KR20040066425A - Ｃｇｍｍｖ-저항성 형질전환 박과 작물을 제조하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 CGMMV-저항성 형질전환 박과 작물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 CGMMV의 외피 단백질을 암호화하는CP유전자를 박과 작물에 도입시켜 CGMMV-저항성 형질전환 박과 작물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 박과 작물에 큰 피해를 주는 CGMMV에 대한 저항성 품종을 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 CGMMV-저항성 박과 작물은 작물의 접목을 위한 대목(stock)으로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 CGMMV-저항성 형질전환 박과 작물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 CGMMV의 외피 단백질을 암호화하는CP유전자를 박과 작물에 도입시켜 CGMMV-저항성 형질전환 박과 작물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
식물 바이러스란 농작물을 포함하여 식물에 병을 일으키는 병원체의 일종이다. 일반 재배농가에서 바이러스병을 쉽게 판별하기 어려운 이유는 바이러스에 감염될 경우 곰팡이나 세균병과는 달리 식물체 내에서 잠복기간이 비교적 길어서 초기에 감염유무를 알기 어렵기 때문이다. 또한, 생리장해와 비슷한 증상을 나타내는 경우도 많으며, 약제살포나 환경요인 등이 복합적으로 작용할 경우 원인을 알아내기가 쉽지 않다. 작물에 발생하는 바이러스 병의 종류는 세계적으로 800여종에 달하며, 국내에도 각종 작물에 대한 약 100여종의 바이러스병이 알려져 있다. 특히, 수박, 호박, 박, 오이, 메론, 참외 등 경제적 부가가치가 높은 시설재배 박과 작물에 바이러스 병의 피해가 늘어가고 있는 실정이다. 곰팡이나 세균병과는 달리 바이러스에 일단 감염되면 실질적으로 치료가 불가능하고 방제할 수 있는 약제가 없다.
상기 수박, 호박 등의 박과 작물에서 발생하는 바이러스병으로는 오이 모자이크 바이러스(cucumber mosaic virus; CMV)-, 오이 녹반 모자이크 바이러스(cucumber green mottle mosaic virus; CGMMV)-, 규리 녹반 모자이크 바이러스(kyuri green mottle mosaic virus; KGMMV)-, 수박 모자이크 바이러스(watermelon mosaic virus; WMV)-, 호박 모자이크 바이러스(zucchiniyellow mosaic virus; ZYMV)- 및 토마토 반점 위조 바이러스(tomato spotted wilt virus; TSWV) 병 등이 있다. 그 중에서도 CGMMV 병이 발생하는 분포지역이 가장 넓고 그 피해 또한 가장 크다.
CGMMV 병에 감염되면, 육묘기 때부터 잎에 모자이크 증상이 나타나는 경우가 있으나, 보통은 정식 후에 나타난다. 발병 초기에는 생장점에서 비교적 가까운 부분의 어린 잎에 황색 반점이 나타나면서 녹색의 진한 부분이 약간 돌출되어 모자이크 증상을 나타낸다. 과일에는 꼭지부분에 갈색의 줄무늬가 나타나며 과피에 농녹색의 작은 혹과 모자이크가 나타나기도 한다. 과육은 씨앗의 주변이 적자색을 띠고 곳곳에 황색 섬유상의 줄이 생기면서 연화되어 산패 냄새를 낸다. CGMMV 병에 걸리면 과육이 악변해서 출하할 수 없게 된다. 이는 바이러스가 잎과 과일 안에서 증식하기 때문이다. 육묘 온도가 25℃ 인 경우에는 감염된 지 10일 후면 잎에 모자이크 증상이 나타나나, 20℃ 이하에서는 발병하기까지 긴 시일이 걸린다. 따라서, CGMMV 병에 감염되어 있어도 바이러스의 증식이 보이지 않으면 모자이크 증상이 나타나지 않는다. 시설재배에서는 정식 직후가 모자이크 발생의 적온 조건이 되기 때문에 노지에 비해 잎의 모자이크 증상도 일찍 나타나고 그 정도도 심하다. 따라서, 과육의 악변도 심하다.
