CN103898034A - 一种生物法合成聚3-羟基丙酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组大肠杆菌工程菌株、该菌株的制备方法以及利用该重组大肠杆菌工程菌株通过生物法从乙酰辅酶A生物合成聚3-羟基丙酸的方法。本发明通过以葡萄糖或甘油等为碳源，在适当的宿主细胞(例如，大肠杆菌)中共同过量表达内源或外源的乙酰辅酶A羧化酶基因(acc)和丙酰辅酶A合成酶基因(prpE)，以及外源的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因(mcr)和聚羟基脂肪酸合成酶基因(phaC)，利用葡萄糖降解中间产物乙酰辅酶A生物合成聚3-羟基丙酸。其中乙酰辅酶A最终是从诸如葡萄糖的简单起始材料获得。

Description

一种生物法合成聚3-羟基丙酸的方法

技术领域

本发明涉及聚3-羟基丙酸的生物合成。具体地，本发明提供了一种重组大肠杆菌工程菌株、该菌株的制备方法以及利用该重组大肠杆菌工程菌株从乙酰辅酶A生物合成聚3-羟基丙酸的方法。 

背景技术

聚3-羟基丙酸(poly(3-hydroxypropionate)，P3HP)是一种非常有发展前景的可生物降解塑料，具有优异的生物材料性质和机械性能，比如具有高机械强度和拉伸强度(＞400MPa)、高断裂伸长量(＞300％)、生物降解性、生物兼容性、不溶于水、无毒、压电性、热塑性等。相对于其它两种研究较多的可生物降解塑料聚3-羟基丁酸(PHB)和聚乳酸(PLA)来说，P3HP具有更优越的性能：它比PLA具有更好的稳定性不会水解，又由于碳链骨架中没有甲基而比PHB更易被微生物降解。作为新型功能材料，P3HP可广泛应用于地膜、矫形外科、个人卫生用品、药物控释、包装等领域。 

目前已知的生物并不能合成天然P3HP。P3HP的化学合成方法中以β-丙内酯开环聚合方法最为成熟。由于β-丙内酯为致癌物质且价格昂贵，限制了该方法的应用。与化学合成法相比，生物合成P3HP具有操作简单、条件温和、绿色环保等优点。然而，P3HP的生物合成目前多需添加3-羟基丙酸、1，5-戊二醇、1，7-庚二醇等相关碳源，这些相关碳源价格昂贵，使P3HP的生产成本过高，无法应用于工业化生产。生物法利用非相关碳源合成P3HP的研究刚刚起步，仅有一篇文献报道Andreessen等利用工程大肠杆菌以甘油为碳源生产P3HP(Andreessen et al.2010)，且需要两步培养法，发酵工艺较为复杂。 

发明内容

为解决上述现有技术中存在的问题，本发明主要通过在大肠杆菌中建立起利用葡萄糖降解中间产物乙酰辅酶A合成聚3-羟基丙酸的生物合成途径，从而在重组大肠杆菌工程菌中实现了大量生物合成聚3-羟基丙酸的目的。 

因此，在第一个方面，本发明提供了一种重组大肠杆菌菌株，所述菌株包含： 

(1)编码乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子、与乙酰辅酶A羧化酶基因具有70％以上同源性且编码具有乙酰辅酶A羧化酶功能的蛋白的核酸分子或与乙酰辅酶A羧化酶基因没有明显的同源性但编码具有乙酰辅酶A羧化酶功能的蛋白的核酸分子； 

(2)编码丙二酸单酰辅酶A还原酶的核酸分子、与丙二酸单酰辅酶A还原酶基因具有70％以上同源性且编码具有丙二酸单酰辅酶A还原酶功能的蛋白的核酸分子或与丙二酸单酰辅酶A还原酶基因没有明显的同源性但编码具有丙二酸单酰辅酶A还原酶功能的蛋白的核酸分子； 

