CN116515724B - 利用无机氮源的运动发酵单胞菌、应用及氮代谢调控基因 - Google Patents
利用无机氮源的运动发酵单胞菌、应用及氮代谢调控基因 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及运动发酵单胞菌技术领域，具体涉及利用无机氮源的运动发酵单胞菌、应用及氮代谢调控基因。将运动发酵单胞菌基因组氮代谢调控蛋白编码基因位点敲除得到运动发酵单胞菌工程菌株，该菌株利用无机氮源的能力显著提高，并且相对于野生型菌株具有更快的生长速率和更大的生物量。并且，本申请还发现了能够抑制固氮调控基因nifA表达的氮代谢调控蛋白编码基因，为运动发酵单胞菌及其他工业菌株的固氮工程菌株构建提供靶点。
Description
技术领域
本申请涉及运动发酵单胞菌技术领域，具体涉及利用无机氮源的运动发酵单胞菌、应用及氮代谢调控基因。
背景技术
运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)作为一种兼性厌氧革兰氏阴性菌，具有许多理想的工业生产特性，如副产物少、高比生产率、糖利用速率快、高乙醇耐受性、生长与能量解偶联、不受噬菌体感染、发酵过程中不需要氧气及通常认为是生物安全的等特点。此外，Z.mobilis ZM4野生菌株被发现能够固定氮气，且以氮气作为唯一氮源生产乙醇时，不影响最终的乙醇产率，能够达到理论乙醇产率的97％，比使用1％的玉米浆作为氮源时的最大理论转化率(94％)更高；但是其生物量较低，固氮能力受到限制。因此，希望进一步提高运动发酵单胞菌的固氮能力，使运动发酵单胞菌成为能高效利用氮气生产多种产品的工业菌株。
发明内容
本申请发明人创造性地发现，将运动发酵单胞菌基因组ZMO1107位点(盛宴/饥荒响应调控蛋白或亮氨酸响应调控蛋白Lrp的编码基因)敲除，能够显著提高菌株利用氮源的能力，比如能够提高菌株将氮气和/硫酸铵作为氮源进行发酵的能力，并且相对于野生型菌株(ZM4)具有更快的生长速率和更大的生物量。并且，本申请还发现了能够抑制固氮调控基因nifA表达的氮代谢调控蛋白编码基因lrp，为运动发酵单胞菌及其他工业菌株的固氮工程菌株构建提供靶点。
为此，本申请实施例至少公开了以下技术方案：
第一方面，本申请实施例公开了一株运动发酵单胞菌的基因工程菌株，所述基因工程菌株为盛宴/饥荒响应调控蛋白或亮氨酸响应调控蛋白Lrp的编码基因被敲除的运动发酵单胞菌ZM4；所述ZM4菌株为Z.mobilis subsp.mobilis ZM4 ATCC 31821。
第二方面，本申请实施例公开了一种运动发酵单胞菌的氮代谢调控基因，为盛宴/饥荒响应调控蛋白或亮氨酸响应调控蛋白Lrp的编码基因，位于ZM4菌株基因组上ZMO1107位点。
第三方面，本申请实施例公开了一种运动发酵单胞菌的基因工程菌株利用无机氮源的发酵方法，包括：
将所述基因工程菌株接入含所述无机氮源的培养基中进行发酵，所述无机氮源选自氮气或硫酸铵中的至少一种；
其中，所述基因工程菌株为盛宴/饥荒响应调控蛋白或亮氨酸响应调控蛋白Lrp的编码基因被敲除的运动发酵单胞菌ZM4；所述ZM4菌株为Z.mobilis subsp.mobilis ZM4ATCC 31821，所述Lrp的编码基因位于ZM4菌株基因组上ZMO1107位点。
第四方面，本申请实施例公开了一株运动发酵单胞菌的基因工程菌株的构建方法，其中，所述基因工程菌株为盛宴/饥荒响应调控蛋白或亮氨酸响应调控蛋白Lrp的编码基因被敲除的运动发酵单胞菌ZM4；所述ZM4菌株为Z.mobilis subsp.mobilis ZM4 ATCC31821，所述Lrp的编码基因位于ZM4菌株基因组上ZMO1107位点；
所述构建方法包括：
构建敲除所述Lrp的编码基因的编辑质粒；以及
将所述编辑质粒转入所述运动发酵单胞菌ZM4中。
第五方面，本申请实施例公开了第一方面所述的基因工程菌在微生物固氮、利用有机氮和/或无机氮进行发酵中的应用。
本申请提供的运动发酵单胞菌的基因工程菌株、氮代谢调控基因、发酵方法、构建方法及应用的有益效果将在具体实施例中详细阐述。
附图说明
图1为本申请实施例提供的菌落PCR验证结果图。