한편, CGMMV 병을 일으키는 CGMMV는 토바모바이러스 그룹(Tobamovirus group)의 일종으로서, ssRNA로 구성되어 있는 300nm의 막대기형 바이러스이다. 1935년 영국에서 처음 발견된 이래 미주와 아프리카를 제외한 전 세계적으로 발생 분포되어 있다. CGMMV는 종자 전염, 토양전염, 접촉 전염 등 그 감염 경로가 매우다양하다. 최근 중국의 산둥지역을 포함하는 많은 지역이 CGMMV에 의해 몇 년째 상당한 피해를 입은 것으로 보고된 바 있다. 국내에서는 1989년 처음으로 경남 함안, 진주의 수박 재배 농가들에서 상기 CGMMV에 의한 피해가 보고되었으며, 매년 지역별로 피해가 증가하다가 1998년 이후부터는 수박뿐만 아니라 오이, 호박에서도 심한 피해 현상이 나타났다. 1998년 발병한 수박 피해 면적은 450ha이며, 이는 전체 수박 재배지의 약 5%에 해당된다. 보고된 피해액은 약 65억 정도이지만 전 농가를 대상으로 발생 및 피해 실태가 조사된 것이 아니기 때문에 실제로는 이보다 훨씬 많은 100억원 정도로 추측되고 있다. 1999년에는 수박 재배지에서의 피해보고는 다소 줄었으나, 경상도 및 전라도 12개의 시와 군에서 쥬키니 호박과 오이에 대한 피해가 심해 총 박과 작물의 피해는 약 150억원 정도에 달한 것으로 보고되었다. 2000-2001년에도 참외, 메론 등을 포함하는 모든 박과 작물로 CGMMV 감염의 폭이 넓어짐으로써 뚜렷한 방제 대책을 형성하지 못한 우리나라의 현 실정으로는 농가에서의 피해가 앞으로도 계속 증가할 수밖에 없다.
현재까지는 CGMMV에 특이적인 방제 방법이 보고되어 있지 않다. 선진 외국에서는 초기 방제 대책으로 토양 관리나 무병 종자생산 또는 관계기관의 지도 및 교육에 의존하고 있다. 채종지가 중국 또는 동남아에 의존하고 있는 우리나라에서는 항구적인 종합 방제 대책이 필요하나, 1999년 10월에야 비로소 농업진흥청, 종자관리소, 각 종묘회사에서 대책협의회를 구성하여 방제 대책을 위한 여러 연구과제를 시작한 실정이다. 앞으로 종합 방제 대책이 확립되기까지는 많은 시간이 걸리고 또한 대책이 수립되었다 하더라도 채종지에서의 감염을 근절하기는 어려운 실정임으로 궁극적으로는 CGMMV 저항성 품종을 선발 또는 개발해야 한다.
그러나, 현재까지 국내외적으로 CGMMV 저항성 품종이 개발된 바 없으며, CGMMV 저항성 품종 육종에 대한 대책 또한 전무하다. 1990년대 초부터 유전공학 기술을 이용하여 바이러스 저항성 식물을 개발하는 연구가 많이 진행되었다. 그 예로는 바이러스 유전자의 일부를 식물 형질전환용 벡터에 클로닝하고, 이를 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용하여 식물에 도입함으로써 바이러스에 저항성을 갖는 형질전환 식물체를 제조하는 것이다. 바이러스의 외피 단백질(coat protein; CP)을 암호화하는 유전자를 이용하여 CMV, TMV(tobacco mosaic virus) 및 ToMV (tomato mosaic virus)에 저항성을 갖는 형질전환 담배나 형질전환 토마토 등에 대해서는 국내외적으로 많이 보고되었다(손성한 외,식물조직배양학회지, 24(3): 153-160, 1998; 손성한 외,식물조직배양학회지, 22(3): 149-155, 1995; Songet al.,Mol. Cells, 9: 569-575, 1999; Powell-Abelet al., Science, 232: 738-743, 1986; Shinet al., Transgenic Research, 11: 215-219, 2002; Baulcombe, D. C.,The Plant Cell, 8: 1833-1844, 1996). 그러나, CGMMV에 대해서는 바이러스의 분리 및 동정에 대한 연구만이 활발히 이루어졌을 뿐(Nozuet al., Virology, 45: 577-585, 1971; Franckiet al.,Intervirology, 26: 156-163, 1986; Ugakiet al.,J. Gen. Virol., 72: 1487-1495, 1991; Ryuet al.,Archives of Virology, 145: 2325-2333, 2000), CGMMV의 유전자를 이용한 저항성 형질전환 식물체, 특히 경제적 부가가치가 높은 CGMMV-저항성 형질전환 박과 작물 및 이의 제조 방법에 대해서는 전혀 연구된 바 없다. 따라서, 이에 대한 개발이 절실히 요구되고 있다.
따라서, 본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 CGMMV-저항성 형질전환 식물체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 CGMMV-저항성 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.
도 1은 CGMMV-NW 균주에서CP유전자를 클로닝하기 위하여 RT-PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
M: 분자량 마커
레인 1-4: CGMMV-NW 균주
도 2은 CGMMV-NW 균주로부터 증폭된 PCR 산물의 염기서열 및 이로부터 유추되는 아미노산 서열의 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 pMBP-1/CGMMV-CP 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 방법에 따른 CGMMV-저항성 형질전환 수박의 기내 배양시 (A), 순화 후(B), 노지 재배시(C) 및 착과 후(D)의 모습을 나타낸 것이다.
도 5는 T1 형질전환체의 게놈 내에서 프라이머에 의해 증폭되는 PCR 산물의 영역(A)와 T1 형질전환체의 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행한 결과(B)를 나타낸 것이다.
M: 분자량 마커
21-42: T1 형질전환체
P1, P2: 양성 대조구(CGMMVCP유전자)
N: 음성 대조구(비형질전환체)
도 6은 T1 형질전환체의 게노믹 DNA를XbaⅠ으로 절단한 후, 게노믹 서던 블럿을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
NC: 음성 대조구(비형질전환체)
26, 36-42: T1 형질전환체
도 7은 CGMMV 접종 후 본 발명에 따라 CGMMVCP유전자가 도입된 T1 형질전환체의 모습을 비형질전환체와 비교하여 도시한 것이다.
A: 비형질전환체(이병성)
B: T1 형질전환체(저항성)
도 8은 T1 형질전환체의 CGMMV 저항성이 CGMMVCP유전자에 의한 것인지 확인하기 위하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
M: 분자량 마커
1-18: CGMMV를 접종한 표 2의 T1 형질전환체
N: CGMMV를 접종하지 않은 비형질전환체
P: 양성 대조구(CGMMVCP유전자)
C1-C9: CGMMV를 접종한 표 2의 비형질전환체
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CGMMV-저항성 형질전환 박과 작물을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 CGMMV-저항성 형질전환 박과 작물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 CGMMV에 저항성을 갖는 박과 작물을 최초로 제조하였다는 점에 특징이 있다. 본 발명에 따른 CGMMV-저항성 형질전환 박과 작물을 제조하는 방법은 오이 녹반 모자이크 바이러스(CGMMV)의 외피 단백질을 암호화하는CP유전자가 삽입된 식물 형질전환용 벡터로 박과 작물을 형질전환하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 방법에 이용될 수 있는 CGMMVCP유전자는 CGMMV의 외피 단백질을 암호화하는 유전자라면 모두 사용될 수 있으며, CGMMV 균주(strain)의 종류에 제한받지 않는다. 바람직하게는 진뱅크 등록번호 D12505, AF225984, AJ243831, AJ245440 등에 개시된 염기서열을 갖는 CGMMVCP유전자를 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 CGMMV-NW 균주의 외피 단백질을 암호화하는CP유전자를 사용할 수 있다. 상기 유전자의 염기서열은 서열번호 3으로 기재되었다. 또한, 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 CGMMVCP유전자는 PCR을 통해 증폭하여 얻어질 수 있다. 이 때 PCR은 상기 유전자의 염기서열로부터 디자인될 수 있는 프라이머, 바람직하게는 유전자의 용이한 클로닝을 위해 그 서열 내에 제한효소 인식 서열이 포함되도록 디자인된 프라이머를 이용하여 수행될 수 있다. 가장 바람직하게는 서열번호 1과 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 구성된 프라이머를 이용하여 증폭될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에서는 (주)농우바이오 병리부로부터 분양받은 CGMMV-NW 균주로부터 총 RNA를 분리한 후, RT-PCR을 수행하여 CGMMVCP유전자를 증폭하였다(도 1 참조). 이후, 상기 유전자의 염기서열과 이로부터 유추되는 아미노산 서열을 여러 CGMMV 균주의CP유전자의 서열들과 비교한 결과, 98% 이상의 상동성을 나타냄을 확인할 수 있었다(표 1 참조). 본 발명에서 클로닝한CP유전자의 염기서열과 이로부터 유추되는 아미노산 서열을 서열번호 3과 서열번호 4로 각각 기재하였다. 이후, CGMMV-NW 균주로부터 분리된CP유전자를 식물 형질전환용 벡터에 삽입하였다. 이 때 상기CP유전자를 식물에 도입하기 위한 식물 형질전환용 벡터는 식물의 형질전환에 사용되는 일반적인 벡터라면 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 pMBP-1, pBI121, pRTL2, pCambia 및 pPMI로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나, 보다 바람직하게는 pMBP-1을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 pMBP-1을 이용하여CP유전자를 발현시키기 위한 pMBP-1/CGMMV-CP 벡터를 제조하였다(도 3 참조).