(3)编码丙酰辅酶A合成酶的核酸分子、与丙酰辅酶A合成酶基因具有70％以上同源性且编码具有丙酰辅酶A合成酶功能的蛋白的核酸分子或与丙酰辅酶A合成酶基因没有明显的同源性但编码具有丙酰辅酶A合成酶功能的蛋白的核酸分子；和 

(4)编码聚羟基脂肪酸合成酶的核酸分子、与聚羟基脂肪酸合成酶基因具有70％以上同源性且编码具有聚羟基脂肪酸合成酶功能的蛋白的核酸分子或与聚羟基脂肪酸合成酶基因没有明显的同源性但编码具有聚羟基脂肪酸合成酶功能的蛋白的核酸分子。 

其中所述乙酰辅酶A羧化酶基因acc选自： 

1)埃希氏菌属大肠杆菌的乙酰辅酶A羧化酶基因acc， 

2)来源于其他细菌的乙酰辅酶A羧化酶基因，例如，沙门氏菌的乙酰辅酶A羧化酶基因， 

3)和埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因同源性超过70％且编码具有与埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因编码的乙酰辅酶A羧化酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或 

4)来源于其它生物体，和埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因没有明显 的同源性，但编码与埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因编码的乙酰辅酶A羧化酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。 

其中所述丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr选自： 

1)绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr， 

2)来源于其他细菌的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因， 

3)和绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因同源性超过70％且编码具有与绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因编码的丙二酸单酰辅酶A还原酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或 

4)来源于其它生物体，和绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因没有明显的同源性，但编码与绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因编码的丙二酸单酰辅酶A还原酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。 

其中所述丙酰辅酶A合成酶基因prpE选自： 

1)埃希氏菌属大肠杆菌的丙酰辅酶A合成酶基因prpE， 

2)来源于其他细菌的丙酰辅酶A合成酶基因，例如，沙门氏菌的丙酰辅酶A合成酶基因， 

3)和埃希氏菌属大肠杆菌的prpE基因同源性超过70％且编码具有与埃希氏菌属大肠杆菌的prpE基因编码的丙酰辅酶A合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或 

4)来源于其它生物体，和埃希氏菌属大肠杆菌的prpE基因没有明显的同源性，但编码与埃希氏菌属大肠杆菌的prpE基因编码的丙酰辅酶A合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。 

其中所述乙酰辅酶A羧化酶、丙二酸单酰辅酶A还原酶和丙酰辅酶A合成酶这三种酶活性的共同提高增加聚3-羟基丙酸的前体物质3-羟基丙酰辅酶A的量。 

其中所述聚羟基脂肪酸合成酶基因phaC1选自： 

1)产碱杆菌属真氧产碱杆菌的聚羟基脂肪酸合成酶基因phaC1， 

2)和产碱杆菌属真氧产碱杆菌的phaC1基因同源性超过70％且编码具有与产碱杆菌属真氧产碱杆菌的phaC1基因编码的聚羟基脂肪酸合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或 

3)来源于其它生物体，和产碱杆菌属真氧产碱杆菌的phaC1基因没 有明显的同源性，但编码与产碱杆菌属真氧产碱杆菌的phaC1基因编码的聚羟基脂肪酸合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。 

在本发明的一个更优选的方面，所述重组大肠杆菌菌株为保藏编号为CGMCC NO.6615的菌株P3HP01，该菌株于2012年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国北京朝阳区大屯路中科院微生物研究所，邮编：100101)。 

在第二个方面，本发明提供了一种制备重组大肠杆菌菌株的方法，该方法包括以下步骤： 

(1)制备包含聚羟基脂肪酸合成酶基因phaC1、丙酰辅酶A合成酶基因prpE和丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr的重组质粒A； 

(2)制备包含乙酰辅酶A羧化酶基因acc的重组质粒B； 

(3)将上述质粒A和B共同转化大肠杆菌感受态细胞，通过筛选获得同时包含聚羟基脂肪酸合成酶、丙酰辅酶A合成酶、丙二酸单酰辅酶A和乙酰辅酶A羧化酶四种酶活性的重组大肠杆菌菌株。 

