CN109844117A

CN109844117A - 产生单磷酰脂质a的细菌和利用细菌产生单磷酰脂质a的方法

Info

Publication number: CN109844117A
Application number: CN201680078202.5A
Authority: CN
Inventors: 郑学淑; 杨恩卿; 黄斗炫
Original assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Current assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Priority date: 2016-01-06
Filing date: 2016-12-16
Publication date: 2019-06-04
Anticipated expiration: 2036-12-16
Also published as: EP3400303A1; US10308945B2; EP3400303B1; US20170191071A1; AU2016385281A1; KR101761348B1; RU2018123741A3; RU2727014C2; JP2019500882A; CN109844117B; WO2017119628A1; KR20170082387A; AU2016385281B2; RU2018123741A; CA3010573A1; EP3400303A4; ES2883256T3; CA3010573C; JP6794453B2

Abstract

提供了产生单磷酰脂质A(MLA)的细菌和产生MLA的方法，所述细菌包括增加编码LpxE多肽的基因的表达的遗传修饰。根据本公开，可以以简单的方式产生MLA而无需酸水解和/或碱水解。

Description

产生单磷酰脂质A的细菌和利用细菌产生单磷酰脂质A的方法

技术领域

一个或更多个实施例涉及产生单磷酰脂质A(MLA)的细菌以及利用该细菌产生MLA的方法。

背景技术

脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌的围绕肽聚糖的外膜的组分之一。LPS是包含脂质A和通过共价键与脂质A结合的多种多糖的分子。在LPS的组分中，脂质A(也被称为内毒素)负责革兰氏阴性菌的毒性。

脂质A是非常有效的免疫系统刺激剂，以皮克每毫升的量激活细胞(例如，单核细胞或巨噬细胞)。脂质A、脂质A的衍生物或脂质A的变体可以用作例如疫苗的组分，诸如佐剂。单磷酰脂质A(MLA)用作佐剂并且用于过敏原特异性免疫治疗和癌症的免疫治疗，或者也用于痴呆的预防和治疗。此外，在MLA中，六酰化单磷酰脂质A(六酰化MLA)、五酰化单磷酰脂质A(五酰化MLA)和3-O-脱酰基-4'-单磷酰脂质A(3D-MLA)在上述用途中有效。脂质A是在革兰氏阴性菌(诸如大肠杆菌)的膜中发现的脂质组分。膜中发现的脂质A与糖结合，诸如2-酮基-3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸(Kdo)。因此，为了获得游离形式的脂质A，应该将其与LPS的其它组分分离。例如，可以从细菌膜提取LPS，在酸存在下对LPS加热以去除Kdo和1-磷酸基团，从而获得脂质A；或者可以通过化学工艺来合成MLA。然而，这些方法的缺点在于它们在工艺步骤中复杂且产量低。

因此，需要开发一种产生MLA及其衍生物的方法，该方法比传统方法简单且不需要酸水解。

发明内容

技术问题

提供一种产生单磷酰脂质A(MLA)的细菌。

提供一种产生MLA的方法。

技术方案

本申请要求于2016年1月6日在韩国知识产权局提交的第10-2016-0001708号韩国专利申请的权益，该韩国专利申请的公开内容通过引用全部包含于此。

这里使用的术语“增加表达”是指某种基因的表达产物(例如，mRNA或细胞中由该基因编码的蛋白质)中可检测到的增加。这里使用的术语“亲本细菌细胞”是指不具有特定遗传修饰的相同类型的细菌细胞。当在遗传修饰中使用野生型细胞时，亲本细菌细胞可以是“野生型”细胞。例如，包括增加基因表达的遗传修饰的细菌可以具有水平比亲本细菌细胞的表达产物高大约5％或更多、大约10％或更多、大约15％或更多、大约20％或更多、大约30％或更多、大约40％或更多、大约50％或更多、大约60％或更多、大约70％或更多、大约80％或更多、大约90％或更多、大约95％或更多或者大约100％或更多的表达产物。细胞中表达产物的增加可以通过本领域已知的任何方法来验证。表达产物的水平可以通过测量诸如mRNA或蛋白质的表达产物的活性或量来确定。

这里使用的术语“减少表达”是指某种基因的表达产物(例如，mRNA或细胞中由该基因编码的蛋白质)中可检测到的减少。这里使用的术语“亲本细菌细胞”是指不具有特定遗传修饰的相同类型的细菌细胞。当在遗传修饰中使用野生型细胞时，亲本细菌细胞可以是“野生型”细胞。例如，包括减少基因表达的遗传修饰的细菌可以具有水平比亲本细菌细胞的表达产物低大约5％或更多、大约10％或更多、大约15％或更多、大约20％或更多、大约30％或更多、大约40％或更多、大约50％或更多、大约60％或更多、大约70％或更多、大约80％或更多、大约90％或更多、大约95％或更多或者大约100％或更多的表达产物。细胞中表达产物的减少可以通过本领域已知的任何方法来验证。表达产物的水平可以通过测量诸如mRNA或蛋白质的表达产物的活性或量来确定。

这里使用的术语“破坏”及其变型等是指由于遗传修饰而导致给定基因的表达降低。破坏可以由参考基因的完全无效表达的基因修饰(在下文中，被称为基因的“失活”)引起。破坏也包括导致基因以减少的水平表达且不完全无效表达(在下文中，被称为基因的“衰减”)的基因修饰。在这个意义上，表达是指基因产物的转录以及活性基因产物的翻译。因此，失活包括基因不被转录或不被翻译以使得基因产物不被表达的情况以及虽然基因被转录和翻译但基因产物不起作用的情况。相似地，衰减包括降低基因的转录和/或翻译的情况以及不降低转录和/或翻译但是基因产物具有较低的活性水平的情况。这里，术语“基因的功能性产物”表示基因产物(例如，蛋白质或酶)具有生化功能或生理功能(例如，酶活性)。基因的破坏包括基因的功能性破坏，其中，与亲本细胞或野生型细胞相比，遗传修饰细胞中的生化功能或生理功能降低或完全无效。

遗传修饰包括：将编码多肽的多核苷酸导入细胞中的修饰；替代、添加(即，插入)或删除亲本细胞的遗传物质的一个或更多个核苷酸的修饰，包括导致亲代细胞遗传物质改变的化学修饰(暴露于化学物质)。遗传修饰包括参照物种的异源修饰或同源修饰。遗传修饰包括用于多肽的编码区的修饰。遗传修饰也包括改变操纵子的基因或功能的表达的非编码调节区的修饰。非编码区包括5'-非编码序列(编码序列的5')和3'-非编码序列(编码序列的3')。

基因的破坏可以通过遗传工程方法来实现，诸如同源重组、定向诱变或定向分子进化。当细胞包括多个相同基因或者2个或更多个旁系同源基因时，一个或更多个基因可以被破坏。例如，遗传修饰可以涉及用包括基因序列的载体使细胞转化，然后培养细胞以引起外源核酸与细胞内源基因的同源重组，从而破坏内源基因。可以通过使用选择性标记来筛选(选择)已经经历了同源重组的细胞。

这里使用的“基因”是指编码特定蛋白质的核酸片段，其可以可选择地包括至少一个调控序列，诸如5'-非编码序列和3'-非编码序列(参照相对于编码序列的位置的3'和5')。

这里使用的核酸或多肽的术语“序列一致性”是指在序列被比对以尽可能彼此匹配之后测量的特定区域上的两个对应序列的核苷酸或氨基酸残基的一致性程度。序列一致性是通过比较特定可比较区域的两个最佳比对的相应序列而测量的值，其中，在可比较区域中，与参考序列相比，可以添加或删除部分序列。在一些实施例中，序列一致性的百分比可以通过如下方法来计算：比较完全可比较区域中的两个最佳比对的相应序列、确定两个序列中氨基酸或核酸相同的位置的数目以获得匹配位置的数量、将匹配位置的数量除以在可比较范围内的所有位置的总数量(即，范围尺寸)、并将结果乘以100以获得序列一致性的百分比。序列一致性的百分比可以通过使用已知的序列比较程序来确定，其示例包括BLASTN和BLASTP(NCBI)、CLC Main Workbench(CLC bio.)、MegAlign^TM(DNASTAR Inc)。

在鉴定可以具有相同或相似功能或活性的不同物种的多肽或多核苷酸时，可以使用序列一致性相似性。例如，相似序列可以具有50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％或更多、或100％的序列一致性。

这里使用的术语“外源”等是指已经导入宿主细胞中的参考分子(例如，核酸)或参考活性。核酸可以以任何合适的方式外源地导入宿主中。例如，可以将核酸导入宿主细胞中并将其插入宿主染色体中，或者可以将核酸作为非染色体遗传物质(诸如表达载体(例如，质粒))导入宿主中，所述表达载体不整合到宿主染色体中。编码蛋白质的核酸应该以可表达的形式导入(即，使得核酸可以被转录和翻译)。外源基因可以包括同源基因(即，与内源基因相同的基因)或异源基因。

一方面提供了产生单磷酰脂质A(MLA)的细菌，所述细菌与亲本细菌细胞相比包括增加编码LpxE多肽的基因的表达的遗传修饰。细菌可以具有增强的产生MLA的能力。细菌可以是遗传工程细菌或重组细菌。

脂质A由具有连接的酰基链的氨基葡萄糖二糖组成，并且通常在每个氨基葡萄糖上包含一个磷酸基团。两个二糖可以通过β(1→6)键连接。酰基链可以直接连接到从氨基葡萄糖二糖的C-2、C-2'、C-3和C-3'位处的羟基残基的组中选择的羟基残基。酰基链可以例如在其C-3位处具有羟基残基，并且另外的酰基链可以连接到位于酰基链中的羟基残基。每个连接的酰基链可以相同或不同。脂质A可以包含2个、3个、4个、5个、6个或7个酰基链。酰基链可以具有8个至30个碳原子。例如，酰基链在长度上可以具有8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或更多、25个或更多、或者30个或更多的碳。大肠杆菌(Escherichia coli)的脂质A部分由六酰化的双-1,4'-磷酸化氨基葡萄糖二糖组成，其在C-2、C-2'、C-3和C3'处具有(R)-3-羟基肉豆蔻基残基。末端氨基葡萄糖部分中的伯(3)-羟基酰基链均与月桂酸和肉豆蔻酸酯化，并且C-6位处的伯羟基通过二聚体3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸(KDO)碳水化合物部分来连接到多糖。脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)的脂质A以对称方式六酰化，而肠杆菌具有不对称的六酰化脂质A。另外，与大肠杆菌的脂肪酸的数量相比，脑膜炎奈瑟菌的脂肪酸的数量少。

MLA是指单磷酰脂质A，其中，仅一个磷酸基结合到氨基葡萄糖二糖的C-1或C-4'位。MLA可以是三酰化的MLA、四酰化的MLA、五酰化的MLA、六酰化的MLA或七酰化的MLA。例如，MLA可以是1-脱磷-脂质A、1-脱磷-五-酰化脂质A、3-O-脱酰基-4'-MLA(3D-MLA)或其组合。在这种情况下，脂质A可以是大肠杆菌的脂质A。3D-MLA也被称为1-脱磷-3-O-脱酰基-脂质A。

