CN114634965B - 一种丙二酸盐转运蛋白突变体文库的高通量筛选方法及突变体和3-羟基丙酸合成的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丙二酸盐转运蛋白突变体文库的高通量筛选方法及突变体和3‑羟基丙酸合成的应用。所述高通量筛选方法包括：首先利用平板显色法对丙二酸盐转运蛋白突变体文库进行初筛，根据菌落的颜色变化筛选得到可能具有较高转运活性的突变体；然后将初筛得到的突变体经深96孔板显色法液体复筛，得到转运酶活性明显提高的突变体；最后将复筛得到的突变体进行摇瓶培养，采用高效液相色谱法测定胞外丙二酸盐浓度，从而最终确定丙二酸盐转运蛋白突变体的活性。本发明的高通量筛选方法普适性强、灵敏度高、简单有效、通量高，筛选得到的丙二酸盐转运蛋白突变体可应用于脂肪酸、聚酮类化合物、3‑羟基丙酸等产物的微生物合成。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质工程领域，具体涉及一种丙二酸盐转运蛋白突变体文库的高通量筛选方法及突变体和3-羟基丙酸合成的应用。
背景技术
丙二酸盐又称胡萝卜酸、甜菜酸或缩苹果酸，是一种C3-二羧酸，在三羧酸循环中是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，亦是植物根系分泌物中的一种常见有机酸。丙二酸盐分子结构中兼有羧基和活性亚甲基两种官能团，因而能参加各种化学反应，是有机合成极为重要的中间体。丙二酸盐在少数微生物细胞内可作为底物合成丙二酸单酰辅酶A(Malonyl-CoA)。Malonyl-CoA是酮类化合物和脂肪酸合成必不可少的重要前体物质。然而，在模式微生物，特别是大肠杆菌和酿酒酵母宿主细胞中，细胞不能代谢丙二酸盐。近些年，研究人员尝试利用丙二酸盐为原料合成基于丙二酰-CoA 介导的高附加值化学品，包括：脂肪酸、聚酮化合物、3-羟基丙酸（3-HP）等，然而产品产量普遍较低，其主要限制是因模式微生物中丙二酸盐转运蛋白的转运效率较低，仅有30%左右，严重影响了产物合成的产量。因此，提高转运蛋白的转运效率有望提高目标化合物的产量。
TRAP（ATP-independent periplasmic transporters）转运系统是一种依赖胞外溶质受体特异性吸收溶质的二级主动运输系统，它是利用离子电化学梯度而不是 ATP 水解提供能量。TRAP 转运体主要包括三个蛋白组分：吸收胞外溶质的结合蛋白 SBP 和两个大小不同的膜内在蛋白（DctQ, DctM）。研究表明，TRAP 转运蛋白是通过 SBP 来捕获具有高亲和力的特定溶质，并将其转移到位于细菌内膜中的伴侣过氧化物复合物中。在Sinorhizobium meliloti中，matP、matQ 和 matM 这三个基因具有吸收丙二酸盐的功能。目前，关于丙二酸盐转运蛋白突变体文库的高通量筛选方法暂无文献报道，这一方面的空白很大程度上限制了对该类蛋白的工程改造和应用。因此，建立一个合适的、有效的高通量筛选方法是丙二酸盐转运蛋白改造成功的关键之一。
发明内容
本发明提供了一种丙二酸盐转运蛋白突变体文库的高通量筛选方法及突变体和3-羟基丙酸合成的应用。本发明通过甲烯蓝平板初筛、甲烯蓝96深孔板液体复筛及高效液相色谱检测三步共同作用，筛选出具有高转运效率的丙二酸盐转运蛋白，以达降低假阳性、提高灵敏度的目的，且填补了目前丙二酸盐转运蛋白突变体文库的高通量筛选方法中的空白。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种丙二酸盐转运蛋白突变体文库的高通量筛选方法，包括以下步骤：
1）初筛：利用含有丙二酸盐和甲烯蓝的平板对转运蛋白突变体文库进行初筛，根据菌落的颜色变化筛选颜色，得到转运活性提高的突变体；
2）复筛：将初筛得到的突变体经深孔板液体筛选法复筛，根据菌落的颜色变化筛选颜色，得到转运活性明显提高的突变体；
3）活性确定：将复筛得到的突变体进行摇瓶培养，测定胞外丙二酸盐含量以确定转运蛋白突变体的转运效率，筛选得到转运活性最高的突变体。
进一步的，所述初筛的具体步骤为：将含有丙二酸盐转运蛋白突变体文库基因的微生物涂布于仅含抗生素的平板上，培养12h-24h后转膜于含有抗生素、诱导剂和丙二酸盐的平板，继续培养微生物，12h-24h后在平板上平铺含有甲烯蓝的凝胶，筛选出菌落的颜色显著变蓝的菌落，即为转运活性提高的突变体。
进一步的，所述复筛的具体步骤为：将初筛平板上颜色显著变蓝的菌落接入96深孔板中液体培养，加入诱导剂和丙二酸盐诱导表达转运蛋白，然后加入甲烯蓝，液体石蜡封闭，观察菌落颜色变化，筛选出菌落的颜色显著变蓝的菌落，即为转运活性明显提高的突变体。
进一步的，所述甲烯蓝的浓度为0.01%；所述丙二酸盐包括丙二酸钠，其浓度为30mM；所述诱导剂为L-阿拉伯糖，其浓度为1 mg/mL。
