CN112626083B - 大豆GmFBX176m3基因及其表达载体和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出一种大豆GmFBX176m3基因及其表达载体和应用，属于基因工程技术领域。该大豆GmFBX176m3基因的序列任选自如下(a)或(b)所述的序列之一：(a)含有序列表SEQ ID NO:1所示的核心核苷酸序列；(b)利用序列表SEQ ID NO:1所示的核心核苷酸序列中的其它位点突变、但利用位点突变后核苷酸序列所编码的氨基酸序列与序列表SEQ ID NO:1所编码的氨基酸序列一致的核苷酸序列。本发明通过PEG模拟干旱和干旱胁迫表型观察发现，过表达GmFBX176m3会降低复合体植株的抗旱性，存在负相关关系，推断GmFBX176m3基因是编码干旱反应的负调控因子，抑制其表达可用于改善大豆的抗旱性。

Description

大豆GmFBX176m3基因及其表达载体和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种大豆GmFBX176m3基因及其表达载体和应用。
背景技术
植物会遭受各种非生物胁迫，例如：干旱、高盐度和冷冻等，这些胁迫会干扰细胞的水平衡，影响植物的生长，从而影响作物的生产力。并且非生物胁迫可导致植物一系列的生理和生化反应，例如：促进气孔关闭、影响细胞的分裂和伸长、改变细胞壁的弹性、抑制光合作用以及激活呼吸作用等，从而影响植物的生长和发育。
大豆作为全球最重要的农作物之一，其种子中含有丰富的蛋白和油，被用于人类食品或者动物饲料。干旱、高盐和低温等一系列非生物胁迫因素对大豆的生长、发育以及生产量造成严重威胁。在大豆植株的各组分中，根具有非常好的可塑性，但是至今为止对于调控根发育的可塑性分子机制仍然存在许多的未知。大豆根是土壤中第一个被逆境胁迫破坏的植物器官，对于研究大豆的抗逆性很关键。然而要确保在逆境中大豆高产机制的成功建立，大豆根抗逆的遗传机制有待探索。因此，探寻大豆抗旱的新机制对于加快大豆抗旱品种育种进程具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种大豆GmFBX176m3基因及其表达载体和应用，通过PEG模拟干旱和干旱胁迫表型观察发现，过表达GmFBX176m3基因会降低复合体植株的抗旱性，而抑制该基因的表达，则能够显著提高大豆的抗旱性，由此可见，GmFBX176m3基因是编码干旱反应的负调控因子，抑制其表达可用于改善大豆的抗旱性。
为了达到上述目的，本发明提供了一种大豆GmFBX176m3基因，所述大豆GmFBX176m3基因的序列任选自如下(a)或(b)所述的序列之一：
(a)含有序列表SEQ ID NO:1所示的核心核苷酸序列；
(b)利用序列表SEQ ID NO:1所示的核心核苷酸序列中的其它位点突变、但利用位点突变后核苷酸序列所编码的氨基酸序列与序列表SEQ ID NO:1所编码的氨基酸序列一致的核苷酸序列。
本发明提供了一种利用含有上述技术方案所述的核心核苷酸序列的大豆GmFBX176m3基因的全长序列所编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。
本发明提供了一种表达载体，其是在植物表达载体中插入了上述技术方案所述的如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
本发明提供了一种根据上述技术方案所述的大豆GmFBX176m3基因在以干旱、高盐和/或ABA为选择压力的选择标记方面的应用。
本发明提供了一种根据上述技术方案所述的大豆GmFBX176m3基因在培育抗干旱、耐高盐和/或耐ABA的转基因植物的应用。
本发明提供了一种根据上述技术方案所述的大豆GmFBX176m3基因在基因工程调整大豆抗旱性中的应用。
作为优选，抑制该基因的表达，能够显著提高大豆的抗旱性；过表达该基因，能够减弱大豆的抗旱性。