MLA可以不包括2-酮基-3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸(Kdo)。Kdo是脂多糖(LPS)的组分。

MLA可以存在于活细菌的膜中，例如，存在于外膜中。

细菌可以包括增加的编码LpxE多肽的基因的拷贝数。细菌可以包括至少一种编码LpxE多肽的外源多核苷酸。

LpxE多肽属于EC3.1.3.-。LpxE属于磷脂磷酸酶家族。LpxE可以包含三联(tripartite)活性位点和六个跨膜螺旋。磷脂磷酸酶是特异性地作用于磷酸单酯键的水解酶，磷脂磷酸酶可以从包含磷酸酯基团的脂质去除磷酸酯基团。LpxE可以是特异性地使1位去磷酸化的磷酸磷酸酶。LpxE多肽可以是从由产液菌(Aquifex)属细菌、螺杆菌(Helicobacter)属细菌、弗朗西斯氏菌(Francisella)属细菌、博代氏杆菌(Bordetella)属细菌、布鲁氏菌(Brucella)属细菌、根瘤菌(Rhizobium)属细菌、中慢生根瘤菌(Mesorhizobium)属细菌、军团杆菌(Legionella)属细菌、土壤杆菌(Agrobacterium)属细菌、绿硫菌(Chlorobium)属细菌、红螺菌(Rhodospirillum)属细菌、磁螺菌(Magnetospirillum)属细菌、绿棒菌(Chlorobaculum)属细菌、暗网菌(Pelodictyon)属细菌、绿假单胞菌(Pseudovibro)属细菌、褐螺菌(Phaeospirillum)属细菌、互营杆菌(Syntrophobacter)属细菌、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)属细菌、卟啉单胞菌(Porphyromonas)属细菌、罗尔斯通氏菌(Ralstonia)属细菌、变性菌(Limnohabitans)属细菌和热脱硫杆菌(Thermodesulfobacterium)属细菌构成的组中选择的细菌的LpxE多肽。产液菌属细菌可以包括风产液菌(Aquifex aeolicus)或嗜火液菌(Aquifex pyrophilus)。产液菌属细菌是嗜热细菌，其在大约85℃至95℃的温度范围下可以生长最好。产液属细菌可以是风产液菌。螺杆菌属细菌可以是幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)。例如，LpxE多肽可以是来源于风产液菌的LpxE多肽(AaLpxE)或来源于幽门螺杆菌的LpxE多肽(HpLpxE)。LpxE多肽可以是对于SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：17的氨基酸序列具有大约99％、大约97％、大约95％、大约90％、大约80％、大约70％、大约60％、大约50％、大约40％、大约30％、大约20％或者大约10％或更多的序列一致性的多肽。LpxE多肽可以由SEQ ID NO：10或SEQ IDNO：16的核酸序列编码；或由包括对于SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：16的核酸序列具有大约99％、大约97％、大约95％、大约90％、大约80％、大约70％、大约60％、大约50％、大约40％、大约30％、大约20％或者大约10％的一致性的多核苷酸编码。

所述细菌与亲本细菌细胞相比还可以包括增加编码LpxL多肽的基因、编码LpxM多肽的基因或其组合的表达的遗传修饰。

细菌可以包括增加的编码LpxL多肽的基因、编码LpxM多肽的基因或其组合的拷贝数。细菌可以包括编码LpxL多肽的外源多核苷酸、编码LpxL多肽的外源多核苷酸或其组合。

LpxL多肽可以属于EC2.3.1.241。LpxL多肽是催化月桂酸酯从月桂酰-酰基载体蛋白(ACP)转移到Kdo₂-脂质IV_A以形成Kdo₂-(月桂酰)-脂质IV_A的脂质A生物合成月桂酰转移酶。LpxL多肽可以是从由埃希氏菌(Escherichia)属细菌、志贺氏菌(Shigella)属细菌、沙门氏菌(Salmonella)属细菌、弯曲杆菌(Campylobacter)属细菌、奈瑟氏菌(Neisseria)属细菌、嗜血杆菌(Haemophilus)属细菌、气单胞菌(Aeromonas)属细菌、弗朗西斯氏菌属细菌、耶尔森氏鼠疫杆菌(Yersinia)属细菌、克雷白氏杆菌(Klebsiella)属细菌、博代氏杆菌属细菌、军团杆菌属细菌、棒状杆菌(Corynebacterium)属细菌、柠檬酸杆菌(Citrobacter)属细菌、衣原体(Chlamydia)属细菌、布鲁氏菌属细菌、假单胞菌(Pseudomonas)属细菌、拟杆菌(Bacteroides)属细菌、普氏菌(Prevotella)属细菌、螺杆菌属细菌、伯克氏菌(Burkholderia)属细菌、卟啉单胞菌、根瘤菌属细菌、中慢生根瘤菌属细菌、沙雷氏菌(Serratia)属细菌、不动杆菌(Acinetobacter)属细菌、希瓦氏菌(Shewanella)属细菌、致病杆菌(Xenorhabdus)属细菌、发光杆菌(Photobacterium)属细菌、溶杆菌(Lysobacter)属细菌、肠杆菌(Enterobacter)属细菌和弧菌(Vibrio)属细菌构成的组中选择的细菌的LpxL多肽。例如，LpxL多肽可以是大肠杆菌的LpxL多肽(EcLpxL)。LpxL多肽可以是包括SEQ IDNO：1的氨基酸序列的多肽；或是对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有大约99％、大约97％、大约95％、大约90％、大约80％、大约70％、大约60％、大约50％、大约40％、大约30％、大约20％或者大约10％或更多的序列一致性的多肽。LpxL多肽可以由SEQ ID NO：2的核酸序列编码；或由对于SEQ ID NO：2的核酸序列具有大约99％、大约97％、大约95％、大约90％、大约80％、大约70％、大约60％、大约50％、大约40％、大约30％、大约20％或者大约10％或更多的序列一致性的多核苷酸编码。

LpxM多肽可以属于EC2.3.1.243。LpxM多肽是催化肉豆蔻酸从肉豆蔻酰基-酰基载体蛋白转移至Kdo₂-月桂酰基-脂质IV_A以形成Kdo₂-脂质A的脂质A生物合成肉豆蔻酰基转移酶。LpxM多肽可以是从由埃希氏菌属细菌、志贺氏菌属细菌、沙门氏菌属细菌、弯曲杆菌属细菌、奈瑟氏菌属细菌、嗜血杆菌属细菌、气单胞菌属细菌、弗朗西斯氏菌属细菌、耶尔森氏鼠疫杆菌属细菌、克雷白氏杆菌属细菌、博代氏杆菌属细菌、军团杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、柠檬酸杆菌属细菌、衣原体属细菌、布鲁氏菌属细菌、假单胞菌属细菌、拟杆菌属细菌、普氏菌属细菌、螺杆菌属细菌、伯克氏菌属细菌、卟啉单胞菌属、根瘤菌属细菌、中慢生根瘤菌属细菌、沙雷氏菌属细菌、不动杆菌属细菌、希瓦氏菌属细菌、致病杆菌属细菌、发光杆菌属细菌、溶杆菌属细菌、肠杆菌属细菌和弧菌属细菌构成的组中选择的细菌的LpxM多肽。例如，LpxM多肽可以是大肠杆菌的LpxM多肽(EcLpxM)。LpxM多肽可以是包括SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽；或是对于SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有大约99％、大约97％、大约95％、大约90％、大约80％、大约70％、大约60％、大约50％、大约40％、大约30％、大约20％或者大约10％或更多的序列一致性的多肽。LpxM多肽可以由SEQ ID NO：6的核酸序列编码；或由对于SEQ ID NO：6的核酸序列具有大约99％、大约97％、大约95％、大约90％、大约80％、大约70％、大约60％、大约50％、大约40％、大约30％、大约20％或者大约10％或更多的序列一致性的多核苷酸编码。

如这里所使用的术语“细菌”是指原核细菌。细菌可以是革兰氏阴性菌。革兰氏阴性菌可以不保留用于革兰氏染色法的结晶紫染色。革兰氏阴性菌的细胞膜由内膜和具有薄肽聚糖层的外膜的双层膜组成。细菌可以从由埃希氏杆菌属细菌、产液菌属细菌、志贺氏菌属细菌、沙门氏菌属细菌、弯曲杆菌属细菌、奈瑟氏菌属细菌、嗜血杆菌属细菌、气单胞菌属细菌、弗朗西斯氏菌属细菌、耶尔森氏鼠疫杆菌属细菌、克雷白氏杆菌属细菌、博代氏杆菌属细菌、军团杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、柠檬酸杆菌属细菌、衣原体属细菌、布鲁氏菌属细菌、假单胞菌属细菌、螺杆菌属细菌、伯克氏菌属细菌、土壤杆菌属细菌、绿硫菌属细菌、红螺菌属细菌、磁螺菌属细菌、绿棒菌属细菌、暗网菌属细菌、绿假单胞菌属细菌、褐螺菌属细菌、互营杆菌属细菌、慢生根瘤菌属细菌、卟啉单胞菌属细菌、根瘤菌属细菌、中慢生根瘤菌属细菌、弧菌属细菌、罗尔斯通氏菌属细菌、变性菌属细菌和热脱硫杆菌属细菌构成的组中选择。细菌可以是例如大肠杆菌。

细菌还可以包括减少编码参与Kdo生物合成途径的多肽的多核苷酸的表达的遗传修饰。参与Kdo生物合成途径的多肽可以是从由KdtA、KdsB、KdsC、KdsA、GutQ、KpsF、KpsU和KdsD多肽构成的组中选择的多肽。KdtA也指WaaA。在细菌中，下列基因可以被破坏：编码KdtA多肽的基因、编码KdsB多肽的基因、编码KdsC多肽的基因、编码KdsA多肽的基因、编码GutQ多肽的基因、编码KpsF多肽的基因、编码KpsU多肽的基因、编码KdsD多肽的基因、它们的组合。在细菌中，下列基因可以被破坏：编码LpxT多肽的基因、编码PagP多肽的基因、编码KdtA多肽的基因、它们的组合。

