CN116334126A - 向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1在提高植株耐旱性能中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1在提高植株耐旱性能中的应用，或在培育具有耐旱性能的转基因植物中的应用；所述向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1，其编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过在植物细胞或种子中过量表达向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1，可以获得耐旱性能优于野生型的转基因植物，这有利于提高干旱胁迫下植株的存活率。本发明为改造或培育其他耐旱农作物新品种提供了理论支持和新的研究思路。

Description

向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1在提高植株耐旱性能中的 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1在提高植株耐旱性能中的应用。

背景技术

干旱是一种会对经济、社会和环境造成影响的气候现象，会对植物的正常生长产生严重的阻碍作用，给农业生产带来巨大损失。全球变暖是引起干旱的主要原因，在过去的几十年中，由于温室气体的过度排放，改变了地球内部的气候循环，使得地球表面平均温度不断升高，导致植物生长环境受到严重破坏。其次，水资源分布不均匀也是引起干旱的原因之一，因此，使得适合农作物耕种的区域以及耕种的农作物品种十分有限。

在各种非生物胁迫中，干旱胁迫对植物生长影响巨大。植物生长对水分缺失最为敏感，当干旱胁迫程度超过了植物自身的调节能力时，植株生长受抑制成为植物面对土壤干旱的第一反应，具体表现为：植物细胞内含水量降低，细胞膜结构受损、植物细胞正常代谢过程遭到破坏，植物体内水分重新进行分配和细胞原生质遭到机械损伤，导致叶片和植株的生长受到抑制。随着干旱胁迫程度的加剧、时间的延长，植物体由于严重失水而导致叶片卷曲、植株下垂萎焉甚至死亡。

光合作用是植物生长、发育的重要的生物过程之一，干旱胁迫对光合作用的影响很大。光合作用可以用来判断植物的生长情况，是评价植物抗旱性强弱的重要指标。生育酚环化酶(VTE1)，位于叶绿体的质体小泡中，与光合作用的光系统(PSⅠ和PSⅡ)相邻，是维生素E合成途径的环化酶之一，能将前体物质2-甲基-6-叶绿醇-1,4-苯醌(MPBQ)和2,3-二甲基-6-叶绿醇-1,4-苯醌(DMPBQ)转化为δ-生育酚和γ-生育酚。因此，通过过量表达生育酚环化酶，不仅可以增加总维生素E的含量，而且还可以降低干旱胁迫对光合作用的影响，提高植株的耐旱性能。

发明内容

本发明的目的在于提供向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1在提高植株耐旱性能中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1，其编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ ID NO.1由1452个核苷酸组成。