进一步的，所述菌落颜色变化的观察时间为1h~2h。
进一步的，所述活性确定的具体步骤为：将复筛得到的突变体菌落进行液体摇瓶培养，加入诱导剂和丙二酸盐反应后，采用高效液相色谱法测量胞外丙二酸盐含量以确定突变体的转运效率，最终筛选得到转运活性最高的突变体。
进一步的，所述丙二酸盐转运蛋白为能够转运丙二酸盐的转运蛋白。
进一步的，所述丙二酸盐转运蛋白为TRAP转运蛋白，其野生型的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
在另一种实施方式中，利用甲烯蓝平板显色法进行初筛包括：
将表达丙二酸盐转运蛋白突变体文库的微生物涂布于仅含抗生素的微生物培养平板上，培养12小时后转膜于含有抗生素、诱导剂和底物（丙二酸盐）的微生物培养平板上，次日在平板上平铺含有显色剂（甲烯蓝）的凝胶，筛选出显著变蓝的菌落，反应底物和显色剂均能够根据丙二酸盐转运蛋白而定；底物进入平板上的细菌细胞内，抑制三羧酸循环中琥珀酸脱氢生成延胡索酸过程，从而阻碍这一过程中氢的产生，进而阻碍氢与显色剂反应，使显色剂不能发生颜色变化，而只能保持原有的蓝色。
进一步的，所述初筛是利用硝酸纤维素膜将微生物形成的菌落转移至含有抗生素、蛋白表达诱导剂和底物的微生物培养平板上。
进一步的，所述蛋白表达诱导剂根据表达蛋白的载体而定。
进一步的，所述诱导剂为L-阿拉伯糖，终浓度为1 mg/mL；所述底物为丙二酸，终浓度为30 mM。
进一步的，所述初筛是向转膜平板中倒入含有显色剂甲烯蓝的半固体琼脂糖凝胶，琼脂糖的终浓度是0.5%，甲烯蓝的终浓度为0.01%。
在另一种实施方式中，利用甲烯蓝96深孔板液体复筛包括：
将初筛得到的蓝色显著的菌落接入96深孔板中进行微生物培养，加入蛋白表达诱导剂与底物，然后加入显色剂，观察颜色的变化，筛选具有较高丙二酸盐转运活性的突变体。
进一步的，所述复筛的步骤为：利用牙签将由初筛得到的突变体菌株接入含有1mL培养基的96深孔板中；37℃摇床培养16-24小时后，按照1%的接种量将突变体加入至另一个96深孔板中，37℃摇床培养至对数生长期，加入诱导剂与底物进行蛋白的诱导表达；30℃摇床培养16-24小时后加入显色剂，最后加入20 μL液体石蜡封闭，观察颜色变化，比较蓝色深浅，筛选出具有较高转运效率，即显著变蓝的菌体。
进一步的，所述蛋白表达诱导剂根据表达蛋白的载体而定。
进一步的，所述诱导剂为L-阿拉伯糖，终浓度为1 mg/mL；所述底物为丙二酸，终浓度为30 mM。
进一步的，所述显色剂是甲烯蓝，终浓度为0.01%。
在另一种实施方式中，所述活性确定步骤包括：将复筛得到的突变体菌落进行摇瓶培养，加入蛋白表达诱导剂与目的底物，反应后，采用高效液相色谱法测定胞外丙二酸盐含量，以此确定突变体的丙二酸盐转运活性。
将得到的具有丙二酸盐转运活性的突变体的菌株进行摇瓶培养，加入蛋白表达诱导剂，生产转运蛋白；加入该转运蛋白的目标底物，底物通过转运蛋白进入细胞内，通过液相色谱仪检测细胞外培养基中的丙二酸盐剩余含量，从而最终确定突变体的丙二酸盐转运活性。
进一步的，所述活性确定步骤为：将复筛得到的突变体进行摇瓶培养，37℃摇床培养。当细胞培养至对数生长期时，加入诱导剂L-阿拉伯糖，终浓度为1 mg/mL，进行蛋白的诱导表达，继续进行30℃摇床培养；培养3小时后加入目标底物丙二酸钠，终浓度是30 mM，30°C摇床反应16小时后取菌1 mL，离心取上清，用1.5%磺基水杨酸处理上清液，反应2 h后采用高效液相色谱法检测样品中丙二酸盐的含量，从而最终确定突变体的丙二酸盐转运活性。
在另一种实施方式中，本发明提供了一种丙二酸盐转运蛋白突变体文库的高通量筛选方法，所述丙二酸盐转运蛋白野生型的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括以下步骤：
1）初筛：利用硝酸纤维素膜将微生物形成的菌落转移至含有抗生素、蛋白表达诱导剂和底物的微生物培养平板上，向平板中倒入含有显色剂甲烯蓝的半固体琼脂糖，发生颜色反应，筛选出显著变蓝的菌落，得到突变体菌株；所述抗生素为氨苄青霉素，终浓度为100 mg/L，所述蛋白表达诱导剂为L-阿拉伯糖，终浓度为1 mg/mL，所述底物为丙二酸盐钠，终浓度为30 mM，所述琼脂糖的终浓度是0.5%，所述甲烯蓝的终浓度为0.01%；
2）复筛：活化初筛得到的突变体菌株，在96深孔板中加入微生物液体培养基、抗生素、蛋白表达诱导剂、底物，进行培养，诱导转运蛋白表达，蛋白将底物从胞外转运至胞内，加入显色剂，观察颜色变化，筛选出显著变蓝的菌液，得到突变体菌株；所述抗生素为氨苄青霉素，终浓度为100 mg/L，所述蛋白表达诱导剂为L-阿拉伯糖，终浓度为1 mg/mL，所述底物为丙二酸盐钠，终浓度为30 mM，所述显色剂为甲烯蓝，终浓度为0.01%；
