CN105002130A - 一种产胆盐水解酶的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产胆盐水解酶的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明采用重组DNA技术将双歧杆菌Bifidobacterium？infantis？KL412的胆盐水解酶(bsh)基因克隆连接到大肠杆菌表达载体pET-22b(+)，并转化Escherichia？coli？BL21(DE3)，经筛选鉴定得到一株可以产较高活性胆盐水解酶的重组大肠杆菌Escherichia？coli？BL21(DE3)-pET-22b(+)-bsh。种子液以2％转接发酵培养基，重组菌在20℃、OD₆₀₀2.0、IPTG1mmol/L条件下诱导32h可达最高酶活，对甘氨脱氧胆酸钠(GDCA)和牛磺酸脱氧胆酸钠(TDCA)的酶活分别为135.2和121.3U/mL。这为胆盐水解酶的大规模生产及其作为功能食品来降低血清胆固醇奠定了良好的基础。

Description

一种产胆盐水解酶的基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种产胆盐水解酶的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

胆盐水解酶能够将脊椎动物体内的结合态胆盐水解成游离态的胆盐和氨基酸，从而导致肝脏细胞由胆固醇从头合成结合胆盐，起到降低机体内的血清中的胆固醇水平的作用。胆盐水解酶因其可以降低血清中胆固醇水平，预防心血管疾病而成为国内外研究的热点之一。

人体中结合胆汁酸主要有6种，包括甘氨鹅脱氧胆酸(26％)、甘氨胆酸(26％)、甘氨脱氧胆酸(22％)、牛磺胆酸(9％)、牛磺脱氧胆酸(9％)和牛磺鹅脱氧胆酸(9％)。不同来源的胆盐水解酶对六种胆盐的亲和力不同。例如：人体肠道内乳酸菌来源的胆盐水解酶通常对甘氨结合胆盐有较高的亲和力，微囊化的植物乳杆菌重组体产生的胆盐水解酶对甘氨脱氧胆酸(glycochenodeoxycholic acid，GDCA)的作用比牛磺脱氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid，TDCA)有效，嗜酸乳杆菌(L.acidophilus NCFM)的胆盐水解酶bshA没有活性，从而降低了菌株降解含有固醇类核基团的鹅去氧胆酸能力，如牛磺鹅脱氧胆酸(taurochenodeoxycholic acid，TCDCA)和甘氨鹅脱氧胆酸(glycochenodeoxycholic acid，GCDCA)。

目前有关研究胆盐水解酶国内外研究主要集中在筛选高产胆盐水解酶的优良菌株和胆盐水解酶基因功能分析。研究报道了多种来源的胆盐水解酶基因在大肠杆菌、乳酸菌、双歧杆菌和酵母细胞中克隆和表达，胆盐水解酶基因异源表达后酶水解底物的能力和酶学性质的研究报道较少。

在大肠杆菌中表达植物乳杆菌胆盐水解酶基因时检测发现，重组表达的胆盐水解酶表达后形成没有活性的包涵体。使用融合标签融合表达，纯化后的重组胆盐水解酶的比酶活为2.43U·mg^-1，因此，重组胆盐水解酶的溶解性得到了显著提高。也有研究利用毕赤酵母表达系统实现植物乳杆菌胆盐水解酶的胞外可溶性表达。董自星利用双精氨酸信号肽将L.plantarumBBE7来源的胆盐水解酶在大肠杆菌中进行了分泌表达，并且利用信号肽α-factor将胆盐水解酶在毕赤酵母中分泌表达，胞外胆盐水解酶总酶活达到2.69U·mL^-1。

利用基因工程的手段来研究胆盐水解酶的过量表达，可以提高胆盐水解酶的水解活性以及产量。这为研究胆盐水解酶的酶学性质提供了一定的基础。另外，纯化后的胆盐水解酶可应用于研究酶的动力学性质以及酶与底物的作用机制。

发明内容

为了克服以上问题，本发明提供了一种高效表达胆盐水解酶的基因工程菌，是将胆盐水解酶基因导入大肠杆菌得到的基因工程菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET-22b(+)-bsh。