图2为本申请实施例提供的ZM4菌株和lrp-菌株在RM和MM中的生长曲线图。
图3为本申请实施例提供的ZM4菌株和lrp-菌株在MMN中的生长曲线图。
图4为本申请实施例提供的向MM和MM-中通入氮气的装置结构示意图。
图5为本申请实施例提供的ZM4菌株和lrp-菌株的基因型及其在MM-N和MM-中的生长曲线图。
图6为本申请实施例提供的双荧光报告系统重组质粒的ZM4菌株和lrp-菌株的菌落PCR电泳结果图。
图7为本申请实施例提供的双荧光报告系统重组质粒的ZM4菌株和lrp-菌株0g/L和2g/L亮氨酸两种条件下的EGFP/mCherry双荧光相对比值。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
本申请实施例提供的运动发酵单胞菌的基因工程菌株是以运动发酵单胞菌ZM4为出发菌株，通过基因工程的手段对菌株的ZMO1107(Gene ID:58026885)位点进行基因敲除得到的菌株。其中，所述ZM4菌株为Z.mobilis subsp.mobilis ZM4 ATCC 31821，所述ZMO1107位点对应为编码盛宴/饥荒响应调控蛋白或亮氨酸调控蛋白的基因lrp。利用ZM4的内源Ⅰ-F型CRISPR-Cas编辑系统的基因编辑技术对菌株基因组ZMO1107位点进行敲除，能够显著提高菌株利用氮源的能力，比如能够提高菌株将氮气和/硫酸铵作为氮源进行发酵的能力，并且相对于野生型菌株(ZM4)具有更快的生长速率和更大的生物量。
为此，本申请实施例公开了一株运动发酵单胞菌的基因工程菌株，所述基因工程菌株为盛宴/饥荒响应调控蛋白或亮氨酸响应调控蛋白Lrp的编码基因被敲除的运动发酵单胞菌ZM4；所述ZM4菌株为Z.mobilis subsp.mobilis ZM4 ATCC 31821。所述Lrp的编码基因位于ZM4菌株基因组上ZMO1107位点。
另外，本申请实施例公开了一种发酵方法，包括：将运动发酵单胞菌的基因工程菌株接入以氮气和/或硫酸铵作为氮源的培养基中进行发酵；其中，所述基因工程菌株为盛宴/饥荒响应调控蛋白或亮氨酸响应调控蛋白Lrp的编码基因被敲除的运动发酵单胞菌ZM4；所述ZM4菌株为Z.mobilis subsp.mobilis ZM4 ATCC 31821，所述lrp的编码基因位于ZM4菌株基因组上ZMO1107位点。在这些实施例中，利用lrp敲除的ZM4进行发酵，以硫酸铵为唯一氮源时，所述基因工程菌株于30h内能够得到OD600值为0.9的生物量。在这些实施例中，利用lrp敲除的ZM4进行发酵，以硫酸铵和氮气为唯一氮源时，所述基因工程菌株于30h内能够得到OD600值为1.8的生物量。在这些实施例中，利用lrp敲除的ZM4进行发酵，以氮气为唯一氮源时，所述基因工程菌株于30h时能够得到OD600值为0.6的生物量。
另外，在一些实施例中，利用lrp敲除的ZM4进行发酵，还能够有机氮源，例如以酵母提取物为唯一氮源时，所述基因工程菌株于20h内能够得到OD600值为4.9的生物量，说明lrp敲除的ZM4极大地促进了其利用有机氮源的能力。
为此，如图5所示，本申请实施例还公开了此种运动发酵单胞菌的基因工程菌株的构建方法。该构建方法包括构建敲除所述Lrp的编码基因的编辑质粒；以及将所述编辑质粒转入所述运动发酵单胞菌ZM4中。进一步的，该构建方法还包括将转入了所述编辑质粒的所述运动发酵单胞菌ZM4在无抗性的RM液体培养基中连续培养和传代，经菌落PCR验证得到所述编辑质粒丢失的菌株，即为所述基因工程菌株。
在一些实施例中，该编辑质粒携带有由如SEQ ID NO.1所示的先导区、如SEQ IDNO.2所述的重复区、位于所述先导区上游的如SEQ ID NO.3所述的供体区以及位于所述重复区之间的如SEQ ID NO.4所述的向导区；其中，所述向导区靶向结合所述ZMO1107位点。将该编辑质粒转入ZM4中，能够利用ZM4自身的内源性内源型CRISPR-ⅠF(例如其内源性表达的Cas酶)实现与编辑质粒上的向导区转录得到的gRNA共同实现对目的基因(lrp)的定点敲除。
另外，本申请实施例还提供了该运动发酵单胞菌的基因工程菌株在微生物固氮、利用有机氮和/或无机氮生物合成乙醇、2-3丁二醇、异丁醇、聚-β-羟丁酸(PHB)和乳酸中的应用。