SEQ ID NO.1：

ATGGAGCTACAGACGACGACGACCTCCCCTCTTTTCTCTTCATTGTTGGCTTCATCAAAACCTAATAATGTTAAATCCTCTGTTAGGCTCAAACTTGAAAGGAATCGTCGGTTATCTGCTGCCAAGACGGATGTCTACGGTGTGGAATTGCAATCGCAAGAGATTGTGAATCCTGTATATGTACCAACGCCTACCAATCGACCTCTTCGTCCTCCTCACAGCGGTTACCACTTTGATGGGACTACAAGGAAATTTTTTGAGGGTTGGTACTTTAAGGTTTCAATACCAGAACAAAGACAAAGCTTCTGCTTTATGTATTCTGTTGAGAATCCTGCTTTCAAAAAGGACTTAAATATTTTGGAGCAACTACAGCATGGACCGCGCTTTACTGGAGTTGGAGCTCAGATCCTTGGGGCTCATGACAAGTACATTTGCCAATACTCAAAAGAATCTCACAACTTTTGGGGAAGTCGGCATGAGCTGATGCTTGGAAATTCTTTTAGTGTGCAAACAGGAAAGCAGCCTCCAAACAGTGAAGTTCCACCCCAGGTTTTTAATCAGAGGGTGATTGAAGGATTCCAAGTTACTCCCCTGTGGCATCAAGGTTTCATCCGTGATGATGGAAGGACAAGTTATGCTGAAACTGTAAAAACTGCACGTTGGGAGTACAGCACACGCCCTGTTTATGGTTGGGGTGATGTAGGGTCTAAACAGAAGTCCACAGCTGGCTGGCTTGCTGCTTTTCCTGTATTTGAACCTCATTGGCAAATATGCATGGCTGGCGGACTCTCAACAGGTTGGATAGAGTGGGGTGATGAAAGATATGAGTTTGAAAATGCTCCTTCTTATTGTGAGAAGAATTGGGGTGGAGGTTTTCCTAGAAAGTGGTTTTGGGTTCAATGTAATGTCTTTAAAGGAGCAAGTGGAGAAGTTGGTTTGACTTGTGGAGGCGGATTACGGCAATTGCCTGGACTAAATGAAACATTTGAGAATGCTGCACTGATTGGAGTTCACCATGGAGGTATTTTCTATGAATTTGTTCCTTGGAATGGAGTTGTTGAATGGGAAGTTGCTGAGTGGGGTTACTGGCACGTAACTGCCCAAAATGAGACGCATAAGGTAGAACTAGAGGCTTCAACCAAGGACCCAGGGACCACATTGCGAGCTCCAACTACAGAGGCAGGCCTTGCACCGGCTTGCAAAGATACCTGCTTTGCCCATTTAACTCTTAAACTTTGGGAAAAAGGATCTGCTGCTGCTGCTGCTGATGGGAAGCTTATCTTGGATGTAACTAGCAACATGGCAGCTGTAGAAGTTGGGGGTGGGCCATGGTTCAACACATGGAAAGGCAAGACGTATACACCAGAAGTCATCAATCGTGCTCTTAACCTTCCTGTTGATGTGGACGGAATCCTTGGTTCCTTTCCATTGCTCAAACCTCCTGGTCTGTAG

向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的SEQ ID NO.2由483个氨基酸残基组成。

SEQ ID NO.2：

MELQTTTTSPLFSSLLASSKPNNVKSSVRLKLERNRRLSAAKTDVYGVELQSQEIVNPVYVPTPTNRPLRPPHSGYHFDGTTRKFFEGWYFKVSIPEQRQSFCFMYSVENPAFKKDLNILEQLQHGPRFTGVGAQILGAHDKYICQYSKESHNFWGSRHELMLGNSFSVQTGKQPPNSEVPPQVFNQRVIEGFQVTPLWHQGFIRDDGRTSYAETVKTARWEYSTRPVYGWGDVGSKQKSTAGWLAAFPVFEPHWQICMAGGLSTGWIEWGDERYEFENAPSYCEKNWGGGFPRKWFWVQCNVFKGASGEVGLTCGGGLRQLPGLNETFENAALIGVHHGGIFYEFVPWNGVVEWEVAEWGYWHVTAQNETHKVELEASTKDPGTTLRAPTTEAGLAPACKDTCFAHLTLKLWEKGSAAAAADGKLILDVTSNMAAVEVGGGPWFNTWKGKTYTPEVINRALNLPVDVDGILGSFPLLKPPGL

向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1在提高植株耐旱性能中的应用，或在培育具有耐旱性能的转基因植物中的应用。

上述应用，在具体应用时，将所述向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1导入植物细胞或种子，然后将导入的植物细胞或种子培养成植株，使向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1在植株中过表达，获得稳定可遗传的耐旱转基因植株。

所述向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1通过植物表达载体导入植物细胞或种子。

所述过表达基因序列为：向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1基因的CDS全长序列，共1452bp。

进一步地，还包括收集所述稳定可遗传的耐旱转基因植株的种子，再用所述种子繁育获得后代种子，通过测序验证获得纯合的过表达的后代种子长成的植株。

所述测序验证的方法是，提取纯合的过表达的后代种子长成的植株的基因组DNA，并用引物35S-seqF和688-VTE1-R进行PCR扩增：

35S-seqF:GGGATGACGCACAATCCCAC，

688-VTE1-R:GACTCACCTAGGGGATCCCTACAGACCAGGAGGTTTGAG。

一种植物表达载体，其含有上述向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1。

一种遗传工程化的宿主细胞，其含有上述植物表达载体，或其基因组中插入了向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1。