在这一方面中，本领域技术人员应该理解，在根据本发明的第一方面确定了聚羟基脂肪酸合成酶、丙酰辅酶A合成酶、丙二酸单酰辅酶A和乙酰辅酶A羧化酶四种基因的核苷酸序列后，可以利用常规分子重组克隆技术将上述四种基因的核苷酸序列与适当的表达控制元件可操作性连接或彼此之间可操作性连接，然后克隆到适宜的大肠杆菌细胞中，并且筛选得到同时包含聚羟基脂肪酸合成酶、丙酰辅酶A合成酶、丙二酸单酰辅酶A和乙酰辅酶A羧化酶这四种酶活性的重组大肠杆菌菌株。此外，上述四种酶的核苷酸序列如果不是来源于大肠杆菌，则可以针对大肠杆菌进行密码子优化，这也是在本领域技术人员的能力范围之内的。 

在第三个方面，本发明提供了生物法合成聚3-羟基丙酸的方法，具体是一种从乙酰辅酶A生物合成聚3-羟基丙酸的方法，所述方法通过将本发明第一方面所述的重组大肠杆菌菌株在适宜于其生长的条件下在包含适当的表达诱导剂的培养基中进行培养，所述重组大肠杆菌菌株利用葡萄糖降解中间产物乙酰辅酶A生物合成聚3-羟基丙酸。 

在所述生物法合成聚3-羟基丙酸的方法中，乙酰辅酶A最终是从诸如葡萄糖的简单起始材料获得，由此建立可持续发展的聚3-羟基丙酸合成工 艺路线。与Andreessen等以甘油为碳源相比，乙酰辅酶A作为糖代谢的中间体，原料来源更广泛，成本更低；此外，从乙酰辅酶A合成聚3-羟基丙酸的过程中，还原力平衡。本发明生产工艺简单，成本低廉，具有广阔的应用前景。 

本发明主要通过基因工程手段提高丙二酸单酰辅酶A还原酶(MCR)途径中限速酶的活性，即提高乙酰辅酶A羧化酶基因(acc)、丙二酸单酰辅酶A还原酶基因(mcr)和丙酰辅酶A合成酶基因(prpE)的活性，从而增加聚3-羟基丙酸的合成前体物3-羟基丙酰辅酶A的量，再利用细菌聚3-羟基丙酸合成酶将3-羟基丙酰辅酶A催化合成目标产物聚3-羟基丙酸。最终在大肠杆菌细胞中成功建立一种聚3-羟基丙酸生物合成代谢途径。 

在本发明的一个优选的方面中，本发明提供一种生物法合成聚3-羟基丙酸的方法，所述方法包括下述步骤： 

第一步，利用分子克隆方法构建共同过量表达内源或外源的乙酰辅酶A羧化酶基因(acc)和丙酰辅酶A合成酶基因(prpE)，以及外源的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因(mcr)和聚羟基脂肪酸合成酶基因(phaC)的重组宿主细胞； 

第二步，将第一步构建得到的重组宿主细胞在适当的培养基中培养发酵，添加表达诱导剂诱导适当的时间； 

第三步，收集菌体，离心，水洗，冻干后，氯仿萃取，得到的聚3-羟基丙酸产物。 

其中，所述宿主细胞可以为大肠杆菌或肺炎克雷伯氏菌，优选大肠杆菌。所用的重组方法为本领域中的常规分子克隆方法。例如，实施例中所述的构建方法。可以将上述各种酶构建到可诱导的启动子的控制下，例如，可以用IPTG诱导上述酶类的表达。 

所述“适当的培养基”包括以各种适于所选用的宿主细胞(例如，大肠杆菌)生长的培养基，对培养基的碳源没有特别的限定，碳源可以是葡萄糖、甘油等，只要是能产生乙酰辅酶A的碳源均可。优选成本低的碳源，例如，葡萄糖或甘油。 

其中所述的乙酰辅酶A羧化酶基因(acc)、丙酰辅酶A合成酶基因 (prpE)、丙二酸单酰辅酶A还原酶基因(mcr)和聚羟基脂肪酸合成酶基因(phaC)均如本发明第一方面所述。 

