CN107119002A

CN107119002A - 一种合成3‑羟基丙酸的重组菌及其构建方法和应用

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Publication number: CN107119002A
Application number: CN201710291755.5A
Authority: CN
Inventors: 赵广; 李申; 冯新军
Original assignee: Ignition Technology Tianjin Co ltd; Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Ignition Technology Tianjin Co ltd; Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2017-04-28
Filing date: 2017-04-28
Publication date: 2017-09-01
Anticipated expiration: 2037-04-28
Also published as: CN107119002B

Abstract

本发明提供一种合成3‑羟基丙酸的重组菌及其构建方法和制备，属于基因工程领域和发酵工程领域，所述重组菌宿主菌为大肠杆菌，表达编码ATP依赖的蛋白酶水解亚单位的基因clpP、编码乙酰辅酶A羧化酶的基因accABCD和编码丙二酸单酰辅酶A还原酶的基因mcr。制备方法为：获得重组载体pETDuet‑clpP‑mcr、重组载体pACYCDuet‑accADBC；转化到宿主感受态细胞中。本发明解决了微生物发酵过程中，随着3‑羟基丙酸的浓度增加，抑制微生物生长影响产量的问题，相对于没有表达编码ATP依赖的蛋白酶水解亚单位的菌株提高了116％，是已知的摇瓶发酵最高水平。

Description

一种合成3-羟基丙酸的重组菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种合成3-羟基丙酸的重组菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

3-羟基丙酸作为一种平台化合物，是美国能源部公布的未来全球最具开发潜力的12种高附加值生物基化工产品之一，具有广阔的应用前景和很高的经济价值。3-羟基丙酸是一种三碳有机化合物，分子内含羧基和羟基，为乳酸的同分异构体，可作为多种有机物合成的前体物质，生产多种具有商业价值的化合物，如丙烯酸、1,3-丙二醇、丙二酸、丙内酯等，以上几种化学品每年的市场份额超过10亿美元。此外，它还是组成诸多大分子化合物和酯类聚合物的单体，可用于包装材料、金属润滑剂、纺织品抗静电材料、个人日常用品及可吸收医用材料等。目前我国的3-羟基丙酸全部依赖国外进口，国内市场售价高达8.5万元/吨。

目前，3-羟基丙酸的生产以化学合成为主，主要以丙烯酸、3-丙内酯、3-羟丙腈、醋酸乙烯酯和1，3-丙二醇为前体物质，通过一系列化工路线进行转化。化学合成方法具有生产成本较高而产率较低等缺点；同时，用于化学合成的前体物质大都具有毒性大、致癌性的特点，严重制约了产业化应用。生物转化法合成3-羟基丙酸的相关研究起步于近二十年，一些学者利用重组大肠杆菌(Escherichia coli)或肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)以甘油或葡萄糖为底物进行微生物转化。为有效提高3-羟基丙酸产量，转化技术路线也各有不同，研究主要集中于工程菌的构建和发酵工艺的改进。

3-羟基丙酸的生物合成技术虽然已经取得了一些进展，在产量和产率上取得了一定进步。但是，生物法生产3-羟基丙酸还存在诸多问题。其中，产物对菌体生长的抑制作用是制约3-羟基丙酸产量的主要因素之一。微生物发酵过程中，随着3-羟基丙酸的合成和积累，当3-羟基丙酸的浓度达到一定高度时，会抑制微生物的生长，阻碍3-羟基丙酸产量的进一步提升。

发明内容

为解决现有技术中，微生物发酵过程中，随着3-羟基丙酸的合成和积累，当3-羟基丙酸的浓度达到一定高度时，会抑制微生物的生长，阻碍3-羟基丙酸产量的进一步提升的问题，本发明首先提供了一种合成3-羟基丙酸的重组菌，所述重组菌宿主菌为大肠杆菌，表达编码ATP依赖的蛋白酶水解亚单位的基因clpP、编码乙酰辅酶A羧化酶的基因accABCD和编码丙二酸单酰辅酶A还原酶的基因mcr。