下方将对上述实施例中使用的编辑质粒的构建过程，以及采用这些质粒对ZM4进行lrp基因敲除得到菌株lrp-的编辑过程，以及所得基因工程菌株的应用进行更加详细的说明。
1、lrp基因敲除的编辑质粒的构建
(1)向导区
在lrp(Gene ID:58026885)基因内部，选择PAM位点CCC位点下游32bp的序列作为向导区，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
(2)构建靶质粒
根据向导区，设计其靶向引物，以将向导区构建至靶质粒中，以引导核酸酶对靶位点的切割。其中，靶向引物包括：gRNA-lrp-F，如SEQ ID NO.5所示，gRNA-lrp-R，如SEQ IDNO.6所示。
在一个实施例中，向导RNA引物序列连接到专利CN110408642 A中含有CRISPR-ⅠF表达单元的壮观霉素编辑质粒载体(pEZ15Asp)上：首先利用限制性内切酶BsaⅠ将载体进行线性化处理，然后将向导RNA引物对进行退火(10μM的引物各取1μL加水补足至10μL，95℃变性5min，然后冷却至室温备用)。退火的产物与线性化载体使用T4 DNA连接酶进行连接，然后通过本领域通用化学转化法转入到大肠杆菌克隆菌株DH5α中进行质粒构建，通过菌落PCR对重组子进行筛选最后通过测序验证。如此得到的靶质粒上携带了向导RNA。
在该实施方式的一些实施例中，该基础质粒壮观霉素编辑质粒载体(pEZ15Asp)是在pEZ15A上插入一个初始CRISPR簇，并且替换成为具有不同的第二复制起始区得到的。其中，pEZ15A(核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示)参照“Yang S,Mohagheghi A,Franden M A,et al.Metabolic engineering of Zymomonas mobilis for 2,3-butanediolproduction from lignocellulosic biomass sugars[J].Biotechnol Biofuels,2016,9(1):189.”方法获得。为获得不同编码基因(例如抗性基因)的pEZ15A，可以参照“质粒pUC19-CM-D的构建及应用[J].安徽农业科学，2010年，公开的方法，第19期”在其中插入不同标记基因，例如插入了壮观霉素抗性基因的pEZ15Asp，其具有如SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列的第一复制起始区、如SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列的第二复制起始区和位于第一复制起始区的复制起始端与第二复制起始区的复制终端之间的标记基因区(Spe基因)，第一复制起始区为156～1069bp之间，第二复制起始区位于2142～3015bp之间。
(3)构建编辑质粒
根据lrp基因上游序列(SEQ ID NO.7所示)设计引物up-lrp-F(SEQ ID NO.8所示)和up-lrp-R(SEQ ID NO.9所示)进行PCR扩增得到上游序列。
根据lrp基因下游序列(SEQ ID NO.10所示)设计引物down-lrp-F(SEQ ID NO.11所示)和down-lrp-R(SEQ ID NO.12所示)进行PCR扩增得到下游序列。
利用引物pL2R-FK-F(SEQ ID NO.13所示)和pL2R-FK-R(SEQ ID NO.14所示)进行对上一步构建好的靶载体进行反向PCR扩增。PCR扩增程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸(根据片段长度按照10s/kb进行设置，共30个循环)；循环反应结束后72℃保持5min。然后通过Gibson装配的方法将片段和载体进行连接，然后转入到大肠杆菌克隆菌株DH5α中进行质粒构建，通过菌落PCR对重组子进行筛选最后通过测序验证。
2、质粒的转化
(1)感受态制备
