CN110804617B - 一种kdtA基因改造的重组菌株及其构建方法与应用 - Google Patents
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- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Abstract
本发明公开了一种kdtA基因改造的重组菌株及其构建方法与应用，是对大肠杆菌中的kdtA基因进行点突变形成，突变后的kdtA基因序列如SEQ ID NO:2所示。该重组菌株与未突变的野生型菌株相比，有利于生产高浓度的L‑苏氨酸，且菌株稳定性好，作为L‑苏氨酸生产菌株能够进一步降低生产成本。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种kdtA基因改造的重组菌株及其构建方法与应用。
背景技术
L-苏氨酸是八大必需氨基酸之一，且是人和动物自身不能合成的氨基酸。L-苏氨酸可以强化谷物吸收，调节体内代谢平衡，促进机体生长发育，被广泛应用于饲料、医药及食品工业中。
目前，L-苏氨酸生产主要有化学合成法、蛋白水解法和微生物发酵法，其中微生物发酵法生产成本低、生产强度高、对环境污染小，因而成为目前工业生产L-苏氨酸应用最广泛的方法。多种细菌可用于L-苏氨酸的微生物发酵生产，如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌株。具体实例包括抗氨基酸类似物突变株或甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸等多种营养缺陷型。然而，传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产菌株。因此，运用代谢工程手段构建重组大肠杆菌是生产L-苏氨酸的有效途径。目前，利用表达质粒介导的氨基酸合成途径和竞争途径中关键性酶基因的过表达或弱化是对大肠杆菌进行基因改造的主要手段。但是仍然存在对开发以高产率更经济地生产L-苏氨酸的方法的需要。
发明内容
本发明的第一方面，提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示的野生型kdtA基因编码序列第82位碱基发生突变而形成的序列。
根据本发明，所述突变是指所述位点的碱基/核苷酸发生变化，所述突变方法可以选自诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。
根据本发明，所述突变为SEQ ID NO:1中第82位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)；具体地，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明的第二方面，提供如上所述的多核苷酸序列编码的重组蛋白。
根据本发明的重组蛋白，其包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
本发明的第三方面，提供包括上述多核苷酸序列或重组蛋白的重组载体。
根据本发明的重组载体，是将上述多核苷酸序列导入质粒构建而成；作为一个实施方案，所述质粒为pKOV质粒。具体地，可以将所述多核苷酸序列和所述质粒通过内切酶进行酶切，形成互补的粘性末端，将二者连接构建成重组载体。
本发明的第四方面，提供一种重组菌株，其含有编码序列发生点突变的kdtA基因编码核苷酸序列。
根据本发明的重组菌株，其含有如第一方面所述的多核苷酸序列。
作为本发明的一个实施方案，其含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
作为本发明的一个实施方案，其含有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
根据本发明的重组菌株，是将上述重组载体导入宿主菌株中重组形成；所述宿主菌株没有特别的限定，可以选自本领域已知的保留kdtA基因的产L-苏氨酸菌株，例如选自大肠杆菌中的至少一种。作为本发明的一个实施方案，所述宿主菌株为E.coli K12(W3110)菌株、E.coli CGMCC 7.232菌株。
根据本发明的重组菌株，是以pKOV质粒为载体。
根据本发明的重组菌株，其可以进一步包括或者不包括其他改造。
本发明的第五方面，还提供一种重组菌株的构建方法，包括如下步骤：
改造如SEQ ID NO:1所示的野生型kdtA基因编码区的核苷酸序列，使其第82位碱基发生突变，得到包含突变kdtA编码基因的产L-苏氨酸重组菌株。
根据本发明的构建方法，所述改造包括诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。
根据本发明的构建方法，所述突变是指SEQ ID NO:1中第82位鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)；具体地，所述突变后的多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步地，所述构建方法包括如下步骤：
(1)改造如SEQ ID NO:1所示的野生型kdtA基因开放阅读框区域的核苷酸序列，使其第82位碱基发生突变，得到突变的kdtA基因开放阅读框区域多核苷酸序列；