更具体地，本发明提供以下各项： 

1.一种重组大肠杆菌菌株，所述菌株包含： 

(1)编码乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子、与乙酰辅酶A羧化酶基因具有70％以上同源性且编码具有乙酰辅酶A羧化酶功能的蛋白的核酸分子或与乙酰辅酶A羧化酶基因没有明显的同源性但编码具有乙酰辅酶A羧化酶功能的蛋白的核酸分子； 

(2)编码丙二酸单酰辅酶A还原酶的核酸分子、与丙二酸单酰辅酶A还原酶基因具有70％以上同源性且编码具有丙二酸单酰辅酶A还原酶功能的蛋白的核酸分子或与丙二酸单酰辅酶A还原酶基因没有明显的同源性但编码具有丙二酸单酰辅酶A还原酶功能的蛋白的核酸分子； 

(3)编码丙酰辅酶A合成酶的核酸分子、与丙酰辅酶A合成酶基因具有70％以上同源性且编码具有丙酰辅酶A合成酶功能的蛋白的核酸分子或与丙酰辅酶A合成酶基因没有明显的同源性但编码具有丙酰辅酶A合成酶功能的蛋白的核酸分子； 

(4)编码聚羟基脂肪酸合成酶的核酸分子、与聚羟基脂肪酸合成酶基因具有70％以上同源性且编码具有聚羟基脂肪酸合成酶功能的蛋白的核酸分子或与聚羟基脂肪酸合成酶基因没有明显的同源性但编码具有聚羟基脂肪酸合成酶功能的蛋白的核酸分子。 

2.根据第1项所述的重组大肠杆菌菌株，其中所述乙酰辅酶A羧化酶基因(acc)选自： 

1)埃希氏菌属大肠杆菌的乙酰辅酶A羧化酶基因， 

2)来源于其他细菌的乙酰辅酶A羧化酶基因，例如，沙门氏菌的乙酰辅酶A羧化酶基因， 

3)和埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因同源性超过70％且编码具有与埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因编码的乙酰辅酶A羧化酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或 

4)来源于其它生物体，和埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因没有明显的同源性，但编码与埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因编码的乙酰辅酶A羧化酶 相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。 

3.根据第1项所述的重组大肠杆菌菌株，其中所述丙二酸单酰辅酶A还原酶基因(mcr)选自： 

1)绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因， 

2)来源于其他细菌的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因， 

3)和绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因同源性超过70％且编码具有与绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因编码的丙二酸单酰辅酶A还原酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或 

4)来源于其它生物体，和绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因没有明显的同源性，但编码与绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因编码的丙二酸单酰辅酶A还原酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。 

4.根据第1项所述的重组大肠杆菌菌株，其中所述丙酰辅酶A合成酶基因(prpE)选自： 

1)埃希氏菌属大肠杆菌的丙酰辅酶A合成酶基因， 

2)来源于其他细菌的丙酰辅酶A合成酶基因，例如，沙门氏菌的丙酰辅酶A合成酶基因， 

3)和埃希氏菌属大肠杆菌的prpE基因同源性超过70％且编码具有与埃希氏菌属大肠杆菌的prpE基因编码的丙酰辅酶A合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或 

4)来源于其它生物体，和埃希氏菌属大肠杆菌的prpE基因没有明显的同源性，但编码与埃希氏菌属大肠杆菌的prpE基因编码的丙酰辅酶A合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。 

5.根据第1项所述的重组大肠杆菌菌株，其中所述乙酰辅酶A羧化酶/丙二酸单酰辅酶A还原酶和丙酰辅酶A合成酶这三种酶活性的共同提高增加聚3-羟基丙酸的前体物质3-羟基丙酰辅酶A的量。 

6.根据第1项所述的重组大肠杆菌菌株，其中所述聚羟基脂肪酸合成酶基因(phaC1)选自： 

1)产碱杆菌属真氧产碱杆菌的聚羟基脂肪酸合成酶基因， 

2)和产碱杆菌属真氧产碱杆菌的phaC1基因同源性超过70％且编码具有与产碱杆菌属真氧产碱杆菌的phaC1基因编码的聚羟基脂肪酸合成酶相 同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或 