LpxT多肽可以属于EC2.7.4.29。LpxT多肽可以是内膜蛋白质。LpxT多肽是催化1-磷酸基团从十一异戊烯基焦磷酸转移至脂质A以形成脂质A 1-焦磷酸的磷酸转移酶。LpxT多肽可以是从埃希氏菌属细菌、志贺氏菌属细菌、沙门氏菌属细菌、弯曲杆菌属细菌、奈瑟氏菌属细菌、嗜血杆菌属细菌、气单胞菌属细菌、弗朗西斯氏菌属细菌、耶尔森氏鼠疫杆菌属细菌、克雷白氏杆菌属细菌、博代氏杆菌属细菌、军团杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、柠檬酸杆菌属细菌、衣原体属细菌、布鲁氏菌属细菌、假单胞菌属细菌、螺杆菌属细菌、伯克氏菌属细菌、卟啉单胞菌属、根瘤菌属细菌、中慢生根瘤菌属细菌和弧菌属细菌构成的组中选择的细菌的LpxT多肽。例如，LpxT多肽可以是大肠杆菌的LpxT多肽(EcLpxT)。LpxT多肽可以是包括SEQ ID NO：20的氨基酸序列的多肽；或是对于SEQ ID NO：20的氨基酸序列具有大约99％、大约97％、大约95％、大约90％、大约80％、大约70％、大约60％、大约50％、大约40％、大约30％、大约20％或者大约10％或更多的序列一致性的多肽。LpxT多肽可以由SEQ IDNO：21的核酸序列编码；或由对于SEQ ID NO：21的核酸序列具有大约99％、大约97％、大约95％、大约90％、大约80％、大约70％、大约60％、大约50％、大约40％、大约30％、大约20％或者大约10％或更多的序列一致性的多核苷酸编码。

PagP多肽可以属于EC2.3.1.251。PagP多肽可以是脂质A棕榈酰转移酶，其是生物合成含有棕榈酸酯的七酰化脂质A物质所需的。PagP多肽催化棕榈酸酯链(16:0)从甘油磷脂的sn-1位向脂质A的位置2处的(R)-3-羟基肉豆蔻酸酯链的游离羟基转移。PagP多肽可以是从埃希氏菌属细菌、志贺氏菌属细菌、沙门氏菌属细菌、弯曲杆菌属细菌、奈瑟氏菌属细菌、嗜血杆菌属细菌、气单胞菌属细菌、弗朗西斯氏菌属细菌、耶尔森氏鼠疫杆菌属细菌、克雷白氏杆菌属细菌、博代氏杆菌属细菌、军团杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、柠檬酸杆菌属细菌、衣原体属细菌、布鲁氏菌属细菌、假单胞菌属细菌、螺杆菌属细菌、伯克氏菌属细菌、卟啉单胞菌属、根瘤菌属细菌、中慢生根瘤菌属细菌和弧菌属细菌构成的组中选择的细菌的PagP多肽。例如，PagP多肽可以是大肠杆菌的PagP多肽(EcPagP)。PagP多肽可以是包括SEQ ID NO：26的氨基酸序列的多肽；或是对于SEQ ID NO：26的氨基酸序列具有大约99％、大约97％、大约95％、大约90％、大约80％、大约70％、大约60％、大约50％、大约40％、大约30％、大约20％或者大约10％或更多的序列一致性的多肽。PagP多肽可以由SEQ ID NO：27的核酸序列编码；或由对于SEQ ID NO：27的核酸序列具有大约99％、大约97％、大约95％、大约90％、大约80％、大约70％、大约60％、大约50％、大约40％、大约30％、大约20％或者大约10％或更多的序列一致性的多核苷酸编码。

KdtA多肽可以属于EC2.4.99.12.、EC 2.4.99.13.、EC 2.4.99.14.和/或EC2.4.99.15.。KdtA(或WaaA)多肽可以是催化Kdo转移至脂质IVA的酶。例如，KdtA多肽可以是大肠杆菌的KdtA多肽(EcKdtA)。EcKdtA可以催化两种Kdo转移至脂质IVA。KdtA多肽可以是包括SEQ ID NO：22的氨基酸序列的多肽；或是对于SEQ ID NO：22的氨基酸序列具有大约99％、大约97％、大约95％、大约90％、大约80％、大约70％、大约60％、大约50％、大约40％、大约30％、大约20％或者大约10％或更多的序列一致性的多肽。KdtA多肽可以由SEQ IDNO：23的核酸序列编码；或由对于SEQ ID NO：23的核酸序列具有大约99％、大约97％、大约95％、大约90％、大约80％、大约70％、大约60％、大约50％、大约40％、大约30％、大约20％或者大约10％或更多的序列一致性的多核苷酸编码。

另一方面提供了产生MLA的方法，所述方法包括培养上述的细菌以获得培养物；以及从培养物分离MLA。

所述方法可以包括培养产生单磷酰脂质A(MLA)的细菌，所述细菌与亲本细菌细胞相比包括增加编码LpxE多肽的基因的表达的遗传修饰。

LpxE多肽、MLA和细菌与这里所述的相同。

培养的步骤可以使用本领域已知的方法来执行。培养液的类型、培养温度和培养条件可以是本领域已知的。培养温度可以是例如大约10℃至大约43℃、大约20℃至大约43℃、大约20℃至大约40℃、大约25℃至大约43℃、大约25℃至大约35℃、大约27℃至大约33℃、大约10℃至大约15℃、大约15℃至大约20℃、大约20℃至大约25℃、大约25℃至大约30℃、大约30℃至大约33℃、大约33℃至大约37℃、大约37℃至大约40℃或者大约40℃至大约43℃。可以分批培养、补料分批培养或连续培养细菌。可以在静止或摇动条件下执行培养。培养期可以是例如大约1小时至大约1周、大约3小时至大约6天、大约6小时至大约5天、大约9小时至大约4天、大约12小时至大约3天、大约18小时至大约2天、大约1天或过夜。培养基可以包括抗生素。抗生素的示例可以包括卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素或其组合。

所述方法可以包括从培养物分离MLA。分离的步骤可以包括从细菌细胞分离MLA。分离的步骤可以包括从培养物分离细菌细胞。可以通过使用本领域已知的方法执行从培养物分离细菌细胞的步骤。例如，可以通过离心从培养物分离细菌。可以用缓冲溶液洗涤分离的细菌。

所述方法可以包括从细菌分离MLA。

可以从细菌的脂质分离MLA。分离脂质的方法可以是本领域已知的方法。MLA可以通过物理方法或化学方法获得。物理方法可以是例如反复超声波脉冲或反复冻融。化学方法可以通过使用有机溶剂来萃取。有机溶剂的示例可以包括氯仿、苯酚、石油醚、二氯甲烷、甲醇、己烷、异丙醇、乙酸乙酯、乙腈、乙醇或其组合。萃取脂质的方法的示例可以是Bligh和Dyer脂质提取方法(参见Bligh,E.G.和Dyer,W.J.，Can.J.Biochem.Physiol.，1959，第37卷，第911-917页)。所述方法还可以包括纯化脂质中的MLA。因为所获得的脂质A可以是游离形式(即，不与Kdo部分连接)，所以所述方法可以不包括水解步骤以去除Kdo部分。

MLA可以包括1-脱磷-脂质A、1-脱磷-四-酰化脂质A、1-脱磷-五-酰化脂质A、3D-MLA或其组合。

现在将详细参照实施例，其示例在附图中示出，其中，同样的附图标记始终表示同样的元件。就这一点而言，本实施例可以具有不同的形式，并且不应该被解释为限于这里阐述的描述。因此，下面仅通过参照附图来描述实施例，以解释本说明书的多个方面。如这里所使用的，术语“和/或”包括一个或更多个相关所列项目的任何和所有组合。

附图说明

通过下面结合附图对实施例进行的描述，这些和/或其它方面将变得明显且更易于理解，在附图中：

图1是细菌中的1-脱磷-Kdo₂-脂质A的生物合成途径的示意图；

图2A是产生包括EcLpxL和EcLpxM的PCR产物的方法的示意图；图2B是产生大肠杆菌菌株KHSC003的方法的示意图；

图3A和图3B是示出脂质的薄层色谱(TLC)分析的结果的图像(在图3A中，泳道1：通过对从大肠杆菌W3110提取的LPS进行酸水解获得的脂质，泳道2：通过对从包括pWSK29-FnLpxE的大肠杆菌W3110提取的LPS进行酸水解获得的脂质，泳道3：从包括pBAD33.1的大肠杆菌KHSC003提取的脂质，泳道4：从包括pBAD33.1-AaLpxE的大肠杆菌KHSC003提取的脂质；在图3B中，泳道1：通过对从大肠杆菌W3110提取的LPS进行酸水解获得的脂质，泳道2：从包括pBAD33.1-HpLpxE的大肠杆菌KHSC003提取的脂质，泳道3：从包括pBAD33.1的大肠杆菌KHSC003提取的脂质)；

图4A是示出对转化有pBAD33.1-AaLpxE的大肠杆菌KHSC003的脂质进行基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)MS的分析结果的图；图4B是示出对图4A中检测到的单磷酰脂质A(m/z：1716.36)进行MALDI-TOF MS/MS的分析结果的图；以及

图5是在转化有pBAD33.1-AaLpxE或pBAD33.1-HpLpxE的大肠杆菌KHSC003中产生MLA的工艺的示意图。

具体实施方式

在下文中，将参照示例更详细地描述本公开。然而，这些示例仅用于说明目的，并且本公开不意图受这些示例的限制。

示例1、包括编码大肠杆菌LpxL和大肠杆菌LpxM的多核苷酸的载体的制备

1.1、pWSK29-EcLpxLEcLpxM的制备

为了从大肠杆菌W3110基因组(GenBank登录号NC_000918.1，ATCC)获得编码大肠杆菌LpxL多肽的多核苷酸，使用下面示出的一对引物通过第一聚合酶链式反应(PCR)来扩增编码包括核糖体结合位点(RBS)的EcLpxL多肽(GenBank登录号BAA35852.1，SEQ ID NO：1)的多核苷酸(GenBank登录号AP009048.1(c1118159.1117239，SEQ ID NO：2)(见图2A)。

LpxL正向引物P1：SEQ ID NO：3

LpxL反向引物P2：SEQ ID NO：4

为了从大肠杆菌W3110基因组获得编码大肠杆菌LpxM多肽的多核苷酸，使用下面示出的一对引物通过第二PCR来扩增编码包括RBS的EcLpxM多肽(GenBank登录号BAA15663.1，SEQ ID NO：5)的多核苷酸(GenBank登录号AP009048.1(c1941907.1940936，SEQ ID NO：6)(见图2A)。

LpxM正向引物P3：SEQ ID NO：7

LpxM反向引物P4：SEQ ID NO：8

使用LpxL正向引物P1和LpxM反向引物P4以及从第一PCR获得的EcLpxL多核苷酸和从第二PCR获得的EcLpxM多核苷酸作为模板通过第三PCR来扩增作为EcLpxL多核苷酸和EcLpxM多核苷酸的融合物的EcLpxLEcLpxM多核苷酸。

在T3000热循环仪(Biometra)中使用KOD热启动DNA聚合酶(Novagen)来执行PCR。

使用DokDo-Prep PCR纯化试剂盒(ELPIS)纯化扩增的产物，并将纯化的产物导入pWSK29质粒的XbaI和HindIII限制性位点中(Wang，R.F.和Kushner，S.R.，Gene(1991)，第100卷，第195-199页)。通过电穿孔将克隆的质粒转化到大肠杆菌DH5α中，然后在LB-氨苄青霉素板上对其选择。克隆的质粒被命名为pWSK29-EcLpxLEcLpxM。