(2)将所述突变的多核酸序列与质粒连接，构建重组载体；
(3)将所述重组载体导入宿主菌株，得到所述包含点突变的产L-苏氨酸重组菌株。
根据本发明的构建方法，所述步骤(1)包括：点突变的kdtA基因编码区构建，即根据kdtA基因编码序列，合成两对扩增kdtA基因编码区片段的引物，通过PCR定点突变法在野生型kdtA基因编码区(SEQ ID NO:1)中引入点突变，得到点突变的kdtA基因编码区核苷酸序列(SEQ ID NO:2)，记为kdtA(G82A)。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)中，所述引物为：
P1:5'CGGGATCCACCAGTGAACCGCCAACA 3'(划线部分为限制性内切酶酶切位点BamHI)(SEQ ID NO:5)
P2:5'TGCGCGGACGTAAGACTC 3'(SEQ ID NO:6)
P3:5'GAGTCTTACGTCCGCGCA 3'(SEQ ID NO:7)
P4:5'AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTCCCGCACCTTTATTG 3'(划线部分为限制性内切酶酶切位点Not I)(SEQ ID NO:8)
在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)包括：以E.coli K12为模板，分别以引物P1/P2及P3/P4，进行PCR扩增，获得两条含有kdtA基因编码区分离的大小为927bp和695bpDNA片段(kdtA Up和kdtA Down)。将上述两条DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，再以上述两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过重叠PCR扩增(Overlap PCR)，获得kdtAG82A-Up-Down。
在本发明的一个实施方案中，所述kdtAG82A-Up-Down核苷酸序列大小为1622bp。
在本发明的一个实施方案中，所述PCR扩增按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸30s(30个循环)。
在本发明的一个实施方案中，所述重叠PCR扩增按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸60s(30个循环)。
根据本发明的构建方法，所述步骤(2)包括重组载体的构建，将上述kdtA(G82A)-Up-Down片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化，然后将其和pKOⅤ质粒分别用BamH I/Not I双酶切，将酶切后的kdtA(G82A)-Up-Down片段和pKOⅤ质粒经琼脂糖凝胶电泳分离纯化并连接，获得重组载体pKOⅤ-kdtA(G82A)。
根据本发明的构建方法，所述步骤(3)包括重组菌株的构建：将重组载体pKOⅤ-kdtA(G82A)转化宿主菌株，得到重组菌株。
在本发明的一个实施方案中，所述步骤(3)的转化为电转化法；示例性地，所述步骤(3)中，是将重组载体转化至所述宿主菌株。
根据本发明的构建方法，还进一步包括筛选重组菌株的步骤；示例性地，采用氯霉素培养基进行筛选。
本发明的第六方面，本发明还提供如上所述的构建方法所获得的重组菌株。而且，本发明第五方面所述的构建方法可用于构建如第四方面所述的重组菌株。
本发明的第七方面，提供如第四方面或第六方面所述的重组菌株在L-苏氨酸制备中或者提高L-苏氨酸发酵量中的应用。
根据本发明所述的重组菌株在L-苏氨酸制备中的应用，包括采用所述重组菌株进行发酵，制备得到L-苏氨酸。
有益效果
本发明通过对野生型谷氨酸棒状杆菌中kdtA基因编码序列引入点突变，获得重组型菌株，所获得的菌株与未突变的野生型菌株相比，有利于生产高浓度的L-苏氨酸，且菌株稳定性好，作为L-苏氨酸生产菌株能够进一步降低生产成本。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。但本领域技术人员了解，本发明的保护范围不仅限于以下实施例。根据本发明公开的内容，本领域技术人员将认识到在不脱离本发明技术方案所给出的技术特征和范围的情况下，对以上所述实施例做出许多变化和修改都属于本发明的保护范围。
实施例1构建kdtA基因编码区定点突变(G82A)的质粒pKOⅤ-kdtA(G82A)
(对应野生型编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:3中第28位丙氨酸被苏氨酸取代(A28T))
3-脱氧D-甘露糖-氨基磺酸转移酶由kdtA基因编码，在E.coli K12菌株及其衍生菌株(如MG1655等)中，野生型的kdtA基因ORF序列如Genbank登录号为CP032667.1中序列73556-74833所示。依据该序列设计并合成两对扩增kdtA的引物，构建载体用于将出发菌株中kdtA基因编码区序列第82位碱基G变为A。引物设计如下(由上海invitrogen公司合成)：P1:5'CGGGATCCACCAGTGAACCGCCAACA 3'(划线部分为限制性内切酶酶切位点BAMH I)(SEQID NO:5)
P2:5'TGCGCGGACGTAAGACTC 3'(SEQ ID NO:6)
