CN116426448B - 可视化运动发酵单胞菌、构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及运动发酵单胞菌的技术领域，尤其涉及可视化运动发酵单胞菌、构建方法及应用。该可视化运动发酵单胞菌为转入了发色基因eforRed的运动发酵单胞菌ZMNP，所述发色基因eforRed来自于Echinopora forskaliana经过随机突变得到的突变基因。该重组菌株菌株的液体培养液能够呈现肉眼可见的粉色，不需要额外添加昂贵的外源底物即可显色，可以进行活细胞荧光示踪，无光毒性，为实现运动发酵单胞菌基因功能验证及代谢工程改造提供了更加有利的生物元件与监控基础。
Description
技术领域
本申请涉及运动发酵单胞菌的技术领域，尤其涉及可视化运动发酵单胞菌、构建方法及应用。
背景技术
运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)作为一种兼性厌氧革兰氏阴性菌，具有许多独特的生理特点和优异的工业生产特性，是目前唯一已知能够在厌氧条件下利用2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸(Entner-Doudoroff，ED)途径的微生物，具有较高的糖吸收率、乙醇收率和乙醇耐受性等优良特性；近年来被作为纤维素类生物质生物炼制生产生物能源的细胞工厂受到重视天然产乙醇菌株，目前已经在运动发酵单胞菌中实现了乳酸、2-3丁二醇，异丁醇等产品的生产。
为实现运动发酵单胞菌在乳酸、2-3丁二醇，异丁醇等产品的发酵生产中更加利于监控，对运动发酵单胞菌进行基因改造，例如将荧光发色蛋白转入，实现可视化改造，能够在其发酵生产中可视化监控，例如通过监控其色度值大小即可得知其生长情况，十分有利于优势菌株的筛选和发酵过程控制。例如，将荧光蛋白GFP及mCherry已经成功在运动发酵单胞菌中表达，并能检测到高强度荧光信号，发色蛋白作为荧光蛋白的同源物，存在作为运动发酵单胞菌报告基因的可能。如此得到的可视化运动发酵单胞菌更有利于实现对胞内胞外各种目标产物含量的检测，判断菌株是否符合生长预期。
而传统报告基因由于需要昂贵的外源底物添加、反应灵敏度低及细胞毒性等，逐渐被荧光蛋白报告基因所替代。即便荧光蛋白具有反应灵敏、无需外源添加底物可被激发荧光及无细胞毒性可进行活体示踪等优势，但在检测时仍需要流式细胞仪，荧光酶标仪等仪器激发荧光后通过检测传感器经仪器数据处理，检验过程较复杂。发色蛋白作为荧光蛋白的同源物，由于其强烈的吸收可见光，因此在自然光下便可观察到菌株的明显颜色，省去了复杂的荧光检验流程，具有作为报告基因的潜在优势。
发明内容
本申请实施例将来源于Echinopora forskaliana的发色蛋白基因eforRed经过针对运动发酵单胞菌密码子优化后并于基因尾端整合终止密码子序列TAA命名为ZMforRed，或者对ZMforRed进行随机突变得到的突变体基因ZMeforRed R1整合到质粒pEZ15A中，将得到的重组质粒转入运动发酵单胞菌ZMNP中，如此能够得到可视化运动发酵单胞菌，其菌株的液体培养液能够呈现肉眼可见的粉色，不需要额外添加昂贵的外源底物即可显色，可以进行活细胞荧光示踪，无光毒性，为实现运动发酵单胞菌在乳酸、2-3丁二醇、异丁醇等产品的发酵生产中提供了更加有利的监控基础。本申请实施例至少提供了如下技术方案：
第一方面，本申请实施例公开了一种可视化运动发酵单胞菌，所述可视化运动发酵单胞菌为转入了发色基因eforRed的运动发酵单胞菌ZMNP，所述发色基因eforRed来自于Echinopora forskaliana，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或2所示；其中，如SEQ ID NO.2所示的基因为如SEQ ID NO.1所示基因的突变基因。
第二方面，本申请实施例公开了一种可视化运动发酵单胞菌的构建方法，包括：
构建重组质粒，所述重组质粒携带有来自于Echinopora forskaliana的发色基因eforRed和启动子组成的操纵子，所述发色基因eforRed的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述启动子选自四环素诱导型启动子Ptet、运动发酵单胞菌组成型启动子Pgap或运动发酵单胞菌组成型启动子Pgap-4S，所述Ptet、所述Pgap和所述Pgap-4S的核苷酸序列依次如SEQID NO.3～5所示；以及
