CN104388368A

CN104388368A - 一株低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌突变株及构建方法

Info

Publication number: CN104388368A
Application number: CN201410592119.2A
Authority: CN
Inventors: 孔庆科; 刘琼; 刘青; 赵新新
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2014-10-30
Filing date: 2014-10-30
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2034-10-30
Also published as: CN104388368B

Abstract

本发明公开了一株低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌突变株及构建方法，属于生物工程技术领域。它是通过将细菌基因组上调控类脂A脂肪酸链合成的 msbB 基因以及 pagP 基因通过自杀性质粒以及同源重组的方法敲除，从而减少类脂A的脂肪酸链的数量，达到降低其脂多糖毒性的目的，并且通过外源低拷贝表达质粒表达pagL以及lpxE蛋白，同时去除类脂A的脂肪酸链以及磷酸基团来达到降低菌株内毒素活性的目的。利用上述技术构建的低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌突变株 Escherichiacoli BL21(DE3)S004，保藏号为CCTCCNO.M2014473，保藏时间为2014年10月14日，其产生的脂多糖刺激细胞表现明显的内毒素活性下降，能够为后续用该工程菌表达用于治疗的外源蛋白和靶向药物打下基础。

Description

一株低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌突变株及构建方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一株低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌突变株及构建方法。

背景技术

脂多糖是革兰氏阴性菌细胞膜中大量存在的结构组份，它由疏水的类脂A，短链不重复的核心多糖以及长链的O抗原多糖组成，其中的活性成分类脂A会激活机体TLR4/MD2/CD14通路，刺激肿瘤坏死因子和白介素6等细胞因子的分泌，从而导致免疫炎症反应，过多的免疫炎症反应会引起机体的组织损伤，休克甚至死亡。

大肠杆菌的类脂A包括两个磷酸基团以及六条脂肪酸链，这种结构能够最有效的刺激机体产生免疫炎症反应，同时脂肪酸链的长度，数量以及结合在碳骨架上的位置和1’和4’的磷酸基团都是影响类脂A刺激TLR4/MD2通路以及caspase-11通路的重要影响因子。Park,B.S等发现去除其中一个磷酸集团后能重构TLR4/MD2，降低细胞因子的分泌水平，但毒性还是较强（Nature 2009, 458, 1191–1195）。

大肠杆菌BL21（DE3）以及其衍生物由于其高效率，大产量以及程序简便的特点被大量用于重组蛋白的表达，然而脂多糖（LPS）在纯化过后的重组蛋白中的残留，极大的限制了重组蛋白在人以及其他哺乳动物中的应用，因此在表达纯化出来的重组蛋白中需要最大限度的降低脂多糖的毒性。

而现有技术中，还未出现一种能显著降低脂多糖内毒素活性的方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一株表现低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌Escherichia coli BL21 (DE3) S004突变株。

所述突变株不含与脂肪酸链转移酶合成有关的基因msbB和pagP，同时能表达去除脂肪酸链的酶pagL以及去磷酸基团的酶lpxE。该菌株保藏于武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，分类命名为Escherichia coli BL21 (DE3) S004，保藏号为CCTCC NO.M2014473，保藏时间为2014年10月14日。

所述msbB的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，pagP的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，pagL的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，lpxE的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

所述的低内毒素大肠杆菌BL21（DE3）突变株，它缺失了转移脂肪酸链的关键基因msbB和pagP，同时在菌株内表达去除脂肪酸链的脱酰基转移酶pagL和去除磷酸基团的酶lpxE，从而使突变株类脂A结构变成含有4条脂肪酸链以及一个磷酸基团的结构，能够最大限度的减低其内毒素活性。

本发明的目的之二在于提供一株表现低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌BL21（DE3）突变株的构建方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

（1）通过同源重组的方法，将细菌基因组上调控脂肪酸链转移在类脂A的碳骨架上的酶合成的相关基因msbB以及pagP敲除，得到不含msbB 和pagP的突变菌株；

（2）构建表达表达去除脂肪酸链的酶pagL和去磷酸基团的酶lpxE的低拷贝质粒，并转化入步骤1）所得突变菌株，得到不含msbB和pagP并能表达pagL和lpxE的低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌突变株。