P3:5'GAGTCTTACGTCCGCGCA 3'(SEQ ID NO:7)
P4:5'AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTCCCGCACCTTTATTG 3'(划线部分为限制性内切酶酶切位点NOT I)(SEQ ID NO:8)
构建方法为：以野生型菌株E.coli K12基因组为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4进行PCR扩增，获得含有点突变的、长度分别为927bp和695bp的两条DNA片段(kdtA(G82A)-Up和kdtA(G82A)-Down片段)。PCR按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸30s(30个循环)。将上述两条DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，再以纯化后的两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过Overlap PCR扩增出长度约为1622bp的片段(kdtA(G82A)-Up-Down片段)。Overlap PCR按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸60s(30个循环)。将上述kdtA(G82A)-Up-Down片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化，然后将其和pKOⅤ质粒(购自Addgene公司)分别用BamH I/Not I双酶切，将酶切后的kdtA(G82A)-Up-Down片段和pKOⅤ质粒经琼脂糖凝胶电泳分离纯化并连接，获得载体pKOⅤ-kdtA(G82A)。将载体pKOⅤ-kdtA(G82A)送测序公司进行测序鉴定，测序结果如SEQ ID NO:11，将含有正确的点突变(kdtA(G82A))的载体pKOⅤ-kdtA(G82A)保存备用。
实施例2包含点突变基因kdtA(G82A)的工程菌株的构建
野生型大肠杆菌菌株E.coli K12(W3110)和高产L-苏氨酸的菌株E.coli CGMCC7.232(保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心，China General MicrobiologicalCulture Collection Center)的染色体上均保留了野生型的kdtA基因。将构建好的质粒pKOⅤ-kdtA(G82A)分别转入E.coli K12(W3110)和E.coli CGMCC 7.232，通过等位基因置换，将这两个菌株染色体中的kdtA基因序列第82位碱基G变为A。具体过程为：将质粒pKOⅤ-kdtA(G82A)通过电击转化转入宿主菌感受态细胞后加入0.5mL的SOC液体培养基；在30℃、100rpm的摇床中复苏2h；取100μL培养液涂布于氯霉素含量为34mg/mL的LB固体培养基，30℃培养18h；挑选长出的单克隆菌落，接种于10mL LB液体培养基中，37℃、200rpm培养8h；取100μL培养液涂布于氯霉素含量为34mg/mL的LB固体培养基，42℃培养12h；挑选1-5个单菌落接种于1mL LB液体培养基中，37℃、200rpm培养4h；取100μL培养液涂布于含有10％蔗糖的LB固体培养基，30℃培养24h；挑选单克隆，并一一对应划线于LB固体培养基和氯霉素含量为34mg/mL的LB固体培养基；挑选在LB固体培养基上生长，同时在氯霉素含量为34mg/mL的LB固体培养基不能生长的对应菌株进行PCR扩增鉴定。PCR扩增采用如下引物(上海invitrogen公司合成)：
P5：5'CTTCCCGAAAGCCGATTG 3'(SEQ ID NO:9)
P6：5'ACAAAATATACTTTAATC 3'(SEQ ID NO:10)
上述PCR扩增产物进行SSCP(单链构象多态性，Single-Strand ConformationPolymorphism)电泳，以质粒pKOⅤ-kdtA(G82A)扩增片段为阳性对照，野生型大肠杆菌扩增片段为阴性对照，水作为空白对照。在SSCP电泳中，长度相同而序列排列不同的单链寡核苷酸链在冰浴中形成的空间结构不同，电泳时迁移率也会有所差异。所以，片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致，且与阳性对照片段位置一致的菌株即为等位替换成功的菌株。以等位替换成功的菌株为模板，用引物P5和P6再次通过PCR扩增目的片段，并将目的片段连接到pMD19-T载体，测序。通过测序结果序列比对，kdtA基因编码区序列第82位碱基G变为A的重组子即为改造成功的菌株，测序结果如SEQ ID NO:12。将来自E.coli K12(W3110)的重组子命名为YPThr07，将来自E.coli CGMCC 7.232的重组子命名为YPThr08。
实施例3苏氨酸发酵实验
将E.coli K12(W3110)菌株、E.coli CGMCC 7.232菌株以及突变菌株YPThr07、YPThr08分别接种在25mL表1所述的液体培养基中，于37℃、200rpm培养12h。然后，分别取1mL各菌株的培养物接种在25mL表1所述的液体培养基中，于37℃、200rpm发酵培养36h。通过HPLC测定L-苏氨酸的含量，每株菌做三个平行，计算平均值，检测结果见表2。
