CN114107371B - 黄瓜绿斑驳花叶病毒基因介导转基因烟草方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开CGMMV基因介导转基因烟草方法。针对现有技术不能利用重组质粒构建含CGMMV来源基因片段的具有发卡结构的ihpRNAi植物表达载体并能成功获得抗性烟草的方法的缺陷，本发明首先提供重组质粒pHellsgate2‑N及其构建方法。该重组载体是将CGMMV基因片段与干涉载体pHellsgate2进行重组反应构建获得。本发明还由该重组质粒转化得到的烟草干涉表达ihpRNAi载体及其构建方法。发明还提供CGMMV Helicase基因、完整外壳基因在病毒基因介导抗性烟草培育中的应用，以及经筛选得到的目的片段He1、He2、He3。

Description

黄瓜绿斑驳花叶病毒基因介导转基因烟草方法

技术领域

本发明涉及一种植物抗性育种，特别是涉及一种由黄瓜绿斑驳花叶病毒基因介导的病原衍生性抗性烟草培育方法，属于基因工程、遗传育种领域。

背景技术

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus spp.)。CGMMV能够以西瓜、甜瓜、南瓜、瓠瓜等较多种葫芦科(Cucurbitaceae)植物作为其自然寄主，且是葫芦科植物最主要病毒之一。由于葫芦科是世界范围内仅次于禾本科、豆科与茄科的重要食用植物科，因而黄瓜绿斑驳花叶病毒容易引发田间连续大面积感染与农业生产的规模性损失，已被世界许多国家与地区都列入检疫对象。CGMMV也可侵染苋色藜(Chenopodium Amaranticolor)、曼陀罗(Datura stramonium)、菟丝子(Cuscuta chinensis)、本氏烟(Nicotiana benthamiana)、珊西烟(Nicotianatabacum var Xanthi nc)等。本氏烟是黄瓜绿斑驳花叶病毒的试验寄主，以本氏烟作为研究对象，通过转基因的手段可以更快的解析该病毒的侵染机制。构建本氏烟草抗性材料在CGMMV研究中意义突出。

RNA干扰(RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA特异性降解，从而导致内源同源靶基因的表达沉默，产生相应的功能缺失表型。一般认为，植物组织内的RNAi是通过转基因产生发夹结构RNA(hairpin RNA，hpRNA)启动，因而通过构建带发卡结构的RNAi植物表达载体(ihpRNAi)诱导病毒基因沉默，能够更有效率地获得病毒基因介导的转基因植物抗性材料。

在黄瓜绿斑驳花叶病毒基因介导转基因抗性烟草中，现有技术构建植物表达载体从而诱导烟草组织内病毒基因沉默获得抗性烟草的方法是采用限制性酶切连接的方法将CGMMV的外壳蛋白(CP)基因部分片段构建到含有CMe-ACS2内含子的pBI12载体中(Transgenic Nicotiana benthamiana plants resistant to cucumber green mottlemosaic virus based on RNA silencing.Plant Cell Rep(2007)26:1283-1288)。该方法操作繁琐、时间材料耗费高，不利大量试验的开展。

现有技术还没有完成利用重组质粒构建含CGMMV来源基因片段的具有发卡结构的ihpRNAi植物表达载体并能成功获得抗性烟草的方法。

发明内容

本发明的目的就是针对现有技术构建ihpRNAi植物表达载体方法操作步骤繁冗、时间材料耗费高的不足，提供利用重组质粒实现的快捷简便的包含CGMMV基因片段的具有发卡结构的ihpRNAi植物表达载体，并能获得抗性烟草的技术方案。

本发明第一个目的是提供一种重组质粒，其技术方案如下：

一种重组质粒，其特征在于：将黄瓜绿斑驳花叶病毒基因片段与干涉载体pHellsgate2进行重组反应构建获得，重组质粒结构pHellsgate2-N，N为CGMMV来源的基因片段。

上述重组质粒是将CGMMV侵染性克隆质粒DNA筛选得到基因片段N连接在pHellsgate2载体上，得到的重组质粒结构为pHellsgate2-N。

构建上述重组质粒pHellsgate2-N的方法，其特征在于：将CGMMV侵染性克隆质粒DNA筛选得到基因片段N经重组反应连接在pHellsgate2载体上，所述重组反应是一步BP重组反应。

