ttttaataag gctgtgggta ccgagctcga attcgtaatc 1380

atggtcatag ctg 1393

Claims

1.一种YH66_07020蛋白突变体，所述YH66_07020蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示。

2.与权利要求1所述YH66_07020蛋白突变体相关的生物材料，所述生物材料为如下B1）至B4）中的任一种：

B1）编码权利要求1所述YH66_07020蛋白突变体的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组谷氨酸棒杆菌。

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。

4.权利要求1所述的YH66_07020蛋白突变体或权利要求2或3中B1）至B3）所述的生物材料在如下X1）至X3）中任一种中的应用：

X1）提高谷氨酸棒杆菌中L-精氨酸产量；

X2）构建产L-精氨酸的谷氨酸棒杆菌；

X3）制备L-精氨酸。

5.一种提高谷氨酸棒杆菌中L-精氨酸产量的方法，所述方法为如下M1）或M2）：

所述M1）包括如下步骤：将谷氨酸棒杆菌基因组中编码YH66_07020蛋白的基因替换为编码YH66_07020蛋白突变体的基因，实现谷氨酸棒杆菌中L-精氨酸产量的提高；

所述M2）包括如下步骤：提高谷氨酸棒杆菌中YH66_07020蛋白突变体的含量和/或活性，实现谷氨酸棒杆菌中L-精氨酸产量的提高；

所述YH66_07020蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述YH66_07020蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

6.一种产L-精氨酸的工程菌的构建方法，所述方法为如下N1）或N2）：

所述N1）包括如下步骤：将谷氨酸棒杆菌基因组中编码YH66_07020蛋白的基因替换为编码YH66_07020蛋白突变体的基因，得到所述产L-精氨酸的工程菌；

所述N2）包括如下步骤：提高谷氨酸棒杆菌中YH66_07020蛋白突变体的含量和/或活性，得到所述产L-精氨酸的工程菌；

所述YH66_07020蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述YH66_07020蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

7.根据权利要求6所述方法构建得到的产L-精氨酸的工程菌在制备L-精氨酸中的应用。

8.一种制备L-精氨酸的方法，包括如下步骤：发酵培养根据权利要求6所述方法构建得到的产L-精氨酸的工程菌，得到L-精氨酸。