3）活性确定：将复筛得到的突变体菌株进行摇瓶培养，加入蛋白表达诱导剂L-阿拉伯糖与目的底物丙二酸盐钠，L-阿拉伯糖终浓度为1 mg/mL，丙二酸钠的终浓度为30 mM，最后采用高效液相色谱法测定胞外丙二酸盐钠含量，以此确定突变体的丙二酸盐转运活性，得到丙二酸盐转运蛋白突变体。
本发明还提供了由所述的高通量筛选方法筛选得到的丙二酸盐转运蛋白突变体，所述丙二酸盐转运蛋白突变体具有以下氨基酸序列之一：
（1）如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；
（2）如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
本发明还提供了所述的丙二酸盐转运蛋白突变体的编码基因，其具有以下核苷酸序列之一：
（1）如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；
（2）如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。
本发明还提供了包含所述的丙二酸盐转运蛋白突变体的编码基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
本发明还提供了所述的丙二酸盐转运蛋白突变体在用于生产3-羟基丙酸中的应用。
进一步的，所述丙二酸盐转运蛋白突变体生产3-羟基丙酸的步骤为：提取丙二酸盐转运蛋白突变体菌株的质粒，将该质粒与质粒pSGH-42转化大肠杆菌C43(DE3)感受态细胞；挑取转化子进行摇瓶培养，当细胞培养至对数生长期时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（终浓度0.6 mM）和L-阿拉伯糖（终浓度1 mg/mL）进行蛋白的诱导表达，30℃诱导3h后，加入转运底物丙二酸盐钠（终浓度30 mM），30°C培养16小时后取培养液1 mL，13000xg离心10 min，取上清液，用水系滤膜过滤处理，得到3-羟基丙酸。
进一步的，所述丙二酸盐转运蛋白突变体具体为氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的PQM-TB2。
与现有技术相比，本发明具有以下有益技术效果：
1、本发明首先利用平板显色法对丙二酸盐转运蛋白突变体文库进行初筛，菌落颜色蓝色显著的突变体可能具有水解酶活性，但是易出现假阳性的结果，只能是做定性分析；进一步对筛选到的这些突变体进行复筛，利用96深孔板进行液体复筛，从而排除了假阳性的突变体；最后通过摇瓶培养，高效液相色谱法检测确定活性。
2、本发明的筛选方法包括甲烯蓝平板显色法（初筛）、甲烯蓝96深孔板液体显色法（复筛）和摇瓶培养高效液相色谱法检测法（结果确定），通过将三种方法有机地结合在一起，实现对丙二酸盐转运蛋白突变体文库，特别是TRAP转运蛋白突变体文库的高通量筛选，本发明的方法普适性强、灵敏度高、简单有效、通量高。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的甲烯蓝平板筛选的菌落显色图；其中A：丙二酸盐浓度为10 mM，甲烯蓝浓度为0.01%的平板，B：丙二酸盐浓度为30 mM，甲烯蓝浓度为0.01%的平板，C：丙二酸盐浓度为30 mM，甲烯蓝浓度为0.005%的平板。
图2为本发明实施例2提供的甲烯蓝液体复筛的菌液显色图；其中A：显色10min的菌液，B：显色1h的菌液，C：显色2h的菌液。
图3为本发明实施例3提供的易错PCR产物琼脂糖核酸电泳图；其中1：Mn2+浓度是0.05 mM；2：Mn2+浓度是0.1 mM；3：Mn2+浓度是0.2 mM；4：Mn2+浓度是0.3 mM；5：Mn2+浓度是0.4mM。
图4是本发明实施例3提供的高效液相色谱检测的突变株转运丙二酸盐的转运率结果图；其中WT：野生型，PQM-TB1、PQM-TB2为两个突变体。
图5是本发明实施例4提供的丙二酸盐转运蛋白突变体用于微生物合成3-羟基丙酸的产量结果图；其中WT：野生型，PQM-TB2为筛选所得到的丙二酸盐转运率较高的突变体。
具体实施方式
下面通过具体实施例结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例中，如无特殊说明，所使用的试剂、仪器都是本领域常规试剂、仪器，可以通过商购途径获得。所使用的方法均为本领域常规方法。
以下实施例以pBAD-PQM转运蛋白的筛选为例，但本发明方法不限于筛选pBAD-PQM转运蛋白，本领域技术人员根据本文所述内容可以毫无疑问地将本方法应用于其它丙二酸盐转运蛋白的筛选中。
实施例1：建立PQM转运蛋白的甲烯蓝平板筛选方法（初筛）