以上述重组质粒为基础，本发明进一步提供：

由上述重组质粒转化得到的烟草干涉表达载体。

上述烟草干涉表达载体即是具有发夹结构的反向重复序列载体ihpRNAi。

本发明同时提供如下方案：

构建上述烟草干涉表达载体的方法，其特征在于：依如下步骤实施：

首先，根据CGMMV目的片段设计PCR扩增引物对，经PCR扩增后回收纯化得到各PCR产物；

其次，将各PCR产物与干涉载体pHellsgate2进行重组反应，重组产物转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，筛选序列正确的阳性重组质粒；

最后，各阳性重组质粒转化农杆菌筛选含阳性ihpRNAi的农杆菌。

上述载体是包含黄瓜绿斑驳花叶病毒基因片段的具有发夹结构的反向重复序列载体ihpRNAi，经试验证明能够诱导烟草组织内CGMMV形成发卡结构RNA从而诱导病毒基因沉默，应用于病原衍生性抗性烟草的育种工程。

本发明的第二个目的从CGMMV基因组中筛选出能够成功构建于本发明重组质粒pHellsgate2-N并介导转基因烟草抗性的目的片段(基因片段N)，从而构建起完整的CGMMV基因介导且通过具有发夹结构的反向重复序列载体ihpRNAi诱导病毒基因沉默实现转基因烟草CGMMV抗性的技术方案。

本发明经大量试验，筛选出来自CGMMV Helicase基因(如SEQ ID NO.4所示)的3条目的片段，能够分别与干涉载体pHellsgate2构建为阳性表达的重组质粒，且构建过程只经一步BP重组反应即可获得理想效果。

本发明筛选出的3条来自CGMMV Helicase基因的目的片段分别是：

黄瓜绿斑驳花叶病毒Helicase基因片段He1，其特征在于：是CGMMV Helicase基因5′端386bp区段，碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

黄瓜绿斑驳花叶病毒Helicase基因片段He2，其特征在于：是CGMMV Helicase基因3′端345bp区段，碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

黄瓜绿斑驳花叶病毒Helicase基因片段He12，其特征在于：是CGMMV Helicase基因3′端736bp区段，碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

以上3条Helicase基因片段都能独立地用于构建上述重组质粒并在后继实验中介导抗性烟草。故而本发明提供如下方案：

黄瓜绿斑驳花叶病毒Helicase基因在病毒基因介导抗性烟草培育中的应用。

除来自CGMMV Helicase基因的目的片段外，本发明还发现利用CGMMV外壳蛋白(CP)完整基因为目的片段，也能成功构建本发明重组质粒与具有发夹结构的反向重复序列的烟草干涉表达载体ihpRNAi。

故而本发明提供如下方案：

黄瓜绿斑驳花叶病毒完整外壳基因在介导抗性烟草培育中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)本发明提供的重组质粒pHellsgate2-N能够经一步BP反应高效地用于构建包含CGMMV目的片段ihpRNAi载体，从而能够实现在烟草组织内通过hpRNA结构诱导CGMMV基因沉默，能够更有效率地实施RNA干扰。在病毒基因介导转基因植物的技术体系开发中需要开展大量的目的片段筛选试验，若采用现有酶切链接构建包含待测碱基片段的载体用于后续试验则操作步骤繁琐、耗费时间与材料。若采用本发明重组质粒构建表达载体则高效经济，能够节省庞大的各项投入。尤其是CGMMV作为农业生产中重要研究对象，本发明提供的重组质粒pHellsgate2-N、载体ihpRNAi在实际研究生产中的意义更显重大。(2)本发明公开了CGMMV Helicase基因在病毒基因介导转基因抗性烟草培育中的应用，并筛选出三条能够独立用于构建烟草干涉载体的Helicase基因片段He1、He2、He12，实现转基因烟草培育。(3)本发明公开了完整CGMMV外壳蛋白编码基因能够用于构建载体ihpRNAi并介导抗性烟草。(4)建立了多个利用CGMMV Helicase或外壳蛋白为病毒来源基因介导转基因抗性烟草的完整技术方案。