表1培养基配方
| 成分 | 配方g/L |
| 葡萄糖 | 40 |
| 硫酸铵 | 12 |
| 磷酸二氢钾 | 0.8 |
| 七水硫酸镁 | 0.8 |
| 七水硫酸亚铁 | 0.01 |
| 一水硫酸锰 | 0.01 |
| 酵母提取物 | 1.5 |
| 碳酸钙 | 0.5 |
| L-甲硫氨酸 | 0.5 |
| 氢氧化钾调节pH值 | pH 7.0 |
表2苏氨酸发酵实验结果
由表2结果所示，无论对于高产还是低产L-苏氨酸的原始菌株，kdtA基因的氨基酸序列第28位丙氨酸被苏氨酸取代后，都有助于L-苏氨酸产量的提高。
序列表
<110> 黑龙江伊品生物科技有限公司
<120> 一种kdtA基因改造的重组菌株及其构建方法与应用
<130> CPCN19410623
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1278
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 1
atgctcgaat tgctttacac cgcccttctc taccttattc agccgctgat ctggatacgg 60
ctctgggtgc gcggacgtaa ggctccggcc tatcgaaaac gctggggtga acgttacggt 120
ttttaccgcc atccgctaaa accaggcggc attatgctgc actccgtctc cgtcggtgaa 180
actctggcgg caatcccgtt ggtgcgcgcg ctgcgtcatc gttatcctga tttaccgatt 240
accgtaacaa ccatgacgcc aaccggttcg gagcgcgtac aatcggcttt cgggaaggat 300
gttcagcacg tttatctgcc gtatgatctg cccgatgcac tcaaccgttt cctgaataaa 360
gtcgacccta aactggtgtt gattatggaa accgaactat ggcctaacct gattgcggcg 420
ctacataaac gtaaaattcc gctggtgatc gctaacgcgc gactctctgc ccgctcggcc 480
gcaggttatg ccaaactggg taaattcgtc cgtcgcttgc tgcgtcgtat tacgctgatt 540
gctgcgcaaa atgaagaaga tggtgcacgt tttgtggcgc tgggcgcaaa aaataatcag 600
gtgaccgtta ccggtagcct gaaattcgat atttctgtaa cgccgcagtt ggctgctaaa 660
gccgtgacgc tgcgccgcca gtgggcacca caccgcccgg tatggattgc caccagcact 720
cacgaaggcg aagagagtgt ggtgatcgcc gcacatcagg cattgttaca gcaattcccg 780
aatttattgc tcatcctggt accccgtcat ccggaacgct tcccggatgc gattaacctt 840
gtccgccagg ctggactaag ctatatcaca cgctcttcag gggaagtccc ctccaccagc 900
acgcaggttg tggttggcga tacgatgggc gagttgatgt tactgtatgg cattgccgat 960
ctcgcctttg ttggcggttc actggttgaa cgtggtgggc ataatccgct ggaagctgcc 1020
gcacacgcta ttccggtatt gatggggccg catactttta actttaaaga catttgcgcg 1080
cggctggagc aggcaagcgg gctgattacc gttaccgatg ccactacgct tgcaaaagag 1140
gtttcctctt tactcaccga cgccgattac cgtagtttct atggccgtca tgccgttgaa 1200
gtactgtatc aaaaccaggg cgcgctacag cgtctgcttc aactgctgga accttacctg 1260
ccaccgaaaa cgcattga 1278
<210> 2
<211> 1278
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgctcgaat tgctttacac cgcccttctc taccttattc agccgctgat ctggatacgg 60
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ttttaccgcc atccgctaaa accaggcggc attatgctgc actccgtctc cgtcggtgaa 180
actctggcgg caatcccgtt ggtgcgcgcg ctgcgtcatc gttatcctga tttaccgatt 240