1）将含有野生型PQM表达载体（pSGN-68）的大肠杆菌 C43(DE3)（Liang B, SunGN, Wang AB, Xiao J and Yang JM. 2019. Production of 3-hydroxypropionateusing a novel malonyl-CoA-mediated biosynthetic pathway in geneticallyengineered E. coli strain. Green Chemistry 21(22): 6103-6115）和不含有载体的大肠杆菌 C43(DE3)阴性对照菌体分别涂布在含有氨苄青霉素（终浓度是100 mg/L）的培养基平板上，37°C培养过夜。PQM转运蛋白的野生型氨基酸序列如SEQID NO.1所示，核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
2）利用硝酸纤维素膜将平板上的菌落转移至含有诱导剂L-阿拉伯糖（终浓度是1mg/mL）、反应底物丙二酸盐钠（终浓度是30 mM）和氨苄青霉素（终浓度是100 mg/L）的另一个培养基平板上。
3）30°C培养24小时后，向平板中倒入含有PBS缓冲液和甲烯蓝（终浓度为0.01%）的半固体琼脂（琼脂糖的终浓度是0.5%），观察菌落的颜色变化。
4）设置不同浓度的甲烯蓝（0-0.01%）和丙二酸盐钠（0-30 mM），选择合适的用量。
5）当甲烯蓝浓度为0.01%时（图1A、图1B），丙二酸盐转运效率越高，菌落的蓝色越深。为了提高检测的灵敏度，选择30 mM作为平板筛选时所使用的底物丙二酸盐的浓度（图1B）。
6）当丙二酸盐钠的浓度为30 mM时（图1B、图1C），甲烯蓝的浓度越高，菌落的蓝色越深。为了提高检测的灵敏度，选择0.01%作为平板筛选时所使用的显色剂甲烯蓝的浓度（图1B）。
实施例2：建立PQM的甲烯蓝96深孔板液体显色筛选方法（复筛）
1）将含有野生型PQM表达载体（pSGN-68）的大肠杆菌 C43(DE3)放入含有培养基和氨苄青霉素（终浓度是100 mg/L）的96深孔板中，37°C过夜培养。
2）按照1%的比例从中取出菌液转接至新的含有培养基和氨苄青霉素（终浓度是100 mg/L）的96深孔板中，37°C培养至对数生长期，加入诱导剂L-阿拉伯糖（终浓度是1 mg/mL）进行蛋白的诱导表达，30℃诱导3小时后加入转运底物丙二酸盐钠（终浓度是30 mM）。
3）30°C过夜培养后，加入显色剂甲烯蓝（终浓度为0.01%），加入液体石蜡20 μL封闭，以防止空气中的氧气进入菌液影响显色。
4）设置不同的反应时间（10 min-2 h），选择合适的时间。
5）如图2所示，随着显色时间的增长，菌液的蓝色逐渐加深，在显色1h时，不同菌液之间的蓝色深浅差距最明显，为了增加筛选的准确性，选择1h作为甲烯蓝96深孔板液体复筛的观察时间（图2B）。
实施例3：丙二酸盐转运蛋白PQM的定向进化以及突变体文库的高通量筛选
1)易错PCR
PCR反应体系为：共25 μl，具体成分如表1所示。
表1：易错PCR反应体系成分表
| 成分 | 体积 | 终浓度 |
| 10×Taq 缓冲液 | 2.5 μl | 1× |
| dNTP | 2 μl | 0.2 mM |
| dCTP | 0.2 μl | 0.8 mM |
| dTTP | 0.2 μl | 0.8 mM |
| 引物-1 | 0.25 μl | 0.2 μM |
| 引物-2 | 0.25 μl | 0.2 μM |
| MgCl2 | 6 μl | 25 mM |
| 模板 | 0.33 μl | 1 ng |
| MnCl2 | 0.25-2 μl | 0.05-0.4 mM |
| Taq DNA聚合酶 | 0.25 μl | 0.05 U |
引物序列如下：
引物1：5’- GCTCTAGAATGAGCAGCTTTCGTCGCAA- 3’（SEQID NO.7）；
引物2：5’ –CCGCTCGAGTTTTCAATCAGTTTATCGCC-3’（SEQID NO.8）。
模板是pSGN-68质粒（Liang B, Sun GN, Wang AB, Xiao J and Yang JM. 2019.Production of 3-hydroxypropionate using a novel malonyl-CoA-mediatedbiosynthetic pathway in genetically engineered E. coli strain. GreenChemistry 21(22): 6103-6115）。
按照上述体系进行易错PCR反应，反应条件是：95°C预变性5 min；95°C变性30 s、58°C退火30 s、72°C延伸1 min 06 s，30个循环；最后72°C延伸5 min。
产物电泳图如图3所示，当Mn2+浓度是0.05-0.4 mM（0.05 mM、0.1 mM、0.2 mM、0.3mM、0.4 mM）时，扩增得到了目标条带。