1.2、pBAD33.1-AaLpxE的制备

1.2.1、pET21-AaLpxE的制备

为了从风产液菌VF5基因组(GenBank登录号NC_000918.1，ATCC)获得编码风产液菌LpxE(AaLpxE)多肽的多核苷酸，通过使用下面示出的一对引物来扩增编码AaLpxE多肽(GenBank登录号NP_214169.1，SEQ ID NO：9)的多核苷酸(GenBank登录号NC_000918.1:1199317..1199841，SEQ ID NO：10)。

AaLpxE正向引物：SEQ ID NO：11

AaLpxE反向引物：SEQ ID NO：12

如1.1中所述，执行PCR，并纯化扩增的产物。将纯化的产物导入pET21a质粒(Novagen)的NdeI和XhoI限制性内切酶位点中。如1.1中所述，将克隆的质粒转化到大肠杆菌DH5α中并对其进行选择。克隆的质粒被命名为pET21-AaLpxE。

1.2.2、pBAD33.1-AaLpxE的制备

使用1.2.1中制备的pET21-AaLpxE作为模板和下面示出的一对引物来扩增编码AaLpxE的多核苷酸。

AaLpxE正向引物：SEQ ID NO：13

AaLpxE反向引物：SEQ ID NO：14

如1.1所述，执行PCR，并纯化扩增的产物。将纯化的产物在NdeI和HindIII限制性内切酶位点克隆到pBAD33.1中(Chung,H.S.和Raetz,C.R.，Biochemistry(2010)，第49卷(19)，第4126-4137页)。如1.1中所述，将克隆的质粒转化到大肠杆菌中，然后对其进行选择。克隆的质粒被命名为pBAD33.1-AaLpxE作为表达载体。

1.2.3、pBAD33.1-HpLpxE的制备

在作为幽门螺杆菌LpxE(HpLpxE)基因的hp0021中，为了删除HindIII限制性内切酶识别位点序列，通过集成DNA技术(mBiotech，ROK)合成了具有在与17丝氨酸残基对应的位置处的丝氨酸密码子AGC且与17多核苷酸序列(SEQ ID NO：15)的密码子TCG不同的多核苷酸序列(SEQ ID NO：16)。使用合成的DNA作为模板和下面示出的一对引物来扩增编码HpLpxE氨基酸序列(SEQ ID NO：17)的多核苷酸。

正向引物：SEQ ID NO：18

反向引物：SEQ ID NO：19

在T3000热循环仪(Biometra)中使用KOD热启动DNA聚合酶(Novagen)执行PCR。

如1.1所述，执行PCR，纯化扩增的产物。将纯化的产物在XbaI和HindIII限制性内切酶位点克隆到pBAD33.1中(Chung,H.S.和Raetz,C.R.，Biochemistry(2010)，第49卷(19)，第4126-4137页)。如1.1中所述，将克隆的质粒转化到大肠杆菌中，然后对其进行选择。克隆的质粒命名为pBAD33.1-HpLpxE作为表达载体。

示例2、大肠杆菌KHSC003(pWSK29-EcLpxLEcLpxM，kdtA：：kan，ΔlpxT，ΔpagP，W3110)菌株的制备

2.1、从基因组去除lpxT基因的大肠杆菌的制备

如1.1中所述，将pCP20质粒(Kirill A.Datsenko和Barry L.Wanner PNAS(2000)，第97卷，第6640-6645页)转化到卡那霉素基因表达框(kanamycin cassette)插入到编码LpxT多肽(SEQ ID NO：20)的大肠杆菌基因组中的lpxT基因(SEQ ID NO：21)中的大肠杆菌菌株W3110，lpxT：：kan中，然后在LB-氨苄青霉素固体培养基上对其选择。将选择的大肠杆菌接种于LB固体培养基上，并且在42℃的温度下对其进行选择，从而制备从其去除了lpxT和卡那霉素基因表达框的大肠杆菌菌株，即，ΔlpxT，W3110(图2B中的步骤1)。

2.2、从基因组去除pagP和lpxT基因的大肠杆菌的制备

从卡那霉素基因表达框插入到大肠杆菌基因组中的pagP基因中的大肠杆菌菌株(JW0617(pagP：：kan))制备P1病毒(Current Protocols in Molecular Biology(2007)，1.16.1-1.16.24，单元1.16)。将P1病毒转导到2.1中制备的ΔlpxT，W3110中，然后在LB-卡那霉素固体培养基上对其选择，从而制备插入有pagP：：kan代替pagP基因的大肠杆菌菌株，即，ΔlpxT，pagP：：kan，W3110(Current Protocols in Molecular Biology(2007)，1.16.1-1.16.24，单元1.16)(图2B中的步骤2)。

将pCP20质粒(Kirill A.Datsenko和Barry L.Wanner，PNAS(2000)，第97卷，第6640-6645页)转化到ΔlpxT，pagP：：kan，W3110中，然后在LB-氨苄青霉素固体培养基上对其进行选择。将选择的大肠杆菌接种于LB固体培养基上，并且在42℃的温度下对其进行选择，从而制备从其去除了pagP和卡那霉素基因表达框的大肠杆菌菌株，即，ΔlpxT，ΔpagP，W3110(图2B中的步骤3)。

2.3、大肠杆菌pWSK29-EcLpxLEcLpxM，ΔlpxT，ΔpagP，W3110菌株的制备

通过电穿孔将1.1中制备的pWSK29-EcLpxLEcLpxM质粒转化到2.2中制备的ΔlpxT，ΔpagP，W3110中。在LB-氨苄青霉素固体培养基上选择转化的大肠杆菌，从而制备大肠杆菌pWSK29-EcLpxLEcLpxM，ΔlpxT，ΔpagP，W3110菌株(图2B中的步骤4)。

2.4、大肠杆菌KHSC003菌株的制备

从包括pEcKdtA质粒的大肠杆菌(即，HSC1/pEcKdt)(其中，卡那霉素基因表达框插入到大肠杆菌染色体中的编码KdtA多肽(SEQ ID NO：22)的kdtA基因(SEQ ID NO：23)中)(Chung，H.S.和Raetz，C.R.，Biochemistry(2010)，第49(19)卷，第4126-4137页)来制备P1病毒(Current Protocols in Molecular Biology(2007)1.16.1-1.16.24，单元1.16)。将P1病毒转导到2.3中制备的大肠杆菌pWSK29-EcLpxLEcLpxM，ΔlpxT，ΔpagP，W3110菌株中，然后在LB-卡那霉素/氨苄青霉素固体培养基上对其选择(图2B中的步骤5)。选择的大肠杆菌被命名为KHSC003(pWSK29-EcLpxLEcLpxM，ΔlpxT，ΔpagP，kdtA：：kan，W3110)。

示例3、导入了AaLpxE、HpLpxE或FnLpxE的大肠杆菌的脂质的测试

3.1、通过酸水解从转化有pWSK29-FnLpxE的大肠杆菌W3110提取脂质

为了对比实验，制备了转化有pWSK29-FnLpxE的大肠杆菌菌株W3110和未转化有pWSK29-FnLpxE的大肠杆菌菌株W3110。

具体地，制备pWSK29-FnLpxE(Wang,X.、Karbarz,M.J.、McGrath,S.C.、Cotter,R.J.和Raetz,C.R.，J Biol Chem(2004)，第279(47)卷，第49470-49478页)，其扩增编码FnLpxE多肽(gi|118422929|gb|ABK89319.1，Francisella novicida U112脂质A磷酸酶，SEQ ID NO：24)的多核苷酸(gb|CP000439.1|:414941-415660Francisella novicidaU112,SEQ ID NO：25)。通过电穿孔将制备的pWSK29-FnLpxE转化到大肠杆菌菌株W3110中，然后在包含50μg/mL的氨苄青霉素的LB固体培养基上选择转化的大肠杆菌。将选择的菌落接种到包含50μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，然后在37℃下对其培养过夜。将培养液接种到包含50μg/mL的氨苄青霉素的200mL新鲜LB液体培养基中，使得在600nm的波长(OD600)下测得的吸光度为0.06。在37℃下培养稀释的培养液直至OD600达到1.0。然后，将培养液在室温下以4000xg的离心力离心大约20分钟，从而获得培养的大肠杆菌菌株W3110。

将未转化的大肠杆菌菌株W3110接种到新鲜的LB液体培养基中，然后在37℃下对其培养过夜。用200mL的新鲜LB液体培养基稀释培养液，使得OD600为0.06。在37℃下培养稀释的培养液直至OD600达到1.0。然后，将培养液在室温下以4000xg的离心力离心大约20分钟，从而获得培养的大肠杆菌菌株W3110。将获得的大肠杆菌pWSK29-FnLpxE/W3110和W3110均用30mL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，然后用8mL的PBS重悬。向重悬的大肠杆菌加入10mL的氯仿(EMD millipore)和20ml的甲醇(EMD millipore)，然后通过摇动混合物几次在室温下孵育大约1小时。随后，将孵育的混合物在室温下以2500xg的离心力离心大约30分钟。弃去离心后的混合物的上清液，然后用30mL的比例为1:2:0.8(v/v)的氯仿、甲醇和PBS的溶液重悬沉淀。将重悬的混合物在室温下以2500xg的离心力离心大约30分钟，弃去离心后的混合物的上清液。以与上面的方式相同的方式再次洗涤沉淀两次，然后弃去离心后的混合物的上清液。将洗涤后的沉淀用18mL的12.5mM乙酸钠溶液(pH4.5，Sigma-Aldrich)重悬，然后进行声波照射。将声波照射的溶液在100℃的温度下的沸水中密闭加热大约30分钟，然后冷却至室温。向冷却的溶液加入20mL的氯仿(EMD millipore)和20mL的甲醇(EMDmillipore)，然后彼此充分混合，随后在室温下以2500xg的离心力离心大约20分钟。从离心后的混合物分离有机溶剂层，然后将预平衡的有机溶剂层加入到上层水层中以提取有机溶剂层两次。合并有机溶剂层，然后在旋转蒸发器中干燥以获得脂质。将获得的脂质溶解于5mL的比例为4:1(v/v)的氯仿和甲醇的混合物中，然后在水浴中进行声波照射。将声波照射的脂质移至新的试管中，然后将获得的脂质在室温下在氮气下干燥，随后在-80℃下储存。

3.2、从转化有pBDA33.1、pBAD33.1-AaLpxE或pBAD33.1-HpLpxE的大肠杆菌KHSC003提取脂质

将1.2.2中制备的质粒pBAD33.1-AaLpxE或pBAD33.1-HpLpxE转化到2.4中制备的大肠杆菌KHSC003中，然后测试大肠杆菌的膜的脂质。至于阴性对照组，使用载体pBAD33.1转化到其中的大肠杆菌KHSC003。

具体地，通过电穿孔将载体pBAD33.1、1.2.2中制备的pBAD33.1-AaLpxE或1.2.3中制备的pBAD33.1-HpLpxE转化到2.4中制备的大肠杆菌菌株KHSC003中。包含pBAD33.1-AaLpxE的KHSC003菌株已于2016年11月18日之前保藏在作为根据布达佩斯条约的国际保藏机构的韩国生物科学与生物技术研究院(登录号：KCTC13155BP)中。包含pBAD33.1-HpLpxE的KHSC003菌株已于2016年11月18日之前保藏在作为根据布达佩斯条约的国际保藏机构的韩国生物科学与生物技术研究院(登录号：KCTC13156BP)。