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gttcagcacg tttatctgcc gtatgatctg cccgatgcac tcaaccgttt cctgaataaa 360
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gtgaccgtta ccggtagcct gaaattcgat atttctgtaa cgccgcagtt ggctgctaaa 660
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cacgaaggcg aagagagtgt ggtgatcgcc gcacatcagg cattgttaca gcaattcccg 780
aatttattgc tcatcctggt accccgtcat ccggaacgct tcccggatgc gattaacctt 840
gtccgccagg ctggactaag ctatatcaca cgctcttcag gggaagtccc ctccaccagc 900
acgcaggttg tggttggcga tacgatgggc gagttgatgt tactgtatgg cattgccgat 960
ctcgcctttg ttggcggttc actggttgaa cgtggtgggc ataatccgct ggaagctgcc 1020
gcacacgcta ttccggtatt gatggggccg catactttta actttaaaga catttgcgcg 1080
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gtttcctctt tactcaccga cgccgattac cgtagtttct atggccgtca tgccgttgaa 1200
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ccaccgaaaa cgcattga 1278
<210> 3
<211> 425
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 3
Met Leu Glu Leu Leu Tyr Thr Ala Leu Leu Tyr Leu Ile Gln Pro Leu
1 5 10 15
Ile Trp Ile Arg Leu Trp Val Arg Gly Arg Lys Ala Pro Ala Tyr Arg
20 25 30
Lys Arg Trp Gly Glu Arg Tyr Gly Phe Tyr Arg His Pro Leu Lys Pro
35 40 45
Gly Gly Ile Met Leu His Ser Val Ser Val Gly Glu Thr Leu Ala Ala
50 55 60
Ile Pro Leu Val Arg Ala Leu Arg His Arg Tyr Pro Asp Leu Pro Ile
65 70 75 80
Thr Val Thr Thr Met Thr Pro Thr Gly Ser Glu Arg Val Gln Ser Ala
85 90 95
Phe Gly Lys Asp Val Gln His Val Tyr Leu Pro Tyr Asp Leu Pro Asp
100 105 110
Ala Leu Asn Arg Phe Leu Asn Lys Val Asp Pro Lys Leu Val Leu Ile
115 120 125
Met Glu Thr Glu Leu Trp Pro Asn Leu Ile Ala Ala Leu His Lys Arg
130 135 140
Lys Ile Pro Leu Val Ile Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Arg Ser Ala
145 150 155 160
Ala Gly Tyr Ala Lys Leu Gly Lys Phe Val Arg Arg Leu Leu Arg Arg
165 170 175
Ile Thr Leu Ile Ala Ala Gln Asn Glu Glu Asp Gly Ala Arg Phe Val
180 185 190
Ala Leu Gly Ala Lys Asn Asn Gln Val Thr Val Thr Gly Ser Leu Lys
195 200 205
Phe Asp Ile Ser Val Thr Pro Gln Leu Ala Ala Lys Ala Val Thr Leu
210 215 220
Arg Arg Gln Trp Ala Pro His Arg Pro Val Trp Ile Ala Thr Ser Thr
225 230 235 240
His Glu Gly Glu Glu Ser Val Val Ile Ala Ala His Gln Ala Leu Leu
245 250 255
Gln Gln Phe Pro Asn Leu Leu Leu Ile Leu Val Pro Arg His Pro Glu
260 265 270
Arg Phe Pro Asp Ala Ile Asn Leu Val Arg Gln Ala Gly Leu Ser Tyr