为进一步确定浓度对易错随机突变频率的影响，分别构建上述五个浓度的基因随机突变文库。每库挑选3个克隆送公司进行测序。表2表明了浓度与基因突变频率的关系，结果表明当Mn2+浓度为0.05 mM时，碱基突变率为0.25%，比较符合构建突变文库的要求。
表2：Mn2+浓度与碱基突变率的关系
| Mn2+浓度（mM） | 碱基替换率（平均值%） |
| 0.05 | 0.25 |
| 0.1 | 0.44 |
| 0.2 | 0.88 |
| 0.3 | 1.1 |
| 0.4 | 1.7 |
2)突变体文库的初筛：
利用浓度为0.05 mM的Mn2+进行易错PCR，构建了随机突变基因表达文库。提取文库中的质粒，转化大肠杆菌 C43(DE3)感受态细胞。利用高通量平板显色法初步筛选出阳性克隆。具体做法是：利用硝酸纤维素膜将平板上的菌落转移至含有诱导剂L-阿拉伯糖和转运底物丙二酸钠的另一个平板上，30°C过夜培养后，加入含有甲烯蓝（0.01%）的半固体琼脂糖凝胶，观察平板颜色的变化情况。平板的颜色会慢慢变深，阳性克隆的菌落颜色变成深蓝色，其他菌落变成白色，根据颜色的差别可以挑选出可能具有高转运活性的突变体。共初筛了约5×104个突变体，从中挑选出61个突变体进行复筛。
3)突变体文库的复筛：
用无菌牙签挑取初筛得到的突变体单菌落，置于含有1 mL培养液的96深孔板中，加入L-阿拉伯糖（终浓度1 mg/L）诱导蛋白表达，加入丙二酸盐钠（终浓度30 mM）。30℃过夜培养，加入甲烯蓝（终浓度0.01%），加20 μL液体石蜡封闭，30℃反应，观察菌液颜色变化。与野生型相比，转运效率提高的突变体有2个。
4)突变体活性的确定：
将复筛得到的2个突变体进行摇瓶培养，当细胞培养至对数生长期时，加入诱导剂L-阿拉伯糖（终浓度1 mg/mL）进行蛋白的诱导表达，30℃诱导三小时后，加入转运底物丙二酸盐钠（终浓度30 mM），30°C培养16小时后取培养液1 mL，13000 xg离心10 min，取上清200μL，加入1.5%磺基水杨酸800 μL，反应两小时后，用水系滤膜过滤处理，装进色谱瓶中，采用高效液相色谱法检测体系中丙二酸钠含量。
结果如图4所示，与野生型相比，丙二酸盐转运效率提高的突变体有2个，说明微孔板筛选法的假阳性率约为0。该方法显著地提高了突变体文库筛选的准确度。在以上2个突变体中，PQM-TB1突变体的突变位点是E103G位点，丙二酸盐转运效率为40%，相对野生型提高了100%，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；PQM-TB2突变体的突变位点是S194G/Y218H/L235P/N272S位点，丙二酸盐转运效率为45%，相对野生型提高了125%，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
实施例4：丙二酸盐转运蛋白PQM突变株在3-羟基丙酸微生物合成中的应用
3-羟基丙酸（3-HP）是一种应用广泛的平台化学品，以3-HP为原料可以合成 1,3-丙二醇、丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酰胺、聚三羟基丙酸、丙内酯以及丙烯腈等化学品。传统的3-HP化学合成方法虽然较成熟，但由于存在资源限制、高成本和使用原料的有毒性等缺点并不能满足可持续发展的生产目标。而微生物发酵方法合成3-HP由于其原料的可再生、合成过程绿色等特性使其成为一种绿色可持续3-HP合成途径。丙二酰辅酶A途径是以葡萄糖为底物合成 3-HP 的最短途径，本发明在此途径基础上通过将Rhodopseudomonas palustris菌中的丙二酰-CoA合成酶以及MCR在大肠杆菌中共表达，重构了一条新的以丙二酸盐为底物经过三步催化的3-HP生物合成途径。
将本发明筛选出的丙二酸盐转运蛋白突变株PQM-TB2应用于3-HP的生物合成，具体步骤为：提取PQM-TB2突变体菌株的质粒，命名为pPQM-TB2，将该质粒与本实验室保存的质粒pSGH-42（Liang B, Sun GN, Wang AB, Xiao J and Yang JM. 2019. Production of3-hydroxypropionate using a novel malonyl-CoA-mediated biosynthetic pathwayin genetically engineered E. coli strain. Green Chemistry 21(22): 6103-6115）共转化大肠杆菌C43(DE3)感受态细胞。挑取转化子进行摇瓶培养，当细胞培养至对数生长期时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（终浓度0.6 mM）和L-阿拉伯糖（终浓度1 mg/mL）进行蛋白的诱导表达，30℃诱导三小时后，加入转运底物丙二酸盐钠（终浓度30 mM），30°C培养16小时后取培养液1 mL，13000 xg离心10 min，取上清液，用水系滤膜过滤处理，采用高效液相色谱法检测体系中3-HP含量，方法参照文献（Liang B, Sun GN, Wang AB,Xiao J and Yang JM. 2019. Production of 3-hydroxypropionate using a novelmalonyl-CoA-mediated biosynthetic pathway in genetically engineered E. colistrain. Green Chemistry 21(22): 6103-6115）。