将转化的大肠杆菌接种到包含50μg/mL的氨苄青霉素(EMD millipore)和30μg/mL的氯霉素(Sigma-Aldrich)的LB液体培养基中，然后在30℃下培养过夜。将培养液接种到200mL的包含50μg/mL的氨苄青霉素、30μg/mL的氯霉素和1mM的异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG，UBP Bio)的LB液体培养基中，因而稀释培养液，使得OD600为0.06至0.1。培养培养液直至OD600达到0.5至0.6。将培养液在室温下以4000xg的离心力离心大约20分钟，以获得大肠杆菌。用30mL的PBS洗涤获得的大肠杆菌，然后用8mL的PBS重悬。将10mL的氯仿和20mL的甲醇加入到重悬的大肠杆菌中，然后在室温下摇动几次并孵育大约1小时。将孵育的混合物在室温下以2500xg的离心力离心大约30分钟，因此获得其上清液。向获得的上清液中加入10mL的氯仿和10mL的水，然后使该混合物完全混合。然后，将混合物在室温下以2500xg的离心力离心大约20分钟。从离心后的混合物分离有机溶剂层，然后将预平衡的有机溶剂层加入到上层水层中以提取有机溶剂层两次。合并有机溶剂层，然后在旋转蒸发器中干燥以获得脂质。将获得的脂质溶解于5mL的比例为4:1(v/v)的氯仿和甲醇的溶液中，然后在水浴中进行声波照射。将声波照射的脂质移至新的试管中，然后将获得的脂质在室温下在氮气下干燥，随后在-80℃下储存。

3.3、对脂质进行薄层色谱(TLC)分析

为了执行TLC，如3.1或3.2中所述，从200mL的大肠杆菌培养液获得脂质，将获得的脂质总量的三分之一溶解于200μL的比例为4:1(v/v)的氯仿和甲醇的混合物中。随后，在10cm×10cm HPTLC板(EMD Chemicals)上点样5μL至15μL的混合物，并在比例为40:25:4:2(v/v)的氯仿、甲醇、水和氢氧化铵(从30％至20％)的溶剂中对其显色。然后干燥显色的板，通过向其喷涂10％(v/v)的硫酸(在乙醇中)来使其可视化，然后在300℃的热板上使其灼烧。脂质TLC的结果示于图3A和图3B(在图3A中，泳道1：通过对从大肠杆菌W3110提取的LPS进行酸水解获得的脂质，泳道2：通过对从包含pWSK29-FnLpxE的大肠杆菌W3110提取的LPS进行酸水解获得的脂质，泳道3：从包含pBAD33.1的大肠杆菌KHSC003获得的提取的脂质，泳道4：从包含pBAD33.1-AaLpxE的大肠杆菌KHSC003获得的提取的脂质；在图3B中，泳道1：通过对从大肠杆菌W3110提取的LPS进行酸水解获得的脂质，泳道2：从包含pBAD33.1-HpLpxE的大肠杆菌KHSC003获得的提取的脂质，泳道3：从包含pBAD33.1的大肠杆菌KHSC003获得的提取的脂质)中。

如图3A和图3B中所示，从经历酸水解过程的大肠杆菌W3110检测到脂质A(图3A中的泳道1)，并且从经历酸水解过程的包括pWSK29-FnLpxE的大肠杆菌W3110检测到1-脱磷-脂质A(图3A中的泳道2)。此外，检测到从大肠杆菌KHSC003检测到的脂质A(图3A中的泳道3)，并检测到从包括pBAD33.1-AaLpxE或pBAD33.1-HpLpxE的大肠杆菌KHSC003检测到的1-脱磷-脂质A(图3A中的泳道4或图3B中的泳道2)。因此，由于转化有pBAD33.1-AaLpxE或pBAD33.1-HpLpxE的大肠杆菌KHSC003的膜包含1-脱磷-脂质A，所以发现可以获得在膜中包含1-脱磷-脂质A的活的大肠杆菌。转化有pBAD33.1-HplLpxE的大肠杆菌KHSC003(即，pBAD33.1-HplpxE/KHSC003)于2016年11月23日以登录号KCTC13156BP国际地保藏到作为根据布达佩斯条约的国际保藏机构的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)。

3.4、对脂质A和1-脱磷-脂质A进行基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱

用比例为4:1(v/v)的氯仿和甲醇的混合物对如3.2中所述获得的脂质重悬，并将重悬的脂质样品送至韩国基础科学研究院，以请求MALDI-TOF质谱分析。

具体地，使用比例为1:4的10mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸(DHB)溶液(Sigma-Aldrich)和乙腈(Sigma-Aldrich)的混合溶液作为基质。将1μL的基质溶液涂布在样品残端上，并在其上点样1μL的重悬的脂质样品，然后真空干燥。通过使用MALDI-TOF质谱仪(Shimadzu Biotech Axima Resonance)对脂质样品执行MALDI-TOF质谱分析。通过使用mMass软件(http://www.mmass.org/)分析质谱数据。MALDI-TOF MS的分析结果示出在图4A中。MALDI-TOF MS-MS的分析结果示出在图4B中(x轴：质荷比(m/z)，y轴：相对强度(％))。

如图4A和图4B中所示，发现从转化有pBAD33.1-AaLpxE的大肠杆菌KHSC003检测到不包括Kdo的单磷酰脂质A(MLA)，即，1-脱磷-脂质A(实际单位质量：1716.25)。因此，通过在大肠杆菌中EcLpxM、EcLpxL和AaLpxE多肽的表达，发现可以获得在膜中包含1-脱磷-脂质A的活的大肠杆菌。转化有pBAD33.1-AaLpxE的大肠杆菌KHSC003(即，pBAD33.1-AaLpxE/KHSC003)于2016年11月18日以登录号KCTC13155BP国际地保藏到作为根据布达佩斯条约的国际保藏机构的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)。

如上所述，根据一个或更多个方面，当使用产生包括LpxE多肽的单磷酰脂质A(MLA)的细菌和通过使用该细菌产生MLA的方法时，可以以简单的方式产生MLA而不需要酸水解和/或碱水解。

保藏机构名称：韩国典型培养物保藏中心

登录号：KCTC13155BP

保藏日期：2016年11月18日

保藏机构的名称：韩国典型培养物保藏中心

登录号：KCTC13156BP

保藏日期：2016年11月18日

应该理解的是，这里描述的实施例应该仅被认为是描述性的而不是为了限制的目的。在每个实施例中的特征或方面的描述通常应该被认为可用于其它实施例中的其它相似特征或方面。

虽然参照附图已经描述了一个或更多个实施例，但是本领域普通技术人员将理解的是，在不脱离如由权利要求限定的发明构思的精神和范围的情况下，可以在其中进行形式和细节上的各种改变。

序列表

<110> 韩国科学技术研究院

<120> 产生六酰化单磷酰脂质A的细菌和利用细菌产生六酰化单磷酰脂质A的方法

<130> PX052404US

<160> 27

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 306

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 大肠杆菌LpxL多肽

<400> 1

Met Thr Asn Leu Pro Lys Phe Ser Thr Ala Leu Leu His Pro Arg Tyr

1 5 10 15

Trp Leu Thr Trp Leu Gly Ile Gly Val Leu Trp Leu Val Val Gln Leu

20 25 30

Pro Tyr Pro Val Ile Tyr Arg Leu Gly Cys Gly Leu Gly Lys Leu Ala

35 40 45

Leu Arg Phe Met Lys Arg Arg Ala Lys Ile Val His Arg Asn Leu Glu

50 55 60

Leu Cys Phe Pro Glu Met Ser Glu Gln Glu Arg Arg Lys Met Val Val

65 70 75 80

Lys Asn Phe Glu Ser Val Gly Met Gly Leu Met Glu Thr Gly Met Ala

85 90 95

Trp Phe Trp Pro Asp Arg Arg Ile Ala Arg Trp Thr Glu Val Ile Gly

100 105 110

Met Glu His Ile Arg Asp Val Gln Ala Gln Lys Arg Gly Ile Leu Leu

115 120 125

Val Gly Ile His Phe Leu Thr Leu Glu Leu Gly Ala Arg Gln Phe Gly

130 135 140

Met Gln Glu Pro Gly Ile Gly Val Tyr Arg Pro Asn Asp Asn Pro Leu

145 150 155 160

Ile Asp Trp Leu Gln Thr Trp Gly Arg Leu Arg Ser Asn Lys Ser Met

165 170 175

Leu Asp Arg Lys Asp Leu Lys Gly Met Ile Lys Ala Leu Lys Lys Gly

180 185 190

Glu Val Val Trp Tyr Ala Pro Asp His Asp Tyr Gly Pro Arg Ser Ser

195 200 205

Val Phe Val Pro Leu Phe Ala Val Glu Gln Ala Ala Thr Thr Thr Gly

210 215 220

Thr Trp Met Leu Ala Arg Met Ser Gly Ala Cys Leu Val Pro Phe Val

225 230 235 240

Pro Arg Arg Lys Pro Asp Gly Lys Gly Tyr Gln Leu Ile Met Leu Pro

245 250 255

Pro Glu Cys Ser Pro Pro Leu Asp Asp Ala Glu Thr Thr Ala Ala Trp

260 265 270

Met Asn Lys Val Val Glu Lys Cys Ile Met Met Ala Pro Glu Gln Tyr

275 280 285

Met Trp Leu His Arg Arg Phe Lys Thr Arg Pro Glu Gly Val Pro Ser

290 295 300

Arg Tyr

305

<210> 2

<211> 921

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码大肠杆菌LpxL多肽的多核苷酸

<400> 2

atgacgaatc tacccaagtt ctccaccgca ctgcttcatc cgcgttattg gttaacctgg 60

ttgggtattg gcgtactttg gttagtcgtg caattgccct acccggttat ctaccgcctc 120

ggttgtggat taggaaaact ggcgttacgt tttatgaaac gacgcgcaaa aattgtgcat 180

cgcaacctgg aactgtgctt cccggaaatg agcgaacaag aacgccgtaa aatggtggtg 240

aagaatttcg aatccgttgg catgggcctg atggaaaccg gcatggcgtg gttctggccg 300

gaccgccgaa tcgcccgctg gacggaagtg atcggcatgg aacacattcg tgacgtgcag 360

gcgcaaaaac gcggcatcct gttagttggc atccattttc tgacactgga gctgggtgcg 420

cggcagtttg gtatgcagga accgggtatt ggcgtttatc gcccgaacga taatccactg 480

attgactggc tacaaacctg gggccgtttg cgctcaaata aatcgatgct cgaccgcaaa 540

gatttaaaag gcatgattaa agccctgaaa aaaggcgaag tggtctggta cgcaccggat 600

catgattacg gcccgcgctc aagcgttttc gtcccgttgt ttgccgttga gcaggctgcg 660

accacgaccg gaacctggat gctggcacgg atgtccggcg catgtctggt gcccttcgtt 720

ccacgccgta agccagatgg caaagggtat caattgatta tgctgccgcc agagtgttct 780

ccgccactgg atgatgccga aactaccgcc gcgtggatga acaaagtggt cgaaaaatgc 840

atcatgatgg caccagagca gtatatgtgg ttacaccgtc gctttaaaac acgcccggaa 900

ggcgttcctt cacgctatta a 921

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LpxL正向引物P1

<400> 3

cgcagtctag aaaggagata tattgatgac gaatctaccc aagttctc 48

<210> 4

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LpxL反向引物P2

<400> 4

cgctattatt ttttttcgtt tccattggta tatctccttc ttattaatag cgtgaaggaa 60

cgccttc 67

<210> 5

<211> 323

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 大肠杆菌LpxM多肽

<400> 5

Met Glu Thr Lys Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Pro Glu Phe Asp Lys