附图说明

图1是He1、He2、He12目的片段的PCR扩增结果。

图2是酶切验证结果((a)He1、(b)He2、(c)He12)。

图3是转化农杆菌的PCR验证结果((a)He1、(b)He2、(c)He12)。

图4是nptII引物检测结果(He1、He2、He12)。

图5是病毒接种攻毒试验结果(示接种后1个月，(a)He1、(b)He2、(c)He12)。

图6(a)是CP-F/CP-R扩增全长基因。

图6(b)是酶切验证结果。

图7是转化农杆菌的PCR验证结果(CP)。

图8是nptII引物检测结果(CP2、CP5、CP7)。

图9是病毒接种攻毒试验结果(示接种后1个月叶片，CP)。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的优选实施例作进一步的描述。

实施例一

克隆构建包含CGMMV Helicase基因的植物干涉表达ihpRNAi载体。

选取CGMMV Helicase基因(如SEQ ID NO.4所示)三个不同区段为目的片段，分别是：5′端386bp(He1，SEQ ID NO.1)、3′端345bp(He2，SEQ ID NO.2)、3′端736bp(He12，SEQID NO.3)。分别利用重组反应构建植物干涉表达ihpRNAi载体。

根据三条目的片段序列特征分别设计扩增引物对(见表1)，用PCR分别扩增He1、He2、He12片段。PCR反应体系与程序均相同。

PCR体系：50μL，内含正反向特异引物各1ul，5×TransStart FastPfu Buffer10ul，2.5mM dNTPs 4ul，TransStart Enzyme 1ul，ddH₂O 32ul，模板1ul，Total 50ul。

PCR扩增条件及程序：94℃预变性3min，94℃45sec，58℃45sec，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，回收、纯化并克隆至pMD18-T载体(宝生物工程有限公司)，进行序列测定，分析结果。图1是He1、He2、He12目的片段的PCR扩增结果。PCR产物回收纯化。

表1 He1、He2、He12目的片段PCR扩增引物对

目的片段	PCR扩增引物对
		He1(5′端386bp)	Helicase-1F(SEQ ID NO.5)、Helicase-1R(SEQ ID NO.6)
He2(3′端345bp)	Helicase-2F(SEQ ID NO.7)、Helicase-2R(SEQ ID NO.8)
		He12(3′端736bp)	Helicase-1F(SEQ ID NO.5)、Helicase-2R(SEQ ID NO.8)

所得回收纯化的PCR产物分别与干涉载体pHellsgate2进行BP重组反应。BP重组反应体系均相同，为：BP酶0.6μL，载体0.9μL，目的片段1.5μL。25℃3h。BP反应产物首先转化到大肠杆菌DH5α(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，spec 100mg/L固体平板筛选阳性克隆。对阳性克隆PCR检测，测序验证正确后，提取阳性重组质粒，分别命名为pHe-He1、pHe-He2、pHe-He12。采用冻融法分别将阳性重组质粒pHe-He1、pHe-He2、pHe-He12转入农杆菌LBA4404(上海唯地生物技术有限公司)感受态细胞，菌落PCR检测验证，挑取序列正确的菌落保存用于遗传转化烟草，保存备用。正确的菌落包含所构建的ihpRNAi载体。图2是酶切验证结果((a)He1、(b)He2、(c)He12)，图3是转化农杆菌的PCR验证结果((a)He1、(b)He2、(c)He12)。

实施例二

烟草遗传转化。

本氏烟(Nicotiana benthamiana)种子：中国农业科学院郑州果树研究所保存

MS培养基：北京酷来博科技有限公司

LB培养基(液体)：10g胰蛋白胨/L、5g酵母提取物/L、5g NaCl/L

过夜菌液：用LB液体培养基28℃，220rpm过夜培养实施例一保存备用农杆菌LBA4404制得。

共培养基：MS+BA 2.25mg/L+NAA 0.3mg/L，pH 5.8

筛选培养基：MS+BA 2.25mg/L+NAA 0.3mg/L+Kan 100mg/L+Timitin300mg/L，pH5.8

生根筛选培养基：MS+Kan 100mg/L+Timitin 150mg/L，pH 5.8

本氏烟种子70％酒精消毒30s，84消毒6min，无菌水冲洗6次，然后播种于MS培养基培养(16h光照、8h黑暗、25℃)。4叶期时选取健康叶片作为外植体进行遗传转化。