结果如图5所示，最终3-HP产量达0.73 ± 0.05 g/L，相对野生型提高了5.08倍，所述结果说明PQM突变体可以有效地提高大肠杆菌细胞对丙二酸盐的转运效率，从而可以明显提高3-HP的生物合成产量。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种丙二酸盐转运蛋白突变体文库的高通量筛选方法及突变体和3-羟基丙酸合成的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 999
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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aagcttgccg ggccggtgga tcggcgcgct ccggcacgcc ggtcattccc ccgcccaagg 1080
tgtgaggaca agccaatgct gaaagcctat agtcaggccg ttggtaatgc aagccgtggt 1140
ctggcagttg ttgcaaccgc cctgctgatt gccgcaatgc tggttgtgtg ccagatgatt 1200
atgcagcgct atatttttcg tcaggcaacc atttggcaga ccgattttgt ggtgtttagc 1260
gcaaccgccg ccatgtttct gggtgcaccg tatgtgctgc tgaaaggcgg ccatgtgggt 1320
attgatgttg tggaaatggt tgtgggtgac cgtgttcgct atgtgctgcg tattattggc 1380
agcctgctgg gtctgctgtt ttgttttgtt atgctgattg ccacctggat tcagtttcat 1440
gatgcctggg caggtaattg gaaacatgca agtgtgtggg caccgccgct gtgggttccg 1500
ctgagtgccc tgccggttag ctttgcaatg ctgtgtctgc agtatgttgc ccagattctg 1560
accctgctga ccgcaccgac cgcccctgct gcaaccggtc atggcgccgc acaggcaggc 1620
agtgcccctg aagcaggtct gccgccgcag gaaattattc agtgcatgag tccgaccgtt 1680
agcggcctga tgattgttgc ctgtctgttt gtgctgctgg ccaccggcat gccgattgca 1740
tttgcactgg gtctggcagc atttgcagca ctgtatatgc agagcggcgc aggcattttc 1800
tatgtgctgg gtgacaccat gtttagcggt attgccaatc tggcctatgt tagtattccg 1860
atgtttgttc tgatgggcgc cgcagttgcc agtagtccgg ccggtagtga tctgtatacc 1920
agcctggatc gctggctgaa tcgcattccg ggcggtctga ttctgagtaa tattggtgcc 1980
tgtgcaattt ttagcggcat gaccggtagt agtccggcaa cctgtgccgc cattggtaaa 2040
atgggtattc cggaaatgat gcgtcgtggc tatccgccga gcgttgccag tggtagcatt 2100
gcagccggtg gcaccctggg cattctgatt ccgccgagtg ttaccctgat tgtgtatggc 2160
attgccaccg aaaccagtat tggtcgtctg tttatggcag gtattctgcc gggtattatg 2220