所述遗传工程化的宿主细胞的构建方法，是将上述植物表达载体导入宿主细胞中，使植物表达载体/向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1在宿主细胞中有效表达。

所述植物表达载体通过农杆菌介导、植物病毒载体、Ti质粒、基因枪等常规生物学方法中的一种或几种方法的组合使用导入宿主细胞。

上述植物表达载体、遗传工程化宿主细胞在培育具有耐旱性能的转基因植物中的应用。

本发明中提及的植物为双子叶植物。优选地，所述双子叶植物为拟南芥、向日葵、大豆、花生、白菜或甘蓝。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1.本发明通过分子克隆技术将向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1在拟南芥中过量表达，结果表明，转基因拟南芥植株在干旱胁迫下的平均总根长都明显高于野生型拟南芥，说明向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1能够提高转基因植物在干旱胁迫下的耐性。

2.通过在植物细胞或种子中过量表达向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1，可以获得耐旱性能优于野生型的转基因植物，这有利于提高干旱胁迫下植株的存活率。本发明为改造或培育其他耐旱农作物新品种提供了理论支持和新的研究思路。

附图说明

图1为转基因拟南芥PCR鉴定电泳图。

图2为用测序引物35S-seqF的测序峰图。

图3为用测序引物688-R的测序峰图。

图4为不同测序引物的测序示意图。

图5为NCBI上的参考序列与用35S-seqF和688-R引物所测得的序列比对图；图中sbjct表示NCBI网站上的参考序列，Query-表示HaVTE1表达载体拼接的测序序列。

图6为转基因拟南芥的耐旱表型；图中WT表示野生型拟南芥，#16和#27为转基因拟南芥，图中3个株系，各3株，图中标尺为1cm。

图7为总根长统计图；图中WT表示野生型拟南芥，#16和#27为转基因拟南芥；*表示具有差异(P<0.05)；**表示具有显著性差异(P<0.01)。

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但是实施例具体细节仅为了说明本发明，并不代表本发明构思下全部技术方法。因此不应理解为对本发明总的技术方案限定。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂与药品，实验均设置三次重复以上，结果取平均值。

实施例中采用的引物名称及序列：

实施例1：过表达HaVTE1基因的转基因拟南芥的构建

一、HaVTE1表达载体(688-HaVTE1)的构建

1.HaVTE1基因的获得

用RNA提取试剂盒(TIANGEN)提取向日葵总RNA，后用HiScript II Q Select RTSuperMix for qPCR(vazyme)反转成cDNA，反转过程如下：

a.基因组DNA去除

在RNase-free离心管中配制如下混合液：

用移液器轻轻吹打混匀。42℃，2min。

b.逆转录反应

在第1步的反应管中直接加入5×HiScript II Select qRT SuperMix II 4μl，用移液器轻轻吹打混匀，50℃，15min；85℃，5s。

以向日葵cDNA为模板、引物688-VTE1-F和688-VTE1-R进行PCR扩增。PCR反应体系如下：

PCR反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸80s，34个循环；72℃后延伸5min。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收PCR产物，测浓度，继而获得HaVTE1基因片段。

2.线性化688表达载体的制备

酶切688表达载体体系如下：

37℃，3h；将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并酶切产物回收，继而获得线性化的688表达载体，用于后续的重组反应。

3.HaVTE1表达载体(688-HaVTE1)的构建

利用重组构建688-HaVTE1表达载体，体系如下：

50℃，反应15min；并将重组产物转入大肠杆菌DH5α(tsingke)中，转化体系如下：

冰上孵育30min，42℃热激45s，冰上放置2min，加入无添加抗生素的LB液体培养基700μl，37℃，200rpm，复苏1h，将含有DH5α的LB液体培养基全部涂于Kan⁺的LB固体培养基中，倒置置于37℃培养箱中，过夜培养。