分别将He1、He2、He12三组试验的烟草幼嫩叶片切下剪取约0.5cm×0.5cm大小作为外植体，于加有100ul新制备过夜菌液的MS液体培养基中侵染10min～30min；取出外植体置于共培养基，黑暗条件下共培养2d～3d。取出外植体转移到筛选培养基进行筛选培养(培养条件同种子MS培养基阶段)；1个月后，从分化的丛生芽中切下单芽，转移到生根筛选培养基进行生根培养(培养条件同种子MS培养基阶段)；当小植株长到3cm左右高时，小心地洗净掉植株根周围的琼脂，将生根植株移栽到基质中炼苗。炼苗期间注意保持基质湿度，2周～3周以后，将成活的小植株转移到花盆中生长。

待遗传转化的烟草结籽，采集T0代种子备用。

实施例三

转基因烟草植株PCR阳性检测。

分别取实施例二He1、He2、He12三组炼苗实验成活的T0代转基因烟草植株的幼嫩叶片为样品，同时取野生型(WT)植株幼嫩叶片为对照。样品与对照材料均提取总DNA(DNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司)，利用标记基因nptII进行PCR检测。标记及检测依现有技术操作(参考文献Generation of transgenic watermelon resistance to Cucumbermosaic virus facilitated by an effective Agrobacterium-mediatedtransformation method.Scientia Horticulturae,Volume 205,23June 2016,Pages 32-38)。图4是nptII引物检测结果。

实施例四

病毒接种攻毒试验。

添加抗生素的LB培养基：Kan 100mg/L+Rif 50mg/L、LB培养基

诱导缓冲液：10mmol/LMgCl₂、10mmol/L MES、100μmol/L乙酰丁香酮

转化pHe-He1、pHe-He2、pHe-He12基因的烟草分别获得20、16、12棵阳性植株。经过预试验，各组分别选取3棵抗病性较好的转基因材料，标记为He1-6、He1-7、He1-10，He2-3、He2-7、He2-9，He12-1、He12-2、He12-3，进行病毒接种攻毒试验。

分别将He1-6、He1-7、He1-10，He2-3、He2-7、He2-9，He12-1、He12-2、He12-3的T0代种子与野生型(WT)种子播种到小花盆中。待长到四片叶片时，取转基因烟草DNA检测为阳性的材料进行植株叶片侵染操作：将CGMMV侵染性单克隆载体的农杆菌(中国农业科学院郑州果树研究所西瓜甜瓜病虫害防控课题组保存)在添加抗生素的LB培养基过夜培养16h～24h，6000rpm离心5min，收集下层菌体，用诱导缓冲液悬浮菌体，室温静置2h后，用1mL注射器分别将0.5ml菌体注射接种至He1、He2、He3三种转基因烟草材料及野生型材料(WT)叶片背面。各材料接种后置于温室条件培养(光照16h、28℃，黑暗8h、24℃)，观察记录病毒病发生情况。

WT材料：在接种10d时全部发病，表现为所有的材料心叶和第二片叶均呈花叶、皱缩。接种30d后，花叶和皱缩加重，植株矮化。

转基因材料各株系：接种10d，He1株系发病2株、He2株系发病4株、He12株系发病2株；接种20d时，He1株系发病增加到9株，He2株系发病增加到7株，He12株系发病增加到7株；接种30d时，He1株系发病增加到10株、He2株系发病增加到8株、He12株系发病增加到8株。30d时烟草发病率稳定，后期不再增加，发病率最高为He1-10株系为26.7％，抗病率较高的为He1-6和He12-2株系，高达86.7％。

图5是病毒接种攻毒试验结果(示接种后1个月，(a)He1、(b)He2、(c)He12)。图5显示各组试验的野生型和转基因株系第5片叶子的表型中，WT显示花叶皱缩，转基因株系叶片表现为健康状态。

表2 He1、He2、He12转基因植株对CGMMV抗性鉴定

以上实施例一～实施例四结果表明：利用CGMMV Helicase基因作为目的片段能够利用重组质粒pHellsgate2-N构建具有发夹结构的反向重复序列载体ihpRNAi，成功对烟草组织内的CGMMV实现RNA干扰，获得具有抗性的烟草植株。本发明在CGMMV Helicase基因上选取的He1(5′端386bp)、He2(3′端345bp)、He12(3′端736bp)三个片段均能够独立地介导抗性烟草。

