CN106754844A - 一种提高胆盐水解酶分泌效率的方法 - Google Patents

一种提高胆盐水解酶分泌效率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高胆盐水解酶分泌效率的方法，属于基因工程技术领域。本发明采用重组DNA技术将植物乳杆菌来源的胆盐水解酶基因bsh与信号肽α‑MF融合并与载体pPIC9K连接，并转化至毕赤酵母GS115中，获得产胆盐水解酶的重组毕赤酵母。并通过外源添加粟精胺和Fe2+提高毕赤酵母胆盐水解酶分泌效率，使发酵3d胆盐水解酶酶活达14.96U/mL，与未外源添加物质相比提高了1.74倍。

Description

一种提高胆盐水解酶分泌效率的方法
技术领域
本发明涉及一种提高胆盐水解酶分泌效率的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
胆盐水解酶(BSH)是由bsh基因编码的一种胞内酶，广泛存在于肠道微生物中，是降解胆汁的主要组成成份——共轭胆酸第一步所需的酶。胆酸盐水解酶可将共轭胆酸水解成牛磺酸或甘氨酸和游离胆酸，后者可由其它肠道微生物在肠道内作进一步降解。胆酸盐水解酶的生理作用体现在两个方面：一、影响宿主的脂肪代谢过程，减少脂肪的消化吸收和降低胆固醇水平等；二、胆汁的降解减少了胆汁对肠道微生物的毒性，改善了微生物生存的肠道环境；由降解产生的氨基酸和游离脂肪酸还可为微生物提供营养物质。
由于胆盐水解酶通常来源于乳酸菌等微生物中，其生长环境和发酵强度不适合大规模工业化生产。另一方面，目前报道的多数胆盐水解酶表达量低，易形成包涵体。因此，筛选一种能够酶活较高并能高效表达的胆盐水解酶基因对于工业化生产胆盐水解酶，及运用胆盐水解酶调节生物机体健康状况具有重要意义。
毕赤酵母宿主虽然具有表达蛋白易于纯化等优点，然而目前的胆盐水解酶在毕赤酵母中表达时，存在表达量不高或者是外源基因原始核苷酸序列并不十分适合于毕赤酵母宿主的问题，从而限制了胆盐水解酶在毕赤酵母中的高效表达，酵母真核表达系统中存在的糖基化现象对碱性果胶酶的高效表达及性质存在极大影响。
发明内容
本发明提供一种提高胆盐水解酶分泌效率的方法，所述方法在产胆盐水解酶的毕赤酵母的发酵培养基中添加80～120mg/L的粟精胺、30～60mg/L Fe2+，并将所述毕赤酵母在30℃，200～220rpm发酵24～48h。
在本发明的一种实施方式中，所述产胆盐水解酶的毕赤酵母是以pichiapastoris GS115为宿主，以pPIC9K为载体，表达SEQ ID NO.1所示基因的重组毕赤酵母。
在本发明的一种实施方式中，所述重组毕赤酵母还具有α-MF信号肽。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵是以按体积比1-5％的接种量将毕赤酵母接种至发酵培养基中，20～28℃，200～220rpm下发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基配方包括：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，7-10％甲醇，YNB 13.4g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述Fe2+为FeCl2。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵前还进行活化。
在本发明的一种实施方式中，所述活化是挑取毕赤酵母单菌落，接种至BMGY培养基中，30℃，200～220r/min培养16-24h。
在本发明的一种实施方式中，所述BMGY培养基含有蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，甘油40g/L，YNB 13.4g/L，
本发明还提供所述的方法在制备含胆盐水解酶的产品中的应用。
有益效果：本发明提供了一种利用粟精胺和Fe2+提高毕赤酵母胆盐水解酶分泌效率的方法，使发酵3d胆盐水解酶酶活达14.96U/mL，与未外源添加物质相比(实施例3)提高了1.74倍。
具体实施方式
LB培养基：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。
YPD培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L。
MD培养基：YNB 13.4g/L、葡萄糖20g/L、生物素4×10-4g/L。
BMGY培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，甘油40g/L，YNB 13.4g/L，pH6.0的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。