3)来源于其它生物体，和产碱杆菌属真氧产碱杆菌的phaC1基因没有明显的同源性，但编码与产碱杆菌属真氧产碱杆菌的phaC1基因编码的聚羟基脂肪酸合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。 

7.根据第1项所述的重组大肠杆菌菌株，所述菌株的保藏号为CGMCC NO.6615。 

8.一种生物法合成聚3-羟基丙酸的方法，所述方法通过将第1-7项中任一项所述的重组大肠杆菌菌株在适宜于其生长的条件下在包含适当的表达诱导剂的培养基中进行培养发酵，所述重组大肠杆菌菌株利用葡萄糖降解中间产物乙酰辅酶A生物合成聚3-羟基丙酸。 

9.一种可生物降解的材料，其由根据第8项所述的方法合成的聚3-羟基丙酸制成。 

10.根据第9项所述的材料，所述材料选自包装材料、缓释材料、电化学材料或组织工程材料。 

定义和缩写 

在本文中使用下列的缩写或简称： 

乙酰辅酶A羧化酶基因：acc 

丙酰辅酶A合成酶基因：prpE 

丙二酸单酰辅酶A还原酶基因：mcr 

聚羟基脂肪酸合成酶基因：phaC 

大肠杆菌(Escherichia coli)：E.coli 

“可操作性连接”指在表达调控元件和受调控序列(例如基因)的多核苷酸之间的功能连接，使得受调控序列在适于表达该受调控序列的条件下表达，从而产生所期望的肽或多肽。例如，表达调控元件可以是转录调控元件如启动子、增强子序列和其他顺式作用元件等。 

“过量表达”或“过表达”是指特定基因在生物体中的表达超过正常水平(即，野生型表达水平)，例如，通过增强内源表达或引入外源基因来实现。 

保藏说明： 

本发明构建的重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli，又称大肠杆菌)菌株已于2012年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国北京朝阳区大屯路中科院微生物研究所，邮编：100101)，保藏编号为CGMCC NO.6615，命名为P3HP01。 

附图简述 

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中： 

图1.利用乙酰辅酶A生物合成聚3-羟基丙酸代谢途径示意图； 

图2.pET21a-phaC-prpE-mcr载体构建示意图(即，pHP304质粒图谱)； 

图3.重组大肠杆菌目标蛋白的表达鉴定图，M表示分子量标记，泳道1为E.coli BL21(DE3)/pACYCDuet-1/pET21a，泳道2为E.coliBL21(DE3)/pACYC-accABCD，泳道3为E.coli BL21(DE3)/pHP304，泳道4为E.coli BL21(DE3)/pHP304/pACYC-accABCD，箭头表示外源蛋白的表达，乙酰辅酶A羧化酶C亚基AccC(49.3kDa)，A亚基AccA和D亚基AccD(35kDa和33.3kDa)，B亚基AccB(16.7kDa)，丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR(132kDa)，和聚羟基脂肪酸合成酶PhaC1(64kDa)； 

图4.本发明的重组细胞发酵生产聚3-羟基丙酸的核磁图谱，a图为H谱，b图为C谱。 

序列表说明 

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。 

除非特别指明，实施例中所用的方法均为本领域常规方法，所用试剂均为市售试剂。 

实施例1 

通过在大肠杆菌(E.coli)中共同过量表达来源于大肠杆菌的乙酰辅酶A羧化酶基因(acc)和丙酰辅酶A合成酶基因(prpE)，来源于C.aurantiacus(橙色绿曲挠菌)的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因(mcr)和来源于R.eutropha(真氧产碱杆菌)的聚羟基脂肪酸合成酶基因(phaC)，利用葡萄糖降解中间产物乙酰辅酶A生物合成聚3-羟基丙酸。 