所述步骤1）的同源重组的方法包括如下步骤：

1）构建自杀性质粒pRE112-msbB和pRE112-pagP；

2）将步骤1）所得自杀性质粒转化入λpir大肠杆菌，并与沙门氏菌自然接合，使同源片段导入沙门氏菌基因组，经过第一次交换和Cm⁺抗性筛选，得到阳性克隆；

3）培养阳性克隆，使其发生自发突变产生二次交换，用含有蔗糖的培养基筛选，得到对抗生素敏感而对蔗糖抗性的克隆；

4）通过PCR筛选得到不含msbB和pagP的突变菌株。

所述自杀性质粒pRE112-msbB的构建步骤为：

1）含有msbB基因上下游同源臂的自杀性质粒pRE112-msbB的构建：

根据Genbank公布的来源于大肠杆菌BL21（DE3），Escherichia coli BL21 (DE3)，全基因组序列，序列号为：NC_012892，设计msbB基因的左右同源臂，运用Vecter NTI软件设计下述引物：

msbB left-up：5’CAGTTCGACAATGTGGAAGAAG 3’

msbB left-down: 5’ ACCTGCAGGATGCGGCCGCGG GCCTCTCGCGAGG3’

msbB right-up: 5’ CCGCGGCCGCATCCTGCAGGT GCTTTTCCAGTTTCGG3’

msbB right-down: 5’ GCGTTATATGCACTTGCGC 3’

提取处于对数生长期的大肠杆菌BL21（DE3）基因组DNA作为模板，分别用左右同源臂引物进行扩增，得到其左右同源臂的扩增产物，回收产物进行融合PCR扩增，即用引物msbB left-up以及msbB right-down进行扩增，得到融合好的左右同源臂扩增产物，再用+A反应试剂盒在片段末端进行+A碱基处理，并与用Adh I酶切后得到pRE112酶切产物在T4连接酶的作用下进行连接并转化入λ pir 大肠杆菌受体菌株中，得到重组质粒pRE112-msbB；将重组质粒转化至需要DAP才能生长的λ pir 大肠杆菌中以便进行后续突变株的构建；

2）含有pagP基因上下游同源臂的自杀性质粒pRE112-pagP的构建：

根据Genbank公布的来源于大肠杆菌BL21（DE3），Escherichia coli BL21 (DE3)，全基因组序列，序列号为：NC_012892，设计pagP基因的左右同源臂，运用Vecter NTI软件设计下述引物：

pagP left-up：5’ CCTTGATTGCATTTTGTCAT 3’

pagP left-down: 5’ GTCTCACCCGGGCCTGCAGGTTGTGACCATAAAACATTTA 3’

pagP right-up: 5’ CACAACCTGCAGGCCCGGGTGAGACAAATGAAGTTTTAGT 3’

pagP right-down: 5’ TGCTGCCGTCTTCCGGAGTA 3’

提取处于对数生长期的大肠杆菌BL21（DE3）基因组DNA作为模板，分别用左右同源臂引物进行扩增，得到其左右同源臂的扩增产物，回收产物进行融合PCR扩增，即用引物pagP left-up以及pagP right-down进行扩增，得到融合好的左右同源臂扩增产物，再用+A反应试剂盒在片段末端进行+A碱基处理，并与用Adh 1酶切后得到pRE112酶切产物在T4连接酶的作用下进行连接并转化入受体菌株中，得到重组质粒pRE112-pagP；将重组质粒转化至需要DAP才能生长的λ pir 大肠杆菌中以便进行后续突变株的构建。

重组自杀质粒由于不能在沙门氏菌复制存活，将转入有重组质粒的λpir大肠杆菌菌株与沙门氏菌自然接合，使同源片段导入沙门氏菌基因组，并且通过同源重组，经过第一次交换和抗性筛选（Cm⁺抗性），得到阳性克隆，然后培养阳性克隆，使其发生自发突变产生二次交换，用含有蔗糖的培养基筛选，得到对抗生素敏感而对蔗糖抗性的克隆，最后PCR的方法筛选得到突变菌株。运用同源重组的方法我们构建得到大肠杆菌突变株BL21 (DE3) ∆msbB ∆pagP。

降低大肠杆菌内毒素活性可以通过减少脂肪酸链的数量以及去除磷酸基团来改造类脂A的结构。这里就必须提到一些能够改变脂肪酸链数量的蛋白，包括HtrB (LpxL)， MsbB (LpxM)， PagP 和PagL，LpxR，前面三个蛋白是在类脂A合成途径中与加入脂肪酸链有关的蛋白，后两个蛋白是与去除脂肪酸链有关的蛋白。msbB基因编码类脂A合成途径最后一步将脂肪酸链加上的一个连接酶，它的去除不会影响细菌生长但能够产生低内毒素的脂多糖。PagP能够催化磷酸化的棕榈酸酯链连入碳骨架中，LpxR则是能够去掉类脂A碳骨架3’的脂肪酸链。

所述步骤2）中低拷贝质粒的制备方法包括如下步骤：

1）以质粒pYA4295为模板，运用引物pagPscreenF和pagPscreenR扩增片段pagPU- P_lpp lpxE-pagPD，并+A连接至表达质粒p15a，获得表达去磷酸基团的酶lpxE的低拷贝质粒；

2）对步骤1）所得质粒通过SnaB I处理，并以质粒pYA4291为模板，运用引物lpxRscreenF和lpxRscreenR将片段lpxRU-P_lpp pagL-lpxRD扩增出来，插入至表达去磷酸基团的酶lpxE的低拷贝质粒中，得到表达去除脂肪酸链的酶pagL和去磷酸基团的酶lpxE的低拷贝质粒。