将ZM4的冻存菌从-80℃冰箱中取出，解冻后取100μL接种在装有1mL RM的冻存管中，于30℃培养箱静置培养以活化菌株。待培养至浑浊后，转接至装有200mL RM液体培养基的250mL蓝盖瓶中，使初始OD600nm在0.025～0.3范围内，于30℃培养箱静置培养，待OD600nm超过0.3时，常温100rpm收集菌体，随后用无菌水洗1次，10％甘油洗两次，最终用1～2mL10％甘油缓慢重悬菌体，分装55μL感受态到1.5mL EP管中。
(2)质粒电转方法
将1mg靶向lrp的编辑质粒加入到装有55μL感受态的1.5mL EP管中，轻轻混匀后转移到1mm电转杯中。电转仪程序设置：200Ω，电容：25μF，电压：1.6KV。将电转杯放入电转仪中进行电转，电转后立即加入1mL RM液体培养基，混匀后转移到无菌EP管中，用封口膜封好后于30℃恒温培养箱中孵育4～6h。取100μL菌液，均匀涂布到RM+Spe平板(100μg/mL壮观霉素)上。用封口膜将平板封好后放在30℃培养箱中倒置培养。
(3)菌落PCR验证方法
平板上长出单菌落后，用验证转入的编辑质粒的引物对单菌落进行PCR验证。PCR体系和PCR程序分别如表1和表2所示。将获得的正确阳性克隆在所带RM+Spe培养基中活化后，甘油保菌。
表1菌落PCR反应体系
表2PCR程序
(4)编辑质粒消除方法
将内源质粒消除成功的菌株接种在没有抗性的RM液体培养基中，待长到浑浊后转接100μL菌液到1mL新鲜的RM液体培养基中，如此连续传代4～5代后，取100μL菌液稀释涂在RM平板上。待平板上长出单菌落后，用验证编辑质粒的引物对单菌落进行PCR验证，若PCR没有条带，则编辑质粒可能丢失。将菌落PCR没有条带的单菌落分别接种在RM液体培养基和RM+Spe液体培养基中，放置在30℃静置培养。第二天对两种培养基下的培养结果进行观察，若在RM液体培养基可以生长变浑浊，而在RM+Spe液体培养基中无法生长呈澄清状态，则可以确认编辑质粒已被消除。
在一个运动发酵单胞菌的基因工程菌株的构建实施例中，将靶向lrp的编辑质粒电转入ZM4中，涂布在RM+Spe平板上。得到的转化子用引物Chk-lrp-F(SEQ ID NO.15所示)和Chk-lrp-R(SEQ ID NO.16所示)进行验证。菌落PCR以ZM4的PCR结果作为对照。菌落PCR以引物pEZ15A-F(SEQ ID NO.17所示)和pEZ15A-R(SEQ ID NO.18所示)的PCR扩增结果观察其它内源质粒是否存在单菌落在RM液体培养基中连续传代后得到编辑质粒丢失的得到lrp-菌株。菌落PCR验证结果如图1所示。结果如图1所示，若菌落PCR的电泳条带无2000bp，出现1500bp条带，说明菌株构建成功的编辑质粒丢失。
3、以酵母提取物或硫酸铵为唯一氮源时的生长测试
RM培养基成分：1％ Yeast extract，0.2％ KH2PO4，50g/L glucose，pH为5.8，108℃灭菌30min。
MM培养基成分：50g/L glucose，1g/L KH2PO4，1g/L K2HPO4，0.5g/L NaCl，1g/L(NH4)2SO4，108℃灭菌30min；0.5g/L MgSO4·7H2O，0.025g/L Na2MOO4·2H2O，过滤除菌。
将运动发酵单胞菌ZM4和lrp敲除菌株lrp-在丰富培养基RM(酵母提取物为唯一氮源)和MM基本培养基(硫酸铵为唯一氮源)中进行生长测试。首先取一定量ZM4和lrp-甘油菌分别接种到含有1mL RM的冻存管中，于30℃培养箱静置活化至浑浊后，转接入装有80mL RM培养基的100mL的三角瓶中作为发酵种子液，于30℃培养箱静置培养。待菌株培养至对数生长期(OD600nm为0.8～2)后，进一步收集菌体、清洗菌体种子液，转接到装有40mL RM或MM培养基的50mL三角瓶中，控制初始OD600nm为0.1、培养温度为30℃、转速为100rpm进行生长测试。用紫外分光光度计测量OD值600nm处的光密度测定不同时间点的细胞生长，待OD600nm数据稳定，则结束测定。
具体为在30℃，装瓶量为80％的RM培养基于50mL三角瓶，100rpm培养条件下进行测试。在发酵过程中每隔一定时间取样测试OD600nm，取其对数，得到ZM4和lrp-在RM和MM中的比生长速率以及曲线图，如图2所示。lrp-在RM和MM中的比生长速率和生物量均低于对照菌株ZM4。