本发明提供了一种提取、扩增上述技术方案所述的大豆GmFBX176m3基因的PCR方法，包括以下步骤：
1)提取大豆根RNA，反转录成cDNA；
2)以大豆根cDNA为模板，利用克隆引物以及LA-Taq聚合酶进行PCR扩增；其中：
PCR反应体系：模板cDNA 1.0μL、正向引物1.0μL、反向引物1.0μL、10×PCR buffer5.0μL、dNTPs 4.0μL、LA-Taq聚合酶0.5μL和ddH2O 35.5μL,总体积50μL。
引物：PFBP-F：5'-GTCCTGTGTGGAAAATGAAGAGAGA-3'，PFBP-R：5'-AAGCTAAATCAAGCCATTGCAGTG-3'。
作为优选，PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s；60℃复性30s；72℃延伸60s；34个PCR循环，72℃延伸10min。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明将突变gma-miR394a靶位点3个碱基的GmFBX176m3转化发根农杆菌K599，命名为GmFBX176m3-K599，并将划线培养菌体注入大豆子叶节中，从而获得转基因毛状根大豆复合体植株。通过PCR和qPCR检测了毛状根中GmFBX176m3基因的表达量显著高于对照植株；通过PEG模拟干旱和干旱胁迫表型观察发现，过表达GmFBX176m3会降低复合体植株的抗旱性，存在负相关关系。由此可见，GmFBX176m3基因是编码干旱反应的负调控因子，抑制其表达可用于大豆抗旱性的改善。
附图说明
图1为本发明实施例提供的转基因毛状根大豆复合体植株获得的示意图；
图2为本发明实施例提供的转基因毛状根PCR检测示意图，其中，M：DL2000；1-5：GmFBX176m3-K599 DNA；6：GmFBX176m3-pEGAD质粒；7：K599对照；-：水对照；
图3为本发明实施例提供的GmFBX176m3转基因毛状根qPCR检测示意图；
图4为本发明实施例提供的转基因毛状根大豆复合体植株PEG胁迫示意图，其中a：将转基因和对照复合体大豆正常水培生长20天，用10％PEG溶液胁迫1周后，表型观察；b：转基因和对照复合体大豆存活率统计分析；实验独立重复3次；
图5为本发明实施例提供的转基因毛状根大豆复合体植株的干旱胁迫示意图，其中a：转基因和对照复合体大豆在营养土中正常生长30天，干旱胁迫5天，复水2天后表型观察；b：转基因和对照复合体大豆存活率统计分析；实验独立重复3次；
图6为本发明实施例提供的转基因毛状根大豆复合体植株生理指标测定示意图，其中a：转基因和对照复合体大豆干旱胁迫前后叶片中MDA含量的测定；b：转基因和对照复合体大豆干旱胁迫前后叶片中蔗糖含量的测定；c：转基因和对照复合体大豆干旱胁迫前后叶片中POD含量的测定(*P<0.05，**P<0.01)。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 GmFBX176m3基因的获得
GmFBX176m3基因的获得包括以下步骤：
gma-miR394a是大豆的一个保守miRNA，过表达gma-miR394a的前体序列能够减少叶片水分丧失且增强转基因拟南芥的干旱忍耐能力。
通过生物信息学预测和修饰的5'RLM-RACE实验证实，gma-miR394a能够在其与GmFBX176的互补位点切割GmFBX176的mRNA，减少GmFBX176的表达水平，进而抑制GmFBX176基因，即gma-miR394a负调控GmFBX176基因。
GmFBX176m3是将gma-miR394a互补位点的3个核苷酸突变得到抵抗gma-miR394a形式的GmFBX176基因，3个核苷酸突变后，将减少gma-miR394a对GmFBX176基因的负调控。考虑到gma-miR394a靶位点3个碱基突变后得到的就是GmFBX176m3，因此，下述将着重说明3个碱基是如何突变的。