所用引物如下所示：

pagPscreenF：5’ AAACGCCGTTAACCCGATA 3’

pagPscreenR：5’ TAGACACAAATGCTGCTGTGTCG 3’

lpxRscreenF：5’ CAGGGGGTGTCAGTATTTGGCG 3’

lpxRscreenR：5’ CGTGAAGCCAATAATTTCTCGCAC 3’

将所得低拷贝质粒通过电转化的方法转入BL21(DE3) ∆msbB ∆pagP菌株中，利用Cm⁺进行转化后筛选，并用对应引物进行鉴定，鉴定正确的菌株，命名为大肠杆菌原核表达工程菌突变株S004。

改变类脂A的磷酸集团也是一种有效的降低内毒素的策略，与减少脂肪酸链类似，碳骨架上1位和4位上的磷酸基团也能够被去除和改造，LpxE，一个来自土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）内膜上的磷酸激酶，能够选择性的去除1位的磷酸基团，能够产生去磷酸基团化（MPL）的类脂A结构从而降低脂多糖的内毒素活性。

所述转化可以为化学转化和电转化。

本发明的主要优点是：

1、大肠杆菌BL21（DE3）作为一种运用最为广泛的表达宿主菌，其表达的重组蛋白中残留有会引起机体炎症反应的脂多糖的问题亟待解决，本发明即从基因工程的角度入手，对脂多糖的关键成分类脂A的结构进行改造，使其刺激机体产生炎症反应的能力显著降低，在源头上降低脂多糖对重组蛋白的污染，从而不需要再次对重组蛋白进行二次纯化，从而为更好的运用该表达菌表达用于治疗疾病以及药物的重组蛋白提供坚实的基础，具有广阔的市场应用前景。

2、本发明提供的低内毒素活性的大肠杆菌原核表达工程菌突变株的构建方法通过改变类脂A脂肪酸链数量以及磷酸基团的数量来降低脂多糖毒性，从而降低细菌对机体的毒性，能够为研发弱毒疫苗提供一定的借鉴意义，并且此种方法不含有任何抗性标记，完全符合我国疫苗生物安全的要求。

3、本发明提供的低内毒素活性的大肠杆菌原核表达工程菌突变株S004与亲本株比较，基因的缺失以及外源基因的表达对其生长影响不大，同时将其用于表达蛋白，其表达蛋白的能力与亲本株比较也无差异。

附图说明

图1：是本发明中用于构建低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌BL21（DE3）突变株的基因敲除示意图；

图2：是p15a-∆lpxR::P_lpp pagL ∆pagP::P_lpplpxE质粒图谱；

图3：是p15a-∆pagP::P_lpplpxE质粒图谱；

图4：是p15a-∆lpxR::P_lpp pagL质粒图谱；

图5：是本发明中大肠杆菌BL21（DE3）突变株∆msbB的PCR鉴定电泳结果，图中M：DNA marker Ⅲ，∆msbB：突变株，BL21（DE3）：亲本株；

图6：是本发明中大肠杆菌BL21（DE3）突变株∆pagP的PCR鉴定电泳结果，

图中M：DNA marker Ⅲ，∆pagP：突变株，BL21（DE3）：亲本株；

图7：是本发明中大肠杆菌BL21（DE3）突变株提取的类脂A进行MALDI-TOF MS分析，确定其类脂A结构的结果；

图8：是本发明中大肠杆菌BL21（DE3）突变株的脂多糖刺激细胞产生细胞因子水平检测的结果；

图9：是本发明中大肠杆菌BL21（DE3）突变株的生长特性以及表达蛋白能力检测的结果。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

1、∆msbB引物设计和PCR扩增

根据已报到的大肠杆菌BL21（DE3）序列（参照GenBank序列号为NC_012892）设计两对融合PCR引物分别扩增msbB基因的上游同源臂以及下游同源臂，扩增片段大小分别为450bp和380bp，上述引物均由北京华大基因公司合成，引物序列如下：

msbB left-up：5’CAGTTCGACAATGTGGAAGAAG 3’

msbB left-down: 5’ ACCTGCAGGATGCGGCCGCGG GCCTCTCGCGAGG3’

msbB right-up: 5’ CCGCGGCCGCATCCTGCAGGT GCTTTTCCAGTTTCGG3’

msbB right-down: 5’ GCGTTATATGCACTTGCGC 3’

2、大肠杆菌BL21（DE3）msbB基因的上、下游同源臂的扩增以及融合

将冻干的大肠杆菌BL21（DE3）菌株接至LB（普通肉汤）平板中过夜培养，第二天挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37℃ 180 r/min 培养8-12h 提取细菌的基因组（提取基因组利用的是天根生化的细菌基因组抽提试剂盒，按照说明书的操作步骤进行基因组的抽提）。

