KR101133101B1 - 양초의 캘러스로부터 재분화를 유도하는 배지 - Google Patents

양초의 캘러스로부터 재분화를 유도하는 배지 Download PDF

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Abstract

본 발명은 키네틴(kinetin)과 NAA가 함유된 MS배지에 양초의 캘러스를 배양함으로써 재분화를 유도하는 방법에 있어서, 키네틴(kinetin)과 NAA가 함유된 MS배지에 카사미노산(casamino acid)이 추가로 함유되는 것을 특징으로 하는 양초의 캘러스로부터 재분화를 유도하는 방법 및 배지에 관한 것으로, 배지에 카사미노산을 함유시킴으로써 재분화율을 높일 수 있고, 양초의 재분화율을 높임으로써 분자 육종을 통한 복합환경스트레스 양초의 개발에 유용하게 응용될 수 있다.
배지, 양초, 재분화, 카사미노산

Description

양초의 캘러스로부터 재분화를 유도하는 배지{Culture medium for deriveing regeneration from callus of Leymus chinensis Trin}
본 발명은 양초의 캘러스로부터 재분화를 유도하는 방법 및 배지에 관한 것으로 더욱 상세하게는 양초의 재분화율을 높일 수 있는 방법 및 배지에 관한 것이다.
급속한 산업화와 인구증가에 의한 지구규모의 생태계 파괴는 21세기 인류생존의 최대 사회문제로 대두되고 있다. 특히, 무리한 개간과 가축의 방목 등에 의한 중국 사막화는 심각한 속도로 전개되고 있으며, 우리나라에 막대한 산업적 피해를 가져다주고 있어 이에 대한 다각적인 대응책이 시급히 요구되고 있다.
양초(Leymus chinensis Trin.)는 중국, 시베리아, 몽골을 포함한 동북아시아의 건조 및 알칼리토양(pH8.5~11.5)에 널리 자생하는 다년생 화본과 식물로, 척박한 환경에 비교적 잘 적응하며 사막화가 진전되고 있는 지역의 토양 유식 및 황사발생을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 높은 단백질을 함유한 양질의 건초로 이용되고 있는 중요한 사료작물이다(Jia 1987).
한편, 양초의 분포는 사막화가 진전되는 지역에서 대규모의 개간 및 가축의 방목 등으로 크게 감소되고 있는 추세인데(Liu and Wang 1999), 특히, 중국 길림성 서북지역으로 들어갈수록 토양의 알칼리화로 인한 사막화 현상이 매우 심각하여 토양이 극심하게 황폐화되고 있다. 따라서 높은 알칼리 토양과 건조지역에 잘 적응하는 양초의 우수한 환경적응성을 분자수준에서 규명하고, 환경 스트레스에 보다 잘 견디는 양초를 개발하는 일은 동북아지역의 생태계 보전 및 복원을 위해서 매우 중요한 일이다.
한편, 최근 Jin(2004)은 양초에 높은 알칼리 처리에서 약 1,500종의 EST를 분리하여 형질전환기술을 이용한 개별 유전자의 기능을 규명하고 있다. 양초가 지닌 환경 내성 유전자의 기능을 직접적으로 규명하기 위해서는 양초의 형질전환체계에 대한 구축이 무엇보다 중요하나, 지금까지 양초의 형질전환에 대한 연구 보고는 단지 한 편 뿐이다. 양초의 형질전환 체계를 구축하기 위해서는 효율적인 재분화체계 확립이 요구되는데, 양초의 조직배양에 대한 연구는 미성숙 배를 통한 식물체 재분화(Liu et al. 2002), 미성숙 화서를 이용한 캘러스 형성 및 기관분화에 의한 식물체 재분화(Liu et al. 2004)가 있다. 성숙배를 이용한 식물체 재분화(김명덕 et el. 2005)체계는 2005년에 만들어졌으나 재분화율이 낮은 문제점이 발생하였다.
이에 본 발명은 양초의 환경적응성 규명 및 복합 환경 스트레스 내성을 지닌 형질전환 양초를 개발하기 위하여 일차적으로 체세포 배발생에 의한 효과적인 식물체 재분화 체계에 있어서, 양초의 재분화율을 높이는 양초의 캘러스로부터 재분화를 유도하는 방법 및 배지를 제공하는데 그 목적이 있다.