ctgaccatta tgtttatggc atgggccgtg attgattgca aacgtaaagg ctatgaattt 2280
gatgcccgcc tggtgcgtta tagcatgaaa gaacgcctga gcggtctgcc gcgcattctg 2340
ccgtttctgc tgattattgc aggtaccctg tatgttctgt atggtggcat tgcaaccccg 2400
agcgaagcag caggtgcagg cgcctttctg accctggttg ttgtgattgt tgcatatcgt 2460
ctgtttcgct ttcgcccggt tgccggtatt tttggtagtg caatgaaaga aagcgttatg 2520
attatgatga tcatggcagc cgcagaactg tttgcctttg cactgagtag tctgtttatt 2580
acccagaccg tggccgccgc cattgcagat atggaagtta atcgttgggt tctgatggcc 2640
attattaatg tgtttctgct ggtttgtggt atgtttctgc cgccggtggc cgtgattgtt 2700
atgaccagcc cgatgctgtt tccgattgtt acccaggccg gttttgatcc gtattggttt 2760
gcaattgttc tgaccattaa tatggaagtt ggcctgatta ccccgccggt tggtctgaat 2820
ctgtttgtga ttaatgcaat tgccccgcag attccgacca aagaaattct gtggggtagc 2880
ctgccgtatg ttctggttat gtttctggca attgtgctgc tgtgcatttt tccggatatt 2940
gccacctggc tgccgaatca gatgctgggt accgtgcagc accaccacca ccaccactaa 3000
<210> 5
<211> 3000
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgagcagct ttcgtcgcaa actgaccacc agtgcagtgg cagcaacctg gagtctgatt 60
gccagtaccg caggcgccca gaccgtgctg aaagcaagcc atcagtttcc gggtggcaaa 120
ggtgacattc gcgatgaaat ggttcagctg attgcacgtg aagtggcagc cgccaatgtg 180
ggcctggaaa ttcaggtttt tccgggcagc agtctgtata aaccgaatga tcagtggaat 240
gcagtgaccc gtggtctgct ggatatgacc agctttccgc tggattatgc cagcggccgc 300
catccggaat tttcagcaac cctgatgccg ggcctggtgg gtaattttga tcgcgcaatg 360
cgtctgaatg atagcgaatt catgggtgac attaagaaag ttattgaaga tgcaggtgca 420
ctggttattg cagatgcatg gctgagtggc gcatttgcaa gcaaaaaatc atgcattacc 480
agtccggata ccattaaggg tcaggttatt cgtgccgcag gcccggcatt tgaagaaatg 540
ctggttgaag caggcgccag tattagtagc atgccgagta gcgaaatcta taccggtatg 600
cagaccggcg tgctggatgc cgcaaatacc agtagtgcca gctttgttag ttatcgtctg 660
tttgaacagg caaaatgcct gaccgccccg ggcgaaaatg cactgtggtt tatgtatgaa 720
ccggtgctgg ttagcaaacg cgtttttgat ggcctgaccg aagaacagca gaaagccatg 780
ctggcagccg gcgaaaaagc cgaagcctat tttaatgaag aagtgcgcaa aggcgatcag 840
gttatgattg atacctataa aaaggccggc gttgaagtgg tggaaatgag caaagaagat 900
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<400> 8