PCR的扩增反应在50μL的体系中进行，反应体系如下：模板DNA 1μL，2×高保真DNA酶预混液，购自宝生物（大连）有限公司25μL，上游引物1μL，下游引物1μL，ddH₂O 22μL。

扩增条件为：94℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃ 10 sec，55℃ 15 sec， 72℃ 10 sec。35个循环后，72℃延伸10min。扩增的PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增两个片段大小分别为450bp和380bp，与预期大小相当。

上下游同源臂的融合：将上下游同源臂按照摩尔数1:1的比例，总模板量为2 μL作为PCR扩增模板，利用引物msbB-1F和msbB-2R在与之前相同体系以及扩增条件下进行扩增，得到大小为800bp左右的融合片段

3、pRE112-msbB自杀质粒的构建

将之前得到的融合片段进行+A处理，利用天根生化的plus A反应试剂盒，反应体系为：模板15μL，plus A buffer 4μL，Taq 酶 1μL；反应条件为：72℃ 30min，反应完成后待用。

自杀质粒pRE112酶切片段的准备：利用AdhⅠ酶切pRE112质粒，将质粒片段酶切出T克隆位点，回收载体pRE112，然后用T4 DNA ligase 连接，16℃水浴过夜，转化λ pi r大肠杆菌感受态细胞，待其长出后进行PCR鉴定，从而获得自杀质粒pRE112-msbB。鉴定结果证实构建的自杀质粒是正确的。

3、msbB基因缺失突变株的构建与鉴定

将构建好的自杀质粒pRE112-msbB转化至λ pir 大肠杆菌菌株中（该质粒缺失了asd基因，需要DAP才能够生长，能够很好的用于后续接合转移的筛选），将携带有自杀质粒pRE112-msbB的λ pir 大肠杆菌与大肠杆菌BL21（DE3）进行接合转移，在氯霉素抗性的LB平板上筛选阳性菌落，将阳性菌落在不含氯霉素抗性的LB液体培养基中培养增殖，在10%蔗糖平板上筛选耐蔗糖菌落，并挑取单菌落进行PCR鉴定。

PCR鉴定：提取msbB突变菌株∆msbB-BL21(DE3) 基因组DNA，用引物msbB-1F和msbB-2R扩增上下游同源臂片段，同时用引物msbB-1R和msbB-2F扩增msbB基因，看能否扩增出大小为800bp左右的缺失了msbB基因的上下游同源臂片段，如果能扩增出相应片段，则表明结果与预期相符，可初步鉴定突变株构建成功。

实施例2

1、∆pagP引物设计和PCR扩增

根据已报到的大肠杆菌BL21（DE3）序列（参照GenBank序列号为NC_012892）设计两对融合PCR引物分别扩增pagP基因的上游同源臂以及下游同源臂，扩增片段大小分别为350bp和280bp，上述引物均由北京华大基因公司合成，引物序列如下：

pagP left-up：5’ CCTTGATTGCATTTTGTCAT 3’

pagP left-down: 5’ GTCTCACCCGGGCCTGCAGGTTGTGACCATAAAACATTTA 3’

pagP right-up: 5’ CACAACCTGCAGGCCCGGGTGAGACAAATGAAGTTTTAGT 3’

pagP right-down: 5’ TGCTGCCGTCTTCCGGAGTA 3’

2、大肠杆菌BL21（DE3）pagP基因的上、下游同源臂的扩增以及融合

扩增条件为：94℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃ 10 sec，55℃ 15 sec， 72℃ 10 sec。35个循环后，72℃延伸10min。扩增的PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增两个片段大小分别为350bp和280bp，与预期大小相当。

上下游同源臂的融合：将上下游同源臂按照摩尔数1:1的比例，总模板量为2 μL作为PCR扩增模板，利用引物msbB-1F和msbB-2R在与之前相同体系以及扩增条件下进行扩增，得到大小为600bp左右的融合片段

3、pRE112-pagP自杀质粒的构建

自杀质粒pRE112酶切片段的准备：利用AdhⅠ酶切pRE112质粒，将质粒片段酶切出T克隆位点，回收载体pRE112，然后用T4 DNA ligase 连接，16℃水浴过夜，转化λ pi r大肠杆菌感受态细胞，待其长出后进行PCR鉴定，从而获得自杀质粒pRE112-pagP。鉴定结果证实构建的自杀质粒是正确的，自杀质粒pRE112-pagP构建流程图如图1所示。

3、BL21(DE3) ∆msbB ∆pagP基因缺失突变株的构建与鉴定

将构建好的自杀质粒pRE112-pagP转化至λ pir 大肠杆菌菌株中（该质粒缺失了asd基因，需要DAP才能够生长，能够很好的用于后续接合转移的筛选），将携带有自杀质粒pRE112-pagP的λ pir 大肠杆菌与大肠杆菌BL21（DE3）∆msbB菌株进行接合转移，在氯霉素抗性的LB平板上筛选阳性菌落，将阳性菌落在不含氯霉素抗性的LB液体培养基中培养增殖，在10%蔗糖平板上筛选耐蔗糖菌落，并挑取单菌落进行PCR鉴定。