본 발명의 바람직한 다른 실시예에서는 상기 pMBP-1/CGMMV-CP 벡터를 박과 작물의 조직에 도입하였다. 이 때 식물 조직으로의 도입은 아그로박테리움 매개 형질전환법(Agrobacterium-mediated transformation), 전기 충격법(electroporation), 입자 총법(microparticle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake)등에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 아그로박테리움 매개 형질전환법을 이용할 수 있다. 구체적으로 본 발명에서는 상기 pMBP-1/CGMMV-CP 벡터가 도입된 아그로박테리움을 박과 작물의 조직과 공동 배양(co-cultivation)하였다. 형질전환된 아그로박테리움과 식물의 조직(식물체 절편)을 공동 배양하기 위해서는 먼저 식물 조직의 무균 시료를 준비하는 것이 필요하다. 이를 위해 종자를 에탄올 및 염화나트륨 용액으로 소독하고 세척한 후, MS 배지에서 발아시켜 본 잎이 나오기 전 어린 자엽(cotyledon)을 형질전환에 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 식물의 조직은 상기 자엽 이외에 배축(hypocotyl) 또는 상기 자엽이나 배축으로부터 유도된 캘러스(callus)를 사용할 수도 있다.
이후, pMBP-1/CGMMV-CP 벡터가 도입된 식물 조직을 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 배지에서 배양하여 신초를 유도한 후, 카나마이신 저항성을 갖는 캘러스 만을 선별하였다. 그리고 나서, 선별된 캘러스를 카르베니실린(carbenicillin)이 포함된 배지에서 4-5주정도 배양한 후, 다시 뿌리 유도 배지에서 약 3주간 배양하여 발근을 유도하였다. 이 때 뿌리 유도용 배지에는 소량의 NAA(naphthalenacetic acid)를 첨가하는 것이 바람직하다. 이외에도 겜보그 비타민 액(Gamborg's vitamin solution), IAA(indole-3-acetic acid) 등의 식물 생장 촉진제를 첨가할 수 있다. 이후, 뿌리 유도 배지에서 배양된 유식물체(plantlet)로부터 세근(부정근)이 나면, 배지를 깨끗이 제거하여 멸균 배합토에 이식하였다. 이 때 비닐로 화분을 덮어 약 3주간 밀봉하는 것이 바람직하다. 그리고 나서, 큰 화분으로 옮겨 완전한 식물체로 재분화시켰다(도 4 참조).
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에서는 본 발명에 따라 제조된 T0 형질전환체를 자가수정하여 T1 형질전환체를 획득한 후, PCR과 게노믹 서던 블럿(genomic southern blot)을 수행하여 T1 형질전환체에CP유전자가 도입된 것을 확인하였다(도 5 및 도 6 참조). 이후, T1 형질전환체가 CGMMV에 대하여 저항성을 나타내는 것을 육안 검정과 ELISA 테스트를 통하여 확인하였다(도 7 및 표 2 참조). 또한, T1 형질전환체의 CGMMV 저항성이 CGMMVCP유전자에 기인하는 것임을 확인하였다(도 8 참조).
본 발명에 따른 방법은 수박, 호박, 박, 오이, 참외, 메론 등을 포함하는 모든 박과 작물에 적용될 수 있다. 일반적으로 박과 작물은 직접 종자를 파종하여 재배하기보다는 대부분 수박 공대나 박 대목 또는 호박 대목에 접목하여 플러그(plug) 묘 형태로 재배되고 있다. 이는 박과 작물에 치명적인 토양 전염성 병해를 방지함은 물론 저온 신장성의 향상, 내건, 내습성 강화, 내염성 증진 등 각종 환경 저항성 증진과 수량 및 품질향상을 도모하기 위함이다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 수박, 호박 또는 박과 같이 대목으로 사용되는 박과 작물에 적용되어 CGMMV-저항성 대목을 생산할 수 있다. 이에 따라, 본 발명에 방법에 의해 제조된 CGMMV-저항성 대목에 원하는 작물을 접목시킴으로써 토양 등에 의한 바이러스 전염을 방지하여 유전자 조작 없이 바이러스 병에 감염되지 않은 비 GMO 작물을 생산할 수 있다. 본 발명의 방법을 이용한 CGMMV-저항성 대목의 개발은 국내 시장의 안정성을 획기적으로 도모할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 따라 제조된 CGMMV-저항성 대목을 이용하여 생산된 채소 등의 작물들은 향후 GMO 작물의 자유 시장 체제 하에서 막대한 외자를 벌 수 있는 주요 품목이 될 수 있다.