ccgctcgagt tttcaatcag tttatcgcc 29
Claims (4)
1.一种丙二酸盐转运蛋白突变体，其特征在于，所述丙二酸盐转运蛋白突变体为以下氨基酸序列之一：
（1）如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；
（2）如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的丙二酸盐转运蛋白突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因为以下核苷酸序列之一：
（1）如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；
（2）如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。
3.包含权利要求2所述的丙二酸盐转运蛋白突变体的编码基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
4.权利要求1所述的丙二酸盐转运蛋白突变体在用于生产3-羟基丙酸中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210298592.4A CN114634965B (zh) | 2022-03-25 | 2022-03-25 | 一种丙二酸盐转运蛋白突变体文库的高通量筛选方法及突变体和3-羟基丙酸合成的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210298592.4A CN114634965B (zh) | 2022-03-25 | 2022-03-25 | 一种丙二酸盐转运蛋白突变体文库的高通量筛选方法及突变体和3-羟基丙酸合成的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114634965A CN114634965A (zh) | 2022-06-17 |
| CN114634965B true CN114634965B (zh) | 2023-08-15 |
Family
ID=81949876
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210298592.4A Active CN114634965B (zh) | 2022-03-25 | 2022-03-25 | 一种丙二酸盐转运蛋白突变体文库的高通量筛选方法及突变体和3-羟基丙酸合成的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114634965B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108913724A (zh) * | 2018-07-05 | 2018-11-30 | 青岛农业大学 | 一种以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸的制备方法及其相应重组细胞和应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108291231B (zh) * | 2015-06-11 | 2022-04-08 | 纳路Ic有限公司 | 由3-羟基丙酸诱导表达的启动子系统及用其生物生产3-羟基丙酸的方法 |
-
2022
- 2022-03-25 CN CN202210298592.4A patent/CN114634965B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108913724A (zh) * | 2018-07-05 | 2018-11-30 | 青岛农业大学 | 一种以丙二酸盐为原料合成3-羟基丙酸的制备方法及其相应重组细胞和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Bo Liang 等.Directed evolution of tripartite ATP-independent periplasmic transporter for 3-Hydroxypropionate biosynthesis.Appl Microbiol Biotechnol.2022,第107卷(第2-3期),663-676. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114634965A (zh) | 2022-06-17 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant |