CN118561973A - 烟草耐低温基因NtCIP及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种调控烟草耐低温的NtCIP基因及其应用。利用基因编辑技术获得了该基因的烟草敲除突变体，耐低温表型鉴定结果表明，其与野生型烟草相比，低温胁迫下敲除株系萎蔫程度更严重，低温耐性明显降低，说明NtCIP正调控烟草低温耐性。该基因的功能鉴定为烟草耐低温育种提供了重要的基因资源和理论基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种烟草耐低温基因NtCIP及其应用。
背景技术
烟草(Nicotiana tabacum L.)起源于温暖的南美洲，是一种喜温不耐低温的叶用经济作物，其最适生长温度为25℃～28℃，烟草对低温胁迫敏感，零下2℃～3℃的低温胁迫就会导致烟草的死亡。烟草苗期对低温胁迫更为明显，在6～7叶龄时，如果烟草遭受到两周左右的12℃低温胁迫就会导致烟草提早开花，降低烟叶产量与品质，从而减少烟农收入。在中国南方烟区，烟草移栽之后经常会遭受“倒春寒”的天气，使烟草遭受低温胁迫。目前主要是通过适时移栽等方法来应对“倒春寒”，这种方式虽然可以在一定程度上减少低温造成的损失，但是还不能从根本上解决问题。还需要深入挖掘鉴定烟草耐低温基因，从而选育耐低温的烟草品种。
CBF(C-repeat binding factor)是较早被发现的参与植物低温胁迫响应的转录因子。CBF转录因子属于AP2/ERF(Apetala2/Ethylene responsive factor)转录因子家族中的DREB亚家族，因此CBF转录因子都具有一个高度保守的AP2/ERF结构域。目前，研究的较为清楚的低温信号途径是ICE-CBF-COR(Inducer of CBF expression-C-repeat bindingfactor-Cold-responsive genes)途径。在该途径中，ICE受到低温诱导后迅速表达，促进CBF基因的表达，CBF结合在COR基因启动子上的CRT/DRE(C-repeat/dehydrationresponsive element)顺式作用元件激活COR基因的表达，从而提高植物对低温的抗性。
目前，烟草耐低温基因的鉴定十分有限。
发明内容
本发明前期通过酵母双杂交筛库获得了一个与耐低温关键转录因子NtCBF互作的基因NtCIP。在此基础上，对该基因开展了功能鉴定，为烟草耐低温分子育种提供基因资源和理论基础。
本发明提供一种NtCIP蛋白或NtCIP蛋白编码基因在培育低温耐受性增强或低温耐受性降低的植物或植物品种中的应用。
具体地，所述植物双子叶或单子叶，优选所述植物是烟草。
在具体实施方式中，低温耐受性增强是通过在植物中过表达所述NtCIP蛋白编码基因实现。
更具体地，所述过表达通过遗传转化操作使所述NtCIP蛋白编码基因在转基因植株中进行过表达。例如，所述遗传转化是农杆菌介导法或基因枪法。
另外具体地，低温耐受性降低是通过敲除植物内源的所述NtCIP蛋白编码基因或弱化其表达来实现。
优选地，所述敲除是通过基因同源重组或基因编辑的方法实现；所述弱化可以通过RNA干扰方法实现；更优选地，其中采用的靶标为ATACGGGTTTGAATCCGACCCGG或TATCCGACCCGACAGAAACCGGG。
具体地，所述NtCIP蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示，或者来源于烟草与其具有相同功能的同源NtCIP蛋白。更具体地，所述NtCIP蛋白编码基因的CDS氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。
另外，还包括鉴定所述转基因植物的低温耐受性的步骤(例如通过将植株于4℃条件下处理6～12h观察植株的外表)，任选还包括进一步种植获得纯种的步骤。
利用基因编辑技术获得了NtCIP基因的烟草敲除突变体，耐低温表型鉴定结果表明，其与野生型烟草相比，低温胁迫下两个敲除株系萎蔫程度更严重，低温耐性明显降低，说明NtCIP正调控烟草低温耐性。由此完全可以得出在植株中过表达该基因也能提高其低温耐受性。该基因的功能鉴定为烟草低温耐受性育种提供了重要的基因资源和理论基础，比如可以培育低温耐受敏感的植株作为对照材料或特殊条件下的育种材料，也可以培育低温耐受性增强的植株，以在减少低温环境下对植株生长的影响因而提供低温耐性强的优良品种。