275 280 285
Ile Thr Arg Ser Ser Gly Glu Val Pro Ser Thr Ser Thr Gln Val Val
290 295 300
Val Gly Asp Thr Met Gly Glu Leu Met Leu Leu Tyr Gly Ile Ala Asp
305 310 315 320
Leu Ala Phe Val Gly Gly Ser Leu Val Glu Arg Gly Gly His Asn Pro
325 330 335
Leu Glu Ala Ala Ala His Ala Ile Pro Val Leu Met Gly Pro His Thr
340 345 350
Phe Asn Phe Lys Asp Ile Cys Ala Arg Leu Glu Gln Ala Ser Gly Leu
355 360 365
Ile Thr Val Thr Asp Ala Thr Thr Leu Ala Lys Glu Val Ser Ser Leu
370 375 380
Leu Thr Asp Ala Asp Tyr Arg Ser Phe Tyr Gly Arg His Ala Val Glu
385 390 395 400
Val Leu Tyr Gln Asn Gln Gly Ala Leu Gln Arg Leu Leu Gln Leu Leu
405 410 415
Glu Pro Tyr Leu Pro Pro Lys Thr His
420 425
<210> 4
<211> 425
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Leu Glu Leu Leu Tyr Thr Ala Leu Leu Tyr Leu Ile Gln Pro Leu
1 5 10 15
Ile Trp Ile Arg Leu Trp Val Arg Gly Arg Lys Thr Pro Ala Tyr Arg
20 25 30
Lys Arg Trp Gly Glu Arg Tyr Gly Phe Tyr Arg His Pro Leu Lys Pro
35 40 45
Gly Gly Ile Met Leu His Ser Val Ser Val Gly Glu Thr Leu Ala Ala
50 55 60
Ile Pro Leu Val Arg Ala Leu Arg His Arg Tyr Pro Asp Leu Pro Ile
65 70 75 80
Thr Val Thr Thr Met Thr Pro Thr Gly Ser Glu Arg Val Gln Ser Ala
85 90 95
Phe Gly Lys Asp Val Gln His Val Tyr Leu Pro Tyr Asp Leu Pro Asp
100 105 110
Ala Leu Asn Arg Phe Leu Asn Lys Val Asp Pro Lys Leu Val Leu Ile
115 120 125
Met Glu Thr Glu Leu Trp Pro Asn Leu Ile Ala Ala Leu His Lys Arg
130 135 140
Lys Ile Pro Leu Val Ile Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Arg Ser Ala
145 150 155 160
Ala Gly Tyr Ala Lys Leu Gly Lys Phe Val Arg Arg Leu Leu Arg Arg
165 170 175
Ile Thr Leu Ile Ala Ala Gln Asn Glu Glu Asp Gly Ala Arg Phe Val
180 185 190
Ala Leu Gly Ala Lys Asn Asn Gln Val Thr Val Thr Gly Ser Leu Lys
195 200 205
Phe Asp Ile Ser Val Thr Pro Gln Leu Ala Ala Lys Ala Val Thr Leu
210 215 220
Arg Arg Gln Trp Ala Pro His Arg Pro Val Trp Ile Ala Thr Ser Thr
225 230 235 240
His Glu Gly Glu Glu Ser Val Val Ile Ala Ala His Gln Ala Leu Leu
245 250 255
Gln Gln Phe Pro Asn Leu Leu Leu Ile Leu Val Pro Arg His Pro Glu
260 265 270
Arg Phe Pro Asp Ala Ile Asn Leu Val Arg Gln Ala Gly Leu Ser Tyr
275 280 285
Ile Thr Arg Ser Ser Gly Glu Val Pro Ser Thr Ser Thr Gln Val Val
290 295 300
Val Gly Asp Thr Met Gly Glu Leu Met Leu Leu Tyr Gly Ile Ala Asp
305 310 315 320
Leu Ala Phe Val Gly Gly Ser Leu Val Glu Arg Gly Gly His Asn Pro
