CN102220276B - 一种产胆盐水解酶的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产胆盐水解酶的基因工程菌及其筛构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明采用重组DNA技术将植物乳杆菌Lactobacillus plantarum BBE7的胆盐水解酶(bsh)基因克隆连接到大肠杆菌表达载体pET28a(+)，并转化Escherichia coli BL21(DE3)，经筛选鉴定得到一株可以产较高活性胆盐水解酶的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bsh，保藏编号为CCTCC NO：M 2011115。该菌株表达的胆盐水解酶对甘氨脱氧胆酸钠(GDCA)的总酶活为3.7819U/mL，比野生菌的总酶活提高了近11倍。这为胆盐水解酶的大规模生产以及其作为功能食品来降低血清胆固醇奠定了良好的基础。

Description

一种产胆盐水解酶的基因工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种产胆盐水解酶的基因工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

胆汁中的胆汁酸均以钠盐或钾盐形式存在，即胆汁酸盐，简称胆盐(bilesalts)。。胆汁酸可分为两类：一类是初级胆汁酸(primary bile acids)，由肝细胞合成，包括胆酸、鹅脱氧胆酸及其与甘氨酸和牛磺酸结合的产物。另一类是次级胆汁酸(secondary bile acids)，是初级胆汁酸在肠道中受细菌作用生成的脱氧胆酸和石胆酸及其在肝中生成的结合产物。人胆汁中的胆汁酸以结合型为主。

胆盐水解酶是乳酸菌的一种代谢产物，该酶能水解结合态胆盐，使结合态胆盐降解为游离态胆盐和氨基酸。很多胆盐水解酶已经从各种微生物中得以纯化和鉴定，目前已经检测到BSH酶活性的菌有乳杆菌，双歧杆菌，肠球菌，梭状芽孢杆菌，类杆菌和链球菌等。但是，国内关于乳酸菌产胆盐水解酶的文章报道和专利报道很少。

微生物胆盐水解酶的作用主要有以下几个方面：(1)对菌体自身的影响：营养价值、脱除胆汁的毒害作用、提高菌体的存活率、改变细胞膜的特性等；(2)对宿主的作用：降低血清胆固醇、消弱对脂肪的消化吸收等。

国内外大量临床实验证实，服用益生菌及其相关制品具有减少人体血清胆固醇含量，降低心血管疾病发病率的功效。而且许多实验实验证明胆盐水解酶和益生菌降低胆固醇作用有密切关系。Klaver等利用许多株乳杆菌和双歧杆菌进行的降胆固醇实验研究证实：乳酸菌产生的胆盐水解酶可以使结合态胆盐分解为游离胆盐，后者与胆固醇形成复合物共同沉淀下来，从而导致环境中胆固醇含量的降低。也有人认为由于胆固醇是形成胆酸的前体物，部分胆固醇需要转化为胆酸以弥补被分解后排出体外的部分，这样就加速了胆固醇的分解代谢，从而导致胆固醇浓度的降低。Verstrate认为乳酸菌的高胆盐水解酶活力这一特征在降低胆固醇含量方面起着重要作用。此外，Ahn认为乳酸菌的胆盐水解酶在降低胆固醇方面有重要作用。

利用基因工程或发酵工程来研究BSH的过量表达，可以提高益生菌株在肠道中的存活能力。这为研究胆盐水解酶对菌体自身和宿主的作用提供了一定的基础。另外，运用纯的胆盐水解酶或含胆盐水解酶的菌株来控制血清中胆固醇水平(如口服活菌细胞疗法)将具有很大的前景。

发明内容

本发明提供了一种产盐水解酶的基因工程菌，是将胆盐水解酶基因导入大肠杆菌得到的基因工程菌，已于2011年4月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉、武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2011115，分类学命名为大肠埃希氏菌BL21(DE3)-pET28a(+)-bsh(Escherichia coliBL21(DE3)-pET28a(+)-bsh)。

本发明还提供了一种产盐水解酶基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

1)设计引物以CCTCC NO：M 2011116的基因组DNA为模板扩增出bsh基因；

2)将bsh基因连接到大肠杆菌表达载体pET28a(+)，得到重组载体pET28a(+)-bsh；

3)重组载体转化Escherichia coli BL21(DE3)。

所述引物根据NCBI网站发表的Lactobacillus plantarum WCFS中胆盐水解酶的基因序列设计，引物序列如下：

bsh1-F：5’-CGGGATCCATGTGTACTGCCATA ACTTATCA ATCTT-3’

bsh1-R：5’-CCCAAGCTTGTTAACTGCATAGTATTGTGCTTCTGAT-3’