根据遗传密码子的摆动性，修改密码子的3个核苷酸，具体的：
gma-miR394a互补位点：GGAGGTTGACAGAATGCCAA
GmFBX176突变位点：GGAAGTTGATAGGATGCCAA
对应的氨基酸序列：E V D R M P
具体操作步骤如下：
1)使用全式金公司的Fast Mutagenesis System试剂盒完成GmFBX176中gma-miR394a互补位点的突变，根据试剂盒中引物设计要求依次突变靶位点，每次突变1个位点，引物序列如下，下划线表示突变碱基：
突变第1个核苷酸所用引物序列：
GmFBX176M1-F：5'-GAAGGAGGTTGACAGGATGCCAAACG-3'
GmFBX176M1-R：5'-CCTGTCAACCTCCTTCCACAAGAAAG-3'
突变第2个核苷酸所用引物序列：
GmFBX176M2-F：5'-GTGGAAGGAGGTTGATAGGATGCCAA-3'
GmFBX176M2-R：5'-ATCAACCTCCTTCCACAAGAAAGTCA-3'
突变第3个核苷酸所用引物序列：
GmFBX176M3-F：5'-TTTCTTGTGGAAGGAAGTTGATAGGA-3'
GmFBX176M3-R：5'-TTCCTTCCACAAGAAAGTCATCTTCT-3'
2)以含有GmFBX176 cDNA序列的GmFBX176-pJET1.2质粒为模板，使用全式金公司的Trans StartTM Fast Pfu DNA Polymerase进行PCR扩增，
PCR体系如下：
Figure BDA0002867785700000051
(3)PCR反应程序为：
94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，25个循环；72℃，10min；
4)取10μl PCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测；
5)加1μl DMT酶于PCR产物中，混匀，37℃孵育1h；
6)转化DMT感受态细胞，菌液PCR检测后测序验证。
7)将含有突变gma-miR394a互补位点的GmFBX176m3序列克隆到pEGAD载体中，命名为GmFBX176m3-pEGAD。
最终所得到的GmFBX176m3的氨基酸序列和未突变的GmFBX176的氨基酸序列一致，如SEQ ID NO.2所示。
实施例2 GmFBX176m3基因的发根农杆菌转化和大豆毛状根转化
2.1农杆菌K599感受态细胞的制备
(1)K599菌液活化：在超净工作台中，用灭过菌的接菌环沾取少许K599菌液，并在事先制备好的含有链霉素抗性的LB固体培养基平板上连续划线，然后将平板密封倒置于28℃的恒温培养箱中，恒温培养约40h；
(2)挑取单菌落置于链霉素终浓度为50mg/L的3mL LB液体培养基中，28℃，200rpm，过夜培养；
(3)过夜培养菌液后继代转接到25mL LB液体培养基中，加入2.5mL菌液和终浓度为50mg/L的链霉素，28℃，200rpm，将菌液培养至OD值为0.6；
(4)将盛有25mL菌液的离心管放入冰盒，冰浴30min，于冷冻离心机4℃，4000rpm离心5min；
(5)弃去上清液后，向每管中加入1mL 200mM的30％甘油氯化钙(CaCl2)重悬菌体，并轻轻在冰盒上来回划动使其混匀；
(6)将重悬菌液分装于灭过菌的1.5mL离心管中，每管200μL，液氮速冻后，置于-80℃保存备用。
2.2发根农杆菌K599的转化(热击转化法)
(1)取200μL冰浴融化的K599感受态细胞，加入5μL植物过表达载体GmFBX176m3-pEGAD，轻轻混匀，冰浴30min；
(2)置于液氮中速冻8min后迅速转移到37℃水浴锅中热激5min；
(3)向每管中加入500μL不含抗生素的LB液体培养基，混匀后28℃，220rpm，恒温培养4h；