将所述重组质粒转入运动发酵单胞菌ZMNP中。
第三方面，本申请实施例公开了一种可视化运动发酵单胞菌的构建方法，包括：
构建重组质粒，所述重组质粒携带有来自于Echinopora forskaliana的发色基因eforRed和启动子组成的操纵子的突变体，所述突变体中Echinopora forskaliana的发色基因eforRed突变后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述启动子为运动发酵单胞菌组成型启动子Pgap-4S，所述Pgap-4S的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.5所示；以及
将所述重组质粒转入运动发酵单胞菌ZMNP中。
第四方面，本申请实施例公开了第一方面所述的可视化远动发酵单胞菌在乳酸、2-3丁二醇或异丁醇发酵生产中的应用。
本申请实施例提供的可视化运动发酵单胞菌、构建方法及应用具有的技术效果将在实施例中详细描述。
附图说明
图1为本申请实施例提供的ZM-Pgap-eforRed菌株的液体培养液实物图。
图2为本申请实施例提供的ZMeforRed及其突变体的核苷酸序列对比图。
图3为本申请实施例提供的分别携带ZMeforRed突变体和野生型ZMeforRed的可视化运动发酵单胞菌菌株与可视化大肠杆菌的液体培养液实物图。
图4为本申请实施例提供的分别携带ZMeforRed突变体和野生型ZMeforRed的可视化运动发酵单胞菌菌株与可视化大肠杆菌的液体培养液荧光检测结果图。
图5为本申请实施例提供的携带有表达ZMeforRed突变体的可视化运动发酵单胞菌的筛选流程图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
在本申请中，术语“可视化”应作最广泛的意义上的解释，意指细菌的生长能够表现出肉眼可见的颜色并且与其生长浓度形成一定比例关系，并且能够与环境色彩形成明显的肉眼可见的视觉差异。例如，该细菌在平板上形成具有特殊性状的菌落，或者其培养液形成能与生长浓度成比例关系的色彩。
在本申请中，“pEZ15A”质粒参照“Metabolic engineering of Zymomonasmobilis for 2,3-butanediol production from lignocellulosic biomass sugars[J]Biotechnol Biofuels.2016；9(1):189.Published online 2016Sep 2.doi:10.1186/s13068-016-0606-y.”获得。“pEZ15Asp”代表获得了壮观霉素的pEZ15A质粒，为获得不同抗性基因，可以参照“质粒pUC19-CM-D的构建及应用[J]安徽农业科学，2010年，公开的方法，第19期”在其中插入不同标记基因)电转到ZM4(ATCC31821，购自美国ATCC菌种保藏中心)。
在本申请中，“ZMNP”菌株的构建过程包括：以运动发酵单胞菌ZM4-Cas12a为出发菌株(该菌株是将来源于弗朗西斯菌(F.novicida)的核酸酶Cas12a基因与用于筛选的壮观霉素抗性基因通过同源重组的方法整合到ZM4(Z mobilis subsp.mobilis ZM4 ATCC3182)菌株基因组ZMO0038位点，构建了重组菌株ZM4-Cas12a，构建方法参照“Establishment andapplication of a CRISPR-Cas12a assisted genome-editing system In Zymomonasmobilis[J],Microbial Cell Factories，2019,18:162”)，这一菌株中含有运动发酵单胞菌内源型CRISPR-ⅠF基因编辑系统，及外源型CRISPR-Cas12a编辑系统。首先，构建第一编辑质粒(其靶向消除pZM32和pZM36)，将第一编辑质粒转入ZM4-Cas12a中，得到了pZM32和pZM36消除的菌株ZM4-Cas12aΔ32Δ36；再将第二编辑质粒(靶向消除pZM33，具体靶向pZM33的复制酶基因ZMOp33×028)转入ZM4-Cas12aΔ32Δ36中，得到内源质粒pZM32、pZM33和pZM36被消除的菌株ZM4-Cas12aΔ32Δ33Δ36；再将第四编辑质粒转入ZM4-Cas12aΔ32Δ33Δ36中，通过同源重组将pZM39质粒上毒素-抗毒素系统(T-A系统)基因替换为氯霉素基因，得到ZM4-Cas12aΔ32Δ33Δ36ΔTA::Cm菌株；再将第三编辑质粒(靶向消除pZM39，具体靶向pZM39的复制酶基因ZMOp39×032)转入ZM4-Cas12aΔ32Δ33Δ36ΔTA::Cm菌株，得到菌株ZMNP-Cas12a；最后，再将第五编辑质粒(携带ZMO0038)转入ZMNP-Cas12a中，通过ZMO0038替换Cas12a和壮观霉素基因，得到菌株ZMNP。