附图说明
图1为NtCIP(XP_016484498.1)系统进化树分析图。
图2为NtCIP蛋白序列同源比对分析图。
图3为cip-a2靶位点附近峰值图(左图)和DNA序列比对图(右图)。
图4为cip-a3靶位点附近峰值图(左图)和DNA序列比对图(右图)。
图5为敲除株系cip-a2(上)和cip-a3(下)和WT中NtCIP蛋白序列比对图。
图6为低温(4℃)处理8h后的野生型与cip突变株系表型。
具体实施方式
1材料方法
1.1基因序列获取及特征分析
利用National Center for Biotechnology Information(www.ncbi.nlm.nih.gov)NtCIP mRNA序列(登录号：XM_016629012.1)设计引物：
NtCIP-CDS-F：TCTCTCCTCATCCCTTCACC
NtCIP-CDS-R：AGATGAGCGAATTGGGGCAA
PCR产物大小：749bp。
从烤烟品种湘烟7号叶片cDNA中扩增该基因，PCR反应体系及程序如下(表1)：
表1PCR反应体系及程序
对获得的PCR产物进行测序，明确该基因CDS序列与蛋白序列。
根据NtCIP蛋白序列(登录号：XP_016484498.1)，利用MEGA7.0软件分析基因同源性并使用邻接法(Neighbor-Joining)构建进化树，使用DNAMAN软件对DNA、CDS及蛋白质进行序列比对。
1.2NtCIP在烟草耐冷性中的功能鉴定
1.2.1基因编辑载体构建
(1)靶标设计
利用http://crispor.gi.ucsc.edu/在线分析工具，在基因外显子上设计靶点，经分析获得以下2个特异性的靶标：Target1，ATACGGGTTTGAATCCGACCCGG，Target2，TATCCGACCCGACAGAAACCGGG。将两个靶位点去除第一个碱基及末尾的NGG，只保留19个nt，将Target1的19nt靶点序列(斜体)插入引物DT1-F0和DT1-BsF中；Target2的19nt靶点的倒转互补序列(斜体)插入引物DT2-R0和DT2-BsR中。
进而设计CRSIPR载体构建引物，其序列信息如下：
DT1-BSF:ATATATGGTCTCGATTGTACGGGTTTGAATCCGACCGTT
DT1-F0:TGTACGGGTTTGAATCCGACCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
DT2-R0:ACGGTTTCTGTCGGGTCGGATCAATCTCTTAGTCGACTCTAC
DT2-BSR:ATTATTGGTCTCGAAACGGTTTCTGTCGGGTCGGATCAA
(2)PCR扩增
以pCBC-DT1T2载体(氯霉素抗性)为模板进行四引物PCR扩增。DT1-BsF/DT2-BsR为正常引物浓度(100μM)；DT1-F0/引物DT2-R0为稀释浓度(10μM)。四个引物各取4μL，再加4μL的无菌水，配制20μL引物母液。高保真酶Max DNA Polymerase扩增，50μL体系，加入2μL引物母液，PCR产物大小626bp。进行PCR扩增，具体程序如下：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸20s，30个循环。
用1.5％琼脂糖凝胶电泳，5v/cm电压，20min，将目的片段(626bp)在紫外灯下切取出来，按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的操作说明回收PCR产物。
(3)连接敲除载体
连接体系和反应条件如下(表2)：
表2连接体系
(4)转化及鉴定
将10μL连接产物转化大肠杆菌感受态(按照试剂盒中大肠杆菌感受态转化方法进行操作)。
转化涂卡那霉素抗性平皿，37℃培养12h，进行菌落PCR鉴定。利用引物U626-IDF和U629-IDR进行菌落PCR，使用U626-IDF和U629-IDF进行测序。
挑取10个单菌落进行PCR鉴定，菌落PCR及测序引物如下：
U626-IDF:TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC
U629-IDF:TTAATCCAAACTACTGCAGCCTGAC