(4)短暂离心后弃去部分上清液，留200μL用移液器将菌液吸打混匀后，均匀的涂在含有终浓度为50mg/L的链霉素和卡那霉素双抗的LB固体培养基平板上；28℃恒温培养箱倒置培养24-48h，直至出现单菌落；
(5)挑取单菌落置于含有抗生素的LB液体培养基中，28℃，225rpm摇菌培养36h，菌液浑浊后做菌液PCR鉴定，确认菌液中含有构建正确的表达载体。
2.3大豆毛状根的转化
(1)将大豆Williams 82种子播于混合土中(营养土:蛭石＝1:1)1-2cm深，置于室温25-28℃；
(2)几天后剪下子叶尚未展开的大豆根上部位，用牙签在大豆子叶节处扎孔并沾取GmFBX176m3-K599和对照K599的菌斑浸染扎孔处；
(3)将侵染过的大豆幼苗置于保湿系统中培养，盖上保鲜膜暗培养2-3天，每天通风5min，待长出毛状根后，转移至水中或者混合土中培养。室温正常培养，从而获得完整的转基因毛状根复合体大豆，如图1所示。
2.4重复上述步骤2.1-2.3，得到后续用于对比的gma-miR394a-K599转基因毛状根。可以理解的是，gma-miR394a能够在转录后水平切割GmFBX176的mRNA，导致GmFBX176的表达水平降低，因此，可以将gma-miR394a过表达转化产生的gma-miR394a-K599转基因毛状根当做为GmFBX176的突变体或表达抑制体用于后续的效果比对试验。
实施例3转基因复合体植株鉴定
3.1基因组水平的鉴定
随机取5株GmFBX176m3-K599转基因毛状根，用植物基因组DNA快捷提取试剂盒(北京天根公司)，提取转基因大豆毛状根基因组DNA。详细步骤参考试剂盒说明书。
以K599转基因毛状根为阴性对照、以转化了GmFBX176m3-K599的毛状根DNA、GmFBX176m3-pEGAD质粒为阳性对照，以DNA为模板进行PCR检测。
具体所采用的引物为：
PEGFP-C-5'：5'-CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG-3'
256-R：5'-AAATGTTTGAACGATCGGGGAAATTC-3'
PCR反应体系如表1所示：
表1 PCR反应体系
Figure BDA0002867785700000081
PCR反应程序：
94℃预变性3min；94℃变性30s；58℃复性30s；72℃延伸1min；35个循环；72℃延伸10min，结束反应。
如图2所示，编号1-5的GmFBX176m3-K599 DNA以及编号6的GmFBX176m3-pEGAD质粒的条带中均显现了与M(DL2000)相对应的条件，而编号7K599对照以及水对照条带中则未显现，说明GmFBX176m3-K599基因已成功转入，获得了完整的转基因毛状根复合体。
为了进一步鉴定转基因大豆复合体植株，分别随机选取3株GmFBX176m3-K599转基因植株，用qPCR方法检测GmFBX176m3基因的表达情况，如图3所示，转基因毛状根中GmFBX176m3基因的表达量显著高于对照植株。
实施例4转基因复合体大豆表型鉴定
以GmFBX176m3-K599、gma-miR394a-K599转基因毛状根大豆复合体植株及对照植株为后续实验材料。
4.1转基因复合体大豆PEG处理
将鉴定转化成功的大豆复合体植株和对照植株从保湿系统内转移至水中，室温条件下生长20天后(期间不断换水培养)，将植株转入含有10％PEG的水中，模拟干旱胁迫培养一周后，观察表型并统计存活率。实验重复3次(每个株系40个重复)。
4.2转基因复合体大豆抗旱性检测
将转基因毛状根大豆复合体植株和对照植株种植在同一个盆里，使其在正常条件下生长30天后，停止浇水5天，观察表型并拍照记录，然后复水，2天后观察表型并统计存活率。实验重复3次(每个株系31个重复)。