本申请实施例提供了能够形成具有明显肉眼可见的粉色的液体培养液的可视化运动发酵单胞菌，并且该粉色色度能够直接反应菌体浓度，无需额外添加昂贵的外源底物即可显色，可以进行活细胞荧光示踪，并且该可视化运动发酵单胞菌无光毒性，为实现运动发酵单胞菌在乳酸、2-3丁二醇、异丁醇等产品的发酵生产中提供了更加有利的监控基础。
本申请实施例提供的可视化运动发酵单胞菌为转入了发色基因eforRed的运动发酵单胞菌ZMNP，所述发色基因eforRed来自于Echinopora forskaliana，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。其中，如SEQ ID NO.2所示的基因为如SEQ ID NO.1所示基因的突变基因。
在一些实施方式中，所述发色基因eforRed的表达是以携带有该基因的重组质粒实现转入ZMNP实现的。
在一些实施方式中，所述重组质粒还携带有启动子，所述启动子选自四环素诱导型启动子Ptet、运动发酵单胞菌组成型启动子Pgap或运动发酵单胞菌组成型启动子Pgap-4S，所述Ptet、所述Pgap和所述Pgap-4S的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.3～5所示。
本申请实施例还提供了一种可视化运动发酵单胞菌的构建方法，包括：
构建重组质粒，所述重组质粒携带有来自于Echinopora forskaliana的发色基因eforRed和启动子组成的操纵子，所述发色基因eforRed的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述启动子选自四环素诱导型启动子Ptet、运动发酵单胞菌组成型启动子Pgap或运动发酵单胞菌组成型启动子Pgap-4S，所述Ptet、所述Pgap和所述Pgap-4S的核苷酸序列依次如SEQID NO.3～5所示；以及
将所述重组质粒转入运动发酵单胞菌ZMNP中。
在一些实施方式中，所述重组质粒的构建步骤包括：
将来自于Echinopora forskaliana的发色基因eforRed密码子优化后得到目的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
将启动子与目的基因片段连接成一个长片段；
将所述长片段与pEZ15A的载体骨架经吉布森装配后反应，转到大肠杆菌DH5α细胞感受态中，提取阳性克隆，即得到所述重组质粒。
在一个实施例中，启动子为四环素诱导型启动子Ptet，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。将Ptet经过针对运动发酵单胞菌密码子优化后并于基因尾端整合终止密码子序列TAA命名为ZMforRed整合到质粒pEZ15A中，然后利用诱导型启动子Ptet控制基因表达量，得到重组质粒pEZ-Ptet-eforRed，将重组质粒转入运动发酵单胞菌ZMNP中，得到具备合成发色蛋白能力的菌株ZM-Ptet-eforRed，该菌株能够表达eforRed蛋白。
在一个实施例中，启动子为运动发酵单胞菌组成型启动子Pgap，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。将Pgap与针对运动发酵单胞菌密码子优化后并于基因尾端整合终止密码子序列TAA命名为ZMforRed的发色基因整合成操纵子，连接至质粒pEZ15A中，得到重组质粒pEZ-Pgap-eforRed。将pEZ-Pgap-eforRed质粒转入运动发酵单胞菌ZMNP的感受态细胞中，得到菌株ZM-Pgap-eforRed，观察显色情况如图1，ZM-Pgap-eforRed菌株的液体培养液能够形成粉色。
本申请实施例提供了一种可视化运动发酵单胞菌的构建方法，包括：