在本发明的一种实施方式中，所述的编码ATP依赖的蛋白酶水解亚单位的基因clpP和编码乙酰辅酶A羧化酶的基因accABCD来源于大肠杆菌，编码丙二酸单酰辅酶A还原酶的基因mcr来源于橙色绿屈挠菌。所述ATP依赖的蛋白酶水解亚单位ClcP在NCBI的蛋白质编号为YP_002406280.1，乙酰辅酶A羧化酶亚基AccA在NCBI的蛋白质编号为WP_000055741.1，乙酰辅酶A羧化酶亚基AccB在NCBI的蛋白质编号为WP_000354622.1，乙酰辅酶A羧化酶亚基AccC在NCBI的蛋白质编号为WP_000884639.1，乙酰辅酶A羧化酶基因亚基AccD在NCBI的蛋白质编号为WP_000118404.1，丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR在NCBI的蛋白质编号为AAS20429.1。

上述ATP依赖的蛋白酶水解亚单位基因clcP在NCBI的Gene ID为7150967，乙酰辅酶A羧化酶亚基基因accA、accB、accC和accD在NCBI的Gene ID分别为944895、947758、947761和946796，丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr在NCBI的Gene ID为5827083。

本发明还提供一种构建上述重组菌的方法，包括以下步骤：

1)克隆ATP依赖的蛋白酶水解亚单位基因clpP，将所得基因与质粒pETDuet进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒，获得重组载体pETDuet-clpP；

2)克隆丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr，将所得基因与步骤1)所得载体pETDuet-clpP进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒，获得重组载体pETDuet-clpP-mcr；

3)克隆乙酰辅酶A羧化酶亚基基因accA，将所得基因与质粒pACYCDuet-1进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒，获得重组载体pACYCDuet-accA；

4)克隆乙酰辅酶A羧化酶亚基基因accD，将所得基因与步骤3)所得pACYCDuett-accA进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒，获得重组载体pACYCDuet-accAD；

5)克隆乙酰辅酶A羧化酶亚基基因accBC，将所得基因与步骤4)所得pACYCDuett-accAB进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒，获得重组载体pACYCDuet-accABCD；

6)将步骤2)与步骤5)所获得的重组载体，转化到宿主Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中，获得大肠杆菌重组菌。

所述ATP依赖的蛋白酶水解亚单位ClcP在NCBI的蛋白质编号为YP_002406280.1，乙酰辅酶A羧化酶亚基AccA在NCBI的蛋白质编号为WP_000055741.1，乙酰辅酶A羧化酶亚基AccB在NCBI的蛋白质编号为WP_000354622.1，乙酰辅酶A羧化酶亚基AccC在NCBI的蛋白质编号为WP_000884639.1，乙酰辅酶A羧化酶基因亚基AccD在NCBI的蛋白质编号为WP_000118404.1，丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR在NCBI的蛋白质编号为AAS20429.1。

所述ATP依赖的蛋白酶水解亚单位基因clpP和乙酰辅酶A羧化酶基因accABCD来源于大肠杆菌，丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr来源于橙色绿屈挠菌；所述ATP依赖的蛋白酶水解亚单位基因clpP和乙酰辅酶A羧化酶基因accABCD来源于大肠杆菌，丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr来源于橙色绿屈挠菌；所述ATP依赖的蛋白酶水解亚单位基因clcP在NCBI的Gene ID为7150967，乙酰辅酶A羧化酶亚基基因accA、accB、accC和accD在NCBI的Gene ID分别为944895、947758、947761和946796，丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr在NCBI的Gene ID为5827083。

本发明还提供一种应用上述重组菌发酵生产3-羟基丙酸的方法，步骤如下：

1)活化重组菌，获得种子液；

2)将步骤1)所得的种子液，与含有氨苄青霉素与氯霉素的发酵培养基，按照体积比种子液：发酵培养基＝(1～2):(100～130)的比例接种后，35℃～37℃、180～220rpm、pH＝7.0条件下培养至OD₆₀₀在0.6～0.8，获得培养液；

3)向所得的培养液中加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.01～0.1mM，然后转入30～33℃、180～220rpm、pH＝7.0条件下继续培养24～48小时；