实施例五

利用CGMMV CP基因构建载体ihpRNAi介导抗性烟草。

1、构建包含CGMMV CP基因的烟草干涉表达载体

以CGMMV CP基因全长(CGMMV CP，468bp，如SEQ ID NO.9所示)为目的片段，根据其序列特征设计扩增引物对(见表3)，用PCR扩增CGMMV CP。PCR反应体系、PCR条件及程序、试剂/材料/操作均与实施例一相同。

表3 CGMMV CP目的片段PCR引物对

目的片段	PCR扩增引物对
		CGMMV CP(468bp)	CP-F(SEQ ID NO.10)、CP-R(SEQ ID NO.12)

PCR产物回收纯化后采用与实施例一相同质粒、载体、操作构建包含CGMMV CP序列的阳性质粒pHe-CP、干涉植物表达载体ihpRNAi载体。图6(a)是CP-F/CP-R扩增全长基因、图6(b)是酶切验证结果(注：CP全长含XbaI位点，所以切出三条带)，图7是转化农杆菌的PCR验证结果(CP)。

2、烟草遗传转化。

利用以上步骤所得ihpRNAi载体采用与实施例二相同试剂/材料/操作转化烟草，得转基因烟草植株，并采集T0代种子备用。

3、转基因烟草植株PCR阳性检测

采用与实施例三相同试剂/材料/操作检测以上步骤所得转基因烟草植株。图8是nptII引物检测结果(CP2、CP5、CP7)。

4、病毒接种攻毒试验

采用与实施例四相同试剂/材料/操作接种攻毒以上步骤所得转基因烟草植株，并观察记录病毒病发生情况。

WT材料：在接种10d时全部发病，表现为所有的材料心叶和第二片叶均呈花叶、皱缩。

转基因材料：接种10d，He1株系发病2株、He2株系发病4株、He12株系发病2株；接种20d时，He1株系发病增加到9株，He2株系发病增加到7株，He12株系发病增加到7株；接种30d时，He1株系发病增加到10株、He2株系发病增加到8株、He12株系发病增加到8株。30d以后观察发病率保持稳定，转基因阳性转基因材料均表现抗性。整个生长周期内，转基因阳性植株均不发病。

图9是病毒接种攻毒试验结果(示接种后1个月叶片，CP)。

表4 CGMMV CP转基因植株对CGMMV病毒抗性鉴定

以上实施例五结果表明：利用完整的CGMMV CP基因片段能够构建本发明重组质粒与载体ihpRNAi，也能够应用于病毒基因介导抗性烟草培育。

对比例一

CP1片段、CP2片段介导抗性烟草培育。

在筛选有效的目的片段试验中，考虑到病毒外壳蛋白(CP)与运动蛋白(MP)都是病毒基因组中筛选目的片段的最常规区域，因而本发明分别从CGMMV CP基因5′端选取片段CP1(157bp，序列如SEQ ID NO.12所示)、从CGMMV CP基因3′端选取片段CP2(235bp，序列如SEQ ID NO.13所示)为目的片段开展烟草转基因试验。

经与实施例一～实施例四相同的操作，扩增得到目的片段CP1、CP2，再分别与干涉载体pHellsgate2重组获得阳性质粒，经转化经农杆菌LBA4404转化得到载体ihpRNAi，再进行烟草遗传转化、病毒接种攻毒试验。

在CP1攻毒试验中，转基因烟草不产生抗性，发病严重，与WT株系情形相同。在CP2攻毒试验中，转基因烟草发病情况略好于WT株系，但抗性水平达不到满意程度。

对比例一表明，利用CGMM CP片段能够成功构建载体ihpRNAi，但不一定能介导转基因烟草抗性或者是良好的抗性水平。

阳性转基因烟草发病情况同样全部感病，且属发病严重。阳性转基因烟草未对CGMMV产生抗性。结果表明选取的CP1片段不能介导转基因抗性烟草。

对比例二

嵌合结构V145介导抗性烟草培育

分别选取CGMMV基因组中VME区域、CP区域、MP区域的各一个区段，组成嵌合结构介导抗性烟草培育。

选取CGMMV中三个区段作为目的片段，包括：MET1片段(581bp，)，CP3片段(403bp)，MP1片段(498bp)，组成的嵌合结构V145(5UTR-MET1+CP3-3UTR+MP1，1482bp，如SEQ IDNO.14所示)。