构建重组质粒，所述重组质粒携带有来自于Echinopora forskaliana的发色基因eforRed和启动子组成的操纵子的突变体，所述突变体中Echinopora forskaliana的发色基因eforRed突变后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述启动子为运动发酵单胞菌组成型启动子Pgap-4S，所述Pgap-4S的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.5所示；以及
将所述重组质粒转入运动发酵单胞菌ZMNP中。
在一些实施例中，获得突变体的步骤包括易错PCR突变以构建eforRed突变文库的步骤。
其中，所述“易错PCR突变以构建eforRed突变文库的步骤”具体包括：
构建6个易错PCR反应体系和易错PCR反应程序；
以所述长片段为模板，依次按照所述6个易错PCR反应体系和易错PCR反应程序进行反应，以得到eforRed突变文库。
在一些实施例中，所述构建方法还包括：
将所述eforRed突变文库与pEZ15A的载体骨架经吉布森装配后反应，转到大肠杆菌DH5α细胞感受态中，提取阳性克隆，即得到所述重组质粒。
“易错PCR”是指通过改变PCR反应条件来调整PCR反应中的突变频率，降低聚合酶固有的突变序列的倾向性，提高突变谱的多样性，使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中，从而得到随机突变的DNA群体，最后用合适的载体克隆突变基因。
运动发酵单胞菌组成型启动子Pgap有一突变体Pgap-4S(如SEQ ID NO.5所示)，该突变体在大肠杆菌中表达强度极弱，在运动发酵单胞菌中表达强度极强。在一个实施例中，如图5所示，将ZMeforRed与Pgap-4S启动子组成操纵子，然后通过连续易错PCR突变该操纵子后整合到质粒pEZ15A上在大肠杆菌中转化。由于Pgap-4S启动子在大肠杆菌中表达量极弱，因此大肠杆菌中出现红色明显的阳性重组子即可判断该重组子中发色蛋白出现有利突变。提取其中的重组质粒后转入运动发酵单胞菌ZMNP菌株中，若发现其液体培养液颜色仍比野生型明显，则筛选成功，即可得到表达ZMeforRed突变体的运动发酵单胞菌菌ZM-Pgap-4S-eforRed。
此种筛选方法在构建穿梭质粒时省去了不同宿主多个启动子的构建，同时省去了高通量质粒转化到目标宿主的过程，在转化菌株大肠杆菌中即可实现初步筛选，初筛后只有剩余的少量突变体才需转化到目标宿主中检验。由于特殊简并性启动子存在，初筛中低表达量突变体转入目标宿主后表达量大幅提高，进一步提高了突变体性状在目标宿主中筛选时的便捷性，从而实现快速筛选。
本申请实施例通过此种方式，将Pgap-4S启动子与ZMeforRed形成操纵子，从快速连续易错PCR得到构建的eforRed突变文库中快速筛选得到一eforRed的突变体ZMeforRedR1，(后简称R1)，突变位点为K201E，即发色蛋白ZMeforRed第201号氨基酸由赖氨酸(Lys)突变为谷氨酸(Glu)，测序由北京擎科公司完成，结果如图2。将R1与Pgap-4S启动子连接后与pEZ15A载体通过吉布森组装构成重组质粒转化到运动发酵单胞菌ZMNP感受态中组成ZM-Pgap-4S-R1菌株。将该菌株与ZM-Pgap-eforRed菌株分别在RMG5培养基培养后，自然光观察及流式细胞仪荧光检测结果如图3及图4，可以观察到，在自然光观察下，转化菌株大肠杆菌及目的菌株运动发酵单胞菌中R1蛋白颜色均强于野生型。同时，流式细胞仪检测荧光信号排除肉眼观察主观性后，与肉眼观察结果一致。
利用该发色基因eforRed，对运动发酵单胞菌的基因改造，本申请实施例还提供了该发色基因eforRed在运动发酵单胞菌的基因改造中的应用，所述发色基因eforRed来自于Echinopora forskaliana，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。同时，本申请实施例还提供了所述的可视化远动发酵单胞菌在乳酸、2-3丁二醇和/或异丁醇产品的发酵生产中的应用。
在一些重组质粒的构建实施例中，以北京擎科公司合成的eforRed(保菌于通用puc质粒载体)及Pgap启动子为DNA扩增模板，以Pgap-eforRed-F、Pgap-eforRed-R、Pgap-F和Pgap-R为引物(划线部分为同源臂)，利用overlap PCR将Pgap与eforRed两个DNA片段连接成一个长片段Pgap-eforRed。