상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 키네틴(kinetin)과 NAA(α-naphthaleneacetic acid)가 함유된 MS배지에 양초의 캘러스를 배양함으로써 재분화를 유도하는 방법에 있어서, 키네틴(kinetin)과 NAA가 함유된 MS배지에 카사미노산(casamino acid)이 추가로 함유되는 것을 특징으로 하는 양초의 캘러스로부터 재분화를 유도하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 키네틴(kinetin)과 NAA가 함유된 MS배지에 카사미노산(casamino acid)이 추가로 함유된 것을 특징으로 하는 양초의 캘러스로부터 재분화를 유도하기 위한 배지를 제공한다.
이하, 본 발명의 과제 해결 수단에 대해 상세히 설명하고자 한다.
양초는 척박한 환경에 비교적 잘 적응하며 사막화가 진전되고 있는 지역의 토양 유식 및 황사 발생을 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 높은 단백질을 함유한 양질의 건초로 이용되고 있는 중요한 사료 작물이지만, 높은 알칼리 토양과 건조지역 에 대한 적응성이 떨어지는 문제점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 유전적 형질전환으로 생장율, 생물 및 무생물적 스트레스에 대한 증가된 저항성, 증가된 수확량 및 환경 스트레스에 대한 유연한 적응력 등과 같은 새로운 농경법적으로 중요한 특징을 지닌 새로운 다양한 식물 종의 개발이 세계적으로 확산되고 있다.
이에 본 발명은 형질전환된 양초를 개발하기 위해 일차적으로 체세포 배발생에 의한 효과적인 식물체 재분화 체계를 확립하기 위하여 키네틴(kinetin)과 NAA가 함유된 MS배지에 양초의 캘러스를 배양함으로써 재분화를 유도하는 방법에 있어서, 키네틴(kinetin)과 NAA가 함유된 MS배지에 카사미노산(casamino acid)이 추가로 함유되는 것을 특징으로 하는 양초의 캘러스로부터 재분화를 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명인 양초의 캘러스로부터 재분화를 유도하는 방법은 카사미노산(casamino acid)을 첨가함으로써 양초의 재분화율을 높일 수 있다는 사실을 실험예 1을 통해 확인할 수 있었다.
한편, 배지 중 카사미노산의 함유량을 특정의 범위에 한정되는 것은 아니나 바람직하게 배지 중 최대 4,000 mg/L 함유되는 것이 좋은데, 4,000 mg/L를 초과하는 경우에는 함유량 대비 효율성이 낮아지기 때문이다.
한편, 배지 중 키네틴의 함유량은 특정의 범위에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게 배지 중 최대 5 mg/L 만큼 함유되는 것이 좋다.
한편, 배지 중 NAA(α-naphthaleneacetic acid)의 함유량은 특정의 범위에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게 배지 중 최대 2 mg/L 만큼 함유되는 것이 좋으며, MS배지는 바람직하게 수크로오스(sucrose)와 젤라이트(gelrite)를 추가로 함유하는 것이 좋다. 이때, 수크로오스와 젤라이트는 가장 바람직하게 배지 중, 각각 최대 50 g/L, 10 g/L 씩 함유되는 것이 좋다.
한편, 본 발명은 양초의 캘러스로부터 재분화를 유도하는 배지에 있어서, 키네틴(kinetin)과 NAA가 함유된 MS배지에 카사미노산(casamino acid)이 추가로 함유된 것을 특징으로 하는 양초의 캘러스로부터 재분화를 유도하기 위한 배지를 제공한다.
본 발명의 배지는 카사미노산을 추가로 함유함으로써 양초의 캘러스로부터 재분화율을 높일 수 있다는 사실을 실험예 1을 통해 확인하였다.
한편, 배지 중 카사미노산의 함유량은 특정의 범위에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게 배지 중 최대 4,000 mg/L 함유된 것이 좋은데, 4,000 mg/L를 초과하는 경우에는 함유량 대비 효율성이 낮아진다.