1 5 10 15

Ser Phe Arg His Pro Arg Tyr Trp Gly Ala Trp Leu Gly Val Ala Ala

20 25 30

Met Ala Gly Ile Ala Leu Thr Pro Pro Lys Phe Arg Asp Pro Ile Leu

35 40 45

Ala Arg Leu Gly Arg Phe Ala Gly Arg Leu Gly Lys Ser Ser Arg Arg

50 55 60

Arg Ala Leu Ile Asn Leu Ser Leu Cys Phe Pro Glu Arg Ser Glu Ala

65 70 75 80

Glu Arg Glu Ala Ile Val Asp Glu Met Phe Ala Thr Ala Pro Gln Ala

85 90 95

Met Ala Met Met Ala Glu Leu Ala Ile Arg Gly Pro Glu Lys Ile Gln

100 105 110

Pro Arg Val Asp Trp Gln Gly Leu Glu Ile Ile Glu Glu Met Arg Arg

115 120 125

Asn Asn Glu Lys Val Ile Phe Leu Val Pro His Gly Trp Ala Val Asp

130 135 140

Ile Pro Ala Met Leu Met Ala Ser Gln Gly Gln Lys Met Ala Ala Met

145 150 155 160

Phe His Asn Gln Gly Asn Pro Val Phe Asp Tyr Val Trp Asn Thr Val

165 170 175

Arg Arg Arg Phe Gly Gly Arg Leu His Ala Arg Asn Asp Gly Ile Lys

180 185 190

Pro Phe Ile Gln Ser Val Arg Gln Gly Tyr Trp Gly Tyr Tyr Leu Pro

195 200 205

Asp Gln Asp His Gly Pro Glu His Ser Glu Phe Val Asp Phe Phe Ala

210 215 220

Thr Tyr Lys Ala Thr Leu Pro Ala Ile Gly Arg Leu Met Lys Val Cys

225 230 235 240

Arg Ala Arg Val Val Pro Leu Phe Pro Ile Tyr Asp Gly Lys Thr His

245 250 255

Arg Leu Thr Ile Gln Val Arg Pro Pro Met Asp Asp Leu Leu Glu Ala

260 265 270

Asp Asp His Thr Ile Ala Arg Arg Met Asn Glu Glu Val Glu Ile Phe

275 280 285

Val Gly Pro Arg Pro Glu Gln Tyr Thr Trp Ile Leu Lys Leu Leu Lys

290 295 300

Thr Arg Lys Pro Gly Glu Ile Gln Pro Tyr Lys Arg Lys Asp Leu Tyr

305 310 315 320

Pro Ile Lys

<210> 6

<211> 972

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码大肠杆菌LpxM多肽的多核苷酸

<400> 6

atggaaacga aaaaaaataa tagcgaatac attcctgagt ttgataaatc ctttcgccac 60

ccgcgctact ggggagcatg gctgggcgta gcagcgatgg cgggtatcgc tttaacgccg 120

ccaaagttcc gtgatcccat tctggcacgg ctgggacgtt ttgccggacg actgggaaaa 180

agctcacgcc gtcgtgcgtt aatcaatctg tcgctctgct ttccagaacg tagtgaagct 240

gaacgcgaag cgattgttga tgagatgttt gccaccgcgc cgcaagcgat ggcaatgatg 300

gctgagttgg caatacgcgg gccggagaaa attcagccgc gcgttgactg gcaagggctg 360

gagatcatcg aagagatgcg gcgtaataac gagaaagtta tctttctggt gccgcacggt 420

tgggccgtcg atattcctgc catgctgatg gcctcgcaag ggcagaaaat ggcagcgatg 480

ttccataatc agggcaaccc ggtttttgat tatgtctgga acacggtgcg tcgtcgcttt 540

ggcggtcgtc tgcatgcgag aaatgacggt attaaaccat tcatccagtc ggtacgtcag 600

gggtactggg gatattattt acccgatcag gatcatggcc cagagcacag cgaatttgtg 660

gatttctttg ccacctataa agcgacgttg cccgcgattg gtcgtttgat gaaagtgtgc 720

cgtgcgcgcg ttgtaccgct gtttccgatt tatgatggca agacgcatcg tctgacgatt 780

caggtgcgcc caccgatgga tgatctgtta gaggcggatg atcatacgat tgcgcggcgg 840

atgaatgaag aagtcgagat ttttgttggt ccgcgaccag aacaatacac ctggatacta 900

aaattgctga aaactcgcaa accgggcgaa atccagccgt ataagcgcaa agatctttat 960

cccatcaaat aa 972

<210> 7

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LpxM正向引物P3

<400> 7

gaaggcgttc cttcacgcta ttaataagaa ggagatatac caatggaaac gaaaaaaaat 60

aatagcg 67

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LpxM反向引物P3

<400> 8

gcagaagctt ttatttgatg ggataaagat ctttgcg 37

<210> 9

<211> 174

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 风产液菌LpxE多肽

<400> 9

Met Val Ile Glu Asp Phe Ala Leu Asn Leu Glu Leu Phe Arg Leu Ile

1 5 10 15

Asn Asn Ala Arg His Pro Leu Leu Asp Val Phe Phe Thr His Phe Ala

20 25 30

Tyr Leu Gly Ser Gly Tyr Val Leu Phe Pro Leu Leu Ile Phe Leu Phe

35 40 45

Ile Phe Arg Lys Glu Lys Val Lys Pro Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu

50 55 60

Glu Thr Val Leu Val Ile Ser Leu Lys Thr Phe Phe Asn Gln Pro Arg

65 70 75 80

Pro Ala Ile Leu Leu Glu Asp Val Asn Leu Leu Phe Pro Leu His Trp

85 90 95

Arg Ser Phe Pro Ser Gly Asp Thr Ala Met Ala Phe Thr Ile Ala Thr

100 105 110

Val Leu Ser His Gly Glu Lys Leu His Ile Lys Ala Ile Leu Phe Leu

115 120 125

Tyr Ala Phe Leu Ile Gly Tyr Glu Arg Ile Tyr Ala Gly Val His Phe

130 135 140

Pro Leu Asp Val Phe Val Gly Ala Leu Ile Gly Ile Ile Cys Gly Ile

145 150 155 160

Ile Ser Leu Lys Tyr Ser Lys Gly Gly Val Tyr Glu Arg Asn

165 170

<210> 10

<211> 525

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码风产液菌LpxE多肽的多核苷酸

<400> 10

atggtaatag aagactttgc tctaaacctt gaactttttc gtttgataaa caatgcgagg 60

catccacttc tggacgtttt ctttactcac tttgcttacc tcggttcggg ctatgtactg 120

tttcctttat taatctttct ttttattttc agaaaggaaa aagtaaagcc tttgatttta 180

gcgataattt tggaaacagt tttagtgatc tctctaaaaa catttttcaa ccagccgaga 240

cctgcaattt tactcgagga tgtaaactta ctttttcctt tacactggcg ttcctttccc 300

tcaggagaca ccgctatggc ttttacgata gcaactgtac tgtcacatgg tgaaaaactc 360

catataaagg caatactctt cttatacgct ttcctaatag ggtatgagag gatttacgcg 420

ggtgttcact ttcctctgga cgtttttgta ggagctctga ttggaattat ttgcggtatt 480

atttctttaa aatattccaa gggaggtgtg tatgagagaa attag 525

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AaLpxE正向引物

<400> 11

gcatgccata tgatggtaat agaagacttt gctctaaac 39

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AaLpxE反向引物

<400> 12

attagcctcg agatttctct catacacacc tccctt 36

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AaLpxE正向引物

<400> 13

taatacgact cactataggg 20

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> AaLpxE反向引物

<400> 14

gcagaagctt ctaatttctc tcatacacac ctccc 35

<210> 15

<211> 573

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 幽门螺杆菌LpxE序列

<400> 15

atgaaaaaat tcttatttaa acaaaaattt tgtgaaagcc tgcccaaaag cttttctaaa 60

actttgttag cgctcagttt gggcttgatt ttattaggca tttttgcgcc tttccctaaa 120

gtccctaaac agcctagcgt gcctttaatg tttcatttca ccgagcatta tgcgcgcttt 180

atccctacga ttttatctgt ggcgattccc ttaatccaaa gagatgcggt agggcttttt 240

caagtcgcta acgcttctat cgctacaacc cttctcacgc acaccaccaa aagagcctta 300

aaccatgtaa caatcaacga tcagcgtttg ggcgagcgcc cttatggagg taatttcaac 360

atgccaagcg ggcattcgtc tatggtgggt ttggcggtgg cgtttttaat gcgccgctat 420

tcttttaaaa aatacttttg gctcttgccc ctagtccctt tgaccatgct cgctcgcatt 480

tatttagaca tgcacaccat tggcgcggtg ctgaccgggc ttggcgttgg aatgttgtgc 540

gtaagccttt ttacaagccc caaaaagcct taa 573

<210> 16

<211> 573

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 突变的幽门螺杆菌LpxE序列(A49T、G50C和C51G)