PCR反应体系：0.2mL PCR管中按顺序加入以下试剂：10×LA PCR bufferII(Mg²⁺plus)5μl；DNTP Mixture 8μl；模板DNA 1μl；上下游引物各2μl；Taq酶0.5μl；加双蒸水至终体积为50μl。

PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火90s，72℃延伸1min(30个循环)；72℃延伸10min。

将胶回收纯化后的PCR产物用BamH I和Hind III酶切后连接到大肠杆菌表达载体pET28a(+)，得到重组载体pET28a(+)-bsh，转化Escherichia coliBL21(DE3)，经筛选鉴定获得重组菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bsh。

胆盐水解酶酶活测定方法：将发酵液离心10min(10000×g，4℃)收集菌体，再用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤离心2次，调整菌浓在600nm下吸光度为10。取1mL上述细胞悬浊液，超声破碎3min(工作时间∶间歇时间＝2∶3)，随即离心10min(10,000×g，4℃)去除细胞碎片，得到无细胞提取物(cell freeextract，CFE)。取0.1mL上清液加入1.8mL 0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.0)和0.1mL结合胆盐(200mM)中混合，并置于37℃孵育30min，取0.5mL上述反应液加入0.5mL15％三氯乙酸(w/t)终止反应，混合均匀，离心10min(离心机最大转速，4℃)取上清。将0.1mL上清液与1.9mL茚三酮显色液(包括0.5mL 1％茚三酮(溶解于0.5M柠檬酸缓冲液(pH5.5)中)、1.2mL甘油和0.2mL 0.5M的柠檬酸缓冲液(pH5.5))混合，震荡混匀，沸水浴14min。冷却3min后测定570nm下的吸收值。标准曲线用甘氨酸或牛磺酸制作。

本发明的有益效果：CCTCC NO：M 2011115在发酵结束后对甘氨脱氧胆酸钠(GDCA)的总酶活高达3.7819U/mL，比野生菌的总酶活提高了近11倍，为胆盐水解酶的大规模生产以及其作为功能食品来降低血清胆固醇奠定了良好的基础。

生物材料样品保藏

一株高产胆盐水解酶的重组大肠杆菌，其分类学命名为：大肠埃希氏菌BL21(DE3)-pET28a(+)-bsh(Escherichia coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bsh)，该菌株于2011年4月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2011115。

附图说明

图1：(a)目的基因的扩增。M：DL 2,000 DNA Marker；泳道1和泳道2：bsh基因的PCR扩增条带；(b)菌落PCR挑选阳性重组子。M：DL 2,000DNAMarker；泳道1和泳道2：阳性重组子；泳道3～5：假阳性。

图2：(a)重组质粒的提取。M：DL 10,000 DNA Marker；泳道1和泳道2：重组质粒pET 28a(+)-bsh；(b)双酶切验证。M：DL 10,000DNAMarker；泳道1：重组质粒pET 28a(+)-bsh；泳道2：重组质粒用BamH I和Hind III双酶切后得到的条带。

图3：蛋白电泳(SDS-PAGE)实验结果。M：蛋白质分子量标准(Protein MolecularWeight Marker)；1：含有pET 28a(+)的E.coli BL21(DE3)；2：含有pET 28a(+)的E.coli BL21(DE3)经过1.0mM IPTG诱导；3：重组菌；4：重组菌经过1.0mMIPTG诱导。

图4：重组菌对甘氨脱氧胆酸钠(GDCA)的总酶活以及和野生菌的总酶活的比较。

具体实施方式

实施例1重组菌的构建及鉴定

1)从植物乳杆菌Lactobacillus plantarum BBE7提取基因组DNA作模板，进行PCR扩增，引物为：

bsh1-F：5’-CGGGATCCATGTGTACTGCCATA ACTTATCAATCTT-3’

bsh1-R：5’-CCCAAGCTTGTTAACTGCATAGTATTGTGCTTCTGAT-3’

植物乳杆菌Lactobacillus plantarum BBE7已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CTCC M 2011116。

0.2mL PCR管中按顺序加入以下试剂：10×LA PCR buffer II(Mg²⁺plus)5μl；DNTP Mixture 8μl；模板DNA 1μl；上下游引物各2μl；Taq酶0.5μl；加双蒸水至终体积为50μl。按下列程序进行PCR扩增：94℃预变性5min；94℃变变性30s，57℃退火90s，72℃延伸1min(30个循环)；72℃延伸10min。