PCR鉴定：提取pagP突变菌株BL21(DE3) ∆msbB ∆pagP 基因组DNA，用引物pagP-1F和pagP-2R扩增上下游同源臂片段，看能否扩增出大小为600bp左右的缺失了pagP基因的上下游同源臂片段，如果能扩增出相应片段，则表明结果与预期相符，可初步鉴定突变株构建成功。

实施例3

1、低拷贝表达质粒的构建

以质粒pYA4291为模板，设计引物扩增出包含有pagL以及启动子P_lpp的一整段序列，lpxRU-P_lpp pagL-lpxRD，将该序列运用进行+A处理，利用天根生化的plus A反应试剂盒，反应体系为：模板15μL，plus A buffer 4μL，Taq 酶 1μL；反应条件为：72℃ 30min，反应完成后待用。需要将该片段连接至T末端的表达载体p15a上，同时用Ahd I进行酶切处理该载体，使其有T末端，将两段片段进行连接，从而得到表达pagL的低拷贝质粒。

利用相同的策略，以质粒pYA4295为模板，扩增出包含有lpxE以及启动子P_lpp的一整段序列，利用相同的方式将其连接至p15a中，得到表达lpxE的低拷贝质粒。

将扩增出来的片段lpxRU-P_lpp pagL-lpxRD以及表达lpxE的低拷贝质粒用SnaB I进行酶切连接从而构建得到表达去除脂肪酸链的酶pagL和去磷酸基团的酶lpxE的低拷贝质粒，相关的引物如下所示：

pagPscreenF：5’ AAACGCCGTTAACCCGATA 3’

pagPscreenR：5’ TAGACACAAATGCTGCTGTGTCG 3’

lpxRscreenF：5’ CAGGGGGTGTCAGTATTTGGCG 3’

lpxRscreenR：5’ CGTGAAGCCAATAATTTCTCGCAC 3’

2、大肠杆菌BL21（DE3）突变菌株S004的构建

将构建好的表达去除脂肪酸链的酶pagL和去磷酸基团的酶lpxE的低拷贝质粒利用电转化的方法，具体电转化以及制作感受态方法详见《分子生物学实验手册》，转入大肠杆菌突变菌株BL21(DE3) ∆msbB ∆pagP中得到最终的大肠杆菌原核表达工程菌BL21（DE3）突变株S004，并运用上述引物进行鉴定，确定其构建成功。

实施例4

1、大肠杆菌BL21（DE3）突变菌株S004的类脂A（lipid A）的纯化

将待检测细菌的过夜LB培养液，以1：100的比例加入到新鲜的200ml的LB培养基中，180转，37℃培养至OD600为0.8到0.9之间。4°C离心10分钟收集菌体，PBS缓冲液冲洗一次，细菌沉淀重悬于20ml的PBS，然后加入氯仿甲醇，最后比例为chloroform:methanol:PBS = 1:2:0.8（v/v），形成单相Bligh/Dyer mixture。细菌悬浮液室温摇晃1个小时，然后2500g离心20分钟，去掉含有磷脂（phospholipid)的上层，留下沉淀，沉淀然后重悬于40 ml的单相Bligh/Dyer，转移到一个50ml能盖紧的Pyrex tube中，离心去掉上清，留沉淀，空气干燥，然后悬于25ml的50 mM sodium acetate pH 4.5中（震荡和超声波方法溶于溶液），如果需要，用醋酸将pH调整到4.5，然后沸水浴30分钟释放lipid A，震荡冷却后，将溶液转移到抗氯仿的离心管，加入氯仿和甲醇到体积比为chloroform : methanol : aqueous sodium acetate = 2:2:1.8，形成一个双相Bligh/Dyer mixture，充分剧烈震荡来抽取lipid A，然后在2,500 x g 20°C离心20min，形成两相，小心收取下相（氯仿有机相）到一个圆形玻璃瓶中，再加入同等的氯仿到溶液中，再次形成双相Bligh/Dyer mixture (2:2:1.8, chloroform : methanol : PBS)，然后离心，小心抽取下相加入到相同的圆形玻璃瓶中，旋转蒸发去掉氯仿，样品于圆形玻璃瓶中，溶于chloroform:methanol (2:1, v/v)，转移到一个小的玻璃瓶中，再干燥，盖紧放于-80°C保存或用于分析。