<400> 16

atgaaaaaat tcttatttaa acaaaaattt tgtgaaagcc tgcccaaatc gttttctaaa 60

actttgttag cgctcagttt gggcttgatt ttattaggca tttttgcgcc tttccctaaa 120

gtccctaaac agcctagcgt gcctttaatg tttcatttca ccgagcatta tgcgcgcttt 180

atccctacga ttttatctgt ggcgattccc ttaatccaaa gagatgcggt agggcttttt 240

caagtcgcta acgcttctat cgctacaacc cttctcacgc acaccaccaa aagagcctta 300

aaccatgtaa caatcaacga tcagcgtttg ggcgagcgcc cttatggagg taatttcaac 360

atgccaagcg ggcattcgtc tatggtgggt ttggcggtgg cgtttttaat gcgccgctat 420

tcttttaaaa aatacttttg gctcttgccc ctagtccctt tgaccatgct cgctcgcatt 480

tatttagaca tgcacaccat tggcgcggtg ctgaccgggc ttggcgttgg aatgttgtgc 540

gtaagccttt ttacaagccc caaaaagcct taa 573

<210> 17

<211> 190

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 幽门螺杆菌LpxE氨基酸序列

<400> 17

Met Lys Lys Phe Leu Phe Lys Gln Lys Phe Cys Glu Ser Leu Pro Lys

1 5 10 15

Ser Phe Ser Lys Thr Leu Leu Ala Leu Ser Leu Gly Leu Ile Leu Leu

20 25 30

Gly Ile Phe Ala Pro Phe Pro Lys Val Pro Lys Gln Pro Ser Val Pro

35 40 45

Leu Met Phe His Phe Thr Glu His Tyr Ala Arg Phe Ile Pro Thr Ile

50 55 60

Leu Ser Val Ala Ile Pro Leu Ile Gln Arg Asp Ala Val Gly Leu Phe

65 70 75 80

Gln Val Ala Asn Ala Ser Ile Ala Thr Thr Leu Leu Thr His Thr Thr

85 90 95

Lys Arg Ala Leu Asn His Val Thr Ile Asn Asp Gln Arg Leu Gly Glu

100 105 110

Arg Pro Tyr Gly Gly Asn Phe Asn Met Pro Ser Gly His Ser Ser Met

115 120 125

Val Gly Leu Ala Val Ala Phe Leu Met Arg Arg Tyr Ser Phe Lys Lys

130 135 140

Tyr Phe Trp Leu Leu Pro Leu Val Pro Leu Thr Met Leu Ala Arg Ile

145 150 155 160

Tyr Leu Asp Met His Thr Ile Gly Ala Val Leu Thr Gly Leu Gly Val

165 170 175

Gly Met Leu Cys Val Ser Leu Phe Thr Ser Pro Lys Lys Pro

180 185 190

<210> 18

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HpLpxE正向引物

<400> 18

gatcctctag aaaggagata tattgatgaa aaaattctta tttaaacaaa aattt 55

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HpLpxE反向引物

<400> 19

agctacaagc ttttaaggct ttttggggc 29

<210> 20

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 大肠杆菌LpxT多肽

<400> 20

Met Ile Lys Asn Leu Pro Gln Ile Val Leu Leu Asn Ile Val Gly Leu

1 5 10 15

Ala Leu Phe Leu Ser Trp Tyr Ile Pro Val Asn His Gly Phe Trp Leu

20 25 30

Pro Ile Asp Ala Asp Ile Phe Tyr Phe Phe Asn Gln Lys Leu Val Glu

35 40 45

Ser Lys Ala Phe Leu Trp Leu Val Ala Leu Thr Asn Asn Arg Ala Phe

50 55 60

Asp Gly Cys Ser Leu Leu Ala Met Gly Met Leu Met Leu Ser Phe Trp

65 70 75 80

Leu Lys Glu Asn Ala Pro Gly Arg Arg Arg Ile Val Ile Ile Gly Leu

85 90 95

Val Met Leu Leu Thr Ala Val Val Leu Asn Gln Leu Gly Gln Ala Leu

100 105 110

Ile Pro Val Lys Arg Ala Ser Pro Thr Leu Thr Phe Thr Asp Ile Asn

115 120 125

Arg Val Ser Glu Leu Leu Ser Val Pro Thr Lys Asp Ala Ser Arg Asp

130 135 140

Ser Phe Pro Gly Asp His Gly Met Met Leu Leu Ile Phe Ser Ala Phe

145 150 155 160

Met Trp Arg Tyr Phe Gly Lys Val Ala Gly Leu Ile Ala Leu Ile Ile

165 170 175

Phe Val Val Phe Ala Phe Pro Arg Val Met Ile Gly Ala His Trp Phe

180 185 190

Thr Asp Ile Ile Val Gly Ser Met Thr Val Ile Leu Ile Gly Leu Pro

195 200 205

Trp Val Leu Leu Thr Pro Leu Ser Asp Arg Leu Ile Thr Phe Phe Asp

210 215 220

Lys Ser Leu Pro Gly Lys Asn Lys His Phe Gln Asn Lys

225 230 235

<210> 21

<211> 714

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码大肠杆菌LpxT多肽的多核苷酸

<400> 21

atgattaaaa atttgccgca aatagtgttg ttgaatattg tcggcctcgc gctgtttctt 60

tcctggtata tccccgttaa tcatggattc tggttgccga ttgatgcgga tattttttat 120

ttctttaatc agaaactggt cgaaagtaag gcctttttgt ggctggttgc attgaccaac 180

aatcgcgcct tcgacggttg ttcactgctg gcgatgggta tgttgatgct gagtttctgg 240

ctgaaagaaa acgcccctgg cagacgacgt atcgtgatta ttggtctggt catgctatta 300

actgcagtgg tattaaacca gctgggtcag gcattaattc ctgtaaaacg ggccagccca 360

acattgactt ttaccgatat taaccgcgtc agcgaactgc tctctgttcc cacgaaagat 420

gcctcacgag atagctttcc cggcgatcac ggcatgatgc tgcttatttt ttcggcattc 480

atgtggcgtt atttcggcaa agttgcaggc cttatcgccc ttattatttt tgtggttttt 540

gcatttccca gagtaatgat tggcgcacac tggtttactg acatcattgt cggttcgatg 600

accgtgatat tgatcggttt gccctgggtg ttgctgacgc cattaagtga tcgattaatc 660

accttttttg acaaatcact accaggaaaa aacaaacatt tccaaaacaa ataa 714

<210> 22

<211> 425

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 大肠杆菌KdtA多肽

<400> 22

Met Leu Glu Leu Leu Tyr Thr Ala Leu Leu Tyr Leu Ile Gln Pro Leu

1 5 10 15

Ile Trp Ile Arg Leu Trp Val Arg Gly Arg Lys Ala Pro Ala Tyr Arg

20 25 30

Lys Arg Trp Gly Glu Arg Tyr Gly Phe Tyr Arg His Pro Leu Lys Pro

35 40 45

Gly Gly Ile Met Leu His Ser Val Ser Val Gly Glu Thr Leu Ala Ala

50 55 60

Ile Pro Leu Val Arg Ala Leu Arg His Arg Tyr Pro Asp Leu Pro Ile

65 70 75 80

Thr Val Thr Thr Met Thr Pro Thr Gly Ser Glu Arg Val Gln Ser Ala

85 90 95

Phe Gly Lys Asp Val Gln His Val Tyr Leu Pro Tyr Asp Leu Pro Asp

100 105 110

Ala Leu Asn Arg Phe Leu Asn Lys Val Asp Pro Lys Leu Val Leu Ile

115 120 125

Met Glu Thr Glu Leu Trp Pro Asn Leu Ile Ala Ala Leu His Lys Arg

130 135 140

Lys Ile Pro Leu Val Ile Ala Asn Ala Arg Leu Ser Ala Arg Ser Ala

145 150 155 160

Ala Gly Tyr Ala Lys Leu Gly Lys Phe Val Arg Arg Leu Leu Arg Arg

165 170 175

Ile Thr Leu Ile Ala Ala Gln Asn Glu Glu Asp Gly Ala Arg Phe Val

180 185 190

Ala Leu Gly Ala Lys Asn Asn Gln Val Thr Val Thr Gly Ser Leu Lys

195 200 205

Phe Asp Ile Ser Val Thr Pro Gln Leu Ala Ala Lys Ala Val Thr Leu

210 215 220

Arg Arg Gln Trp Ala Pro His Arg Pro Val Trp Ile Ala Thr Ser Thr

225 230 235 240

His Glu Gly Glu Glu Ser Val Val Ile Ala Ala His Gln Ala Leu Leu

245 250 255

Gln Gln Phe Pro Asn Leu Leu Leu Ile Leu Val Pro Arg His Pro Glu

260 265 270

Arg Phe Pro Asp Ala Ile Asn Leu Val Arg Gln Ala Gly Leu Ser Tyr

275 280 285

Ile Thr Arg Ser Ser Gly Glu Val Pro Ser Thr Ser Thr Gln Val Val

290 295 300

Val Gly Asp Thr Met Gly Glu Leu Met Leu Leu Tyr Gly Ile Ala Asp

305 310 315 320

Leu Ala Phe Val Gly Gly Ser Leu Val Glu Arg Gly Gly His Asn Pro

325 330 335

Leu Glu Ala Ala Ala His Ala Ile Pro Val Leu Met Gly Pro His Thr

340 345 350

Phe Asn Phe Lys Asp Ile Cys Ala Arg Leu Glu Gln Ala Ser Gly Leu

355 360 365

Ile Thr Val Thr Asp Ala Thr Thr Leu Ala Lys Glu Val Ser Ser Leu

370 375 380

Leu Thr Asp Ala Asp Tyr Arg Ser Phe Tyr Gly Arg His Ala Val Glu

385 390 395 400

Val Leu Tyr Gln Asn Gln Gly Ala Leu Gln Arg Leu Leu Gln Leu Leu

405 410 415

Glu Pro Tyr Leu Pro Pro Lys Thr His

420 425

<210> 23

<211> 1278

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码大肠杆菌KdtA多肽的多核苷酸

<400> 23

atgctcgaat tgctttacac cgcccttctc taccttattc agccgctgat ctggatacgg 60

ctctgggtgc gcggacgtaa ggctccggcc tatcgaaaac gctggggtga acgttacggt 120

ttttaccgcc atccgctaaa accaggcggc attatgctgc actccgtctc cgtcggtgaa 180

actctggcgg caatcccgtt ggtgcgcgcg ctgcgtcatc gttatcctga tttaccgatt 240

accgtaacaa ccatgacgcc aaccggttcg gagcgcgtac aatcggcttt cgggaaggat 300

gttcagcacg tttatctgcc gtatgatctg cccgatgcac tcaaccgttt cctgaataaa 360