在本发明的一种实施方式中，步骤2)所述培养条件为：37℃，180rpm。

在本发明的一种实施方式中，发酵培养基的碳源为葡萄糖，氮源为无机氮源，如氯化铵或硫酸铵等，其他成分为无机盐。

在本发明的一种实施方式中，发酵培养基的配方为：20g/L葡萄糖，9.8g/L三水磷酸氢二钾，2.1g/L一水合柠檬酸，0.3g/L柠檬酸铁铵，3.0g/L硫酸铵，0.5g/L硫酸镁，18mg/L二水合氯化钙，0.1％(v/v)微量元素。

在本发明的一种实施方式中，微量元素母液的配方为：6.0g/L七水合硫酸亚铁，2.0g/L硼酸，2.0g/L四水合氯化锰，0.8g/L四水合钼酸铵，0.2g/L五水合硫酸铜。

在本发明的一种实施方式中，上述发酵的具体步骤为：将重组菌活化后，按1％的接种量接种到含100μg·mL^-1氨苄青霉素和100μg·mL^-1氯霉素的发酵培养基中，37℃、180rpm条件下振荡培养，待OD₆₀₀达到0.6时，温度调节至30℃，并加入0.05mM IPTG进行诱导；此后，每隔12h添加一次0.05mM IPTG、100μg·mL^-1氨苄青霉素和100μg·mL^-1氯霉素，IPTG初次诱导后48h终止发酵。

本发明所获得的的有益效果如下：

本发明解决了微生物发酵过程中，随着3-羟基丙酸的合成和积累，当3-羟基丙酸的浓度达到一定高度时，会抑制微生物的生长的问题，以Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌株，表达编码ATP依赖的蛋白酶水解亚单位的基因clpP、编码乙酰辅酶A羧化酶的基因accABCD和编码丙二酸单酰辅酶A还原酶的基因mcr。提高了重组菌株的3-羟基丙酸耐受性，并结合整体方案，以葡萄糖为碳源，实现了3-羟基丙酸在产量上的大幅增加。本发明所构建的重组菌具有利用葡萄糖为唯一碳源合成3-羟基丙酸的特点，发酵48h，可以得到6.7g/L的3-羟基丙酸，相对于没有表达编码ATP依赖的蛋白酶水解亚单位的菌株提高了116％，取得了预料不到的技术效果，是已知的摇瓶发酵最高水平。

定义和缩写

在本文中使用下列的缩写或简称：

ATP依赖的蛋白酶水解亚单位基因：clpP

乙酰辅酶A羧化酶A亚基基因：accA

乙酰辅酶A羧化酶B亚基基因：accB

乙酰辅酶A羧化酶C亚基基因：accC

乙酰辅酶A羧化酶D亚基基因：accD

丙二酸单酰辅酶A还原酶基因：mcr

大肠杆菌(Escherichia coli):E.coli

橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)：C.aurantiacus

3-羟基丙酸：3-HP

“过量表达”或“过表达”指特定的基因在生物体中大量表达，表达量超过正常水平(即，野生型表达水平)，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。

具体实施方式

下面通过实例来进一步阐明本发明。但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。

所用酶试剂购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自美国OMEGA公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。

培养基配方：

1)种子液摇瓶培养基

LB培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，其余为水，121℃，20min灭菌。

2)摇瓶发酵培养基

基本改良培养基：20g/L葡萄糖，9.8g/L三水磷酸氢二钾，2.1g/L一水合柠檬酸，0.3g/L柠檬酸铁铵，3.0g/L硫酸铵，0.5g/L硫酸镁，18mg/L二水合氯化钙，0.1％(v/v)微量元素。

微量元素母液的配方：6.0g/L七水合硫酸亚铁，2.0g/L硼酸，2.0g/L四水合氯化锰，0.8g/L四水合钼酸铵，0.2g/L五水合硫酸铜。

在实际培养过程中，可向上述培养基中添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100mg/L的氨苄青霉素和100μg·mL^-1氯霉素。

实施例1重组菌株的构建

1)载体pETDuet-clpP的构建

本实施例中，获取来源于C.aurantiacus的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr(MCR在NCBI的蛋白质编号为AAS20429.1)，是以C.aurantiacus基因组为模板，通过PCR扩增获得(引物：5'-CATGGTACCAGCGGAACAGGACGAC-3'和5'-CCCTCGAGGAATTTACACGGTAATCGC-3')，具体扩增程序如下：

PCR结束后，进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒(OMEGA GelExtraction Kit)回收大小为3700bp左右的目的片段。