本领域技术人员应该理解，将上述四种基因共同克隆到大肠杆菌细胞中，各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行。并且，也可以根据实际需要，对不是来源于大肠杆菌的基因进行适当的大肠杆菌密码子优化，以便能够更好地在大肠杆菌中表达。在本发明中，本发明人发现，来源于C.aurantiacus(橙色绿曲挠菌)的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因(mcr)无需针对大肠杆菌进行密码子优化就可以在大肠杆菌中很好地表达，来源于R.eutropha(真氧产碱杆菌)的聚羟基脂肪酸合成酶基因(phaC)需要针对大肠杆菌进行密码子优化。 

1.1外源基因的克隆和表达载体的构建 

1.1.1外源基因的克隆 

1.1.1.1C.aurantiacus(橙色绿曲挠菌)丙二酸单酰辅酶A还原酶基因的克隆 

以质粒pTrc99A-MCR(该质粒由Dr.Georg Fuchs(Freiburg)提供，其构建方法可参见Kroeger et al.2011)为模板，设计引物Mcr-L和Mcr-R，PCR扩增丙二酸单酰辅酶A还原酶基因(mcr)(SEQ ID NO：4)，再利用胶回收试剂盒(购自ZYMO RESEACH)回收目的基因片段。 

扩增引物序列为： 

Mcr-L：5’-GGCAGATCTCAGCGGAACAGGACGAC-3’ 

Mcr-R：5’-CCCTCGAGGAATTTACACGGTAATCGC-3’ 

1.1.1.2E.coli丙酰辅酶A合成酶基因的克隆 

提取E.coli BL21的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物，PCR扩增丙酰辅酶A合成酶基因(prpE)(SEQ ID NO：5，GenBank登记号：8181460)。再利用胶回收试剂盒回收目的基因片段。 

扩增引物序列为： 

prpE-L：5’-CAGGATCCGGAGGAATAAACCATGTCTTTTAGCGAATTTTATC-3’ 

prpE-R：5’-CAGAAGCTTACTCTTCCATCGCCTGGC-3’ 

1.1.1.3R.eutropha(真氧产碱杆菌)聚羟基脂肪酸合成酶基因的克隆 

利用化学合成方法(上海捷瑞生物工程有限公司，上海市松江区九亭镇同利路433号)合成来源于R.eutropha的phaC1基因(GenBank登记号4250156)，并经过密码子优化，得到最适合在大肠杆菌中表达的序列SEQ ID NO：6。 

1.1.2表达载体的构建 

1.1.2.1pHP301载体的构建 

将质粒pGH-phaC1(购自上海捷瑞生物工程有限公司)用NdeI和BamHI进行双酶切，将胶回收后的phaC1基因片段与经过NdeI和BamHI双酶切的pET21a(+)载体(购自Novagen)进行连接，载体与phaC1基因片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有50μg·mL^-1氨苄青霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pHP301(pET21a-phaC)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。 

1.1.2.2pHP302载体的构建 

将胶回收后的prpE基因与得到的pHP301载体分别用BamHI和HindIII进行双酶切，载体与prpE基因片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有50μg·mL^-1氨苄青霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pHP302(pET21a-phaC-prpE)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。 

1.1.2.3pHP303载体的构建 

将胶回收后的mcr基因与pCOLADuet-1载体(购自Novagen)分别用BglII和XhoI进行双酶切，载体与mcr基因片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有50μg·mL^-1卡那霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pHP303(pCOLA Duet-mcr)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。 

1.1.2.4pHP304载体的构建 

将重组质粒pHP303用HindIII和XhoI进行双酶切，得到包含T7启动子和mcr基因的片段，与经HindIII和XhoI双酶切的重组质粒pHP302连接，载体与包含T7启动子和mcr基因的片段按摩尔比1∶5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有50μg·mL^-1氨苄青霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pHP304(pET21a-phaC-prpE-mcr)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。 

1.2E.coli(pHP304/pACYC-accABCD)重组菌株的构建 

将pHP304和pACYC-accABCD(由曹玉锦提供，也可参见Cao et al.2011)重组质粒热击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于加有氨苄青霉素和氯霉素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得含有双质粒的工程大肠杆菌菌株P3HP01(pHP304/pACYC-accABCD)，该菌株已于2012年9月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国北京朝阳区大屯路中科院微生物研究所，邮编：100101)，保藏编号为CGMCC NO.6615。。 