所述胆盐水解酶，在本发明的一种实施方式中，来源于Bifidobacterium infantis KL412。

本发明的第一个目的是提供一种产胆盐水解酶的大肠杆菌基因工程菌，所述基因工程菌表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的胆盐水解酶。

所述胆盐水解酶，在本发明的一种实施方式中，其核苷酸序列是SEQ ID NO.2所示的序列。

所述基因工程菌，在本发明的一种实施方式中，是将SEQ ID NO.2所示的序列连接到表达载体pET-22b(+)得到重组质粒，然后将重组质粒转化到Escherichia coli BL21(DE3)中得到的。

本发明的第二个目的是提供一种所述基因工程菌的构建方法，是化学合成或者扩增得到SEQ ID NO.2所示的基因序列，然后将基因序列连接到表达载体pET-22b(+)上得到重组质粒pET-22b(+)-bsh，然后将重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中得到的。

所述构建方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：

(1)合成如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；以合成的序列为模板，使用序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的引物bsh-F、bsh-R扩增；

(2)用限制性核酸内切酶Nde I、Xho l酶切扩增得到的PCR产物和质粒pET-22b(+)，然后将酶切后的PCR产物pET-22b(+)连接得到重组载体pET-22b(+)-bsh；

(3)将重组载体pET-22b(+)-bsh转化Escherichia coli BL21(DE3)，经筛选、鉴定获得重组菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET-22b(+)-bsh。

3)重组载体转化Escherichia coli BL21(DE3)。

本发明的第三个目的是提供所述基因工程菌在胆盐水解酶生产中的应用。

所述应用，在本发明的一种实施方式中，是将基因工程菌种子液以1-3％的接种量转入基本发酵培养基，于36-38℃下培养至OD₆₀₀值为1.5-2.0，然后加入终浓度为0.8-1.0mmol·L^-1的IPTG诱导，在20℃诱导培养26-36h。

所述应用，在本发明的一种实施方式中，是将基因工程菌种子液以2％的接种量转入基本发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养至OD₆₀₀值为2.0，然后加入终浓度为1.0mmol·L^-1的IPTG诱导，在20℃诱导培养32小时。

所述基本发酵培养基，在本发明的一种实施方式中，为TB培养基，含有：酵母浸出粉24g·L^-1，蛋白胨10-14g/L g·L^-1，甘油3-4g·L^-1，KH₂PO₄ 12-17mmol·L^-1，K₂HPO₄ 68-72mmol·L^-1。

本发明的第四个目的是提供一种所述胆盐水解酶的酶活测定方法，所述方法是将取0.1mL待测样品加入1.8mL 0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.0)和0.1mL胆盐(200mmol·L^-1)中混合，并置于37℃孵育30min，取0.5mL上述反应液加入0.5mL15％三氯乙酸(w/t)终止反应，混合均匀，离心10min(离心机最大转速,4℃)取上清。将0.1mL上清液与1.9mL茚三酮显色液(包括0.5mL 1％茚三酮(溶解于0.5M柠檬酸缓冲液(pH 5.5)中)、1.2mL甘油和0.2mL 0.5M的柠檬酸缓冲液(pH为5.5))混合，震荡混匀，沸水浴14min。冷却3min后测定570nm下的吸收值。标准曲线用甘氨酸或牛磺酸制作。

本发明还要求保护所述基因工程菌生产得到的胆盐水解酶，以及所述胆盐水解酶在降低胆固醇方面的应用。

本发明将来源于Bifidobacterium infantis KL412的产胆盐水解酶基因，以pET-22b(+)为载体，在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达，所得重组菌发酵的到的酶，对甘氨脱氧胆酸钠和牛磺酸脱氧胆酸钠的酶活分别为135.2U·mL^-1和121.3U·mL^-1。同时本发明得到的重组酶，对人体中六种胆盐都有较好的特异性，对GCA酶活为220.1U·mg^-1，对TCA的相对酶活为154.1U·mg^-1，对TCA的相对酶活70.3％高于文献报道的其他来源的胆盐水解酶。本发明为胆盐水解酶的大规模生产以及其作为功能食品来降低血清胆固醇奠定了良好的基础。