2、大肠杆菌BL21（DE3）突变菌株S004的类脂A的MALDI-TOF MS分析

纯化过后的类脂A溶解于100 μL chloroform/methanol (2:1, v/v)溶液中，并点样于Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) 样品平台上，并点1 μL的浓度为100 mg/mL的 norharmane MALDI 混合液随后进行样品分析，所用仪器为Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF/TOF mass spectrometer (Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA, USA)，最终所得结果如图4所示，结果说明将msbB基因以及pagP基因敲除，在菌体内表达pagL和lpxE能够成功的改造大肠杆菌BL21（DE3）的类脂A结构，为后续验证其是否能够真正引起内毒素活性的降低打下理论基础。

实施例5

1、大肠杆菌BL21（DE3）突变菌株S004的脂多糖的纯化

大肠杆菌BL21（DE3）以及其突变菌株S004的脂多糖的纯化方法如下所示：收集干燥菌体（500 mg）重悬于15 mL 10 mM Tris–Cl buffer (pH8.0)，其中含有2% SDS，4% 2-巯基乙醇，2 mM MgCl₂，并装入离心管中。悬液放置于 65 °C 水浴直到细菌溶解。随即加入100 μg 蛋白酶K，并放置样品于 65 °C水浴一小时，过后放置样品于37 °C过夜。隔日，加入2 mL 3M 醋酸钠并与细菌悬液充分混匀，然后加入40 mL预冷的乙醇，将样品放置于–20 °C过夜形成沉淀。隔日，样品以4000 × g离心15 min，上层悬液缓慢丢弃，用9 mL 蒸馏水重悬下层沉淀，加入1mL 3 M 的乙酸钠，并涡旋，随即加入20 mL 预冷的乙醇再次涡旋后将样品放入–20 °C 过夜。隔日再次离心丢弃上层悬液，加入9 mL 10 mM Tris–Cl (pH7.4) 重悬沉淀，并加入50 μg DNase I 和12.5 μg Rnase。样品放置于37 °C 4小时，消化掉残留的核酸。并再次进行乙醇沉淀，混合样品放置于65 °C 水浴30分钟，加入等体积的90% 苯酚，于65 °C 放置15 min。时间到后，立即将样品放置于4 °C 迅速冷却，随机离心6000 × g 15 min。上层的水层收集在一个新的管子中，下层的苯酚层再次加入相同体积的水再次放置于65 °C 15 min，并冷却于冰水混合物的环境中，离心过后，上层的水层加入到第一次收集出来的水层中，将水层透析出去残留的苯酚，并将样品干燥，所得样品即为脂多糖，用蒸馏水溶解备用。

2、大肠杆菌BL21（DE3）突变株S004脂多糖刺激鼠巨噬细胞RAW264.7以及人单核细胞系THP1

鼠巨噬细胞RAW264.7以及人单核细胞系THP1均购买于中国科学院细胞库（上海，中国），RAW264.7细胞培养于37 °C，5% CO₂，培养基为DMEM (Gibco BRL, USA) 并加入10% FBS (Hyclone Logan, UT, USA)，THP1细胞培养于RPMI-1640 Medium (Gibco BRL, USA)，并加入10% FBS (Hyclone Logan, UT, USA)。细胞培养好后，按10⁵/孔的量分装于96孔板中，18小时过后，向板中加入不同溶度的脂多糖对其进行刺激（10⁴, 10⁵, 10⁶ and 10⁷fM），24小时过后，收集细胞培养上清，离心去除细胞碎片，进行检测其细胞因子的表达水平。TNF-α以及IL-12的含量均是用购买于R&D Systems, Inc. 的ELISA试剂盒进行，步骤都严格按照说明书进行，所检测到的TNF-α水平以及IL-12水平如图5所示，刺激RAW264.7细胞产生TNFα水平由20,904 pg/mL降低至4,427 pg/mL，刺激THP1细胞则不产生炎症因子，通过细胞刺激试验可以得知改造过后的大肠杆菌突变株的脂多糖刺激细胞产生炎症反应的能力得到了极大的降低。

实施例6

1、大肠杆菌BL21（DE3）突变菌株S004的生长特性分析

将10 μL的 BL21 (DE3)亲本株以及突变株加入到含有2 mL LB 液体培养基的小管中放置于37 °C培养箱中过夜，隔日，在装有100 mL的三角瓶中加入1 mL过夜孵育的细菌，并放置于37°C摇床中培养，每个一小时测定其OD₆₀₀值并记录，所有统计分析重复三次，所得结果如图6所示，结果说明对大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）的基因工程改造对其正常生长影响不大。

2、大肠杆菌BL21（DE3）突变菌株S004表达蛋白能力检测

将已构建好的原核表达质粒pET28-phoP转化入大肠杆菌BL21（DE3）以及其突变菌株中，将含有质粒的菌株培养至OD₆₀₀值达到0.6，往其中加入终浓度为1 mM 的IPTG 对其进行诱导表达，4小时过后，收集细菌菌体，使其溶解于25 mM Tris–HCl pH 8.0, 1.15 mM EDTA, 1 mg/mL lysozyme中，离心除去不溶组份，将上清进行SDS-PAGE电泳，待电泳完成后进行考马氏亮蓝染色分析结果，结果如图6所示，结果说明以上所述的对大肠杆菌表达菌株的基因工程改造对其表达蛋白的功能没有影响。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 一株低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌突变株及构建方法