将获得的mcr基因片段和质粒pETDuet-1用KpnI和XhoI限制性内切酶在37℃条件下进行双酶切3.5h，酶切产物进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒(OMEGAGel Extraction Kit)回收酶切产物，将回收的载体与mcr基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有100μg·mL^-1氨苄青霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pETDuet-mcr后，再通过限制性酶酶切和测序鉴定，确认mcr基因片段已经正确插入到pETDuet-1载体上。

2)载体pETDuet-clpP-mcr的构建

获取来源于E.coli的ATP依赖的蛋白酶水解亚单位基因(clpP)(ClcP在NCBI的蛋白质编号为YP_002406280.1)，是以E.coli基因组为模板，通过PCR扩增获得(引物：5'-GTAGGATCCGATGTCATACAGCGGCGAACGAG-3'和5'-CAGGAGCTCTCAATTACGATGGGTCAGAATCG-3')，具体扩增程序如下：

PCR结束后，进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒(OMEGA GelExtraction Kit)回收大小为700bp左右的目的片段。

将获得的clpP基因片段和质粒pETDuet-mcr用BamHI和SacI限制性内切酶作用下于37℃水浴锅中酶切3.5h，酶切产物进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒(OMEGA Gel Extraction Kit)回收酶切产物。将回收的载体与clpP基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有100μg·mL^-1氨苄青霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pETDuet-clpP-mcr后，再通过限制性酶酶切和测序鉴定，确认clcP基因片段已经正确插入到表达载体中。

3)载体pACYCDuet-accA的构建

本实施例中，获取来源于E.coli的乙酰辅酶A羧化酶A亚基基因(accA)(AccA在NCBI的蛋白质编号为WP_000055741.1)，是以E.coli基因组为模板，通过PCR扩增获得(引物：5'-CGCGGATCCGATGAGTCTGAATTTCCTTGATTTTG-3'和5'-ATGCGAGCTCTTACGCGTAACCGTAGCTCATC-3')，具体扩增程序如下：

PCR结束后，进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒(OMEGA GelExtraction Kit)回收大小为1000bp左右的目的片段。

将获得的accA基因片段和质粒pACYCDuet-1用BamHI和SacI限制性内切酶在37℃水浴锅中酶切3.5h，回收酶切产物。将回收的载体与accA基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有100μg·mL^-1氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pACYCDuet-accA后，再通过限制性酶酶切和测序鉴定，确认基因accA已经正确插入到表达载体中。

4)载体pACYCDuet-accAD的构建

获取来源于E.coli的乙酰辅酶A羧化酶D亚基基因(accD)(AccD在NCBI的蛋白质编号为WP_000118404.1)，是以E.coli基因组为模板，通过PCR扩增获得(引物：5'-ATGCGAGCTCTTAATACGACTCACTATAGGGG-3'和5'-ACGCGTCGACTCAGGCCTCAGGTTCCTGATC-3')，具体扩增程序如下：

将获得的accD基因片段和质粒pACYCDuet-accA用SacI和SalI在37℃水浴锅中酶切3.5h，回收酶切产物。将回收的载体与accD基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有100μg·mL^-1氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pACYCDuet-accAD后，再通过限制性酶酶切和测序鉴定，确认基因accD片段已经正确插入到表达载体中。

5)载体pACYCDuet-accABCD的构建

获取来源于E.coli的乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因(accBC)(AccB在NCBI的蛋白质编号为WP_000354622.1，AccC在NCBI的蛋白质编号为WP_000884639.1)，是以E.coli基因组为模板，通过PCR扩增获得(引物：5'-GGAATTCCATATGGATATTCGTAAGATTAAAAAAC-3'和5'-CCGCTCGAGTTATTTTTCCTGAAGACCGAG-3')，具体扩增程序如下：

PCR结束后，进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒(OMEGA GelExtraction Kit)回收大小为目的片段。

将获得的accBC基因片段和质粒pACYCDuet-accAD用NdeI和XhoI在37℃水浴锅中酶切3.5h，回收酶切产物。将回收的载体与accBC基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布在加有100μg·mL^-1氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pACYCDuet-accABCD后，再通过限制性酶酶切和测序鉴定，确认已经将accBC片段正确插入到表达载体中。