일반적인 박과 작물들, 특히 수박은 형질전환이 잘 되지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서, 현재 많은 연구자들이 박과 작물을 형질전환시키기 위하여 연구를 계속하고 있다. 이와 같은 사실을 고려할 때에 본 발명에 따른 CGMMV-저항성 형질전환 박과 작물을 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 CGMMV-저항성 형질전환 박과 작물은 그 유용성이 크다고 할 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 CGMMV-저항성 형질전환 박과 작물은 뿌리 유도 배지에서 CGMMVCP유전자가 도입된 형질전환체로부터 뿌리를 유도한 후, 토양 순화 및 재분화 과정을 거쳐 무성번식될 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 통상의 호접, 삽접, 합접, 할접 및 단근삽접 등의 접목 방법에 의해서도 무성번식될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
CGMMV
CP
유전자의 클로닝 및 서열 분석
1-1) RT-PCR
CGMMV-NW 균주((주) 농우바이오 병리부)로부터 당업계에 공지된 방법에 따라 총 RNA(total RNA)를 분리하였다. 이후, 서열번호 1과 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 구성된 프라이머쌍과 PCR 레드디믹스(PCR Reddymix; 기산과학)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 상기 프라이머쌍의 염기서열 내에는BamHⅠ 인식서열이 각각 삽입되어 있다. PCR 반응 조건은 47℃에서 30분 동안 반응시키고, 94℃에서 2분간 DNA를 변성시킨 후, 94℃/20초; 60℃/30초; 및 72℃/5분을 한 사이클로 하여 총 36회 반복 수행하였다. 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시켰다. 이후, 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 PCR 산물의 증폭 여부를 확인하였다. 그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이,CP유전자에 해당하는 약 550bp 크기의 밴드가 검출됨을확인할 수 있었다.
1-2) PCR 산물의 서열 분석
상기 실시예 1-1)에서 증폭된 PCR 산물을 진클린 키트(BIO 101)를 이용하여 겔로부터 분리·정제한 후, 이를 pGEM-T 이지 벡터(Promega)에 클로닝하였다. 이후, 자동서열 분석기(ABI Prism 377 DNA Sequencing System, Applied Biosystem)를 이용하여 상기 벡터에 삽입된 PCR 산물의 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, PCR 산물의 크기는 548bp이었으며, 이로부터 암호화되는 단백질은 162개의 아미노산으로 구성되어 있었다(도 2 참조). 또한, 상기 PCR 산물의 ORF 내의 서열(염기서열 및 아미노산 서열)을 기존에 알려진 여러 CGMMV 균주의CP유전자의 서열과 비교한 결과 98% 이상의 상동성을 나타내었다(표 1 참조).
| 바이러스 균주 명 | CP유전자 진뱅크 등록번호 | 염기서열 상동성(%) | 아미노산 서열 상동성(%) |
| CGMMV-NW(본 발명) | - | 100 | 100 |
| CGMMV-NS | AJ243831 | 100 | 100 |
| CGMMV-Y | AJ245440 | 99.6 | 98.7 |
| CGMMV-SH | D12505 | 99.8 | 100 |
| CGMMV-W | AF225984 | 98.9 | 100 |
상기 결과로부터 CGMMV-NW 균주에서 증폭된 PCR 산물이 CGMMVCP유전자임을 확인할 수 있었으며, 상기CP유전자의 염기서열을 서열번호 3으로 기재하였다.또한, 이로부터 추정되는 아미노산의 서열을 서열번호 4로 기재하였다.
<실시예 2>
식물 형질전환용 벡터로의 도입
프라이머 내에 삽입된BamHⅠ 인식 서열을 이용하여 상기 실시예 1에서 얻은 PCR 산물을 절단한 다음, 이를 식물 형질전환용 벡터인 pMBP-1 벡터(한국생명공학연구원 권석윤 박사 실험실로부터 분양받음)에 삽입시켰다. 제조된 재조합 벡터를 'pMBP-1/CGMMV-CP'라 명명하였다(도 3 참조). 이후, 상기 pMBP-1/CGMMV-CP 벡터를 이용하여 아그로박테리움 LBA 4404(The Netherlands Culture Collection of Bacteria, NCCB)를 형질전환시켰다. 형질전환된 아그로박테리움을 수박 공대의 형질전환에 사용하였다.