BMMY培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，7-10％甲醇，YNB 13.4g/L，pH6.0的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。
胆盐水解酶酶活测定方法：取10μL酶液用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.0)稀释至90μL，加入10μL结合胆盐(200mM)混合，于37℃孵育30min，加入等体积的15％(w/v)三氯乙酸终止反应，离心后取10μL上清液与190μL茚三酮试剂混合，于100℃反应15min，冷却后于570nm处测定吸光值，根据甘氨酸标准曲线进行计算。其中，茚三酮试剂的组成为：0.5mL 1％(w/v)茚三酮(溶解于0.5M、pH5.5柠檬酸盐缓冲液)，1.2mL甘油，0.2mL 0.5M、pH5.5的柠檬酸缓冲液。
具体实施方式中选用牛磺脱氧结合胆盐测定酶活。
实施例1重组质粒的构建及鉴定
将植物乳杆菌来源的bsh基因(NCBI登录号为)进行密码自由化，并通过化学合成获得序列如SEQ ID NO.1所示序列，设计引物，通过融合PCR将SEQ ID NO.1所示序列与信号肽α-MF连接，柱回收产物获得融合片段。将融合片段αMF-bsh和pPIC9K质粒16℃过夜连接。连接产物pPIC9K-αMF-bsh化学法转化至大肠杆菌JM109感受态细胞。将转化液涂布于含50mg/L卡那霉素的LB平板，提取质粒测序验证构建的重组质粒。
实施例2产胆盐水解酶的重组毕赤酵母的构建
将重组质粒pPIC9K-αMF-bsh线性化，电击转化至pichia pastoris GS115感受态细胞，具体方法如下：
(1)接种YPD平板活化的pichia pastoris GS115于25mL/250mL三角瓶，30℃过夜培养；以1％(按体积比)接种上述培养液于含50mL/500mL培养基的三角瓶，培养菌体浓度OD600为1.3～1.5；
(2)5000r/min，4℃离心10min收集菌体，分别用50mL、25mL无菌水悬浮细胞；
(3)5mL 1M山梨醇重悬上述细胞，5000r/min，4℃离心10min收集菌体；
(4)500μL 1M山梨醇重悬上述细胞，分装80μL/1.5mL EP管用于电转化感受态细胞；5)20μL线性化质粒与上述80μL感受态细胞混合，冰上静置15min；
(5)上述混合物加入预冷的无菌电转化杯(0.2cm)，1500V、25μF、200Ω电击一次，加入1mL1M山梨醇；
(6)取上述混合物150μL涂布MD平板，30℃培养3天；
(7)挑取阳性克隆，分别点种在1、2、3、4mg/mL(遗传霉素)YPD平板中，挑选在4mg/mL遗传霉素平板中的单菌落用于摇瓶发酵。
实施例3
将本发明构建的工程菌作为生产菌株，在YPD平板活化。种子液培养，接种50mL/250mL种子培养基，30℃，220r/min培养24h。离心种子液，按发酵培养基中种子终浓度为OD600＝1接种发酵培养基，28℃，220r/min培养3d。测定胆盐水解酶胞外酶活为5.46U/mL。
实施例4
按实施例3的方法培养和发酵，其区别在于，分别向发酵培养基中添加100mg/L的粟精胺、苦马豆素和衣霉素，发酵结束后测定胆盐水解酶酶活，结果显示，添加粟精胺、苦马豆素和衣霉素后发酵3d胆盐水解酶酶活分别为7.49U/mL，5.18U/mL，6.16U/mL。
实施例5
按实施例3的方法培养和发酵，其区别在于，分别向发酵培养基中添加20～140mg/L(每20mg/L为一个梯度)的粟精胺，发酵结束后测定胆盐水解酶酶活，结果如表1所示，添加80～120mg/L的粟精胺可将胆盐水解酶酶活提高了125％以上。
表1不同浓度粟精胺对胆盐水解酶酶活的影响
实施例6
按实施例3的方法培养和发酵，其区别在于，分别向发酵培养基中添加50mg/L的金属盐离子，以未添加金属盐离子的胞外酶活为100％，测定培养基添加不同金属盐离子后胆盐水解酶酶活，结果如表2所示。添加铁离子的发酵液中胆盐水解酶酶活提高至159.17％。
表2各种金属离子对胆盐水解酶酶活的影响
实施例7
按实施例3的方法培养和发酵，其区别在于，向发酵培养基中添加50mg/L的Fe2+离子，并添加100mg/L粟精胺，测定发酵结束后胆盐水解酶酶活，结果显示，发酵3d胆盐水解酶酶活达14.96U/mL，与未外源添加物质相比(实施例3)提高了1.74倍。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 曹书华
<120> 一种提高胆盐水解酶分泌效率的方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 972