经与实施例一～实施例四相同的操作，扩增得到目的片段V145、与干涉载体pHellsgate2重组获得阳性质粒，经转化经农杆菌LBA4404转化得到载体ihpRNAi，再进行烟草遗传转化、病毒接种攻毒试验。攻毒试验中，所获得的14个阳性转基因烟草株系发病情况与WT相同，均为全部感病，表明未对CGMMV产生抗性。结果表明所构建嵌合结构V145不能介导转基因烟草抗性。

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序列表

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 黄瓜绿斑驳花叶病毒基因介导转基因烟草方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 386

<212> DNA/RNA

<213> 片段He1，CGMMV Helicase基因5′端386bp(CGMMV)

<400> 1

ggttgtggaa agaccgccga gattatagcg agggtcaatt ggaaaactga tctagtattg 60

actcccggga gggaggcggc tgctatgatt aggcggagag cctgcgccct gcataagtca 120

cctgtggcaa ctagtgacaa cgtcagaact ttcgattctt ttgtgatgaa taggaaaatc 180

tttaagtttg acgctgtcta tgttgacgag ggtctgatgg tccatacggg attacttaat 240

tttgcgttaa agatctcagg ttgtaaaaaa gccttcgtct ttggtgatgc taagcaaatc 300

ccgtttataa acagagtcat gaattttgat tatcctaagg agttaagaac tttaatagtc 360

gataatgtag agcgtaggta tgtcac 386

<210> 2

<211> 345

<212> DNA/RNA

<213> 片段He2，CGMMV Helicase基因3′端345bp(CGMMV)

<400> 2

ggtgtcctag agatgtcact agttttctta atactatcta taaagccgct gtcgctacta 60

ctagtccggt tgtacattct gtgaaggcaa ttaaagtgtc aggggccggt attctgaggc 120

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aggagacggc agttgtgcgt gctaccccga ctccaatagg tttgattgcc cgtgattcac 300

cacatgtact agtggcctta actaggcaca ctaaggcaat ggtgt 345

<210> 3

<211> 736

<212> DNA/RNA

<213> 片段He12，CGMMV Helicase基因3′端736bp(CGMMV)

<400> 3

ggttgtggaa agaccgccga gattatagcg agggtcaatt ggaaaactga tctagtattg 60

actcccggga gggaggcggc tgctatgatt aggcggagag cctgcgccct gcataagtca 120

cctgtggcaa ctagtgacaa cgtcagaact ttcgattctt ttgtgatgaa taggaaaatc 180

tttaagtttg acgctgtcta tgttgacgag ggtctgatgg tccatacggg attacttaat 240

tttgcgttaa agatctcagg ttgtaaaaaa gccttcgtct ttggtgatgc taagcaaatc 300

ccgtttataa acagagtcat gaattttgat tatcctaagg agttaagaac tttaatagtc 360

gataatgtag agcgtaggta tgtcacccat aggtgtccta gagatgtcac tagttttctt 420

aatactatct ataaagccgc tgtcgctact actagtccgg ttgtacattc tgtgaaggca 480

attaaagtgt caggggccgg tattctgagg cctgagttga caaagatcaa aggaaagata 540

ataacgttta ctcaatctga taagcggtcc ttgattaaga gtgggtacaa cgatgtgaat 600

actgtgcatg aaattcaggg agaaaccttt gaggagacgg cagttgtgcg tgctaccccg 660

actccaatag gtttgattgc ccgtgattca ccacatgtac tagtggcctt aactaggcac 720

actaaggcaa tggtgt 736

<210> 4

<211> 765

<212> DNA/RNA

<213> CGMMV Helicase基因(总基因组 2575-3339CGMMV)

<400> 4

acattagttg acggggtgcc gggttgtgga aagaccgccg agattatagc gagggtcaat 60

tggaaaactg atctagtatt gactcccggg agggaggcgg ctgctatgat taggcggaga 120

gcctgcgccc tgcataagtc acctgtggca actagtgaca acgtcagaac tttcgattct 180

tttgtgatga ataggaaaat ctttaagttt gacgctgtct atgttgacga gggtctgatg 240

gtccatacgg gattacttaa ttttgcgtta aagatctcag gttgtaaaaa agccttcgtc 300

tttggtgatg ctaagcaaat cccgtttata aacagagtca tgaattttga ttatcctaag 360

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agtgggtaca acgatgtgaa tactgtgcat gaaattcagg gagaaacctt tgaggagacg 660

gcagttgtgc gtgctacccc gactccaata ggtttgattg cccgtgattc accacatgta 720

ctagtggcct taactaggca cactaaggca atggtgtatt atacc 765

<210> 5

<211> 48

<212> DNA/RNA

<213> 引物Helicase-1F(人工合成)