4、以氮气和硫酸铵为混合氮源时的生长测试
MMN培养基成分：利用真空泵排空装有MM培养基的厌氧瓶中的空气，时间为30s，随后通入氮气，时间为30s，氮气压力设置为0.05MPa，重复三次。
将运动发酵单胞菌ZM4和lrp敲除菌株lrp-在MMN(通入氮气的MM，氮气通入装置如图4所示)培养基中进行生长测试。首先取一定量ZM4和lrp-甘油菌分别接种到含有1mL RM的冻存管中，于30℃培养箱静置活化至浑浊后，转接入装有80mL RM培养基的100mL的三角瓶中作为发酵种子液，于30℃培养箱静置培养。待菌株培养至对数生长期(OD600nm为0.8～2)后，进一步收集菌体、清洗菌体种子液，转接到装有35mL MMN培养基的100mL厌氧瓶中，控制初始OD600nm为0.1、培养温度为30℃进行生长测试。用紫外分光光度计测量OD值600nm处的光密度测定不同时间点的细胞生长，待OD600nm数据稳定，则结束测定。
具体为在30℃，装瓶量为35％的MMN培养基于100mL厌氧瓶中，100rpm培养条件下进行测试。在发酵过程中每隔一定时间取样测试OD600nm得到ZM4和lrp-在MMN中的生长曲线图，如图3所示。lrp-在MMN中的比生长速率和生物量均高于对照菌株ZM4。
5、以氮气为唯一氮源时的生长测试
MM-培养基成分：50g/L glucose，1g/L KH2PO4，1g/L K2HPO4，0.5g/L NaCl，108℃灭菌30min；0.5g/L MgSO4·7H2O，0.025g/L Na2MOO4·2H2O，过滤除菌。
将运动发酵单胞菌ZM4和lrp敲除菌株lrp-在MM-(不含氮源的MM培养基)和MM-N(通入氮气的MM-培养基，氮气通入装置如图4所示)培养基中进行生长测试。首先取一定量ZM4和lrp-甘油菌分别接种到含有1mL RM的冻存管中，于30℃培养箱静置活化至浑浊后，转接入装有80mL RM培养基的100mL的三角瓶中作为发酵种子液，于30℃培养箱静置培养。待菌株培养至对数生长期(OD600nm为0.8～2)后，进一步收集菌体、清洗菌体种子液，转接到装有40mL MM-培养基的50mL三角瓶或装有35mL MM-N培养基的100mL厌氧瓶中，控制初始OD600nm为0.2、培养温度为30℃进行生长测试。用紫外分光光度计测量OD值600nm处的光密度测定不同时间点的细胞生长，待OD600nm数据稳定，则结束测定。
具体为在30℃，装瓶量为35％的MM-N培养基于100mL厌氧瓶中，100rpm培养条件下进行测试；在30℃，装瓶量为80％的MM-培养基于50mL三角瓶，100rpm培养条件下进行测试。在发酵过程中每隔一定时间取样测试OD600nm，得到ZM4和lrp-在MM-N和MM-中的生长曲线图，如图5所示。lrp-在MM-N和MM-中的生长均优于对照菌株ZM4。
另外，本申请实施例还公开了一种运动发酵单胞菌的氮代谢调控蛋白编码基因，为盛宴/饥荒响应调控蛋白或亮氨酸响应调控蛋白Lrp的编码基因，位于ZM4菌株基因组上ZMO1107位点。在一些实施例中，该氮代谢调控基因lrp编码蛋白抑制固氮调控基因nifA的表达。
在一些实施例中，通过转录组测序技术，挖掘lrp-和ZM4相比差异表达的基因。具体为在30℃，装瓶量为80％的RM培养基于50mL三角瓶，100rpm培养条件下，lrp-和ZM4在RM和MM中生长至OD600nm为0.4～0.6时，以4000rpm离心收集10mL细胞，液氮速冻后立即保存于-80℃冰箱中。最后，将收集的ZM4和lrp-委托GENEWIZ(中国苏州)进行转录组测序，得到lrp-和ZM4在RM和MM中共同存在的显著差异基因表，如表3所示。显著差异基因中包括了固氮调控蛋白编码基因nifA等固氮相关基因，Lrp可能调控Z.mobilis生物固氮过程。
表3在RM和MM中lrp-与ZM4相比共同存在的显著差异基因
在一些实施例中，将nifA启动子(PnifA)克隆至含有PlacUV5和Ptet启动子的双荧光(EGFP和mCherry)报告基因系统中替换Ptet启动子序列，构建双荧光报告系统重组质粒。随后，将重组质粒电转化至菌株ZM4和lrp-中，得到双荧光报告重组菌株ZM4(PnifA_Dual)和lrp-(PnifA_Dual)，菌落PCR验证结果如图6所示。