6)转化

将pETDuet-clpP-mcr和pACYCDuet-accABCD导入E.coli BL21(DE3)合成3-HP

将实施例1中获得的载体pETDuet-clpP-mcr与实施例2中获得的载体pACYCDuet-accABCD导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布在含有100μg·mL^-1氨苄青霉素和100μg·mL^-1氯霉素的LB固体平板；涂布后的平板置于37℃恒温培养箱，继续培养至长出单克隆。

实施例2发酵生产3-羟基丙酸

将获得的工程菌株单克隆在LB培养中进行活化，活化后的种子液按种子液：基本改良液体培养基体积比1:100的比例接种到含有100mL的基本改良液体培养基的250mL摇瓶中(内含100μg·mL^-1氨苄青霉素和100μg·mL^-1氯霉素)，37℃、180rpm条件下振荡培养。OD₆₀₀达到0.6左右时，温度调节至30℃，并加入0.05mM IPTG进行诱导。此后，每隔12h添加一次0.05mM的IPTG和100mg/mL氨苄青霉素及100μg·mL^-1氯霉素，IPTG初次诱导后48h终止发酵。

取1mL发酵液，4℃，15000rpm离心10min，取上清，用高效液相色谱检测产物浓度，使用紫外检测器，测得3-HP产量为6.7g/L。相比对比例2，产量提高了116％。

实施例3

将获得的工程菌株单克隆在LB培养中进行活化，活化后的菌株按2:100的比例接种到含有100mL的基本改良液体培养基的250mL摇瓶中(内含100μg·mL-1氨苄青霉素和100μg·mL-1氯霉素)，37℃、220rpm条件下振荡培养。OD600达到0.8左右时，温度调节至33℃，并加入0.1mM IPTG进行诱导。此后，每隔12h添加一次0.1mM的IPTG和100mg/mL氨苄青霉素及100μg·mL-1氯霉素，IPTG初次诱导后24h终止发酵。

取1mL发酵液，4℃，15000rpm离心10min，取上清，用高效液相色谱检测产物浓度，使用紫外检测器，测得3-HP产量为3.5g/L。

实施例4

将获得的工程菌株单克隆在LB培养中进行活化，活化后的种子液按种子液：基本改良液体培养基体积比1:130的比例接种到含有100mL的基本改良液体培养基的250mL摇瓶中(内含100μg·mL^-1氨苄青霉素和100μg·mL^-1氯霉素)，35℃、180rpm条件下振荡培养。OD₆₀₀达到0.6左右时，温度调节至30℃，并加入0.01mM IPTG进行诱导。此后，每隔12h添加一次0.01mM的IPTG和100mg/mL氨苄青霉素及100μg·mL^-1氯霉素，IPTG初次诱导后48h终止发酵。

取1mL发酵液，4℃，15000rpm离心10min，取上清，用高效液相色谱检测产物浓度，使用紫外检测器，测得3-HP产量为5.1g/L。

对比例1对照重组菌的构建

与实施例1的区别在于：步骤6)转化：

将pETDuet-mcr和pACYCDuet-accABCD导入E.coli BL21(DE3)合成3-HP

将获得的载体pETDuet-mcr与获得的载体pACYCDuet-accABCD导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布在含有100μg·mL^-1氨苄青霉素和100μg·mL^-1氯霉素的LB固体平板；涂布后的平板置于37℃恒温培养箱，继续培养至长出单克隆。

对比例2发酵生产3-羟基丙酸

将对比例1获得的工程菌株单克隆在LB培养中进行活化，活化后的种子液按种子液：基本改良液体培养基体积比1:100的比例接种到含有100mL的基本改良液体培养基的250mL摇瓶中(内含100μg·mL^-1氨苄青霉素和100μg·mL^-1氯霉素)，37℃、180rpm条件下振荡培养。OD₆₀₀达到0.6左右时，温度调节至30℃，并加入0.05mM IPTG进行诱导。此后，每隔12h添加一次0.05mM的IPTG和100mg/mL氨苄青霉素及100μg·mL^-1氯霉素，IPTG初次诱导后48h终止发酵。