附图说明

图1：目的基因的扩增；M：DL 1,000DNAMarker；泳道1：bsh基因的PCR扩增条带；

图2：蛋白电泳(SDS-PAGE)结果；M：蛋白质分子量标准(Protein MolecularWeight Marker)；1：含有pET 28a(+)的E.coli BL21(DE3)；2：含有pET 28a(+)的E.coli BL21(DE3)经过1.0mmol·L^-1IPTG诱导；3：重组菌；4：重组菌经过1.0mmol·L^-1IPTG诱导；5：重组菌经过1.0mmol·L^-1IPTG诱导后细胞破碎液沉淀；6：重组菌经过1.0mmol·L^-1IPTG诱导后细胞破碎液上清；

图3：诱导OD₆₀₀对重组胆盐水解酶酶活的影响；

图4：接种量对重组胆盐水解酶酶活的影响；

图5：温度对重组胆盐水解酶活力(A)和稳定性(B)影响；

图6：pH对重组胆盐水解酶活力(A)和稳定性(B)影响；

图7：重组胆盐水解酶底物特异性；其中：GCA，甘氨胆酸钠；GDCA，甘氨脱氧胆酸钠；GCDCA，甘氨鹅脱氧胆酸钠；TCA，牛磺胆酸钠；TDCA，牛磺脱氧胆酸钠；TCDCA，牛磺鹅脱氧胆酸钠。

具体实施方式

胆盐水解酶酶活测定方法：将发酵液离心5min(10000×g，4℃)收集菌体，用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤离心2次，调整菌浓在600nm下吸光度为1。取1mL上述细胞悬浊液，超声破碎1min(工作时间:间歇时间＝1:2)，离心10min(10,000×g,4℃)去除细胞碎片，得到无细胞提取物(cell free extract,CFE)。取0.1mL上清液加入1.8mL 0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.0)和0.1mL胆盐(200mmol·L^-1)中混合，并置于37℃孵育30min，取0.5mL上述反应液加入0.5mL15％三氯乙酸(w/t)终止反应，混合均匀，离心10min(离心机最大转速,4℃)取上清。将0.1mL上清液与1.9mL茚三酮显色液(包括0.5mL 1％茚三酮(溶解于0.5M柠檬酸缓冲液(pH 5.5)中)、1.2mL甘油和0.2mL 0.5M的柠檬酸缓冲液(pH为5.5))混合，震荡混匀，沸水浴14min。冷却3min后测定570nm下的吸收值。胆盐水解酶酶活定义为：单位时间内、单位体积的酶使结合型胆盐水解产生氨基酸的物质的量，单位μmol·(min·mL)^-1。

实施例1：重组菌的构建及鉴定

1)合成如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；以合成的序列为模板，设计引物进行PCR：

bsh-F：5’-GGGAATTCCATATGATGTGCACTGCAGTACGTTTCGATG-3’

bsh-R：5’-CCGCTCGAGTTTGGACTGCAGCTGGTTGCTAGACG-3”

0.2mL PCR管中按顺序加入以下试剂：10×LA PCR buffer II(Mg²⁺plus)5μl；DNTPMixture 8μl；模板DNA 1μl；上下游引物各2μl；Taq酶0.5μl；加双蒸水至终体积为50μl。PCR反应程序为为：95℃下预变性5min后，再98℃变性10s，然后57℃退火30s，接着72℃下延伸1min，最后在68℃下延伸10min，30个循环。

2)以1％琼脂糖凝胶电泳验证并以0.8％琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，结果扩增得到大小相符的bsh基因片段(图1)。

3)用限制性核酸内切酶Nde I、Xho l对回收的PCR产物和质粒pET-22b(+)分别双酶切，使用连接酶Solution I将酶切后的片段与载体连接(16℃，8h)。将上述连接液与大肠杆菌JM109感受态细胞混匀并在冰上静置30min，然后42℃热击90s，再加入0.6mL LB培养基，于37℃、200r·min^-1培养1h，均匀涂布于LB固体培养基，37℃倒置培养10h。

以bshF和bshR为引物进行菌落PCR的方法鉴定阳性克隆子，最终获得含有bsh基因的重组表达质粒pET-22b(+)-bsh。

4)选取测序正确的质粒pET-22b(+)-bsh转化大肠杆菌BL21(DE3)，菌落PCR挑选阳性克隆。得到重组菌大肠杆菌BL21(DE3)(pET-22b(+)-bsh)。

