CN108913724B - 一种以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸的制备方法及其相应重组细胞和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种以丙二酸盐为原料合成3‑羟基丙酸的制备方法及其相应重组细胞和应用，本发明旨在大肠杆菌中表达外源的matB基因、mcrC基因和mcrN基因，同时选择多种外源基因matC在大肠杆菌中外源表达且对其进行优化，从而建立一条新的生物合成3‑羟基丙酸的方法，最终获得含有丙二酰辅酶A合成酶、C端丙二酰辅酶A还原酶和N端丙二酰辅酶A还原酶对应的编码基因的重组细胞。该重组细胞能够从丙二酸盐合成3‑羟基丙酸，从而在大肠杆菌中建立一条新的利用丙二酸盐为原料的生物催化剂生产平台化合物3‑羟基丙酸的方法。同时，通过载体构建提高代谢过程所需的还原力NADPH的NAD激酶和转氢酶，进而提高产物3‑羟基丙酸的产量。

Description

一种以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸的制备方法及其相应 重组细胞和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸的制备方法及其相应重组细胞和应用。

背景技术

3-羟基丙酸是一种重要的化工平台化合物，通过氧化、脱水、酯化反应等可以合成多种重要的化学物质，如丙烯酸、丙二酸，以及生物降解性塑料聚3-羟基丙酸，还可以作为食品或饲料的添加剂和防腐剂。

目前，3-羟基丙酸的合成方法主要有化学法和微生物法，化学合成方法：将3-羟基丙腈加入氢氧化钠溶液中在30℃反应，反应混合物减压蒸发至干，继续升高温度直至产物变为糊状。冷却，加硫酸搅拌，用乙醚提取生成的3-羟基丙酸，蒸除乙醚，得含量75-80％的糖浆状3-羟基丙酸，收率28-31％。化学法使用不可再生资源，副产物多、分离困难、容易造成环境污染，近年来的研究热点逐渐聚焦到微生物方法上。

微生物具有生长速度快、发酵周期短、遗传背景清楚、易于工程化操作、可利用廉价的可再生资源等特点，因此微生物作为生物催化剂已成为近年来生产生物基化学品的有效手段。

发明内容

本发明的发明目的是提供了一种以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸的制备方法及其相应重组细胞和应用，本发明是将丙二酰-CoA合成酶matB以及丙二酰辅酶A还原酶mcr通过基因工程手段在大肠杆菌中表达，同时通过比较三种来源的丙二酸盐转运酶matC从而进行了优化，且通过载体构建提高代谢过程所需的还原力NADPH的NAD激酶(YfjB)和转氢酶(PntAB)，从而建立一条新的利用丙二酸盐为原料的生物催化剂生产三羟基丙酸的方法。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸的制备方法，它包括以下步骤：

(1)分别克隆matB基因、mcrN基因、mcrC基因、YfjB基因、PntAB基因和matC基因；

(2)扩增基因matB片段，将该片段与载体pACYCDuet分别用BamHI和Hind III进行双酶切，酶切后的载体与mat B基因片段按摩尔比1:3的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pACYCDuet-matB；

扩增基因mcrC片段，将pET28a载体与基因mcrC片段分别用BamHI和HindIII进行双酶切，酶切后的载体与mcrC基因片段按摩尔比1:3的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pET28a-mcrC；

扩增基因mcrN片段，将载体pACYCDuet-matB与基因mcrN片段分别用NdeI进行单酶切，酶切后的载体与mcrN基因片段做无缝连接，融合产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN；

将matC基因连于质粒pACYCDuet-matB-mcrN的BglII的酶切位点处，获得重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN-matC；

扩增YfjB基因片段，将上述的重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN-matC与该YfjB基因片段分别用Hind III进行单切，酶切后的载体与YfjB基因片段做无缝连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN-matC-YfjB；

扩增PntAB基因片段，将上述的重组质粒pET28a-mcrC与该片段分别用NotI进行单切，酶切后的载体与PntAB基因片段做无缝连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pET28a-mcrC-PntAB；

(3)将重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN和pET28a-mcrC、重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN-matC-YfjB和重组质粒pET28a-mcrC-PntAB，共同转化大肠杆菌，涂布于加有卡那霉素和氯霉素抗生素的LB固体平板，分别获得阳性克隆工程大肠杆菌；

(4)活化后的上述工程大肠杆菌接种到含有卡那霉素、氯霉素以葡萄糖为碳源的培养液中培养，然后转入在以丙二酸盐为碳源的培养基中继续诱导培养，发酵获得3-羟基丙酸。

进一步的：所述matB基因来源于：拟南芥、沼泽红假单胞菌、氧化木糖无色杆菌、泥炭假单胞菌或支气管败血性博代氏杆菌。

进一步的：所述matC基因来源于：裂殖酵母、根瘤菌、古菌、藤黄单胞菌或长柄镰刀菌。

进一步的：所述mcr基因来源于：海洋卤虫、亚硝基假丝酵母、绿曲桡菌或嗜盐小碱菌。

进一步的：所述YfjB基因是来源于：蚜虫、大肠杆菌K-12、沙门氏菌或欧文氏菌。

进一步的：所述PntAB基因是来源于：柔嫩艾美球虫、放线菌、大肠杆菌、嗜热栖热菌或牛型结核菌。

进一步的：所述步骤(4)中发酵是将活化后的所述工程大肠杆菌接种到M9液体培养液中培养，当OD_600nm为0.6时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.2mmol·L^-1，然后转入在以丙二酸盐为碳源的M9液体培养基中继续诱导培养，最终发酵获得3-羟基丙酸。