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgtgtactg ctatcactta ccaatcttac aacaactact tcggtagaaa cttcgactac 60
gaaatctctt acaacgaaat ggttactatc actccaagaa agtacccatt ggttttcaga 120
aaggttgaaa acttggacca ccactacgct atcatcggta tcactgctga cgttgaatct 180
tacccattgt actacgacgc tatgaacgaa aagggtttgt gtatcgctgg tttgaacttc 240
gctggttacg ctgactacaa gaagtacgac gctgacaagg ttaacatcac tccattcgaa 300
ttgatcccat ggttgttggg tcaattctct tctgttagag aagttaagaa gaacatccaa 360
aagttgaact tggttaacat caacttctct gaacaattgc cattgtctcc attgcactgg 420
ttggttgctg acaagcaaga atctatcgtt atcgaatctg ttaaggaagg tttgaagatc 480
tacgacaacc cagttggtgt tttgactaac aacccaaact tcgactacca attgttcaac 540
ttgaacaact acagagcttt gtctaactct actccacaaa actctttctc tgaaaaggtt 600
gacttggact cttactctag aggtatgggt ggtttgggtt tgccaggtga cttgtcttct 660
atgtctagat tcgttagagc tgctttcact aagttgaact ctttgtctat gcaaactgaa 720
tctggttctg tttctcaatt cttccacatc ttgggttctg ttgaacaaca aaagggtttg 780
tgtgaagtta ctgacggtaa gtacgaatac actatctact cttcttgttg tgacatggac 840
aagggtgttt actactacag aacttacgac aactctcaaa tcaactctgt ttctttgaac 900
cacgaacact tggacactac tgaattgatc tcttacccat tgagatctga agctcaatac 960
tacgctgtta ac 972
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgagattcc ttcaatttta ctgctgtttt attcgcagca tcctccgcat tagct 55

Claims (8)

1.一种提高胆盐水解酶分泌效率的方法，其特征在于，在产胆盐水解酶的毕赤酵母的发酵培养基中添加80～120mg/L的粟精胺、30～60mg/L Fe2+，并将所述毕赤酵母在20～28℃，200～220rpm发酵24～48h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产胆盐水解酶的毕赤酵母是以pichiapastoris GS115为宿主，以pPIC9K为载体，表达SEQ ID NO.1所示基因的重组毕赤酵母。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组毕赤酵母还具有α-MF信号肽。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵是以按体积比1-5％的接种量将毕赤酵母接种至发酵培养基中，20～28℃，200～220rpm下进行发酵。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基配方包括：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，7-10％甲醇，YNB 13.4g/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵前还进行活化。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述活化是挑取毕赤酵母单菌落，接种至BMGY培养基中，30℃，200～220r/min培养16-24h。
8.权利要求1所述的方法在制备含胆盐水解酶的产品中的应用。
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