325 330 335
Leu Glu Ala Ala Ala His Ala Ile Pro Val Leu Met Gly Pro His Thr
340 345 350
Phe Asn Phe Lys Asp Ile Cys Ala Arg Leu Glu Gln Ala Ser Gly Leu
355 360 365
Ile Thr Val Thr Asp Ala Thr Thr Leu Ala Lys Glu Val Ser Ser Leu
370 375 380
Leu Thr Asp Ala Asp Tyr Arg Ser Phe Tyr Gly Arg His Ala Val Glu
385 390 395 400
Val Leu Tyr Gln Asn Gln Gly Ala Leu Gln Arg Leu Leu Gln Leu Leu
405 410 415
Glu Pro Tyr Leu Pro Pro Lys Thr His
420 425
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgggatccac cagtgaaccg ccaaca 26
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgcgcggacg taagactc 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gagtcttacg tccgcgca 18
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaggaaaaaa gcggccgctt cccgcacctt tattg 35
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cttcccgaaa gccgattg 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acaaaatata ctttaatc 18
<210> 11
<211> 1596
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
accagtgaac cgccaacaaa ggcgagatcg gcaatgccat acagtaacat caactcgccc 60
atcgtatcgc caaccacaac ctgcgtgctg gtggagggga cttcccctga agagcgtgtg 120
atatagctta gtccagcctg gcggacaagg ttaatcgcat ccgggaagcg ttccggatga 180
cggggtacca ggatgagcaa taaattcggg aattgctgta acaatgcctg atgtgcggcg 240
atcaccacac tctcttcgcc ttcgtgagtg ctggtggcaa tccataccgg gcggtgtggt 300
gcccactggc ggcgcagcgt cacggcttta gcagccaact gcggcgttac agaaatatcg 360
aatttcaggc taccggtaac ggtcacctga ttattttttg cgcccagcgc cacaaaacgt 420
gcaccatctt cttcattttg cgcagcaatc agcgtaatac gacgcagcaa gcgacggacg 480
aatttaccca gtttggcata acctgcggcc gagcgggcag agagtcgcgc gttagcgatc 540
accagcggaa ttttacgttt atgtagcgcc gcaatcaggt taggccatag ttcggtttcc 600
ataatcaaca ccagtttagg gtcgacttta ttcaggaaac ggttgagtgc atcgggcaga 660
tcatacggca gataaacgtg ctgaacatcc ttcccgaaag ccgattgtac gcgctccgaa 720
ccggttggcg tcatggttgt tacggtaatc ggtaaatcag gataacgatg acgcagcgcg 780
cgcaccaacg ggattgccgc cagagtttca ccgacggaga cggagtgcag cataatgccg 840
cctggtttta gcggatggcg gtaaaaaccg taacgttcac cccagcgttt tcgataggcc 900
ggagacttac gtccgcgcac ccagagccgt atccagatca gcggctgaat aaggtagaga 960
agggcggtgt aaagcaattc gagcatagta aatagctgac ttatggatgt gctggggatt 1020
ctatgtattt agctgtggct ttaccattac ttttcccgtt tttgacttaa atagcttcag 1080
tttggtctga tctgccgcta catcttcatt ttttttgtat ttttatgcga ttcattgaaa 1140