2)以1％琼脂糖凝胶电泳验证并以0.8％琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，结果扩增得到与文献报道大小相符的bsh基因片段(图1a-泳道1、泳道2)。

3)用限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切消化纯化后的bsh基因和载体pET 28a(+)，用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，连接产物用化学转化法转化宿主菌JM109，转化菌液涂布在含有卡那霉素(30mg/mL)的LB平板上，37℃过夜培养，以bsh1-F和bsh1-R为引物进行菌落PCR的方法鉴定阳性克隆子(图1b-泳道1、泳道2)，最终获得含有bsh基因的重组表达质粒pET 28a(+)-bsh(图2a-泳道1、泳道2)，用双酶切进行验证(图2b-泳道2)。

大肠杆菌化学转化为：取连接产物5μl加入到含有100μl JM109感受态细胞中，充分混匀后，冰浴30min；将装有混合物的Eppendorf管，42℃水浴热休克90s，然后将Eppendorf管立即转移到冰上冷却2min；向管中加入600μl LB液体培养基，置于37℃200rpm恒温摇床上培养1h，然后涂布于含有卡那霉素的平板上，37℃向上放置1h，倒置培养12-16h后观察菌落。

4)将重组质粒pET 28a(+)-bsh转化Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞，得到能在含有卡那霉素(30mg/mL)的LB平板上正常生长的基因工程菌，并经过鉴定命名为Escherichia coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bsh。

实施例2重组菌的酶活测定和蛋白电泳

培养基：种子和斜面培养基为LB培养基(1L)：胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 10g，用1N NaOH将pH调至7.0；斜面培养基添加琼脂15g；基本发酵培养基为TB培养基(1L)：去离子水900mL，胰蛋白胨12g，酵母抽提物24g，甘油10mL，高压灭菌，冷却至60℃，加100mL灭菌磷酸钾缓冲液；

培养方法：将20℃、200rpm下培养到OD₆₀₀在0.6～0.7之间的种子以2％的接种量转入基本发酵培养基，于20℃、200rpm条件下培养；

诱导条件：诱导OD值为0.6，重组菌在20℃诱导35小时，IPTG浓度为1.0mM。

以空载体作为对照，通过蛋白电泳(SDS-PAGE)得到一条分子量大小约为37.5kDa的蛋白条带(见图3)，同时测定该重组菌对甘氨脱氧胆酸钠(GDCA)的总酶活，总酶活为3.7819U/mL比野生菌的总酶活(0.322U/mL)提高了近11倍(见图4)。

序列表

 

<110>  江南大学

 

<120>  一种产胆盐水解酶的基因工程菌及其构建方法和应用

 

<130>  1

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  36

<212>  DNA

<213>  bsh1-F

 

<400>  1

cgggatccat gtgtactgcc ataacttatc aatctt                                 36

 

 

<210>  2

<211>  37

<212>  DNA

<213>  bsh1-R

 

<400>  2

cccaagcttg ttaactgcat agtattgtgc ttctgat                                37

 

Claims (1)

1.一种发酵生产生产胆盐水解酶的方法，其特征在于：以产胆盐水解酶的基因工程菌为生产菌株，将20℃、200rpm条件下，种子培养基培养的种子培养到OD₆₀₀在0.6-0.7之间，以2%的接种量转入基本发酵培养基，于20℃、200rpm条件下培养；当菌体OD值为0.6，重组菌在20℃诱导35小时，IPTG浓度为1.0mM；所述种子和线面培养基为LB,1L LB的组成为：胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl10g，用1N NaOH将pH调至7.0；斜面培养基添加琼脂15g；基本发酵培养基为TB培养基,1L TB的组成为：去离子水900mL，胰蛋白胨12g，酵母抽提物24g，甘油10mL，高压灭菌，冷却至60℃，加100mL灭菌磷酸钾缓冲液；所述基因工程菌于2011年4月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2011115，其构建方法为:

1）设计引物以CCTCC NO：M2011116的基因组DNA为模板扩增出bsh基因；

2）将bsh基因连接到大肠杆菌表达载体pET28a(+)，得到重组载体pET28a(+)-bsh；

3）重组载体转化Escherichia coli BL21(DE3)得到基因工程菌CCTCC NO：M2011115；

所述引物如下：

bsh1-F：5’-CGGGATCCATGTGTACTGCCATAACTTATCAATCTT-3’

bsh1-R：5’-CCCAAGCTTGTTAACTGCATAGTATTGTGCTTCTGAT-3’。

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