<실시예 3>
수박의 형질전환
먼저 수박 공대 종자((주)농우바이오 종자)를 70% 에탄올에서 10-15초간 흔들어 준 후, 2% 염화나트륨 용액에 10-30분간 담가두었다. 이후, 멸균된 증류수로 3-5회 세척한 후, MS 배지(Sigma)에 파종하여 명 상태(16시간/일), 온도 25℃, 습도 40%의 무균 조건에서 배양하였다. 3-4일 후 자라난 자엽을 2일간 25℃에서 명배양하였다(전 배양). 상기 실시예 2에서 형질전환된, pMBP-1/CGMMV-CP 벡터를 포함하는 아그로박테리움을 YEP 배지(yeast extract 10 g/ℓ, peptone 10 g/ℓ,NaCl 5 g/ℓ, pH 7.0)에서 28℃, 20시간 동안 배양한 후, 원심분리하여 균체를 침전시켰다. 이후, 항생제를 포함하지 않는 동일한 부피의 YEP 배지에 다시 현탁(resuspension)시켰다. 이를 다시 원심분리로 침전시킨 후, 항생제를 포함하지 않는 MS 배지에 OD600값이 0.5-0.8이 되도록 재현탁시키고, 여기에 전배양한 수박의 자엽을 넣고 약 15분간 잘 흔들어 주었다. 이후, 3일 동안 25℃에서 공동 배양(co-cultivation)하였다. 공동배양이 끝난 후, 400 mg/ℓ 카르베니실린이 첨가된 멸균된 증류수로 자엽을 2-3회 세척하고 3mm 종이 위에서 물기를 제거해 주었다. 이후, 상기 자엽을 500 ㎎/ℓ카나마이신, 8 g/ℓ 아가(agar) 및 2 ㎎/ℓBA을 함유하는 MS 기본 배지에서 배양하여 신초(shoot)를 유도하였다. 신초가 형성된 캘러스를 400 ㎎/ℓ카르베니실린과 8 g/ℓ아가를 포함하는 MS 배지로 옮겨 4-5주 배양하였다. 이후, 뿌리 유도 배지(MS 배지, 아가 g/ℓ, 400㎎/ℓ 카르베니실린 및 0.1㎎/ℓNAA)에서 약 3주간 배양하여 발근을 유도하였다. 이후, 유식물체(plantlet)의 크기가 약 7-8cm 정도 되었을 때 세근(부정근)이 나면, 배지를 깨끗지 제거하여 멸균 배합토에 이식하였다. 이 때 100% 습도를 유지하기 위하여 비닐로 화분을 덮어 약 3주간 밀봉하였다. 이후, 비닐을 제거하고 5주 후에 큰 화분(pot)으로 옮겨 완전한 식물체로 재분화시켰다. 도 4는 본 발명에 따라 제조된 CGMMV-저항성 형질전환 수박이 기내 배양에서 순화를 거쳐 착과한 과정까지의 모습을 도시한 것이다.
<실시예 4>
CGMMV
CP
유전자가 도입된 형질전환체의 분석
상기 실시예 3에서 얻은 T0 형질전환체 2개체를 자가수정하여 T1 종자 200여 개를 얻었다. T1 종자를 다시 파종하여 잎의 수가 6매 정도가 되었을 때 PCR과 게노믹 서던 블럿 분석을 수행하여 T1 형질전환체에 CGMMVCP유전자가 도입되었는지를 확인하였다.
4-1) PCR 분석
CGMMVCP유전자가 T1 형질전환체에 도입되었는지 확인하기 위하여,CP유전자를 증폭하기 위한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다(도 5의 A 참조). 이 때 프라이머로는 상기 실시예 1에서 사용한 서열번호 1과 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 구성된 프라이머를 사용하였다. 22개체의 T1 형질전환체에 대한 PCR 결과를 도 5의 B에 도시하였다. 도 5의 B에 도시된 바와 같이, 음성 대조구인 비형질전환체에서는 PCR 산물이 검출되지 않았으나, 본 발명에 따른 T1 형질전환체에서는 양성대조구(실시예 1에서 PCR로 증폭된CP유전자)와 동일하게 모두 약 550bp 크기의 단일 밴드가 검출됨을 확인할 수 있었다.
4-2) 게노믹 서던 블럿 분석
상기 실시예 4-1)에서 CGMMVCP유전자가 도입된 것으로 확인된 T1 형질전환체 중 임의로 선택된 7개체로부터 게노믹 DNA를 추출하였다. 게노믹 DNA 30㎍을XbaⅠ으로 절단한 후, 14시간 동안 20V로 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다. 이후, 분리된 게노믹 DNA를 알칼리 전이 방법(alkaline transfer method)으로 하이본드(Hybond) N+나일론 막에 옮겼다. 탐침은 상기 실시예 1에서 클로닝한 CGMMVCP유전자를 메가 프라임 라벨링 키트(Mega prime DNA random labeling kit, Amersham Pharmacia Biotech)를 이용하여32P-dCTP로 표지하여 제조하였다. 이후, 혼성화 완충용액(0.25M disodium phosphate, pH7.2, 1mM EDTA, 7% SDS)을 이용하여 65℃에서 20시간 동안 혼성화시켰다. 그리고 나서, 혼성화된 막을 2×SSC, 1% SDS로 상온에서 한번 세척한 후, 동일한 용액으로 65℃에서 10분간 3회 세척하였다. 마지막으로 0.1×SSC, 1% SDS로 65℃에서 10분간 세척하였다. 이후, X-ray 필름(Kodak)을 이용하여 혼성화 시그널을 검출하였다. 그 결과, 도 6에 도시된 바와 같이, 하나의 T1 형질전환체(26번)에서는 CGMMVCP유전자가 단일 카피(single copy)로 존재하는 반면, 나머지 T1 형질전환체들(36-42번)에서는 최소 3-4개의 카피로 존재하는 것으로 나타났다.