U629-IDR:AGCCCTCTTCTTTCGATCCATCAAC
大小：726bp。
PCR反应体系及程序如下(表3)：
表3菌落PCR反应体系及程序
取3个阳性条带为726bp左右条带对应的菌液100μL送样测序，其余400μL菌液接种到含有10ml卡那霉素抗性LB中，试管摇菌，待测序结果出来后，对测序正确的菌液提取质粒，并保存于-20℃冰箱。
1.2.2烟草遗传转化
(1)农杆菌准备
取1μL质粒加入50μLGV3101农杆菌感受态细胞中(按照试剂盒中中农杆菌感受态转化方法进行操作)。转化涂卡那霉素抗性平皿，28℃培养48h后进行菌落PCR鉴定。PCR反应体系及程序见表3。PCR产物通过凝胶电泳检测，菌液样品及阳性对照的电泳条带清晰、大小正确，且阴性对照均无条带的情况下，表明该菌液样品可用于转化烟草。
(2)烟草遗传转化
湘烟7号烟草种子于75％的酒精消毒30s，无菌水清洗1min，再使用84消毒液消毒3～5min，无菌水清洗3次，1min/次。将消毒后的烟草种子播种于萌发培养基上，温度设定为23℃，光周期设定为16h光照/8h黑暗，培养4～5周，将无菌烟草叶片用手术刀切成小块接种于预培养培养基上。挑取农杆菌于浸染液中，制备OD600为0.2的农杆菌重悬液，将预培养2～3d的烟草叶片接种于农杆菌悬浮液中浸染10～15min，将浸染后的烟草叶片接种于滤纸上，吸干液体后接种于共培养培养基上，暗培养48～72h。然后转入诱导培养基上诱导愈伤，约10d，待其长出愈伤组织。挑选符合标准的愈伤组织，接种于对应抗性的筛选培养基上，培养温度设定为23℃，光周期设定为16h光照/8h黑暗，培养时间15～30d。将生长旺盛的阳性愈伤组织接种至分化培养基上，4～5个愈伤/每皿，培养温度、光周期及时间同筛选培养基。分化过程中，愈伤如有幼苗形成，将其接种至壮苗培养基上生长。
1.2.3阳性苗测序分析
使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的Plant DNA Isolation MiniKit植物总DNA提取试剂盒对阳性苗叶片基因组DNA进行提取，详细方法参照说明书。使用高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase对敲除株系进行PCR扩增。
设计一对引物同时对靶位点Target1和Target2进行PCR检测。
引物序列信息如下：
NtCIP-F1：GAGAAGAAGAATCCCAAGAAATACAAG
NtCIP-R1：CAAACGGAAAATCACCACCATAT
目的片段长度约为384bp。
PCR扩增体系及程序见表4。
表4靶位点检测PCR反应体系及程序
所得PCR产物送往北京擎科生物科技有限公司进行测序。分别采用SnapGeneViewer和DNAMAN进行测序峰值图和序列比对分析。
1.2.4敲除株系低温耐受性鉴定
选取籽粒饱满大小一致的转基因纯系植株和野生型植株的种子，消毒灭菌后置于4℃低温处理48h。然后将其播种于直径9cm的培养钵中，并盖上透明塑料盖子保温保湿，待长到四叶一心时，揭开透明塑料盖子。培养温度设定为23℃，光周期设定为16h光照/8h黑暗。播种30d后(六叶一心期)，选取长势一致的烟苗放入4℃培养箱中进行低温处理，观察表型并拍照记录。
2结果分析
2.1NtCIP序列特征分析
通过PCR扩增并测序获得NtCIP的CDS序列及蛋白序列。
(1)NtCIP CDS序列(SEQ ID NO：1)：
ATGGCTGAGTCGACTCAACCAATTAAACGTTCAAGAGAAGAAGAATCCCAAGAAATACAAGAAAATTTATGTGAAGGTAA
TAATACAAAGCGCCATAAATCATCTTATAATGATATCCTCTCCATTCTTGAAGAGGAAGAATACGGGTTTGAATCCGACC
CGGTTTCTGGGTCCGACCTATTCGCCACCCTTCAACAAGAACTTCTCCCAAATGACGGGTTTGAGGCCGACCCGGTTTCT
GTCGGGTCGGATATTTCTTCTAAAGAAGATGAAGTAGAAGATGACAGAAGTAGTGTTATTAGACACCTTCTAGAAGCTTC
TGATGATGAACTAGGTATTCCCAGTGGAGATGGAACCAACGGTGTAGATTTAACGTTTGCTGAAGAAAATGAAACATATG