ctcggcccca ttttcaaatc tacataggcc gtactgacat tatcgaaatg ctatttttta 1200
tctatttgat ttttatgatt aaagtatatt ttgtgtataa aaatcattcg ggtcggattg 1260
ctgcgaaaga aatgatacac tagcacgtca aagtaagtgc gttatcagta ttcaggtagc 1320
tgttgagcct ggggcggtag cgtgcttttt tctgcttaac ttaaccagac aatcacacaa 1380
aagagtcgct agtggaaaag ccatttcgaa aaatcctggt cataaagatg cgatatcatg 1440
gggatatgtt attaactact cctgtcatca gtacgctcaa gcagaattat cctgatgcaa 1500
aaatcgatat gctgctttat caggacacca tccctatttt gtctgaaaac ccggaaatta 1560
atgcgctcta tgggataagc aataaaggtg cgggaa 1596
<210> 12
<211> 544
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cttcccgaaa gccgattgta cgcgctccga accggttggc gtcatggttg ttacggtaat 60
cggtaaatca ggataacgat gacgcagcgc gcgcaccaac gggattgccg ccagagtttc 120
accgacggag acggagtgca gcataatgcc gcctggtttt agcggatggc ggtaaaaacc 180
gtaacgttca ccccagcgtt ttcgataggc cggagactta cgtccgcgca cccagagccg 240
tatccagatc agcggctgaa taaggtagag aagggcggtg taaagcaatt cgagcatagt 300
aaatagctga cttatggatg tgctggggat tctatgtatt tagctgtggc tttaccatta 360
cttttcccgt ttttgactta aatagcttca gtttggtctg atctgccgct acatcttcat 420
tttttttgta tttttatgcg attcattgaa actcggcccc attttcaaat ctacataggc 480
cgtactgaca ttatcgaaat gctatttttt atctatttga tttttatgat taaagtatat 540
tttg 544
Claims (9)
1.一种多核苷酸序列在发酵制备L-苏氨酸或者提高L-苏氨酸发酵量中的应用，其特征在于，所述多核苷酸序列包括SEQ ID NO:1所示的野生型kdtA基因编码序列第82位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)。
2.权利要求1所述的应用，所述突变后的多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.重组蛋白在发酵制备L-苏氨酸或者提高L-苏氨酸发酵量中的应用，所述重组蛋白由权利要求1的突变后的多核苷酸序列编码。
4.根据权利要求3的应用，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
5.重组载体在发酵制备L-苏氨酸或者提高L-苏氨酸发酵量中的应用，所述重组载体包括如权利要求1所述的突变后的多核苷酸序列。
6.一种重组菌株在发酵制备L-苏氨酸或者提高L-苏氨酸发酵量中的应用，所述重组菌株含有权利要求1的突变后的多核苷酸序列。
7.根据权利要求6的应用，所述重组菌株含有权利要求5所述的重组载体。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，是将所述重组载体导入宿主菌株中重组形成。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述宿主菌株为E.coli K12菌株或者E.coli CGMCC 7.232菌株。
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Denomination of invention: A Recombinant Strain Modified by kdtA Gene and Its Construction Method and Application Effective date of registration: 20220927 Granted publication date: 20200922 Pledgee: Heilongjiang Xinzheng financing guarantee Group Co.,Ltd. Pledgor: Heilongjiang Yipin Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2022230000071 |