其中acc基因亚基A的核苷酸序列参见SEQ ID NO：1，acc基因亚基BC的核苷酸序列参见SEQ ID NO：2，acc基因亚基D的核苷酸序列参见SEQ IDNO：3。 

1.3SDS-PAGE鉴定目标蛋白的表达 

将活化后的工程大肠杆菌按1∶100的接种量接种到10mL LB液体培养液中(内含50μg·mL^-1氨苄青霉素)，37℃，225rpm振荡培养，OD达到0.6时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mmol·L^-1，而后继续培养2h，诱导表达目的蛋白。取出诱导后的培养物，12000g离心2min，收集菌体， 菌体细胞用0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH7.8)洗涤一次，按1∶10的比例再用此缓冲液重悬细胞，加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸10min，瞬时高速离心，10％SDS-PAGE电泳检测，即可检测到目标蛋白的表达(图3)。 

1.4工程大肠杆菌的摇瓶发酵试验 

将活化后的工程大肠杆菌按1∶100的比例接种到含有50mlM9液体培养基(1L M9salts：20g Glucose，6g Na₂HPO₄，3g KH₂PO₄，2g(NH₄)₂SO₄，0.5g yeast extract，0.2g MgSO₄·7H₂O，30mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)，121℃高压蒸汽灭菌15min。)的250ml摇瓶中，氨苄青霉素的浓度为50μg·mL^-1，37℃，225rpm条件下振荡培养，当OD_600nm为0.6时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.2mmol·L^-1，此后，每隔12h添加IPTG(0.2mM)，biotin(40mg L-1)，NaHCO₃(20mM)。诱导后60h终止发酵。 

收集菌体，离心，水洗两遍，冻干后，氯仿萃取，得到的聚3-羟基丙酸产物通过核磁共振(AVANCE III 600，Bruker，Switzerland)对其进行定性分析，分析方法参见(Wang et al.2009)。核磁图谱(图4)证实确实获得的产物确实为聚3-羟基丙酸。 

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。 

参考文献： 

1.Andreessen B，Lange AB，Robenek H，Steinbüchel A(2010)Conversionof glycerol to poly(3-hydroxypropionate)in recombinant Escherichia coli.Appl Environ Microbiol 76(2)：622-626. 

2.Cao YJ，Jiang XL，Zhang RB，Xian M(2011)Improved phloroglucinolproduction by metabolically engineered Escherichia coli.Appl MicrobiolBiotechnol 91(6)：1545-1552. 

3.Kroeger JK，Zarzycki J，Fuchs G(2011)A spectrophotometric assay formeasuring acetyl-coenzyme A carboxylase.Anal Biochem 411(1)：100-105. 

4.Wang HH，Li XT，Chen GQ(2009)Production and characterization ofhomopolymer polyhydroxyheptanoate(P3HHp)by a fadBA knockout mutantPseudomonas putida KTOY06derived from P.putida KT2442.ProcessBiochemistry 44(1)：106-111. 

Claims (10)

1.一种重组大肠杆菌菌株，所述菌株包含：

(1)编码乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子、与乙酰辅酶A羧化酶基因具有70％以上同源性且编码具有乙酰辅酶A羧化酶功能的蛋白的核酸分子或与乙酰辅酶A羧化酶基因没有明显的同源性但编码具有乙酰辅酶A羧化酶功能的蛋白的核酸分子；

(2)编码丙二酸单酰辅酶A还原酶的核酸分子、与丙二酸单酰辅酶A还原酶基因具有70％以上同源性且编码具有丙二酸单酰辅酶A还原酶功能的蛋白的核酸分子或与丙二酸单酰辅酶A还原酶基因没有明显的同源性但编码具有丙二酸单酰辅酶A还原酶功能的蛋白的核酸分子；