实施例2：重组菌的酶活测定和蛋白电泳

培养方法：挑取大肠杆菌BL21(DE3)(pET-22b(+)-bsh)单菌落接种到LB液体培养基中，于37℃、200r·min^-1条件下培养过夜。种子以2％的接种量转入基本发酵培养基，于37℃、200r·min^-1条件下培养；

诱导条件：发酵液培养至OD₆₀₀为0.6时，加入IPTG(终浓度1mmol·L^-1)，诱导10h。取样用于重组胆盐水解酶酶活测定和SDS-PAGE检测。

以空载体作为对照，通过蛋白电泳(SDS-PAGE)得到一条分子量大小约为37.5kDa的蛋白条带(见图2)，表明重组菌成功表达了胆盐水解酶。

实施例3：培养条件对产酶的影响

(1)将基因工程菌种子液以1％的接种量转入基本发酵培养基，于培养至OD₆₀₀值为1.5，然后加入终浓度为0.8mmol·L^-1的IPTG诱导，在20℃诱导培养26h。得到的重组胆盐水解酶对GDCA、TDCA两种底物的酶活分别为105.3U·mL^-1、120.3U·mL^-1。

(2)将基因工程菌种子液以3％的接种量转入基本发酵培养基，于36-38℃下培养至OD₆₀₀值为2.0，然后加入终浓度为1.0mmol·L^-1的IPTG诱导，在20℃诱导培养36h。重组胆盐水解酶对GDCA、TDCA两种底物的酶活达到最高，分别为123.1U·mL^-1、115.2U·mL^-1。

(3)比较了不同诱导OD₆₀₀对发酵产酶的影响，具体是：将种子液以2％的接种量转接至TB培养基，同时加入氨苄青霉素，在37℃、200r·min_- ¹下分别培养至OD₆₀₀为0.6、1.0、1.5、2.0、2.5，加入IPTG(终浓度1mmol·L^-1)，在20℃下培养32h，定时取样检测胞内酶活。结果如3所示。结果显示，当OD₆₀₀为2.0时诱导表达，重组胆盐水解酶对GDCA、TDCA两种底物的酶活达到最高，分别为132.32U·mL^-1、120.43U·mL^-1。OD₆₀₀为0.5的时候重组胆盐水解酶对GDCA、TDCA两种底物的酶活仅为78.23U·mL^-1、70.57U·mL^-1。这是因为20℃培养的时候，菌体生长较慢，还没有进入对数生长期，此时诱导表达抑制了宿主菌本身的生长繁殖。而当诱导OD₆₀₀过高的时候，诱导剂相对不足，T7启动子不能被完全启动。所以，最优的诱导OD₆₀₀为2.0。

(4)比较了不同接种量对重组胆盐水解酶酶活的影响，具体是将种子液以1-5％的接种量转接至TB培养基，培养至OD₆₀₀为2.0，加入IPTG(终浓度1mmol·L^-1)诱导。结果如图4所示。结果表明，在2％的接种量下，重组胆盐水解酶对GDCA、TDCA两种底物的酶活达到最高，分别为135.58U·mL^-1、121.74U·mL^-1。

实施例4：胆盐水解酶的纯化及酶学性质分析

菌株培养：将重组菌种子液以2％转接基本发酵培养基，与37℃200rpm培养至OD₆₀₀2.0，然后加入终浓度为1mmol/L的IPTG在20℃下诱导32h。收集菌体，超声破碎后离心取上清。

酶的纯化：用5-15mL的结合缓冲溶液以1mL·min^-1的流速平衡纯化柱HisTrap FF crude(1mL)(GE公司，康涅狄格州费尔菲尔德市，美国)。样品以1mL·min^-1流速流进纯化柱，然后用15mL结合缓冲溶液将未结合蛋白洗脱，最后用洗脱缓冲溶液梯度洗脱，收集目的蛋白。其中，结合缓冲溶液的配制：20mmol·L^-1磷酸盐缓冲溶液，0.5mol·L^-1NaCl，20mmol·L^-1咪唑，pH 7.4。洗脱缓冲溶液的配制：20mmol·L^-1磷酸盐缓冲溶液，0.5mol·L^-1NaCl，0.5mmol·L^-1咪唑，pH 7.4。