<실시예 5>
T1 형질전환체의 CGMMV 저항성 검정
5-1) 육안 검정과 ELISA 테스트
본 발명에 따라 CGMMVCP유전자가 도입된 T1 형질전환체가 CGMMV에 대하여 저항성을 나타내는지 확인하기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다. T1 형질전환체 18개체와CP유전자가 도입되지 않은 비형질전환체(대조구) 9개체의 종자를파종하여 잎의 수가 6매일 때 잎 면에 CGMMV를 스크래치(scratch)하는 방식으로 1차 접종하였다. 1주일 후 동일한 개체의 다른 잎에 2차 접종을 실시하였다. 한 개체 당 총 2개의 잎에 CGMMV를 접종하였다. 그 결과, 비형질전환체에서는 1차 접종한 지 약 2주 후부터 육안으로 확인할 수 있는 병증이 나타나기 시작하였다. 육안 검정 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 또한, 대표적인 저항성 개체(T1 형질전환체; B)와 이병성 개체(비형질전환체; A)의 표현형을 도 7에 도시하였다. 도 7에서 보는 바와 같이,CP유전자가 도입되지 않은 이병성 개체(도 7의 A)의 경우 잎 색깔이 옅으며, 모자이크 현상이 나타난 것을 볼 수 있다.
이후, T1 형질전환체내의 바이러스 활성화 정도를 검정하기 위하여, 2차 접종한지 2주 후에 T1 형질전환체 18개체를 대상으로 ELISA 테스트를 실시하였다. 이 때 ELISA 테스트는 DAS ELISA 테스트 시스템(Agdia, INC.)를 이용하여 제조사의 권장방법에 따라 실시하였다. 그 결과, 하기 표 2에 기재된 바와 같이, T1 형질전환체 18개체 중 6개체의 T1 형질전환체에서는 CGMMV 활성이 검출되지 않았으며, 나머지 12개체의 T1 형질전환체에서는 낮은 CGMMV 활성이 검출되었다. 상기 12개체의 T1 형질전환체의 경우, CGMMV 활성이 검출되었음에도 불구하고 병증은 나타나지 않는 것으로 확인되었다. 반면, 대조구인 비형질전환체 9개체에서는 ELISA 테스트에서 모두 CGMMV 활성이 검출되었다.
| No. | T1형질전환체 | 육안검정 | ELISA | No. | T1형질전환체 | 육안검정 | ELISA | No. | 비형질전환체(대조구) | 육안검정 | ELISA |
| 1 | 1S-1 | × | ○ | 10 | 2S-4 | × | ○ | 1 | C-1 | ○ | ○ |
| 2 | 1S-2 | × | ○ | 11 | 2S-5 | × | ○ | 2 | C-2 | ○ | ○ |
| 3 | 1S-3 | × | × | 12 | 2S-6 | × | × | 3 | C-3 | ○ | ○ |
| 4 | 1S-5 | × | ○ | 13 | 2S-7 | × | × | 4 | C-4 | ○ | ○ |
| 5 | 1S-7 | × | × | 14 | 2S-8 | × | ○ | 5 | C-5 | ○ | ○ |
| 6 | 1S-8 | × | ○ | 15 | 2S-9 | × | ○ | 6 | C-6 | ○ | ○ |
| 7 | 2S-1 | × | × | 16 | 2S-10 | × | ○ | 7 | C-7 | ○ | ○ |
| 8 | 2S-2 | × | ○ | 17 | 2S-11 | × | ○ | 8 | C-8 | ○ | ○ |
| 9 | 2S-3 | × | × | 18 | 2S-15 | × | ○ | 9 | C-9 | ○ | ○ |
*육안 검정 - ×: 병증이 나타나지 않음, ○: 병증이 나타남
*ELISA 테스트 - ×: CGMMV 활성 없음, ○: CGMMV 활성 있음
5-2) PCR 분석
본 발명자들은 상기 실시예 5-1)에서 나타난 T1 형질전환체의 CGMMV 저항성이 CGMMVCP유전자에 의한 것인지 확인하기 위하여, 18개체의 T1 형질전환체를 대상으로 하여 상기 실시예 1-1)과 동일한 방법에 따라 PCR을 수행하였다. 그 결과, 도 8에 도시된 바와 같이, 비형질전환체에서는 CGMMVCP유전자가 검출되지 않은 반면, 본 발명에 따른 T1 형질전환체에서는 CGMMVCP유전자가 모두 검출되었다. 이로부터 본 발명에 따라 CGMMVCP유전자가 도입된 형질전환체의 CGMMV 저항성이 CGMMVCP유전자에 기인하였음을 확인할 수 있었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 CGMMV의CP유전자를 박과 작물에 도입시킴으로써 CGMMV에 대해 저항성을 갖는 형질전환 박과 작물을 제조하고, 이의CGMMV 저항성을 검증하였다. 본 발명에 따른 방법은 박과 작물에 큰 피해를 주는 CGMMV에 대한 저항성 품종을 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 CGMMV-저항성 박과 작물은 작물의 접목을 위한 대목(stock) 으로 유용하게 사용될 수 있다.