如图4所示，将GmFBX176m3-K599和gma-miR394a-K599转基因复合体大豆和对照植株水培20天后，转移至含有10％PEG的水中培养一周后，观察表型并统计植株的存活率。结果发现，在10％PEG处理下，GmFBX176m3-K599转基因复合体植株的存活率为25.6％，其存活率显著低于对照植株(对照植株存活率为48.2％)；而gma-miR394a-K599转基因复合体植株的存活率为65.6％，存活率显著高于对照植株。
如图5所示，在混合土中干旱胁迫下，GmFBX176m3-K599转基因复合体植株的存活率为25.6％，存活率显著低于对照植株(对照存活率为39.1％)，而gma-miR394a-K599转基因复合体植株的存活率为54.3％，显著高于对照植株的存活率。
以上结果说明，过表达GmFBX176m3降低了复合体大豆的抗旱性；而过表达gma-miR394a则增强了复合体大豆的抗旱性。
实施例5转基因复合体大豆干旱胁迫下生理机制分析
使用南京建成生物提供的试剂盒检测干旱胁迫下，GmFBX176m3-K599、gma-miR394a-K599转基因复合体大豆及对照大豆叶片中的MDA、POD和蔗糖含量。具体方法参照试剂盒说明书。
如图6所示，在干旱胁迫之前，GmFBX176m3-K599和gma-miR394a-K599转基因复合体大豆叶片中的丙二醛(MDA)、过氧化物歧化酶(POD)和蔗糖含量与对照植株相比没有差异；但是在干旱胁迫下，GmFBX176m3-K599转基因复合体大豆叶片中的MDA和蔗糖含量显著高于对照植株，POD含量显著低于对照植株；而gma-miR394a-K599转基因复合体大豆叶片中MDA和蔗糖含量显著低于对照植株，POD含量显著高于对照植株。这说明过表达GmFBX176m3使得细胞膜的受损程度加深，从而增强了干旱胁迫对转基因植株的损害；而过表达gma-miR394a则通过减少细胞膜的受损程度来降低干旱胁迫对转基因植株的损害。
序列表
<110> 新疆农业大学
<120> 大豆GmFBX176m3基因及其表达载体和应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 大豆GmFBX176基因突变位点核心序列
<400> 1
GGAAGTTGATAGGATGCCAA
<210> 2
<211> 453
<212> PRT
<213> 大豆GmFBX176基因编码的蛋白
<400> 2
MEEEEEGLAMLITHLHHFSHSLSPLFFTLHPPLLSHQLPRLSFFDIDDYSLDDFCGLVMA
AGKSGSSRMLEPLKHPSKKSRRDRSLGKSSGRSSRDEAMEQQIWKKLPEDLFEPVIARLP
IATFFCFRSVCQRWNSLLTSQSFSQHCAQVPQANPWFYTVTHEHANSGAMYDPSMKKWYH
PTISTLPAELIVLPVASAGGLVCFLDIYRQNFYVCNPLTQSLKELPARSVRVGSRASVGM
TVNGNSTSAGYKILLVGCDGEYEIYDSVTKSWSHPENMPADIKLPLSLNFRSQAVSIDST
LYFMHSDPEGIVLYDMATGVWTQYIIPAPLHLTDHMLAECDGRILLVGLLTKNAATCICI
WELQKMTFLWKEVDRMPNVWCLDFYGKHVRMTCLGNKGLLMLSLRSRQMNRLVTYNIASR
EWVKVPACLVPHGRKRQWVAHGTAFYPCLTAMA

Claims (2)

1. 大豆GmFBX176m3基因在基因工程调整大豆抗旱性中的应用，其特征在于，所述大豆GmFBX176m3基因的序列含有序列表SEQ ID NO:1所示的核心核苷酸序列；所述大豆GmFBX176m3基因的全长序列所编码的蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，抑制该基因的表达，能够显著提高大豆的抗旱性；过表达该基因，能够减弱大豆的抗旱性。
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