<400> 5

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg gttgtggaaa gaccgccg 48

<210> 6

<211> 49

<212> DNA/RNA

<213> 引物Helicase-1R(人工合成)

<400> 6

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg tgacatacct acgctctac 49

<210> 7

<211> 49

<212> DNA/RNA

<213> 引物Helicase-2F(人工合成)

<400> 7

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg gtgtcctaga gatgtcact 49

<210> 8

<211> 49

<212> DNA/RNA

<213> 引物Helicase-2R(人工合成)

<400> 8

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta caccattgcc ttagtgtgc 49

<210> 9

<211> 486

<212> DNA/RNA

<213> CGMMV CP基因，486bp(CGMMV)

<400> 9

atggcttaca atccgatcac acctagcaaa cttattgcgt ttagtgcttc ttatgttccc 60

gtcaggactt tacttaattt tctagttgct tcacaaggta ccgctttcca gactcaagcg 120

ggaagagatt ctttccgcga gtccctgtct gcgttaccct cgtctgtcgt agatattaat 180

tctagattcc cagatgcggg tttttacgct ttcctcaacg gtcctgtgtt gaggcctatc 240

ttcgtttcgc ttcttagctc cacggatacg cgtaataggg tcattgaggt tgtagatcct 300

agcaatccca cgactgctga gtcgcttaac gctgtaaagc gtactgatga cgcgtctaca 360

gccgctaggg ctgagataga taatttaata gagtctattt ctaagggttt tgatgtttac 420

gatagggctt catttgaagc cgcgttttcg gtagtctggt cagaggctac cacctcgaaa 480

gcttag 486

<210> 10

<211> 50

<212> DNA/RNA

<213> 引物CP-F(人工合成)

<400> 10

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tggcttacaa tccgatcaca 50

<210> 11

<211> 49

<212> DNA/RNA

<213> 引物CP-R(人工合成)

<400> 11

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc taagctttcg aggtggtag 49

<210> 12

<211> 157

<212> DNA/RNA

<213> 片段CP1，CGMMV CP基因5端′端157bp(CGMMV)

<400> 12

tggcttacaa tccgatcaca cctagcaaac ttattgcgtt tagtgcttct tatgttcccg 60

tcaggacttt acttaatttt ctagttgctt cacaaggtac cgctttccag actcaagcgg 120

gaagagattc tttccgcgag tccctgtctg cgttacc 157

<210> 13

<211> 235

<212> DNA/RNA

<213> 片段CP2，CGMMV CP基因3端′端235bp(CGMMV)

<400> 13

gtttcgcttc ttagctccac ggatacgcgt aatagggtca ttgaggttgt agatcctagc 60

aatcccacga ctgctgagtc gcttaacgct gtaaagcgta ctgatgacgc gtctacagcc 120

gctagggctg agatagataa tttaatagag tctatttcta agggttttga tgtttacgat 180

agggcttcat ttgaagccgc gttttcggta gtctggtcag aggctaccac ctcga 235

<210> 14

<211> 1482

<212> DNA/RNA

<213> 嵌合结构V145(1482bpCGMMV)