gtcgacccta aactggtgtt gattatggaa accgaactat ggcctaacct gattgcggcg 420

ctacataaac gtaaaattcc gctggtgatc gctaacgcgc gactctctgc ccgctcggcc 480

gcaggttatg ccaaactggg taaattcgtc cgtcgcttgc tgcgtcgtat tacgctgatt 540

gctgcgcaaa atgaagaaga tggtgcacgt tttgtggcgc tgggcgcaaa aaataatcag 600

gtgaccgtta ccggtagcct gaaattcgat atttctgtaa cgccgcagtt ggctgctaaa 660

gccgtgacgc tgcgccgcca gtgggcacca caccgcccgg tatggattgc caccagcact 720

cacgaaggcg aagagagtgt ggtgatcgcc gcacatcagg cattgttaca gcaattcccg 780

aatttattgc tcatcctggt accccgtcat ccggaacgct tcccggatgc gattaacctt 840

gtccgccagg ctggactaag ctatatcaca cgctcttcag gggaagtccc ctccaccagc 900

acgcaggttg tggttggcga tacgatgggc gagttgatgt tactgtatgg cattgccgat 960

ctcgcctttg ttggcggttc actggttgaa cgtggtgggc ataatccgct ggaagctgcc 1020

gcacacgcta ttccggtatt gatggggccg catactttta actttaaaga catttgcgcg 1080

cggctggagc aggcaagcgg gctgattacc gttaccgatg ccactacgct tgcaaaagag 1140

gtttcctctt tactcaccga cgccgattac cgtagtttct atggccgtca tgccgttgaa 1200

gtactgtatc aaaaccaggg cgcgctacag cgtctgcttc aactgctgga accttacctg 1260

ccaccgaaaa cgcattga 1278

<210> 24

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 新凶手弗朗西斯菌LpxE多肽

<400> 24

Met Leu Lys Gln Thr Leu Gln Thr Asn Phe Gln Gly Phe Lys Asp Ile

1 5 10 15

Phe Lys Lys Pro Lys Leu His Asn His Lys Leu Pro Arg Tyr Leu Gln

20 25 30

Leu Lys Tyr Thr Phe Ile Pro Leu Leu Ile Leu Val Ile Phe Ala Tyr

35 40 45

Tyr Asn Leu Asp Thr Pro Val Glu Asn Tyr Ile Lys His Ser Met Pro

50 55 60

Asn Ile Val Gly Val Ile Phe Gly Lys Ile Thr Asp Val Gly Lys Ala

65 70 75 80

Glu Tyr Ile Leu Ile Ile Cys Gly Val Ile Val Leu Ala Arg Leu Phe

85 90 95

Thr Asp Ser Gln Lys Leu Ser Ala Asn Thr Arg Ala Met Phe Asp Lys

100 105 110

Val Ser Ala Tyr Ala Gly Phe Ile Leu Ala Thr Val Ala Ile Ser Gly

115 120 125

Ile Leu Gly Gln Ile Leu Lys Met Ile Ile Gly Arg Ala Arg Pro Lys

130 135 140

Phe Phe Leu Glu Tyr Gly Ser His Tyr Phe Gln His Phe His Ala Pro

145 150 155 160

Gly Tyr Asp Phe Ala Ser Met Pro Ser Gly His Ser Ile Thr Val Gly

165 170 175

Ala Met Phe Ile Ala Phe Phe Tyr Ile Phe Pro Lys Leu Arg Tyr Phe

180 185 190

Trp Tyr Leu Leu Ile Val Val Phe Ala Gly Ser Arg Ile Met Val Gly

195 200 205

Ser His Tyr Pro Ser Asp Val Ile Phe Gly Val Ala Phe Gly Cys Tyr

210 215 220

Cys Thr Ala Tyr Ile Tyr Tyr Trp Met Arg Asn Arg Glu Ile Ile

225 230 235

<210> 25

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码新凶手弗朗西斯菌LpxE多肽的多核苷酸

<400> 25

atgctcaaac agacattaca aacaaacttt caaggtttta aagatatttt taaaaaacca 60

aaactacaca atcataaatt gcctagatat ctacagttga aatatacgtt tataccatta 120

ttaattttgg taatttttgc atactataac ttagataccc cagttgagaa ctatatcaag 180

cattctatgc caaatattgt tggtgtaatt tttggtaaaa taactgatgt tggtaaggcc 240

gagtatattt tgataatttg cggtgtgata gtgttagcgc gtttatttac agatagccaa 300

aaattatctg ctaatactag agctatgttt gacaaggtgt cggcatatgc gggttttatc 360

ttagcaactg tagctattag tggtattttg ggacaaatac tcaagatgat aataggtaga 420

gcgcgtccta agtttttctt ggaatatggt tcgcattatt tccaacattt tcatgcacct 480

ggatatgatt ttgcaagtat gccgtcaggg cactcaatca cagttggagc aatgtttata 540

gcattttttt atattttccc taagctaaga tatttttggt atttgctgat agtggtattt 600

gctgggagta gaattatggt tggttcacat tatcctagtg atgtaatttt tggcgttgct 660

tttggttgtt actgtacagc atatatctac tattggatga gaaatagaga gattatttag 720

720

<210> 26

<211> 186

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 大肠杆菌PagP多肽

<400> 26

Met Asn Val Ser Lys Tyr Val Ala Ile Phe Ser Phe Val Phe Ile Gln

1 5 10 15

Leu Ile Ser Val Gly Lys Val Phe Ala Asn Ala Asp Glu Trp Met Thr

20 25 30

Thr Phe Arg Glu Asn Ile Ala Gln Thr Trp Gln Gln Pro Glu His Tyr

35 40 45

Asp Leu Tyr Ile Pro Ala Ile Thr Trp His Ala Arg Phe Ala Tyr Asp

50 55 60

Lys Glu Lys Thr Asp Arg Tyr Asn Glu Arg Pro Trp Gly Gly Gly Phe

65 70 75 80

Gly Leu Ser Arg Trp Asp Glu Lys Gly Asn Trp His Gly Leu Tyr Ala

85 90 95

Met Ala Phe Lys Asp Ser Trp Asn Lys Trp Glu Pro Ile Ala Gly Tyr

100 105 110

Gly Trp Glu Ser Thr Trp Arg Pro Leu Ala Asp Glu Asn Phe His Leu

115 120 125

Gly Leu Gly Phe Thr Ala Gly Val Thr Ala Arg Asp Asn Trp Asn Tyr

130 135 140

Ile Pro Leu Pro Val Leu Leu Pro Leu Ala Ser Val Gly Tyr Gly Pro

145 150 155 160

Val Thr Phe Gln Met Thr Tyr Ile Pro Gly Thr Tyr Asn Asn Gly Asn

165 170 175

Val Tyr Phe Ala Trp Met Arg Phe Gln Phe

180 185

<210> 27

<211> 561

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码大肠杆菌pagP多肽的多核苷酸

<400> 27

atgaacgtga gtaaatatgt cgctatcttt tcctttgttt ttattcagtt aatcagcgtt 60

ggtaaagttt ttgctaacgc agatgagtgg atgacaacgt ttagagaaaa tattgcacaa 120

acctggcaac agcctgaaca ttatgattta tatattcctg ccatcacctg gcatgcacgt 180

ttcgcttacg acaaagaaaa aaccgatcgc tataacgagc gaccgtgggg tggcggtttt 240

ggcctgtcgc gttgggatga aaaaggaaac tggcatggcc tgtatgccat ggcatttaag 300

gactcgtgga acaaatggga accgattgcc ggatacggat gggaaagtac ctggcgaccg 360

ctggcggatg aaaattttca tttaggtctg ggattcaccg ctggcgtaac ggcacgcgat 420

aactggaatt acatccctct cccggttcta ctgccattgg cctccgtggg ttatggccca 480

gtgacttttc agatgaccta cattccgggt acctacaaca atggcaatgt gtactttgcc 540

tggatgcgct ttcagttttg a 561

PCT/RO/134表

Claims

1.一种产生单磷酰脂质A的重组细菌，所述细菌与亲本细菌细胞相比包括增加编码LpxE多肽的基因的表达的遗传修饰。

2.根据权利要求1所述的细菌，其中，所述单磷酰脂质A包括2个酰基链至7个酰基链。

3.根据权利要求1所述的细菌，其中，所述细菌包括至少一种编码LpxE多肽的外源多核苷酸。

4.根据权利要求1所述的细菌，其中，所述单磷酰脂质A包括1-脱磷-脂质A、1-脱磷-四-酰化脂质A、1-脱磷-五-酰化脂质A或其组合。

5.根据权利要求1所述的细菌，所述细菌与亲本细菌细胞相比还包括增加编码LpxL多肽的基因、编码LpxM多肽的基因或其组合的表达的遗传修饰。

6.根据权利要求1所述的细菌，其中，所述细菌包括编码LpxL多肽的外源多核苷酸、编码LpxM多肽的基因或其组合中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的细菌，其中，所述LpxE多肽属于EC 3.1.3.-。

8.根据权利要求1所述的细菌，其中，所述LpxE多肽是对于SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：17的氨基酸序列具有大约90％或更多的序列一致性的多肽。

9.根据权利要求4所述的细菌，其中，所述LpxL多肽属于EC 2.3.1.241，并且所述LpxM多肽属于EC 2.3.1.243。

10.根据权利要求4所述的细菌，其中，所述LpxL多肽是对于SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有大约90％或更多的序列一致性的多肽，并且所述LpxM多肽是对于SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有大约90％或更多的序列一致性的多肽。

11.根据权利要求1所述的细菌，其中，所述细菌是革兰氏阴性菌。

12.根据权利要求1所述的细菌，其中，所述细菌是从由埃希氏菌属细菌、志贺氏菌属细菌、沙门氏菌属细菌、弯曲杆菌属细菌、奈瑟氏菌属细菌、嗜血杆菌属细菌、气单胞菌属细菌、弗朗西斯氏菌属细菌、耶尔森氏鼠疫杆菌属细菌、克雷白氏杆菌属细菌、博代氏杆菌属细菌、军团杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、柠檬酸杆菌属细菌、衣原体属细菌、布鲁氏菌属细菌、假单胞菌属细菌、螺杆菌属细菌、伯克氏菌属细菌、土壤杆菌属细菌、绿硫菌属细菌、红螺菌属细菌、磁螺菌属细菌、绿棒菌属细菌、暗网菌属细菌、绿假单胞菌属细菌、褐螺菌属细菌、互营杆菌属细菌、慢生根瘤菌属细菌、卟啉单胞菌属细菌、根瘤菌属细菌、中慢生根瘤菌属细菌、弧菌属细菌、罗尔斯通氏菌属细菌、变性菌属细菌和热脱硫杆菌属细菌构成的组中选择。

13.根据权利要求1所述的细菌，其中，所述细菌还包括减少编码参与Kdo生物合成途径的多肽的多核苷酸的表达的遗传修饰。

14.根据权利要求13所述的细菌，其中，参与Kdo生物合成途径的多肽是从由KdtA、KdsB、KdsC、KdsA、GutQ、KpsF、KpsU和KdsD构成的组中选择的多肽。

15.根据权利要求1所述的细菌，其中，以下基因中的至少一种被破坏：编码KdtA多肽的基因、编码KdsB多肽的基因、编码KdsC多肽的基因、编码KdsA多肽的基因、编码GutQ多肽的基因、编码KpsF多肽的基因、编码KpsU多肽的基因、编码KdsD多肽的基因或其组合。

16.根据权利要求1所述的细菌，其中，以下基因中的至少一种被破坏：编码LpxT多肽的基因、编码PagP多肽的基因、编码KdtA多肽的基因或其组合。

17.一种产生单磷酰脂质A的方法，所述方法包括：

培养根据权利要求1所述的细菌以获得培养物；以及

从所述培养物分离单磷酰脂质A。

18.根据权利要求17所述的方法，分离的步骤包括从所述细菌细胞分离单磷酰脂质A。

19.根据权利要求17所述的方法，其中，培养的步骤包括分批培养、补料分批培养或连续培养。

20.根据权利要求17所述的方法，其中，所述单磷酰脂质A包括1-脱磷-脂质A、1-脱磷-五-酰化脂质A、1-脱磷-四-酰化脂质A或其组合。