GTGGTGATTTTCCGTTTGCTATATCTGATGGTTTATTATGGGAGTTTGAAGATGAAGCTGCTAACTATTATTCTTTGTTA
CAGTCCGAACTTTTTATGTAG
(2)NtCIP蛋白序列(SEQ ID NO：2)：
MAESTQPIKRSREEESQEIQENLCEGNNTKRHKSSYNDILSILEEEEYGFESDPVSGSDLFATLQQELLPNDGFEADPVS
VGSDISSKEDEVEDDRSSVIRHLLEASDDELGIPSGDGTNGVDLTFAEENETYGGDFPFAISDGLLWEFEDEAANYYSLL
QSELFM
系统进化树分析发现，NtCIP与林烟草NsCIP(XP_009778551.1)亲缘关系最近(图1)。蛋白序列比对分析发现，NtCIP蛋白序列与茄科作物的CIP基因同源性较高(图2)。
2.2cip纯合敲除株系材料筛选
通过对转基因阳性苗靶位点测序分析，从中筛选到2个成功编辑的株系cip-a2和cip-a3。cip-a2株系突变位点为明显的单峰(图3中左图)，说明该株系为纯合突变，序列比对发现第1个靶位点附近发现插入一个碱基A，在第2个靶位点附近发现缺失了两个碱基TT(图3的右图)；cip-a3株系突变位点为明显的单峰(图4中左图)，表明该株系均为纯合突变，序列比对发现在第2个靶点附近有41个碱基的缺失(图4中右图)。蛋白序列进行比对发现，cip-a2和cip-a3株系中NtCIP蛋白翻译提前终止(图5)，表明这两个敲除株系中NtCIP基因功能被破坏。
2.3NtCIP基因在烟草低温耐受性中的功能鉴定
如图6所示，常温条件下，NtCIP敲除株系cip-a2和cip-a3与湘烟7号(WT)表型无明显差别。4℃低温处理到8h后，两个敲除株系cip-a2和cip-a3出现整株萎蔫的现象，而WT叶片仅表现出轻微下垂。结果表明，cip-a2和cip-a3株系耐冷性明显降低。上述结果说明NtCIP正调控烟草耐冷性。
Claims (10)
1.一种NtCIP蛋白或NtCIP蛋白编码基因在培育低温耐受性增强或低温耐受性降低的植物或植物品种中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物双子叶或单子叶，优选所述植物是烟草。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，低温耐受性增强是通过在植物中过表达所述NtCIP蛋白编码基因实现。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述过表达通过遗传转化操作使所述NtCIP蛋白编码基因在转基因植株中进行过表达。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述遗传转化是农杆菌介导法或基因枪法。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，低温耐受性降低是通过敲除植物内源的所述NtCIP蛋白编码基因或弱化其表达来实现。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述敲除是通过基因同源重组或基因编辑的方法实现；所述弱化可以通过RNA干扰方法实现；
优选地，其中采用的靶标为atacgggtttgaatccgacccgg或tatccgacccgacagaaaccggg。
8.如权利要求1至7任一项所述的应用，其特征在于，所述NtCIP蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示，或者来源于烟草与其具有相同功能的同源NtCIP蛋白。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述NtCIP蛋白编码基因的CDS氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，其特征在于，还包括鉴定所述转基因植物的低温耐受性的步骤（例如通过将植株于4℃条件下处理6~12 h观察植株的外表），任选还包括进一步种植获得纯种的步骤。
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