<130> 2014

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 972

<212> DNA

<213> Escherichia coli BL21 (DE3)

<400> 1

atggaaacga aaaaaaataa tagcgaatac attcctgagt ttgataaatc ctttcgccac 60

ccgcgctact ggggagcatg gctgggcgta gcagcgatgg cgggtatcgc tttaacgccg 120

ccaaagttcc gtgatcccat tctggcacgg ctgggacgtt ttgccggacg actgggaaaa 180

agctcacgcc gtcgtgcgtt aatcaatctg tcgctctgct ttccagaacg tagtgaagct 240

gaacgcgaag cgattgttga tgagatgttt gccaccgcgc cgcaagcgat ggcaatgatg 300

gctgagttgg caatacgcgg gccggagaaa attcagccgc gcgttgactg gcaagggctg 360

gagatcatcg aagagatgcg gcgtaataac gagaaagtta tctttctggt gccgcacggt 420

tgggccgtcg atattcctgc catgctgatg gcctcgcaag ggcagaaaat ggcagcgatg 480

ttccataatc agggcaaccc ggtttttgat tatgtctgga acacggtgcg tcgtcgcttt 540

ggcggtcgtc tgcatgcgag aaatgacggt attaaaccat tcatccagtc ggtacgtcag 600

gggtactggg gatattattt acccgatcag gatcatggcc cagagcacag cgaatttgtg 660

gatttctttg ccacctataa agcgacgttg cccgcgattg gtcgtttgat gaaagtgtgc 720

cgtgcgcgcg ttgtaccgct gtttccgatt tatgatggca agacgcatcg tctgacgatt 780

caggtgcgcc caccgatgga tgatctgtta gaggcggatg atcatacgat tgcgcggcgg 840

atgaatgaag aagtcgagat ttttgttggt ccgcgaccag aacaatacac ctggatacta 900

aaattgctga aaactcgcaa accgggcgaa atccagccgt ataagcgcaa agatctttat 960

cccatcaaat aa 972

<210> 2

<211> 561

<212> DNA

<213> Escherichia coli BL21 (DE3)