在一些实施例中，在不同浓度配体亮氨酸条件下，将双荧光报告重组菌株ZM4(PnifA_Dual)和lrp-(PnifA_Dual)进行流式细胞仪分析，得到EGFP/mCherry双荧光相对比值，如图7所示。0和2g/L亮氨酸两种条件下，lrp-(PnifA_Dual)的EGFP/mCherry双荧光相对比值均高于ZM4(PnifA_Dual)中的比值，说明Lrp抑制固氮调控蛋白编码基因nifA的表达。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
Claims (6)
1.一株运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）的基因工程菌株，所述基因工程菌株为ZMO1107基因被敲除的运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）ZM4菌株；所述ZM4菌株为Z.mobilis subsp.mobilis ZM4 ATCC 31821，所述ZMO1107基因的基因编号为Gene ID:58026885。
2.一种运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）的基因工程菌株利用无机氮源的发酵方法，包括：
将所述基因工程菌株接入含所述无机氮源的培养基中进行发酵，所述无机氮源选自氮气或硫酸铵中的至少一种；
其中，所述基因工程菌株为ZMO1107基因被敲除的运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）ZM4菌株，所述ZM4菌株为Z.mobilis subsp.mobilis ZM4 ATCC 31821，所述ZMO1107基因的基因编号为Gene ID:58026885。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述无机氮源为硫酸铵时，所述基因工程菌株于30h内能够得到OD600值为0.9的生物量；或者
所述无机氮源为氮气时，所述基因工程菌株于30h时能够得到OD600值为0.6的生物量；或者
所述无机氮源为硫酸铵和氮气时，所述基因工程菌株于30h时能够得到OD600值为1.5的生物量。
4.一株运动发酵单胞菌的基因工程菌株的构建方法，其中，所述基因工程菌株为ZMO1107基因被敲除的运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）ZM4菌株，所述ZM4菌株为Z.mobilis subsp.mobilis ZM4 ATCC 31821，所述ZMO1107基因的基因编号为Gene ID:58026885；
所述构建方法包括：
构建敲除所述ZMO1107基因的编辑质粒；以及
将所述编辑质粒转入所述运动发酵单胞菌ZM4中。
5.根据权利要求4所述的构建方法，还包括：
将转入了所述编辑质粒的所述运动发酵单胞菌ZM4在无抗性的RM液体培养基中连续培养和传代，经菌落PCR验证得到所述编辑质粒丢失的菌株，即为所述基因工程菌株。
6.权利要求1所述的基因工程菌株在微生物固氮、利用有机氮和/或无机氮进行发酵中的应用。
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|---|
| Zymomonas mobilis subsp. mobilis ZM4=ATCC 31821 chromosome, complete genome;Yang，s.，等;Genbank登录号CP023715.1;参见第104521-106158位碱基序列 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116515724A (zh) | 2023-08-01 |
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