Pgap-eforRed-F:gttaggagaataaacatgagcgttattaagcaggttatgaaaacc；如SEQ IDNO.6所示。
Pgap-eforRed-R:ctcgagtttggatccttaaggaagggccttcggcaac；如SEQ ID NO.7所示。
Pgap-F:gttcgatcaacaacccgaatccta；如SEQ ID NO.8所示。
Pgap-R:gtttattctcctaacttattaagtagctactatattccatagc；如SEQ ID NO.9所示。
将长片段Pgap-eforRed与pEZ15A的载体骨架通过吉布森装配的方法转到大肠杆菌DH5α细胞感受态中，PCR验证平板上的阳性克隆，过夜培养后提取其中的质粒(质粒提取按照质粒提取试剂盒标准步骤)。为提高质粒电转化效率，将得到的大肠杆菌DH5α目的菌株的质粒提取后转化到去甲基化大肠杆菌trans110细胞感受态中，PCR验证平板上的阳性克隆，过夜培养后提取其中的质粒。
具体的，吉布森反应体系如表1所示，其中长片段Pgap-eforRed与pEZ15A的载体骨架的摩尔比为3:1，反应体系配制完成后，在冰上静置5分钟，然后添加化学感受态，进行化学转化。利用卡纳霉素抗性(60μg/mL)平板进行筛选，挑取单菌落，用合适的引物通过PCR进行验证PCR扩增程序设置为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸15s，共30个循环，条带大小与预期一致的通过测序进行验证。
表1
| 试剂 | 体积 |
| Pgap-eforRed | 0.12pM |
| pEZ15A | 0.04pM |
| 10×Buffer 4(Thermo) | 0.5μL |
| T5 Exonuclease | 0.5U |
| ddH2O | To 5μL |
在一个可视化运动发酵单胞菌(ZMNP-Pgap-eforRed)的构建实施例中，包括：(1)目的运动发酵单胞菌菌株感受态的制备
用接种环挑取适量运动发酵单胞菌ZMNP甘油菌在RMG5固体培养基(RMG5:50g/L葡萄糖,10g/L酵母提取物,2g/L KH2PO4，3g/L琼脂)平板上划线，30℃倒置培养2～3天活化；挑取活化的单菌落转接至含有10mL左右的RMG5(RMG5：50g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，2g/LKH2PO4)液体培养基中，于30℃静置培养至对数中期用作种子液；转接种子液至含有200mLRMG5液体培养基的250mL蓝盖瓶中，控制初始OD在0.025～0.03之间。30℃静置培养至OD＝0.4～0.6；将装有菌液的蓝盖瓶放至冰上冷却30min后，用预冷的50mL离心管于4000rpm/min，离心10min收集菌体，弃上清；向离心管中加入30mL预冷的无菌水重悬洗涤菌体，混合均匀后，4000rpm/min离心10min弃上清；向离心管中加入30mL预冷的10％甘油重悬洗涤菌体，混合均匀后，4000rpm/min离心10min弃上清，并重复该步骤一次；加入1％(体积比)的预冷的10％甘油重悬菌体，缓慢混合均匀后于冰上进行分装，每50μL分装至无菌的1.5mL离心管中，置于液氮中速冻后于-80℃保存。
(2)将重组质粒转入目的运动发酵单胞菌感受态细胞中
取运动发酵单胞菌ZMNP感受态细胞于冰上，待感受态细胞融化后取50μL加入电转杯中，并在电转杯中加入1μg质粒。电转条件为1800V，25μF，200Ω。电转完毕后于RMG5液体培养基中于30℃培养箱复苏。复苏4-6小时的培养物于6000rpm/min，1min离心，除去部分上清。悬浮菌体取100μL涂布于300μg/mL卡纳霉素抗性平板，30℃培养2天。
待有菌落生长出来之后，对重组菌株进行菌落PCR检测，PCR扩增程序设置为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸(根据片段长度按照10s/kb进行设置)，共30个循环；循环反应结束后72℃保持5min；反应体系如表2所示。
表2
| 试剂 | 反应体系用量 |
| F-primer(10μM)，如SEQ ID NO.10所示 | 0.4μL |