(3)编码丙酰辅酶A合成酶的核酸分子、与丙酰辅酶A合成酶基因具有70％以上同源性且编码具有丙酰辅酶A合成酶功能的蛋白的核酸分子或与丙酰辅酶A合成酶基因没有明显的同源性但编码具有丙酰辅酶A合成酶功能的蛋白的核酸分子；和

(4)编码聚羟基脂肪酸合成酶的核酸分子、与聚羟基脂肪酸合成酶基因具有70％以上同源性且编码具有聚羟基脂肪酸合成酶功能的蛋白的核酸分子或与聚羟基脂肪酸合成酶基因没有明显的同源性但编码具有聚羟基脂肪酸合成酶功能的蛋白的核酸分子。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌菌株，其中所述乙酰辅酶A羧化酶基因acc选自：

1)埃希氏菌属大肠杆菌的乙酰辅酶A羧化酶基因，

2)来源于其他细菌的乙酰辅酶A羧化酶基因，例如，沙门氏菌的乙酰辅酶A羧化酶基因，

3)和埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因同源性超过70％且编码具有与埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因编码的乙酰辅酶A羧化酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或

4)来源于其它生物体，和埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因没有明显的同源性，但编码与埃希氏菌属大肠杆菌的acc基因编码的乙酰辅酶A羧化酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。

3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌菌株，其中所述丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr选自：

1)绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因，

2)来源于其他细菌的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因，

3)和绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因同源性超过70％且编码具有与绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因编码的丙二酸单酰辅酶A还原酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或

4)来源于其它生物体，和绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因没有明显的同源性，但编码与绿屈挠菌属橙色绿屈挠菌的mcr基因编码的丙二酸单酰辅酶A还原酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。

4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌菌株，其中所述丙酰辅酶A合成酶基因prpE选自：

1)埃希氏菌属大肠杆菌的丙酰辅酶A合成酶基因，

2)来源于其他细菌的丙酰辅酶A合成酶基因，例如，沙门氏菌的丙酰辅酶A合成酶基因，

3)和埃希氏菌属大肠杆菌的prpE基因同源性超过70％且编码具有与埃希氏菌属大肠杆菌的prpE基因编码的丙酰辅酶A合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或

4)来源于其它生物体，和埃希氏菌属大肠杆菌的prpE基因没有明显的同源性，但编码与埃希氏菌属大肠杆菌的prpE基因编码的丙酰辅酶A合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。

5.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌菌株，其中所述乙酰辅酶A羧化酶、丙二酸单酰辅酶A还原酶和丙酰辅酶A合成酶这三种酶活性的共同提高增加聚3-羟基丙酸的前体物质3-羟基丙酰辅酶A的量。

6.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌菌株，其中所述聚羟基脂肪酸合成酶基因phaC1选自：

1)产碱杆菌属真氧产碱杆菌的聚羟基脂肪酸合成酶基因，

2)和产碱杆菌属真氧产碱杆菌的phaC1基因同源性超过70％且编码具有与产碱杆菌属真氧产碱杆菌的phaC1基因编码的聚羟基脂肪酸合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列，或

3)来源于其它生物体，和产碱杆菌属真氧产碱杆菌的phaC1基因没有明显的同源性，但编码与产碱杆菌属真氧产碱杆菌的phaC1基因编码的聚羟基脂肪酸合成酶相同或相似的功能的蛋白的核酸序列。

7.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌菌株，所述菌株的保藏号为CGMCC NO.6615。

8.一种生物法合成聚3-羟基丙酸的方法，所述方法通过将权利要求1-7中任一项所述的重组大肠杆菌菌株在适宜于其生长的条件下在包含适当的表达诱导剂的培养基中进行培养发酵，所述重组大肠杆菌菌株利用葡萄糖降解中间产物乙酰辅酶A生物合成聚3-羟基丙酸。

9.一种可生物降解的材料，其由根据权利要求8所述的方法合成的聚3-羟基丙酸制成。

10.根据权利要求9所述的材料，所述材料选自包装材料、缓释材料、电化学材料或组织工程材料。

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