한편, 배지 중 키네틴의 함유량은 특정의 밤위에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게 배지 중 최대 5 mg/L 만큼 함유된 것이 좋고, NAA는 바람직하게 배지 중 최대 2 mg/L 만큼 함유된 것이 좋다.
한편, MS배지는 특정의 종류에 한정되는 것은 아니나 바람직하게 수크로오스(sucrose)와 젤라이트(gelrite)를 추가로 함유하는 것이 좋고, 이때, 수크로오스와 젤라이트는 가장 바람직하게 배지 중, 각각 최대 50 g/L, 10 g/L 씩 함유되는 것이 좋다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 양초의 캘러스로부터 재분화를 유도하는 방법 및 배지는 배지에 카사미노산을 함유시킴으로써 재분화율을 높이는 효과를 발휘한다.
또한, 본 발명은 양초의 우수한 환경적응성을 분자 수준에서 규명하고 환경 스트레스에 보다 잘 견디는 양초를 개발하는 일에 있어서, 양초의 재분화율을 높임으로써 분자 육종을 통한 복합 환경 스트레스 양초의 개발에 유용하게 응용될 수 있다.
이하, 본 발명의 내용에 대해 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
제조예 1: 양초 종자로부터 캘러스 유도
단계 1: 식물 재료 및 종자 살균
양초(Leymus chinensis Trin.) 종자는 중국 길림성 사평시 자연초원에서 채종한 것으로, 종자 살균은 Liu 등(2002) 방법에 준하여 종피를 제거하고 70% 에탄올(ethanol)에서 1분간 교반하면서 살균한 후, 5% 소디움 하이포클로라이트(sodium hypochlorite) 용액에서 20분간 교반하면서 표면살균 하였다. 살균한 종자는 멸균 수로 3~5번 세정한 후, 멸균된 필터 페이퍼(filter paper)에 옮겨 물기를 제거하고 종자로부터 캘러스를 유도하였다.
단계 2: 캘러스 유도
양초의 종자로부터 캘러스를 유도하기 위한 배지는 MS기본 배지에 5 mg/L L-글루탐산(L-glutamic acid)과 30 g/L 수크로스(sucrose), 4 g/L 젤라이트(gelrite) 및 다양한 농도의 2,4-D가 함유되어 있고, 각각을 이렇게 명명하였다: M 0(5 mg/L L-glutamic acid + 0 mg/L 2,4-D), M 0.5(5 mg/L L-glutamic acid + 0.5 mg/L 2,4-D), M 1(5 mg/L L-glutamic acid + 1.0 mg/L 2,4-D), M 2(5 mg/L L-glutamic acid + 2.0 mg/L 2,4-D), M 2.5(5 mg/L L-glutamic acid + 2.5 mg/L 2,4-D).
배지를 pH 5.8로 조정하고 121℃ 20분간 고압 증기멸균한 다음, M 0, M 0.5, M 1, M 2, M 2.5를 각각 0.2㎛ 'filter-sterilized' 한 후, 모든 배지에 각각을 첨가하였다.
살균된 종자를 배지별로 각각 10개씩 28℃ 암조건에서 4~5주간 배양하고 2주간 동안은 1회 계양배양을 하였다. 5~7일 후에 종자가 발아를 할 경우, 작은 싹과 뿌리는 완전히 절제하였다.
제조예 2: 양초 잎으로부터의 캘러스 유도
단계 1: 식물 재료
상기 실시예 1에서 살균된 종자 15개를 MS기본 배지 35-40ml포함한 pot (100X40mm)안에 치상하고 1주 정도 후에 무균싹 받았다. 잎을 1cm 절편으로 썰고 잎으로부터 캘러스를 유도하기 위해 페트리 디쉬((90X20mm)안에 치상하였다.
단계 2: 캘러스 유도
양초의 잎으로부터 캘러스를 유도하기 위한 배지는 MS기본 배지에 5 mg/L L-글루탐산(L-glutamic acid)과 30 g/L 수크로스(sucrose), 4 g/L 젤라이트(gelrite) 및 다양한 농도의 2,4-D가 함유되고 있고, 각각을 이렇게 명명하였다: M 0(5 mg/L L-glutamic acid + 0 mg/L 2,4-D), M 0.5(5 mg/L L-glutamic acid + 0.5 mg/L 2,4-D), M 1(5 mg/L L-glutamic acid + 1.0 mg/L 2,4-D), M 2(5 mg/L L-glutamic acid + 2.0 mg/L 2,4-D), M 2.5(5 mg/L L-glutamic acid + 2.5 mg/L 2,4-D).