<400> 2

atgaacgtga gtaaatatgt cgctatcttt tcctttgttt ttattcagtt aatcagcgtt 60

ggtaaagttt ttgctaacgc agatgagtgg atgacaacgt ttagagaaaa tattgcacaa 120

acctggcaac agcctgaaca ttatgattta tatattcctg ccatcacctg gcatgcacgt 180

ttcgcttacg acaaagaaaa aaccgatcgc tataacgagc gaccgtgggg tggcggtttt 240

ggcctgtcgc gttgggatga aaaaggaaac tggcatggcc tgtatgccat ggcatttaag 300

gactcgtgga acaaatggga accgattgcc ggatacggat gggaaagtac ctggcgaccg 360

ctggcggatg aaaattttca tttaggtctg ggattcaccg ctggcgtaac ggcacgcgat 420

aactggaatt acatccctct cccggttcta ctgccattgg cctccgtggg ttatggccca 480

gtgacttttc agatgaccta cattccgggt acctacaaca atggcaatgt gtactttgcc 540

tggatgcgct ttcagttttg a 561

<210> 3

<211> 564

<212> DNA

<213> Salmonella typhimurium

<400> 3

gtgtatatga agagaatatt tatatatcta ttattacctt gtgcattcgc atgttctgct 60

aatgataatg ttttttttgg caagggcaac aagcatcaga tctcttttgc tgcgggagaa 120

agtataagaa gaggaggggt tgagcactta tatacggctt ttctgacata cagtgaaccc 180

agcgattttt tctttttaca ggcaagaaat aatctggagt taggaggatt taaggctaag 240

ggtagcgatg attgcagtaa acattctggc agcgttccct gtaataaata taaccagggc 300

gtattgggta tctcgaagga tgtggcgctg gttcatttcg ctggtatcta taccggtatt 360

ggtctggggg cttatataaa atctaagtcg cgagatgata tgcgtgtcaa ttctgcattt 420

acctttggag aaaaagcgtt tcttggctgg aactttgggg ctttttctac agaagcttat 480

atccggcatt tctcgaatgg atcacttacg gataaaaatt cagggcataa ttttgtaggt 540

gcttcaatta gttataattt ctga 564

<210> 4

<211> 720

<212> DNA

<213> Francisella tularensis

<400> 4

atgctcaaac agacattaca agcaaacttt caaggtttta aagatatttt taaaaaacca 60

aaactacaca atcataaatt gcctagatat ctacagttga aatatacgtt tataccatta 120

ttaattttag taatctttgc atactataac ttagataccc cagttgagaa ctatatcaag 180

cattctatgc caaatattgt tggtgtaatt tttggtaaaa taactgatgt tggtaaggcc 240

gagtatattt tgataatttg cggtgtgata gtgttagcgc gtttatttac agatagccaa 300

aaattatctg ctaatgctag agttatgttt gacaaggtgt cggcatatgc cggttttatc 360

ttagcaactg tagctattag tggtattttg ggacaaatac tcaagatgat aataggtaga 420

gcgcgtccta agtttttctt ggaatatggt tcgcattatt tccaacattt tcatgcacct 480

ggatatgatt ttgcaagtat gccgtcgggg cactcaatta cagttggagc aatgtttata 540

gcattttttt atattttccc taagctaaga tatttttggt atttgctcat agtggtattt 600

gctggtagta gaattatggt tagttcacat taccctagtg atgtaatctt tggcgttgct 660

tttggttgtt actgtacagc atatatctac tattggatga gaaatagaga gattatttag 720

Claims

1.一株低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌突变株，其特征在于：所述突变株不含与脂肪酸链转移酶合成有关的基因msbB 和pagP，同时能表达去除脂肪酸链的酶pagL以及去磷酸基团的酶lpxE；所述突变株的分类命名为Escherichia coli BL21 (DE3) S004，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC NO.M2014473，保藏时间为2014年10月14日。

2.根据权利要求1所述的突变株，其特征在于：所述msbB的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，pagP的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，pagL的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，lpxE的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

3.一种低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌突变株的构建方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

1）通过同源重组的方法，将细菌基因组上调控脂肪酸链转移在类脂A的碳骨架上的酶合成的相关基因msbB以及pagP敲除，得到不含msbB和pagP的突变菌株；

2）构建表达去除脂肪酸链的酶pagL和去磷酸基团的酶lpxE的低拷贝质粒，并转化入步骤1）所得突变菌株，得到不含msbB 和pagP并能表达pagL和lpxE的低内毒素大肠杆菌原核表达工程菌突变株。

4.根据权利要求3所述的突变株的构建方法，其特征在于：所述步骤1）的同源重组的方法包括如下步骤：

1）构建自杀性质粒pRE112-msbB和pRE112-pagP；

2）将步骤1）所得自杀性质粒转化入λpir大肠杆菌，并与沙门氏菌自然接合，使同源片段导入沙门氏菌基因组，经过第一次交换和Cm+抗性筛选，得到阳性克隆；

4）通过PCR筛选得到不含msbB和pagP的突变菌株。

5.根据权利要求3所述的突变株的构建方法，其特征在于：所述步骤2）中低拷贝质粒的制备方法包括如下步骤：

2）对步骤1）所得质粒通过SnaB I处理，并以质粒pYA4291为模板，运用引物lpxRscreenF和lpxRscreenR将片段lpxRU-P_lpp pagL-lpxRD扩增出来，插入至质粒表达去磷酸基团的酶lpxE的低拷贝质粒中，得到表达去除脂肪酸链的酶pagL和去磷酸基团的酶lpxE的低拷贝质粒。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述自杀性质粒pRE112-msbB的构建步骤为：

1）引物设计：

msbB left-up：5’ CAGTTCGACAATGTGGAAGAAG 3’

msbB left-down: 5’ ACCTGCAGGATGCGGCCGCGG GCCTCTCGCGAGG3’

msbB right-up: 5’ CCGCGGCCGCATCCTGCAGGTGCTTTTCCAGTTTCGG3’

msbB right-down: 5’ GCGTTATATGCACTTGCGC 3’

2）提取处于对数生长期的大肠杆菌BL21（DE3）基因组DNA作为模板，分别用左右同源臂引物进行扩增，得到其左右同源臂的扩增产物，回收产物进行融合PCR扩增，即用引物msbB left-up以及msbB right-down进行扩增，得到融合好的左右同源臂扩增产物；

3）再用+A反应试剂盒在片段末端进行+A碱基处理，并与用Adh I酶切后得到pRE112酶切产物在T4连接酶的作用下进行连接并转化入受体λpir大肠杆菌菌株中，得到重组质粒pRE112-msbB。

7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：自杀性质粒pRE112-pagP的构建步骤为：

1) 引物设计

pagP left-up：5’ CCTTGATTGCATTTTGTCAT 3’

pagP left-down: 5’ GTCTCACCCGGGCCTGCAGGTTGTGACCATAAAACATTTA 3’

pagP right-up: 5’ CACAACCTGCAGGCCCGGGTGAGACAAATGAAGTTTTAGT 3’

pagP right-up: 5’ TGCTGCCGTCTTCCGGAGTA 3’

3）再用+A反应试剂盒在片段末端进行+A碱基处理，并与用Adh I酶切后得到pRE112酶切产物在T4连接酶的作用下进行连接并转化入λpir大肠杆菌受体菌株中，得到重组质粒pRE112-pagP。

8.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述转化可以为化学转化或电转化。