酶学性质分析：

(1)最适反应温度与温度稳定性的测定：分别在4℃-50℃的不同温度下测定重组胆盐水解酶的酶活，以酶活最高值作为100％。酶液分别在4℃-50℃的不同温度下孵育30min，测定重组胆盐水解酶酶活，以未孵育的样品的酶活为100％。结果如图5所示，重组胆盐水解酶的最适反应温度为37℃，在4-37℃范围内能够保持95％以上的活性，在45℃和50℃孵育30min，酶活残留分别为68％和28％。

(2)最适反应pH与pH稳定性测定：分别检测重组胆盐水解酶在pH 4.0至8.5的不同环境下酶活(以GDCA为底物)，以酶活最高值作为100％。酶液分别在pH 4.5至9的不同pH下孵育30min，检测重组胆盐水解酶活性，以未孵育样品的酶活为100％。不同pH环境所用缓冲溶液分别为：50mmol·L^-1醋酸钠缓冲液(pH 4.0-5.5)，50mmol·L^-1磷酸钠缓冲液(pH6.0-9.0)。结果图图6所示，重组胆盐水解酶的最适反应pH范围为6.0-7.0，在pH 6.0-9.0范围内稳定性最好，37℃放置30min后，重组酶保留95％以上活性。

(3)底物特异性测定：分别以人体中的六种胆盐GCA、GDCA、GCDCA、TCA、TDCA和TCDCA为底物，测定重组重组胆盐水解酶酶活，以酶活最高值为100％。结果如图7所示，重组胆盐水解酶对甘氨结合胆盐酶活明显高于牛磺结合胆盐，其中重组胆盐水解酶对GCA酶活最高，为220.1U·mg^-1，对TCA的相对酶活为70.3％，重组胆盐水解酶对TCDCA酶活最低，仅为最高酶活的35.4％。且重组胆盐水解酶对TCA的相对酶活70.3％高于文献报道的其他来源的胆盐水解酶。

(4)反应动力学参数：不同浓度的底物GDCA、TDCA加入反应体系中，37℃下孵育30min，测定比酶活。根据Hill方程拟合数据并计算重组酶催化反应比酶活(V_max)，酶反应速率最大是底物浓度(S_0.5)，转换数(k_cat)。Hill方程：

$V=\frac{V_{\max }{\[s\]}^h}{{\[S\]}^h+S_{0.5}^h}$

其中，v是反应速度，h是希尔系数，S_0.5是最大反应速度一半时的底物浓度。

结果表1所示，重组胆盐水解酶对GDCA的催化效率(k_cat)和亲和力(k_cat/S_0.5)高于TDCA。

表1重组胆盐水解酶酶动力学参数

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种产胆盐水解酶的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的胆盐水解酶。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以Escherichia coliBL21(DE3)为宿主，以pET-22b(+)为质粒载体。

3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述胆盐水解酶的核苷酸序列是SEQ ID NO.2所示的序列。

4.权利要求1所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法是化学合成或者扩增得到SEQ ID NO.2所示的基因序列，然后将基因序列连接到表达载体pET-22b(+)上得到重组质粒，然后将重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中得到的。

5.权利要求1-3任一所述基因工程菌在胆盐水解酶生产中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用是将基因工程菌种子液以1-3％的接种量转入基本发酵培养基，于36-38℃下培养至OD₆₀₀值为1.5-2.0，然后加入终浓度为0.8-1.0mmol·L^-1的IPTG诱导，在20℃诱导培养26-36h。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述基本发酵培养基为TB培养基，含有：酵母浸出粉24g·L^-1，蛋白胨10-24g·L^-1，甘油3-4g·L^-1，KH₂PO₄12-17mmol·L^-1，K₂HPO₄68-72mmol·L^-1。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是将基因工程菌种子液以2％的接种量转入基本发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养至OD₆₀₀值为2.0，然后加入终浓度为1.0mmol·L^-1的IPTG诱导，在20℃诱导培养32h。

9.根据权利要求5所述应用得到的胆盐水解酶。

10.权利要求9所述胆盐水解酶在降低胆固醇方面的应用。