배지를 pH 5.8로 조정하고 121℃ 20분간 고압 증기멸균한 다음, M 0, M 0.5, M 1, M 2, M 2.5를 각각 0.2㎛ 'filter-sterilized' 한 후, 모든 배지에 각각을 첨가하였다.
잎 절편을 3회 반복으로 4~5주 동안 배양하고 2주 동안 1회 계대배양을 하였다.
실시예 1: 카사미노산을 함유하는 배지에서 양초의 재분화 유도
1단계: 식물체의 재분화
상기 제조예 1 또는 제조예 2에서 2회 이상 계대 배양한 후, 식물체 재분화를 위한 좋은 생장상태의 캘러스를 재분화 배지에 치상하였다.
재분화 배지는 MS기본 배지로 2,000 mg/L 카사미노산(casamino acid), 2 mg/L KT, 다양한 농도의 NAA, 30 g/L 수크로오스(sucrose), 4 g/L 젤라이 트(gelrite)가 함유되어 있고, 각각을 다음과 같이 명명하였다: ZN 0(2,000 mg/L casamino acid + 2 mg/L KT + 0 mg/L NAA), ZN 0.2(2,000 mg/L casamino acid + 2 mg/L KT + 0.2 mg/L NAA), ZN 0.5(2,000 mg/L casamino acid + 2 mg/L KT + 0.5 mg/L NAA), ZN 1(2,000 mg/L casamino acid + 2 mg/L KT + 1.0 mg/L NAA), ZN 1.5(2,000 mg/L casamino acid + 2 mg/L KT + 1.5 mg/L NAA).
각각의 배지를 H 5.8로 조정하고, 121℃에서 20분간 고압 증기 멸균한 후, 28℃ 약광(20~30μEm-2s-1) 16/8(light/dark) 조건으로 배양하였다.
2주 후, 수트(shoot)가 나온 캘러스 수량하고 한 캘러스에서 나온 수트 수량도 통계하였다. 수트가 안 나온 캘러스는 계속 같은 배지에서 2-3주간 배양하면서 수트가 나오면 상기의 수량 같이 계산하였다. 본 발명에서 '수트(shoot)'라는 용어는 성숙한 식물체로 생장할 수 있는 능력을 지닌 캘러스로부터 유도된 초록색을 지닌 분화된 조직을 나타낸다.
2단계: 뿌리 유도
수트(shoot)크기가 3-4cm의 캘러스를 각각 1/2 MS배지에서 1주간 뿌리발생을 유도하였다. 배양 조건은 28℃, 강광 (60~80 μEm-2s-1), 16/8 (light/dark) 조건으로 하였다. 뿌리가 잘 생장한 싹은 토양에 이식하고 그린 하우스(greenhouse)에 배양하였다. 식물체 꽃 7월에 피고 종자 8월 받을 수 있었다.
비교예 1: 카사미노산을 함유하지 않는 배지에서 양초의 재분화 유도
상기 제조예 1 또는 제조예 2에서 2회 이상 계대 배양한 후, 식물체 재분화를 위한 좋은 생장상태의 캘러스를 재분화 배지에 치상하였다.
재분화 배지는 MS기본 배지로 2 mg/L KT, 다양한 농도의 NAA, 30 g/L 수크로오스(sucrose), 4 g/L 젤라이트(gelrite)가 함유되어 있고, 각각을 다음과 같이 명명하였다: Z 0(2 mg/L KT + 0 mg/L NAA), Z 0.2(2 mg/L KT + 0.2 mg/L NAA), Z 0.5(2 mg/L KT + 0.5 mg/L NAA), Z 1(2 mg/L KT + 1.0 mg/L NAA), Z 1.5(2 mg/L KT + 1.5 mg/L NAA).
각각의 배지를 H 5.8로 조정하고, 121℃에서 20분간 고압 증기 멸균한 후, 28℃ 약광(20~30μEm-2s-1) 16/8(light/dark) 조건으로 배양하였다.