取1mL发酵液，4℃，15000rpm离心10min，取上清，用高效液相色谱检测产物浓度，使用紫外检测器，测得3-HP产量为3.1g/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所，燃点科技（天津）有限公司

<120> 一种合成3-羟基丙酸的重组菌及其构建方法和应用

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物1

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(25)

<400> 1

catggtacca gcggaacagg acgac 25

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物2

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(27)

<400> 2

ccctcgagga atttacacgg taatcgc 27

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物3

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(32)

<400> 3

gtaggatccg atgtcataca gcggcgaacg ag 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物4

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(32)

<400> 4

caggagctct caattacgat gggtcagaat cg 32

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物5

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(35)

<400> 5

cgcggatccg atgagtctga atttccttga ttttg 35

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物6

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(32)

<400> 6

atgcgagctc ttacgcgtaa ccgtagctca tc 32

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物7

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(32)

<400> 7

atgcgagctc ttaatacgac tcactatagg gg 32

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物8

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(31)

<400> 8

acgcgtcgac tcaggcctca ggttcctgat c 31

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物9

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(35)

<400> 9

ggaattccat atggatattc gtaagattaa aaaac 35

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物10

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(30)

<400> 10

ccgctcgagt tatttttcct gaagaccgag 30

Claims

1.一种合成3-羟基丙酸的重组菌，其特征在于，宿主菌为大肠杆菌，表达编码ATP依赖的蛋白酶水解亚单位的基因clpP、编码乙酰辅酶A羧化酶的基因accABCD和编码丙二酸单酰辅酶A还原酶的基因mcr。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述的编码ATP依赖的蛋白酶水解亚单位的基因clpP和编码乙酰辅酶A羧化酶的基因accABCD来源于大肠杆菌，编码丙二酸单酰辅酶A还原酶的基因mcr来源于橙色绿屈挠菌。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述ATP依赖的蛋白酶水解亚单位ClcP在NCBI的Gene ID为7150967，乙酰辅酶A羧化酶亚基AccA在NCBI的Gene ID为944895，乙酰辅酶A羧化酶亚基AccB在NCBI的Gene ID为947758，乙酰辅酶A羧化酶亚基AccC在NCBI的Gene ID为947761，乙酰辅酶A羧化酶基因亚基AccD在NCBI的Gene ID为946796，丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR在NCBI的Gene ID为5827083。

4.一种构建权利要求1所述重组菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

5)克隆乙酰辅酶A羧化酶亚基基因accBC，将所得基因与步骤4)所得pACYCDuett-accAD进行酶切、连接，并转入E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，提取质粒，获得重组载体pACYCDuet-accADBC；

6)将步骤2)与步骤5)所获得的重组载体，转化到宿主Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组菌。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述ATP依赖的蛋白酶水解亚单位基因clpP和乙酰辅酶A羧化酶基因accABCD来源于大肠杆菌，丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr来源于橙色绿屈挠菌；所述ATP依赖的蛋白酶水解亚单位基因clcP在NCBI的Gene ID为7150967，乙酰辅酶A羧化酶亚基基因accA、accB、accC和accD在NCBI的Gene ID分别为944895、947758、947761和946796，丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr在NCBI的Gene ID为5827083。

6.一种应用权利要求1-3任一所述的重组菌发酵生产3-羟基丙酸的方法，其特征在于，步骤如下：

1)活化重组菌，获得种子液；

3)向所得的培养液中加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.01～0.1mM，然后转入30～33℃、180～220rpm、pH＝7.0条件下继续培养24～48小时。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)所述培养条件为：37℃，180rpm。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵培养基的碳源为葡萄糖，氮源为无机氮源，其他成分为无机盐。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，氮源为氯化铵和/或硫酸铵。

10.根据权利要求6～9任一所述的方法，其特征在于，发酵培养基的配方为：20g/L葡萄糖，9.8g/L三水磷酸氢二钾，2.1g/L一水合柠檬酸，0.3g/L柠檬酸铁铵，3.0g/L硫酸铵，0.5g/L硫酸镁，18mg/L二水合氯化钙，0.1％(v/v)微量元素母液；微量元素母液的配方为：6.0g/L七水合硫酸亚铁，2.0g/L硼酸，2.0g/L四水合氯化锰，0.8g/L四水合钼酸铵，0.2g/L五水合硫酸铜。