| R-primer(10μM)，如SEQ ID NO.11所示 | 0.4μL |
| 2×T5 Super PCR Mix(Tsingke) | 5μL |
| 模板 | 1μL |
| 双蒸水 | To 10μL |
| 总体积 | 10μL |
将获得的正确阳性克隆在卡那霉素抗性液体RMG5培养基中活化后，甘油保菌。
(3)培养条件优化
将所得到的目的菌株ZMNP-Pgap-eforRed在RMG5中进行培养条件优化。首先取一定量的甘油菌接种到含有1mLRMG5(加有3μL卡那霉素)的冻存管中，于30℃培养箱静置活化至浑浊后，倒入含有适量培养基的容器中作为培养条件优化种子液于30℃培养箱静置培养至对数中后期，转接到以50％装瓶量RMG5培养基的25mL细菌培养瓶中。将上述细菌培养瓶分别在摇床转速50rpm、100rpm、150rpm及200rpm中培养，观察发色蛋白颜色情况。
在一个可视化运动发酵单胞菌(ZMNP-Pgap-4S-eforRed)构建的实施例中，包括：(1)构建发色蛋白eforRed突变文库
参照上述实施例提供的方法，利用overlap PCR将Pgap-4S与eforRed连接成一个长片段，后使用全式金公司易错PCR DNA聚合酶(产品名为DNA Polymerase)按照如下反应体系及反应程序分6组不同的反应条件进行易错PCR突变。前一轮PCR结束后，将产物作为模板继续实验，进行连续易错PCR，构建发色蛋白eforRed突变文库。
表3易错PCR突变的反应体系即反应程序
(2)转化及重组质粒筛选
将eforRed突变文库片段与pEZ15A的载体骨架通过吉布森装配的方法转到大肠杆菌DH5α细胞感受态中，PCR验证平板上的阳性克隆，过夜培养后提取其中的质粒(质粒提取按照质粒提取试剂盒标准步骤)。为提高质粒电转化效率，将得到的大肠杆菌DH5α目的菌株的质粒提取后转化到去甲基化大肠杆菌trans110细胞感受态中，PCR验证平板上的阳性克隆，过夜培养后提取其中的质粒。
构建质粒时将获取的片段和载体按照3:1的比例进行混合，按照如表1所示的反应体系配制完成后，在冰上静置5分钟，然后添加化学感受态，进行化学转化。利用卡纳霉素抗性(60μg/mL)平板进行筛选，挑取单菌落，用合适的引物通过PCR进行验证PCR扩增程序设置为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸15s，共30个循环，条带大小与预期一致的通过测序进行验证。
(4)得到ZMNP-Pgap-4S-eforRed
取运动发酵单胞菌ZMNP感受态细胞于冰上，待感受态细胞融化后取50μL加入电转杯中，并在电转杯中加入1μg质粒。电转条件为1800V，25μF，200Ω。电转完毕后于RMG5液体培养基中于30℃培养箱复苏。复苏4-6小时的培养物于6000rpm/min，1min离心，除去部分上清。悬浮菌体取100μL涂布于300μg/mL卡纳霉素抗性平板，30℃培养2天。将获得的正确阳性克隆在卡那霉素抗性液体RMG5培养基中活化后，甘油保菌，即得可视化运动发酵单胞菌菌株ZMNP-Pgap-4S-eforRed。
(5)荧光强度测定
将所得到的目的菌株ZMNP-Pgap-eforRed在RMG5中进行培养条件优化。首先取一定量的甘油菌接种到含有1mLRMG5(加有3μL卡那霉素)的冻存管中，于30℃培养箱静置活化至浑浊后，倒入含有适量培养基的容器中作为培养条件优化种子液于30℃培养箱静置培养至对数中后期。在深孔板中每孔中加入3mLRMG5培养基，控制初始OD600nm为0.1，接入上述活化后菌液放入恒温摇床30℃100rpm培养。12h后每孔取200μL菌液加入2.0mL EP管中，12000rpm，1min离心后，去掉上清，向沉淀中加入500μLPBS缓冲液并摇匀重悬。然后再次12000rpm，1min离心后，去掉上清，向沉淀中加入500μLPBS缓冲液并摇匀重悬，完成样品处理。使用流式细胞仪检测细胞荧光强度。所用检测仪器为贝克曼库尔特公司CytoFLEX S系列流式细胞仪，每个检测样品收集20000个细胞后记录样品荧光。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种可视化运动发酵单胞菌，其特征在于，所述可视化运动发酵单胞菌转入了携带有发色基因eforRed的重组质粒的运动发酵单胞菌ZMNP，所述发色基因eforRed来自于Echinopora forskaliana，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或2所示；其中，如SEQ ID NO.2所示的基因为如SEQ ID NO.1所示基因的突变基因，所述重组质粒还携带有启动子，所述启动子选自四环素诱导型启动子Ptet、运动发酵单胞菌组成型启动子Pgap或运动发酵单胞菌组成型启动子Pgap-4S，所述Ptet、所述Pgap和所述Pgap-4S的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.3~5所示；