2주 후, 수트(shoot)가 나온 캘러스 수량하고 한 캘러스에서 나온 수트 수량도 통계하였다. 수트가 안 나온 캘러스는 계속 같은 배지에서 2-3주간 배양하면서 수트가 나오면 상기의 수량 같이 계산하였다. 본 발명에서 '수트(shoot)'라는 용어는 성숙한 식물체로 생장할 수 있는 능력을 지닌 캘러스로부터 유도된 초록색을 지닌 분화된 조직을 나타낸다.
실험예 1: 재분화율 비교
상기 실시예 1 및 비교예 1에서 캘러스로부터의 재분화율을 측정한 후, 비교하였다.
MS medium with NAA MS medium with 2,4-D and casamino acid
NAA of different
concentrations(mg/L)		 plant regeneration(%) NAA of different
concentrations(mg/L)		 plant regeneration(%)
Z 0 11±0.5 ZN 0 23±1.0
Z 0.2 25±0.5 ZN 0.2 71±1.0
Z 0.5 35±1.2 ZN 0.5 54±1.2
Z 1 20±0.8 ZN 1 30±0.8
Z 1.5 18±1.9 ZN 1.5 20±0.6
양초의 재분화율을 비교한 결과(표 1), NAA만 첨가된 MS 배지보다 NAA과 카사미노산이 첨가된 MS 배지에서 식물의 재분화율이 높았고, 특히 ZN 0.2 배지에서 가장 좋은 재분화율이 나타났다.
실시예 1은 재분화 1주 후에 녹색점이 있는 캘리(calli)를 형성하는 반면, 비교예 1은 녹색점이 있는 캘리를 형성하는데 오랜 시간이 걸리기 때문에 수트를 배양하는데 어려움이 발생하였다(도 1).
2주 후, 실시예 1은 많은 녹색 점이 보이고, 3~4㎝인 수트(shoot)가 관찰되었는데, 이러한 수트는 바로 뿌리 배지에 옮기면 완전한 식물체로 자랄 수 있다. 비교예 1은 적은 녹색점이 보이고, 생장 속도가 매우 느려 계속 계대배양을 해야만 했다(도 2).
3주 후, 실시예 1은 비교예 1보다 빠른 시간 내 수팅(shooting)되어, 바로 뿌리 배지에 옮기면 되었지만, 비교예 1은 생장 속도가 느려 계속 계대 배양을 해야하는 어려움이 있었다(도 3).
상기의 결과로부터 본 발명은 양초의 재분화율을 높일 수 있다는 사실을 확인할 수 있었고, 그로부터 완전한 식물체로 성장할 때까지의 시간을 감소시킬 수 있어, 효율적이라는 사실도 확인할 수 있었다.
도 1은 카사미노산을 함유하지 않는 배지에서 양초의 캘러스를 이용하여 재분화한 1주 후의 비교예 1과 카사미노산을 함유하는 배지에서 양초의 캘러스를 이용하여 재분화한 1주 후의 실시예 1을 비교한 사진이다.
도 2는 카사미노산을 함유하지 않는 배지에서 양초의 캘러스를 이용하여 재분화한 2주 후의 비교예 1과 카사미노산을 함유하는 배지에서 양초의 캘러스를 이용하여 재분화한 2주 후의 실시예 1을 비교한 사진이다.
도 3은 카사미노산을 함유하지 않는 배지에서 양초의 캘러스를 이용하여 재분화한 3주 후의 비교예 1과 카사미노산을 함유하는 배지에서 양초의 캘러스를 이용하여 재분화한 3주 후의 실시예 1을 비교한 사진이다.

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  7. 양초의 캘러스로부터 재분화를 유도하기 위한 배지로서,
    MS배지에 2,000 mg/L 카사미노산(casamino acid), 2 mg/L 키네틴(kinetin), 0.2 mg/L의 NAA(α-naphthaleneacetic acid), 30 g/L 수크로오스(sucrose) 및 4 g/L 젤라이트(gelrite)가 함유된 것을 특징으로 하는 양초의 캘러스로부터 재분화를 유도하기 위한 배지.
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