挑取在Kan⁺的LB固体培养基上长出的单克隆，并接种到装有3ml Kan⁺的LB液体培养基的12ml无菌离心管中，37℃，200rpm，过夜培养，第二天提质粒(TIANGEN)，测浓度、跑电泳；并用35S-seqF和688-R进行测序，结果如图5所示，HaVTE1基因测序序列与NBCI上参考序列一致，表明HaVTE1基因表达载体构建成功，即获得表达载体688-HaVTE1；随后将表达载体转入农杆菌GV3101(tsingke)中，用于后续的遗传转化。

二、拟南芥的遗传转化

把在长日照(光照16h、黑暗8h)环境下生长了5周的拟南芥果荚剪掉，并在侵染前一天，浇足水；挑取已经转化了688-HaVTE1质粒的农杆菌单菌落，接种到3mL的含有Kan和rif抗生素的LB培养基中，28℃，过夜培养，第二天转大摇，直至菌液OD₆₀₀＝0.6-0.8，4000rpm，20分钟，收菌；将菌重悬于适当的渗透液(1/2MS+10％蔗糖+400μL/L Silwet-77，OD₆₀₀＝0.8-1.0)中。将植株的地上部分浸入上述菌液中，20s-30s，轻微震荡；梳理枝条，暗培养1d，然后置于正常培养条件；继续培养到植物成熟、收种子；将种子置于37℃烘干，随后春化一周，用乙醇和84消毒液消毒，点在带有抗性的MS板子上筛选转化。

三、转基因拟南芥的鉴定

将能在含有Basta的MS板子上正常生长的拟南芥移入土里，5周后，取适量叶片，用CTAB法提取植株叶片的基因组DNA，以35S-seqF和688-VTE1-R进行PCR扩增，PCR反应体系如下：

扩增程序如下：95℃预变性10分钟；95℃变性15秒，56℃退火15秒，72℃延伸80秒，扩增34个循环；最后再72℃延伸5分钟。

实施例2：过表达HaVTE1基因的转基因拟南芥苗期的耐旱实验

以野生型(WT)和过表达HaVTE1基因的转基因拟南芥为实验材料，随机选取适量种子，37℃烘2-3天，接着用乙醇和84消毒液对种子进行消毒，随后用无菌水置于4℃浸泡3天，将春化好的种子点到1/2MS培养基上，22℃，光照16h/黑暗8h，生长4-5天；挑选长势均一的小苗，移到1/2MS+200mM mannitol的竖板上，22℃，光照16h/黑暗8h，每个Line各3株，重复3次，观察并在生长十天后拍照记录表型(图6)和统计平均根长(图7)，其中野生型平均总根长5.209cm，转基因拟南芥#16和#27的平均总根长分别为8.396cm和7.762cm，过表达株系的平均总根长皆高于野生型，且都具有差异。

实验表明，在干旱条件下，过表达HaVTE1基因的转基因拟南芥的总根长明显长于野生型，说明过表达株系通过增加根的总长度来适应干旱，这有利于植株在干旱条件下能吸收更多的水分，提高存活率，长得更好。

Claims (10)

1.向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1在提高植株耐旱性能中的应用，或在培育具有耐旱性能的转基因植物中的应用；所述向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1，其编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1在提高植株耐旱性能中的应用，或在培育具有耐旱性能的转基因植物中的应用；所述向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体应用时，将所述向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1导入植物细胞或种子，然后将导入的植物细胞或种子培养成植株，使向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1在植株中过表达，获得稳定可遗传的耐旱转基因植株。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1通过植物表达载体导入植物细胞或种子。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，还包括收集所述稳定可遗传的耐旱转基因植株的种子，再用所述种子繁育获得后代种子，通过测序验证获得纯合的过表达的后代种子长成的植株。

6.植物表达载体，其含有上述向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1，所述向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1，其编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.遗传工程化的宿主细胞，其含有权利要求6所述的植物表达载体，或其基因组中插入了向日葵生育酚环化酶基因HaVTE1。

8.权利要求6所述的植物表达载体在培育具有耐旱性能的转基因植物中的应用。

9.权利要求7所述的遗传工程化的宿主细胞在培育具有耐旱性能的转基因植物中的应用。

10.根据权利要求1～5任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为双子叶植物。

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