所述运动发酵单胞菌ZMNP的构建方法包括：以运动发酵单胞菌ZM4-Cas12a为出发菌株，通过依次靶向消除其内源性质粒pZM32、pZM33和pZM36，再通过同源重组将内源性质粒pZM39上毒素-抗毒素系统（T-A系统）基因替换为氯霉素基因后靶向消除pZM39质粒，再通过转入携带内源基因ZMO0038的质粒以替换Cas12a和壮观霉素基因。
2.一种可视化运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于，包括：
构建重组质粒，所述重组质粒携带有来自于Echinopora forskaliana的发色基因eforRed和启动子组成的操纵子，所述发色基因eforRed的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述启动子选自四环素诱导型启动子Ptet、运动发酵单胞菌组成型启动子Pgap或运动发酵单胞菌组成型启动子Pgap-4S，所述Ptet、所述Pgap和所述Pgap-4S的核苷酸序列依次如SEQID NO.3~5所示；以及
将所述重组质粒转入运动发酵单胞菌ZMNP中；
其中，所述运动发酵单胞菌ZMNP的构建方法包括：以运动发酵单胞菌ZM4-Cas12a为出发菌株，通过依次靶向消除其内源性质粒pZM32、pZM33和pZM36，再通过同源重组将内源性质粒pZM39上毒素-抗毒素系统（T-A系统）基因替换为氯霉素基因后靶向消除pZM39质粒，再通过转入携带内源基因ZMO0038的质粒以替换Cas12a和壮观霉素基因。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述重组质粒的构建步骤包括：
将来自于Echinopora forskaliana的发色基因eforRed密码子优化后得到目的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
将启动子与目的基因片段连接成一个长片段；
将所述长片段与pEZ15A的载体骨架经吉布森装配反应后，转到大肠杆菌DH5α细胞感受态中，提取阳性克隆，即得到所述重组质粒。
4.一种可视化运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于，包括：
构建重组质粒，所述重组质粒携带有来自于Echinopora forskaliana的发色基因eforRed和启动子组成的操纵子的突变体，所述突变体中Echinopora forskaliana的发色基因eforRed突变后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述启动子为运动发酵单胞菌组成型启动子Pgap-4S，所述Pgap-4S的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；以及
将所述重组质粒转入运动发酵单胞菌ZMNP中；
其中，所述运动发酵单胞菌ZMNP的构建方法包括：以运动发酵单胞菌ZM4-Cas12a为出发菌株，通过依次靶向消除其内源性质粒pZM32、pZM33和pZM36，再通过同源重组将内源性质粒pZM39上毒素-抗毒素系统（T-A系统）基因替换为氯霉素基因后靶向消除pZM39质粒，再通过转入携带内源基因ZMO0038的质粒以替换Cas12a和壮观霉素基因。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括：
将转入了所述重组质粒的ZMNP菌株于RMG5中培养，并对培养液进行荧光强度检测。
6.如权利要求1所述的可视化远动发酵单胞菌在乳酸、2-3丁二醇或异丁醇发酵生产中的应用。
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