本发明还提供了所述合成3-羟基丙酸的制备方法中获得的重组细胞，所述重组细胞为包含matB基因、mcrN基因和matC基因的pACYCDuet载体以及包含mcrC基因的pET28a载体。

本发明还提供了所述的重组细胞在用于以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益技术效果：

(1)本发明步骤只有三步酶催化，更有利于代谢途径后续调控及转化效率的提高；

(2)后两步骤所用的mcrN基因与mcrC基因是已经优化后的序列，转化率较高；

(3)丙二酸盐转运所需要的matC基因碱基进行了优化，且通过比较了三种来源的基因后选出了最优的matC；

(4)本发明中在大肠杆菌中过表达了NAD激酶以及转氢酶，可以为催化反应中提供较多的还原力。

本发明主要通过基因工程的手段，在细胞中表达丙二酰辅酶A合成酶B、二羧酸盐载体蛋白、C端丙二酰辅酶A还原酶(mcrC)和N端丙二酰辅酶A还原酶(mcrN)，获得的重组细胞含有表达上述酶的基因，该重组细胞能够从丙二酸盐合成3-羟基丙酸，同时在大肠杆菌中过表达NAD激酶以及转氢酶，提供大量的还原力，最终在大肠杆菌细胞中成功建立一种高效的三羟基丙酸生物合成代谢途径，获得了可以高效合成三羟基丙酸的重组细胞，从而建立一条新的利用丙二酸盐为原料的生物催化剂生产三羟基丙酸的生物法法。

附图说明

图1是本发明中新合成三羟基丙酸途径的示意图。

图2是本发明中pSGN-3的质粒图谱。

图3是本发明中pSGN-4的质粒图谱。

图4是本发明中pYQ-1的质粒图谱。

图5是本发明中pYQ-2的质粒图谱。

图6是本发明中HPLC测定3-HP的图谱。

具体实施方式

下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于下述的具体实施例。

实施例1

如图1所示，本发明通过在大肠杆菌中共同表达来源于沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)的丙二酰辅酶A合成酶B(Mat B)；来源于根瘤菌(Rhizobium leguminosarum bv.trifolii)二羧酸盐载体蛋白(Mat C)和来源于绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)的C端丙二酰辅酶A还原酶(mcrC)和N端丙二酰辅酶A还原酶(mcrN)，利用丙二酸盐生物合成3-羟基丙酸。

本发明中所述丙二酰辅酶A合成酶基因来源于以下其中一种：1)拟南芥(Arabidopsis thaliana)(GenBank:OAP02278.1)、或2)来源于其它细菌，优选沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)(GenBank:CAE25665.1)、氧化木糖无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)(GenBank:AMH04723.1)、泥炭假单胞菌(Pseudorhizobiumpelagicum)(GenBank:KEQ04843.1)、支气管败血性博代氏杆菌(Bordetellabronchiseptica)(GenBank:AMG89483.1)；或3)来源于其它生物体，和丙二酰辅酶A合成酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。

所述丙二酰辅酶A还原酶基因来源于：1)海洋卤虫(Halolamina pelagic)(GenBank:4039422)、亚硝基假丝酵母(Candidatus Nitrosomarinus catalina)(GenBank:ARS64022.1)；或2)来源于其它细菌、优选绿曲桡菌(Chloroflexus aurantiacus)(GenBank:AAS20429.1)、嗜盐小碱菌(Halalkalicoccus paucihalophilus)(GenBank:KYH26963.1)；或3)来源于其它生物体，和二羧酸盐载体蛋白基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。

所述二羧酸盐载体蛋白基因来源于：1)裂殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)(GenBank:AAB71336.1)；或2)来源于其它细菌，优选根瘤菌(Rhizobium leguminosarumbv.trifolii)(GenBank:CP001191.1)、古菌(Methanothermococcus okinawensis IH1)(GenBank:CP002792.1)、藤黄单胞菌(Xanthomonas arboricola)(GenBank:SOU12872.1)长柄镰刀菌(Fusarium langsethiae)(GenBank:KPA43209.1)；或3)来源于其它生物体，和丙二酰辅酶A还原酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。

所述转氢酶基因是来源于:1)柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)(GenBank:AAA29081.1)、放线菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)(GenBank:AEW77498.1)；2)来源于细菌，优选大肠杆菌(Escherichia coli)(GenBank:NP_416119.1)嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(GenBank:AEG32619.1)、牛型结核菌(Mycobacteriumbovis)(GenBank:CUI09926.1)；或3)来源于其它生物体，和转氢酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。

所述NAD激酶基因是来源于：1)蚜虫(Buchnera aphidicola)(GenBank:ACL30556.1)；2)来源于细菌，优选大肠杆菌K-12(Escherichia coli)(GenBank:ANK02917.1)、沙门氏菌(Salmonella enterica sub sp)，(GenBank:CBY96927.1)、欧文氏菌(Erwinia gerundensis)(GenBank:CUU24954.1)；或3)来源于其它生物体，和NAD激酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。

1.外源基因的克隆

1.1外源基因的克隆

1.1.1沼泽红假单胞菌中matB基因的克隆

选取来自(Rhodopseudomonas palustris)的丙二酰辅酶A合成酶B(Mat B)(GenBank：CAE25665.1)，由扩增沼泽红假单胞菌CGA009基因组中matB基因方法获得，matB基因序列如SEQ ID No：1。

1.1.2绿屈挠菌中丙二酰辅酶A还原酶mcrC和mcrN基因的克隆

选取来自绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)的丙二酰辅酶A还原酶mcrC和mcrN基因(GenBank：AAS20429.1)，由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得，之后分别与载体pUC57连接得到pUC57-mcrN和pUC57-mcrC。mcrN基因序列如SEQ ID No：2，mcrC基因序列如SEQ ID No：3。

1.1.3大肠杆菌中的Yfjb基因的克隆

选取来自脑大肠杆菌DH5ɑ(Escherichia coli)的NAD激酶的Yfjb基因(GenBank:ANK02917.1)，由扩增大肠杆菌DH5ɑ基因组中Yfjb基因方法获得。YfjB基因序列如SEQ IDNo：7。

1.1.4大肠杆菌中的PntAB基因的克隆

选取来自脑大肠杆菌BL21(DE3)(Escherichia coli)的转氢酶的PntAB基因(GenBank:NP_416119.1)，由扩增大肠杆菌BL21(DE3)基因组中PntAB基因方法获得。PntAB基因序列如SEQ ID No：8。

1.1.5根瘤菌中的matC基因的克隆

扩增基因mcrN片段，将载体pACYCDuet-matB与基因mcrN片段分别用NdeI进行单酶切，酶切后的载体与mcrN基因片段做无缝连接，融合产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN。

选取来自根瘤菌(Rhizobium leguminosarum bv.trifolii)的二羧酸载体蛋白基因(GenBank：6983655)，由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得，之后与载体pACYCDuet-matB-mcrN分别用Bgl II酶切位点进行酶切后连接，转化入大肠杆菌，筛选的阳性克隆为pACYCDuet-matB-mcrN-matC1，matC1基因序列如SEQ ID No：4。

1.1.6裂殖酵母中的matC基因的克隆

选取来自裂殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)(GenBank:6979291)的二羧酸载体蛋白基因(GenBank：NC_011369.1)，由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得，之后与载体pACYCDuet-matB-mcrN分别用Bgl II酶切位点进行酶切后连接，转化入大肠杆菌，筛选的阳性克隆为pACYCDuet-matB-mcrN-matC2。matC2基因序列如SEQ ID No：5。

1.1.7古菌中的matC基因的克隆

选取来自古菌(Methanothermococcus okinawensis IH1)的二羧酸载体蛋白基因(GenBank：10773754)，由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得，之后与载体pACYCDuet-matB-mcrN分别用Bgl II酶切位点进行酶切后连接，转化入大肠杆菌，筛选的阳性克隆为pACYCDuet-matB-mcrN-matC3。matC3基因序列如SEQ ID No：6。

2.表达载体的构建

2.1 pSGN-1载体的构建

利用下列引物matB-F(5’-CGCGGATCCGATGAACGCCAACCTGTTCGCC-3’)和matB-R(5’-CCCAAGCTTTTACTTGTAGATGTCCTTGTAG GT-3’)和沼泽红假单胞菌CGA009基因组为模板扩增matB片段。

将pACYCDuet载体与基因matB片段分别用BamHI和HindIII进行双酶切，酶切后的载体与基因片段matB按摩尔比1:3的比例，16℃连接过夜，连接产物转化E.coli BL21，然后涂布加有卡那霉素的LB固体平板，PCR扩增菌落筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pSGN-1(pACYCDuet-matB)后，再通过限制性酶切和测序鉴定，筛选的阳性克隆为重组质粒pACYCDuet-matB。

2.2 pSGN-2载体的构建

利用下列引物mcrC-F(5’-CGCGGATCCATGAGCGCCACCACCGGCG-3’)和mcrN-R(5’-CCCAAGCTTTTACACGGTAATCGCCCGTC-3’)和质粒pUC57为模板扩增mcrN片段。

将pET28a载体与基因mcrC片段分别用BamHI和HindIII进行双酶切，酶切后的载体与基因片段mcrC按摩尔比1:3的比例，16℃连接过夜，连接产物转化E.coli BL21，然后涂布加有卡那霉素的LB固体平板，PCR扩增菌落筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pSGN-2(pET28a-mcrC)后，再通过限制性酶切和测序鉴定，筛选的阳性克隆为重组质粒pET28a-mcrC。

2.3 pSGN-3载体的构建

如图2所示，利用下列引物mcrN-F(5’-CGCGGATCCGATGAACGCCAACCTGTTCGCC-3’)和mcrC-R(5’-CCCAAGCTTTTACTTGTAGATGTCCTTGTAGGT-3’)和载体质粒pUC57模板扩增mcrN片段。

将pACYCDuet-matB载体用NdeI进行酶切，酶切后的载体与基因片段mcrN用无缝连接酶融合，50℃温育15min后将连接产物转化E.coli BL21，然后涂布加有氯霉素的LB固体平板，PCR扩增菌落筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pSGN-3(pACYCDuet-matB-mcrN)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。

2.4 pSGN-4载体的构建

如图3所示，pSGN-4载体构建是通过matC基因在由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得时直接连于载体质粒pSGN-3(pACYCDuet-matB-mcrN)的BglII的酶切位点处，获得重组质粒pSGN-4(pACYCDuet-matB-mcrN-matC)。

2.5 pYQ-1载体的构建

如图4所示，利用下列引物YfjB-F(5’-GCCTGCAGGTCGACAAGCTTGCAAGGAGATATACCATGAATAATCATTTCAAGTGTA-3’)和YfjB-R(5’-GACTTAAGCATTATGCGGCCGCAAGCTTTTAGAATAATTTTTTTGACCAGCC-3’)和大肠杆菌模板扩增基因YfjB片段。将pSGN-4载体用HindIII进行酶切，酶切后的载体与基因片段YfjB用无缝连接酶融合，50℃温育15min后将连接产物转化E.coli BL21，然后涂布加有卡那霉素的LB固体平板，PCR扩增菌落筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYQ-1(pACYCDuet-matB-mcrN-matC-YfjB)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。

2.6 pYQ-2载体的构建

如图5所示，利用下列引物PntAB-F(5’-CGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCAAGGAGATATACCATGAAGATTGCTGTTGCCAAAG-3’)和PntAB-R(5’-TCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTAGTGCGCCATCGCCTTGA-3’)和大肠杆菌模板扩增基因PntAB片段将所述载体pSGN-2分别用NotI进行酶切，酶切后的载体与基因片段PntAB用无缝连接酶融合，50℃温育15min后将连接产物转化E.coliBL21，然后涂布加有卡那霉素的LB固体平板，PCR扩增菌落筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYQ-2(pET28a-mcrC-PntAB)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。

3.E.coli重组菌株的构建

将pSGN-3(pACYCDuet-matB-mcrN)和pSGN-2(pET28a-mcrC)重组质粒共同热击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于加有卡那霉素和氯霉素抗生素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得SGN04工程大肠杆菌。

将pYQ-1(pACYCDuet-matB-mcrN-matC-YfjB)和pYQ-2(pET28a-mcrC-PntAB)重组质粒共同热击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于加有卡那霉素和氯霉素抗生素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得YQ03工程大肠杆菌。

将pSGN-4(pACYCDuet-matB-mcrN-matC)和pSGN-2(pET28a-mcrC)重组质粒共同热击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于加有卡那霉素和氯霉素抗生素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得SGN05工程大肠杆菌。

本发明获得的重组细胞包含下述基因片段：C端丙二酰辅酶A还原酶(mcrC)N端丙二酰辅酶A还原酶(mcrN)、丙二酰-CoA合成酶B(Mat B)以及二羧酸盐载体蛋白(Mat C)，该重组大肠杆菌能够从丙二酸盐合成三羟基丙酸。

4.工程大肠杆菌的培养

将构建好的重组质粒转化到感受态细胞中，通过摇瓶发酵和发酵罐发酵两种方法对重组菌进行发酵培养，利用高效液相色谱技术对发酵产物进行定性和定量的检测。

将活化后的上述工程大肠杆菌按1:100的比例接种到含有卡那霉素、氯霉素、40mM的丙二酸盐的LB液体培养液中，37℃，180rpm条件下振荡培养，当OD_600nm为0.6-0.8时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.2mmol·L^-1，然后转入在16℃，180rpm条件下，继续培养。当工程菌株诱导24h后，取发酵液10000rpm高速离心5min后过滤与色谱小瓶中，HPLC检测。

5.工程菌发酵试验

挑取单克隆到50ml M9种子培养基(1L M9salts：20g Glucose，6g Na₂HPO₄，3gKH₂PO₄，1g NH₄Cl，0.5g NaCl，0.24g MgSO₄，121℃高压蒸汽灭菌15min。)中，37℃，180rpm活化过夜(18-24h)。将种子按10％的接种量接种至含有2L发酵培养基(19.6g K₂HPO₄·3H₂O；4.2g Citric acid·H₂O；0.6g柠檬酸铁铵；0.8ml浓硫酸；40g葡萄糖,(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O0.123mg；ZnSO₄·7H₂O 0.097mg；H₃BO₄0.823mg；CuSO₄·5H₂O 0.083mg；MnCl₂·4H₂O0.527mg,4ml 1M MgSO₄，1900ml蒸馏水)的5L小型发酵罐中，通气量1.3VVM，转速400rpm，37℃培养至OD₆₀₀约为12时，0.2mM IPTG，37℃诱导表达，以氨水调pH，控制pH在7.0，每隔8h补加一次I PTG。得到的三羟基丙酸产物通过HPLC对其进行定性和定量分析。培养过程中对发酵液中丙二酸钠残余进行检测，并通过变速流加浓度为800g/L的丙二酸钠，维持残糖浓度在0.5g/L以下。每4h取发酵液5ml，测定细胞OD₆₀₀、浓度；每15min取发酵液1ml,利用高效液相检测产物3-HP浓度。直到OD不再变化，产物不再产生为止。

检测条件：HPLC系统采用Thermo Ultimate 3000高效液相，色谱柱为ZORBAXSB-18(4.6mm×50mm，1.8mm)柱，检测器为UV检测器；柱温箱温度35℃；检测器波长为210℃；流动相为A：20mM NaH₂PO₄(PH2.0)，B：乙腈；流动相流速：1ml/min.

流动相程序为：99％20mM NaH₂PO₄，1％乙腈持续10min。

实验结果如图6所示。图6表明，发酵液中检测出了3-羟基丙酸，根据峰面积为26.138，可算出产物的浓度为8.26mM，根据底物浓度，转化率为20％。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸的制备方法及其相应重组细胞和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1272

<212> RNA

<213> 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)

<400> 1

agaacgccaa ccgcgcccgc cgcgaaagcc gacgaccccc acaagccgcg acgaaaccgc 60

ggccggggac aagacagcac gccgagcggg gcgcgggcgg gccgcgcgcc aacggcgggg 120

cacgcggccg caggcggcga ccgcggcggc gcaaaccgag aagcggggaa gcgcgggcga 180

ccgccacggg cgggccggcg gcggacgccg ccaacaccgc caacgcgcac gagccgaacc 240

acaccgagcc gagccgaaga cgggggcgac cgccaagcgc gacgggacgc ggcgagccgc 300

caaggcggcg ccacggggag acgcggcccc gacggcgggg ccgccaccga gcggcagcgg 360

agccagcgag gcgcgccacg acgaccgcgg cgccgagacg gcggcgaccc acacccaggg 420

acgaccggcc gcccaagggc gcgagccagc cacgacaagg cgcgaaccgc gacgcggcga 480

acggcgccac gccggagacg gcgaccacgc gcgccgacac acacccagga gcgggccagc 540

aacgcacgcg cgcgcgcgga cgagacccgc cgaagcgacc cgacaagacc cgaccgaggc 600

gcgcgccacc ggcgaggggg ccgacgcaca cgcggccgca gagcccgcgg cgaccaagga 660

gacgacgggc cacagaggcg cacccgggcg gcgccgcgcc gccgaacgca cgcgaaggcg 720

gcgaagaccg gcacgccggc cgagcgcacg gcagaccgag accaacagaa cacccgaacc 780

cgagacggcg accgcgcccc ggcgcggcgg cccggcgcgc ccggcgcggc gcgcggaccg 840

accggaaacc ggcaaggaac gccgcgcggc gacacgggag acgagggaag ggcccgaacg 900

gcaagggcac ggcggagccg gagaagacca agcgaaccgc gacgacggcc cacaccggcg 960

acccggcaag acgacgagcg cggcacgcca cacccggccg cggcaaggac gggacaccgg 1020

cggccaacgc accgaaggaa acgagagcga gacgacgcca gccgggcggg cgaaccgcgg 1080

gacggcggcc gcacgccgac ggcgagggcg cacgccgggg ggcgcgacaa ggggccacga 1140

cgacgaagcg cagggcgcac ggcccgacgg cagccgccaa gcaagagccg aagaaaggac 1200

cgcgacgacc gccgcgcaac accagggcaa ggccagaaga acgccgcgcg agaccacaag 1260

gacacacaag aa 1272

<210> 2

<211> 1281

<212> RNA

<213> 绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)

<400> 2

agagcggaac aggacgacgg caggaaagag cgaaaccggg gcgccggcaa acggcaggaa 60

gacacgcgcc cgcagaggga gcgacggcaa agggacggaa cgggcgaagg accgcacggc 120

cgaacggagc aggcagaggc aggaggccgg caaagcgcac gaccgaagca ggagggagga 180

ccggcgcgga cggccggacg aagcgagggc ccgcacggcc agacgacacg gcaacaagca 240

ggaaggccgg gcccagcgcg cggccgagac caccacgaag cgaaaggccc ggcgccgaag 300

agacgccagc cagcacgcca aacggaggga ggcacgagcg agcggcaccc aagccggagg 360

aaggcggcac aagccgacca ccacgggcga gacacgggcg gaccgagcac cccaaagcgc 420

caagccacca acgcgcgcgg agagggcacg ggcaccgcga aacgaccccg gcccgagaaa 480

ggacgcaccg acaggccagc gaggacagcc aaggggcggc ccgaaggcga cacagcgcac 540

cagaacacca gcgaggcggc caacgaccag ggcgcgcgaa cgcggccccc cgcgggaggg 600

cagacgccgc gccggccagg ccgaaccgcc gcccccggga gacgagagga cgcacggaag 660

gaggccggcc gcaggagacc agccgcggcc cgacgacgcg cacgagagcc agggccgcac 720

gacgccacgc gccggcgacc agagaagagg gaggcgccac cggaggcgac cggggaggaa 780

ggacacggcc cgcggcgcgg cgcggcccag cgagcaggca gcaagagagc ggcggcggcc 840

ggcgcagaca cgcccccagc cgccaccgac cacgcgaccg gcaacaagac gcgccgaggg 900

ccggcgagaa accggcggga cagcagcggg acgccgcacc agcacgaacc ggcaccggcg 960

gagagggaga gagcggggcg aacggccgag aaacaccggg acaaggagcc agcgccggcc 1020

cgacggcagc gcaacggcac ccccggcgca cggcgcgggg ccgcggcacc cgaacgggcc 1080

gacaaaaggg aagacggacg cacaaaggcc gcacggcagc cacgggggcg cacgaggcga 1140

acgacacagc ggccagcgcc gccgggacag gcgccgccgg agggccaaca gaggcgccgc 1200

aaccgcagcc gaagggagaa gccggccgga cagccaagcc caagcaacgc caacaagaga 1260

accccaacac ccgccaacaa a 1281

<210> 3

<211> 1575

<212> RNA

<213> 绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)

<400> 3

agagcgccac caccggcgca cgcaggcacg gcggagggcg gaaagccgac ggggcagggg 60

aaaggccgaa ccggggcagc gccggagggg gcagacgggc gccccggcga gggcgcgcgc 120

ggagcggcag cccggacggc aaagccgaac agagcaggcg agaccaacga gcggcgaggg 180

gggaaccgag cgaagacgcg ccacagcacc gggcgcgagg agagcgaagc gcagcgcgga 240

cggaacgacc cgcagcggca ccgcgaacga caacaacgcc gggacgccgg gcgaagagag 300

gacgaagcca ggagggaggc gccaaccccc gccaacgaca gcaacaccgg agcgcaaacg 360

gcgccggaga aaaaacaggg agcggacacc aacgccacaa cggcgggaaa aagagcggcc 420

acccacccca accggccgaa cgccgccgaa ggcggcagcg ggcaaggccg aagcgcgcgc 480

ccggcccgga gaacagacaa gccagcgccg ggccggcgaa gggacgcgcg cggaccggga 540

acgcccggcc cgcccgcggg cgcggcgagg agaacaagcg gcgaagagcc acgcgccacg 600

cggcgcgcgc accgagagcg acagcacgaa cgggaacgcc acccaagagg gccgcacaga 660

gcagaacccg cagcaccacc gcggcggaac ggcacgacgc gcagcgaagg cgaccggcgg 720

cacacaagca ggcgcgcgaa ccgcaagccg caaagcggcc ggcaaagggg cagggccgcc 780

gacacgcaaa ccgccaaacc cgcccgaccc ccacccgagc ccagagacgc gaggccgcaa 840

ggcggacggc acaggggagc caccgcaacg gagccgacga ggagcgcaag gccaccgcaa 900

ccgccgaccg cgcgcagggg agacaccacc cacagggggc gacgaacgca ccccaccggg 960

gcgaacccgg cgccccaccg gaacggcggc ggagcggcgg aagcacggca cgaagggaac 1020

acgacgaaca ccaaccgcgc ccggcgaccc gaacgacggg gcacgcagga ggagaggaga 1080

cagaaaccgg ggcagagaca agcgcgcgcc cacgacacgc gaggcggcgg cgagacaggg 1140

ccgggacaga cgaagccgca cgaccaggca caccgcacgg cgcccagggc cggcgcgacc 1200

cccccggcca cgccgacgga ccacggcggg cgaaagacag gacggagcac agggaggagg 1260

cgaagccgag ggcgaacacc agccacccac caccgggagc gcgcggagcc cgaggagggc 1320

ccgcccgcgc ggcaccccga aacacggcac ccaacaccga gcaagccggc aaccacaaaa 1380

cgaccccacg cacggcacga gggcgagagc gaaagaacgc cagcgcacga caacaagcga 1440

cgacccggcg gcgcggccga agagccgcgg accgcacgag cgcaacaaga acggaacgac 1500

gaggcagcgc ggcacgcacc accccgccga agccgaaccc gacgccgggc ggacacgcgg 1560

acgggcgaac cggaa 1575

<210> 9

<211> 922

<212> RNA

<213> 根瘤菌(Rhizobium leguminosarumbv. trifolii)

<400> 9

agggcagaaa agcaaggcgc ggggcaagaa gccaccacag ccgaaaaggg gccagccgca 60

ggcgccggcg ggagagacca ggagaaaacc accgaagcag gcccgagcga cgcgacccgg 120

gccggaccac ggcaagcaca gaaagggaca agaggaggaa ggcagcgcgg cgcggcaagg 180

cgaccggggg agcgggccgc agaaccggcg ggccaggccc ggccgcaggc caagccccgg 240

gcacgagcgc cacagacgac accggagagg gcaagggaca ggcgcacagg ccggcggcag 300

ccgacaaggc ggaaccaaca gaggccaaag caggcgccgg ccccgaccca cgcgcagcaa 360

cggcaagcag cgggggggcg ggccaaagga gcgcaggccg gcccagcggc cgcgccggaa 420

acaccggaag gcggcagcac acgcggcagg cggcaccccg gccaaaccga cgcgacagca 480

gggacgcggc agaaccgcag caacccgcgc gaaaagaacg aaccaccaag gccgaccgcc 540

cgggaggcgc caggaaaaag gggcagggcc agaccgggcc gggccagccc gcgagccgaa 600

aacccagaaa gccgcaagaa aaggcggaga ccggcgaagc aggaaaccag gggcggagga 660

aaaagcagga cggggaaggg caaaggcaag caggagccgc gaggcacgcg cggaccggcg 720

caaggagcgc cgcaccaacc gccacgggcg ccaaccgagc cgccgcgagc agggcaggag 780

cgccaggcgg ggcagccagc aacaaccacc agggaacccc cgcaccaagg cgcccggggg 840

caaagccccg gagaagcgcg aacagggcgc gcagacgaaa gcgcacgagc aaaggccgag 900

ggcaggaggg gccgggcagg aa 922

<210> 5

<211> 830

<212> RNA

<213> 裂殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 5

aggggaacca aggaaacgaa acagaggaca gaggcgacgg aagcaaagcc cccagccccc 60

agcaacgacg aagcaacagg cgggcagaca ggcaacgggg ggggaaggcc ccccgaaggc 120

aaacaaggca aaagaaccaa acgcccggac agcagccgca aaaacccaac acaaggaccg 180

gaaccacagg aaaagccagc acgcccaaac cacgcacgac agcgccaaac gccaccgaac 240

cggcgaggga ggggggcacg aaccaacaac ggcagaccaa acgcgaaggc acaacaacaa 300

ccagaaacca gaaaccgcac ccgcggaccc acccccagag gggcagcggc gccgcaacac 360

acaacccgcc acaaaaaaaa aggacggacc ccaaggacgg gggacacggc cgcaagcacg 420

gacgaggccg gcaaaacccc aagacgaccg gagaggcggc caccagccca ggggccaaaa 480

agcgcggggc agggcagcgc ccaagggcgc caaccaccga gacgggcacc aggcaagggg 540

cgcgcgggac gccgccagga gcagcgggcc accgagcccc ccaaggcggg agggcacacc 600

ccaacggggg aagaccagag aaggaaaaga agaccaaagc ccaaagggac aacaggggca 660

cgacagggac cccaagaaag gccggcgccg caagacgcac cggcaaagac gaagagccca 720

ccccaccaaa accaaaacag ggccaaccca cccccaccga aaaagcaccg cacggaaaaa 780

gcgaacacag cacacacggg ggaacggacc ccagaggaac agaaagcgaa 830

<210> 6

<211> 651

<212> RNA

<213> 根瘤菌(Rhizobium leguminosarum bv. trifolii)

<400> 6

agcggaagca ggaaagaaag ggaaaaaaaa accgagcggg cagccaaggg gacgggcacg 60

gcaaacccca cagagccaga cgccgacgaa accggcagga cgggaaaggc gacgagcacc 120

gggacccgcg ggaaccgaaa aagccaaagc gacgaacacc gggcgagcgc caccgaccgc 180

aggcagaggc ggcaagcgaa ccacgcaaaa aggagaaaag gacgggcgca cgcaagagga 240

gcaaggccgc agagaaacag aaaaaaaacg gacaggaacc gggggaaccg ccgggggcaa 300

ggaccgagca ggcggccgag ccccgcaacc ggccgacaga acggcaggaa ccaagggggg 360

cgcaggccga cggccacggc aaggacgcag cgcacaccgc gccgcaacca gccccgaccg 420

gggaaacggg ccgaggcgca ggcaagcacg aaaagcaaaa ccccgaacaa aaagaccgaa 480

aagcaggggc ggccgggggg caaaggccag gagaccacaa aaaaaacgaa acgccgagga 540

gccggggggc caccgaggcg ccaggggaga ccaaaaaacg caaaaaggaa aaggcggcga 600

ggacggggca aacccgaaaa accgcaacaa ccacaggcac cgaaaggcaa a 651

<210> 7

<211> 668

<212> RNA

<213> 优选大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 7

agaaaacaca aggaggcagg ggacacccac ggcaccccac gcacgacaac acagaaagcc 60

accgcggcgg cacaaaagga cgaggcacgg agcaacaaac gccacgaacg caacgaagaa 120

ggaaaacggc acgccgcgga gagggcaaca gcgaccgcgg agcgggggcg acggaaagcg 180

ggcgcggcac gcacaccgcc cgacgaaaaa gaggaacaac cgggcaaccg ggccgacgac 240

cgaccccgaa acgcccagca acagagccga ggcggaaggc cacacacagc gagaaacggc 300

ggaagcgcaa gcgcagcaag agccagaaac gcacagcacc gcgaaaagaa ggggccacca 360

ggcaaagggc gcaagagagc gaaggaacga cgagacgcgc cagcgacgag gacaaacgac 420

gccaacaggc ccaccgccac ccccgcaggc ggccacgacc cccccggagc gaacccgggc 480

ccagcccgca acggcagcac gaccacggca aaacagcagc agcacgaccg cgcgcgcacg 540

ccgaacgacc ggaaacaggc gacagccaga agcacgccga caggaaggga agagccgacg 600

cgcggaacca cgaacgacac cgaaagaaca gacaacacaa agcaccaagc cggcggcaaa 660

aaaaacaa 668

<210> 8

<211> 2201

<212> RNA

<213> 古菌(Methanothermococcus okinawensis IH)

<400> 8

agcgaaggca accaagagaa cggaaccaag aaacccgggc agcaacgcca aaaacaggga 60

acagcgcgaa acgggaccgc gcggagagag cggcgcgggc aacggcaagg acgaaaagcg 120

ggcaagcggg cgcgaaagag aagggaaagc gcggcagcag agacacgaag gcaagcgccg 180

agagagaaag cgacgaaccg ggacaacgcg ggagacggcc gcgcagaacc ggaaaagcaa 240

aaacgcggaa cgaacggacc ggaggcgagg accggccgcg accacgcgca caacgcggac 300

gcacaagccg aggcgaacac gccggacgcg ccaggaagcg gcacagaagg gcgccaccgg 360

gcaaaacgcg gccgggaaag gccaccggca aaaggaggga gggcgggggc aggcggccgc 420

caggcgcagc aaacagccgg cgcgaggcgg cacgacaccc gcccggaagg aaagaacaag 480

caaagagggc gcggaacccg agcggaaaag aggaagcggc agcggcgagg cagccaaagg 540

agcggacgcg cacaaagcgg aaaggaaccg ccgcccaggc aaaagaggcg aacagcacca 600

ccgcgcacca ggcaaaccag cgccgaagca aacccggaaa gggacccaga aggcgggcag 660

ggagcgaccg gcagcccaaa acggcggcaa cggaaacacc ggccggggaa accacacgga 720

aaagggcaaa ggaggaaccg acccgggccg cgccgacgca acccacagca cggcacaaac 780

ccgaacgcga aacgggcaaa gagaaagacg gcaaacacgg agagagggga cgcggcggac 840

cggaccggcg ggcgaaaacc ggccggcacc gccgacagga cagccagccg caggcggcac 900

aaaaagcggc accggaagga aaacgaggaa aaagaccgcc accgggcgaa aacgcggagg 960

cgcggcaaca cggcggaggc aagcggcgcc gaaagaaccg ggcaccaccg cgcgcggccg 1020

cggcggaacg gggggaagac gcacgcgcgc aacaccggag cggcaccaac gcgacaggga 1080

aggcggagca cggcagaggc cagggcggcg ggagcccaga cgcgggcaag ccagcaaaac 1140

ggggccaccg gaccagcgca gcgaaaagcc gcaaaaaaaa gcggaggaag acagcgcaac 1200

aggccgcgac cgaccagcgg ccggccgaaa cagaaacgcc gccagggaac aaccggacgc 1260

cgggaggcga gcgaagcaac caggaccgga acgggaaggg cggacgcggc gaggcagggg 1320

ggcaaggacc gcggcgaaga aaggaaagac cgaaagccag aacggggcga ccgcaagccg 1380

gggcggcggc aggcggggca acagcacgca cagacgcggg aaggcaccga cggcaaacac 1440

cgacggaagg cccggaccac ggggcggaac gcacgggcgg ggggcgcggc aaacggggca 1500

agacgcaaac cagagcgcca aaccgcacaa aagaaccggc ggccggcgcc ccgcgcgaga 1560

gcgcacggac agcgcggccg caaggcggca gcgaaagacc gcaagcgcgg acggcggcaa 1620

gcgccccacg ggggcagaag ccaggggggc gagcgaaccg acccggcggg cggcgcggcg 1680

cgggcagcca gcaacgaccg cgaggaccgg gcgcggcggc cgggggcacc cacaaggaag 1740

gcgagaaccg ccacagcgag cgggggcggc accgacggcc cacggcgaga caggaagggg 1800

gagcaccgcg aaacaccgca gaagagacag cggaacgcga aaaaccccac aggacaaccc 1860

ggggacggca ggcagcgcgc aggcgcaaac cgcgcgaaaa cgagaaagcg cgccgggaaa 1920

ggcgcggacc acccggcgcg gggcggccgg acaagaacga gcggcgaagc aaaagaccga 1980

gacacggcgg aaaggacgag acaagagacg cgaaccgaac cgacgggagg gcaacgaacg 2040

gaacccggcg gcgcaggaga ccgaagagcc gagcggagcc ggcggaaggg gaaagcgcag 2100

aacggagcaa acgcgagaac acggcagcgg ggcaaaaccc gcgccaagga aaacacccac 2160

agcggggacg ccaaagccag cgggagcaac cgaaagccga a 2201

Claims (9)

1.一种以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：

（1） 分别克隆丙二酰辅酶A合成酶B（matB）基因、N端丙二酰辅酶A还原酶（mcrN）基因、C端丙二酰辅酶A还原酶（mcrC）基因、NAD激酶（YfjB）基因、转氢酶（PntAB）基因和二羧酸盐载体蛋白（matC）基因；

（2）扩增基因matB片段，将该片段与载体pACYCDuet分别用BamHI和Hind III进行双酶切，酶切后的载体与mat B基因片段按摩尔比1:3的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pACYCDuet-matB；

扩增基因mcrC片段，将pET28a载体与基因mcrC片段分别用BamHI 和 HindIII进行双酶切，酶切后的载体与mcrC基因片段按摩尔比1:3的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pET28a-mcrC；

扩增基因mcrN片段，将载体pACYCDuet-matB与基因mcrN片段分别用Nde I进行单酶切，酶切后的载体与mcrN基因片段做无缝连接，融合产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN；

将matC基因连于质粒pACYCDuet-matB-mcrN的BglII的酶切位点处，获得重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN-matC；

扩增YfjB基因片段，将上述的重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN-matC与该YfjB基因片段分别用Hind III进行单切，酶切后的载体与YfjB基因片段做无缝连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN-matC-YfjB；

扩增PntAB基因片段，将上述的重组质粒pET28a-mcrC与该片段分别用NotI进行单切，酶切后的载体与PntAB基因片段做无缝连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pET28a-mcrC-PntAB；

（3）将重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN和pET28a-mcrC共同转化大肠杆菌，或将重组质粒pACYCDuet-matB-mcrN-matC-YfjB和重组质粒pET28a-mcrC-PntAB共同转化大肠杆菌，涂布于加有卡那霉素和氯霉素抗生素的LB固体平板，分别获得阳性克隆工程大肠杆菌；

（4）活化后的上述工程大肠杆菌接种到含有卡那霉素、氯霉素以葡萄糖为碳源的培养液中培养，然后转入在以丙二酸盐为碳源的培养基中继续诱导培养，发酵获得3-羟基丙酸。

2.根据权利要求1所述的合成3-羟基丙酸的制备方法，其特征在于：所述matB基因来源于：拟南芥、沼泽红假单胞菌、氧化木糖无色杆菌、泥炭假单胞菌或支气管败血性博代氏杆菌。

3.根据权利要求1所述的合成3-羟基丙酸的制备方法，其特征在于：所述matC基因来源于：裂殖酵母、根瘤菌、古菌、藤黄单胞菌或长柄镰刀菌。

4.根据权利要求1所述的合成3-羟基丙酸的制备方法，其特征在于：所述mcr基因来源于：海洋卤虫、亚硝基假丝酵母、绿曲桡菌或嗜盐小碱菌。

5.根据权利要求1所述的合成3-羟基丙酸的制备方法，其特征在于：所述YfjB基因是来源于：蚜虫、大肠杆菌K-12、沙门氏菌或欧文氏菌。

6.根据权利要求1所述的合成3-羟基丙酸的制备方法，其特征在于：所述PntAB基因是来源于：柔嫩艾美球虫、放线菌、大肠杆菌、嗜热栖热菌或牛型结核菌。

7.根据权利要求1所述的合成3-羟基丙酸的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中发酵是将活化后的所述工程大肠杆菌接种到M9液体培养液中培养，当OD_600nm为0.6时，在菌液中加入诱导剂 IPTG至终浓度0.2 mmol·L^-1，然后转入在以丙二酸盐为碳源的M9液体培养基中继续诱导培养，最终发酵获得3-羟基丙酸。

8.权利要求1所述合成3-羟基丙酸的制备方法中获得的大肠杆菌，其特征在于所述大肠杆菌为包含matB基因、mcrN基因和matC基因的pACYCDuet载体以及包含mcrC基因的pET28a载体。

9.权利要求8所述的大肠杆菌在用于以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸中的应用。

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