<110> NONG WOO BIO CO.LTD
<120> Method for producing CGMMV-resistant transgenic Cucurbitaceous
crops
<130> NP02-1152
<160> 4
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for PCR
<400> 1
ccgggatccg aagagtccag ttctgtt 27
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for PCR
<400> 2
gtgggatccc accatcagaa gaccctc 27
<210> 3
<211> 483
<212> DNA
<213> CGMMV-NW
<400> 3
atggcttaca atccgatcac acctagcaaa cttattgcgt ttagtgcttc ttatgttccc 60
gtcaggactt tacttaattt tctagttgct tcacaaggta ccgctttcca gactcaagcg 120
ggaagagatt ctttccgcga gtccctgtct gcgttaccct cgtctgtcgt agatattaat 180
tctagattcc cagatgcggg tttttacgct ttcctcaacg gtcctgtgtt gaggcctatc 240
ttcgtttcgc ttctcagctc cacggatacg cgtaataggg tcattgaggt tgtagatcct 300
agcaatccta cgactgctga gtcgcttaac gctgtaaagc gtactgatga cgcgtctacg 360
gccgctaggg ctgagataga taatttaata gagtctattt ctaagggttt tgatgtttac 420
gatagggctt catttgaagc cgcgttttcg gtagtctggt cagaggctac cacctcgaaa 480
gct 483
<210> 4
<211> 161
<212> PRT
<213> CGMMV-NW
<400> 4
Met Ala Tyr Asn Pro Ile Thr Pro Ser Lys Leu Ile Ala Phe Ser Ala
1 5 10 15
Ser Tyr Val Pro Val Arg Thr Leu Leu Asn Phe Leu Val Ala Ser Gln
20 25 30
Gly Thr Ala Phe Gln Thr Gln Ala Gly Arg Asp Ser Phe Arg Glu Ser
35 40 45
Leu Ser Ala Leu Pro Ser Ser Val Val Asp Ile Asn Ser Arg Phe Pro
50 55 60
Asp Ala Gly Phe Tyr Ala Phe Leu Asn Gly Pro Val Leu Arg Pro Ile
65 70 75 80
Phe Val Ser Leu Leu Ser Ser Thr Asp Thr Arg Asn Arg Val Ile Glu
85 90 95
Val Val Asp Pro Ser Asn Pro Thr Thr Ala Glu Ser Leu Asn Ala Val
100 105 110
Lys Arg Thr Asp Asp Ala Ser Thr Ala Ala Arg Ala Glu Ile Asp Asn
115 120 125
Leu Ile Glu Ser Ile Ser Lys Gly Phe Asp Val Tyr Asp Arg Ala Ser
130 135 140
Phe Glu Ala Ala Phe Ser Val Val Trp Ser Glu Ala Thr Thr Ser Lys
145 150 155 160
Ala
Claims (10)
- 오이 녹반 모자이크 바이러스(cucumber green mottle mosaic virus; CGMMV)의 외피 단백질을 암호화하는CP유전자가 삽입된 식물 형질전환용 벡터로 박과 작물을 형질전환하는 것을 포함하는 CGMMV-저항성 형질전환 박과 작물을 제조하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 오이 녹반 모자이크 바이러스의 외피 단백질은 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기CP유전자는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기CP유전자는 서열번호 1과 서열번호 2로 기재되는 프라이머를 이용한 PCR에 의해 증폭된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기CP유전자가 삽입된 식물 형질전환용 벡터로 아그로박테리움을 형질전환시키고, 형질전환된 아그로박테리움을 박과 작물의 조직과 공동 배양하여 형질전환하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 박과 작물의 조직은 자엽(cotyledon), 배축 (hypocotyl) 또는 캘러스(callus)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기CP유전자가 삽입된 식물 형질전환용 벡터는 도 3에 도시된 개열지도를 갖는 pMBP-1/CGMMV-CP 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 박과 작물은 수박, 호박, 박, 오이, 참외 및 메론으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조되고, 조직배양을 통해 재분화시킨 CGMMV-저항성 형질전환 박과 작물.
- 제 9항에 있어서, 상기 박과 작물은 수박인 것을 특징으로 하는 CGMMV-저항성 형질전환 박과 작물.
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