<400> 14

gttttaattt ttataattaa acaaacaaca acaacaacaa caaacaattt taaaacaaca 60

atggcaaaca ttaatgaaca aatcaacaac caacgtgacg ccgcggctag cgggagaaac 120

aatctcgtta gccaattggc gtcaaaaagg gtgtatgacg aggctgttcg ctcgttggat 180

catcaagaca gacgcccgaa aatgaacttt tctcgtgtgg tcagcacaga gcacaccagg 240

cttgtaactg atgcgtatcc ggagttttcg attagcttta ccgccaccaa gaactctgta 300

cactcccttg cgggtggtct gaggcttctt gaattggaat atatgatgat gcaagtgccc 360

tacggctcac cttgttatga catcggcggt aactatacgc agcacttgtt caaaggtaga 420

tcatatgtgc attgctgcaa tccgtgccta gatcttaaag atgttgcgag gaatgtgatg 480

tacaacgata tgatcacgca acatgtacag aggcacaagg gatctggcgg gtgtagacct 540

cttccaactt tccagataga tgcattcagg aggtacgata gtccacggat acgcgtaata 600

gggtcattga ggttgtagat cctagcaatc ccacgactgc tgagtcgctt aacgctgtaa 660

agcgtactga tgacgcgtct acagccgcta gggctgagat agataattta atagagtcta 720

tttctaaggg ttttgatgtt tacgataggg cttcatttga agccgcgttt tcggtagtct 780

ggtcagaggc taccacctcg aaagcttagt ttcgagggtc ttctgatggt ggtgcacacc 840

aaagtgcata gtgctttccc gttcacttaa atcgaacggt ttgctcattg gtttgcggaa 900

acctctcacg tgtgacgtcg aagtttctat gggcagtaat tctgcaaggg gttcgaatcc 960

cccctttccc cgggtagggg cccatgtctc taagtaaggt gtcagtcgag aactcgttga 1020

aacctgagaa gtttgtcaaa atctcttggg tcgataagtt gctccctaac tatttttcca 1080

ttcttaagta tttatctata actgacttta gtgtagttaa agctcagagc tatgaatccc 1140

tcgtgcctgt caagttgttg cgtggtgttg atcttacaaa acacctttat gtcacattgt 1200

tgggcgttgt ggtttctggt gtatggaacg taccggaatc ctgtaggggt ggtgctactg 1260

ttgctctggt tgacacaagg atgcattctg ttgcagaggg aactatatgc aaattttcag 1320

ctcccgccac cgtccgcgaa ttctctgtta ggttcatacc taattattct gtcgtggctg 1380

cggatgccct tcgcgatcct tggtctttat ttgtgagact ctctaatgtg ggtattaaag 1440

atggtttcca tcctttgact ttagaggtcg cttgtttagt cg 1482

Claims (9)

1.黄瓜绿斑驳花叶病毒Helicase基因片段，其特征在于：是如下方案之一：

方案一、片段He1，是CGMMV Helicase基因5′端386bp区段，碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

方案二、片段He2，是CGMMV Helicase基因3′端345bp区段，碱基序列如SEQ ID NO.2所示；

方案三、片段He12，其特征在于：是CGMMV Helicase基因3′端736bp区段，碱基序列如SEQ ID NO.3所示；

所述基因片段利用重组反应构建植物干涉表达ihpRNAi载体。

2.权利要求1所述黄瓜绿斑驳花叶病毒Helicase基因片段在病毒基因介导抗性烟草培育中的应用。

3.重组质粒，其特征在于：将黄瓜绿斑驳花叶病毒基因片段与干涉载体pHellsgate2进行重组反应构建获得重组质粒pHellsgate2-N，N为权利要求1所述任一CGMMV Helicase基因片段。

4.构建权利要求3中所述重组质粒pHellsgate2-N的方法，其特征在于：CGMMV侵染性克隆质粒DNA筛选得到基因片段N经重组反应连接在pHellsgate2载体上，所述重组反应是一步BP重组反应。

5.烟草干涉表达载体，其特征在于：包含权利要求1所述任一CGMMV Helicase基因片段，或利用权利要求3所述重组质粒转化得到。

6.根据权利要求5所述的烟草干涉表达载体，其特征在于：是具有发夹结构的反向重复序列载体ihpRNAi。

7.根据权利要求6所述烟草干涉表达载体，其特征在于：所述烟草是本氏烟（Nicotiana benthamiana）。

8.构建权利要求6或7所述烟草干涉表达载体的方法，其特征在于：依如下步骤实施：

首先，根据CGMMV目的片段设计PCR扩增引物对，经PCR扩增后回收纯化得到各PCR产物，所述目的片段是SEQ ID NO.1序列所示片段He1或SEQ ID NO.2序列所示片段He2或SEQ IDNO.3序列所示片段He12；

其次，将各PCR产物与干涉载体pHellsgate2进行重组反应，重组产物转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，筛选序列正确的阳性重组质粒；

最后，各阳性重组质粒转化农杆菌筛选含阳性ihpRNAi的农杆菌。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述农杆菌转化是采用冻融法分别将各阳性重组质粒转入农杆菌LBA4404。