CN101946711A - 紫花苜蓿高效组织培养再生的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种紫花苜蓿高效组织培养再生方法，其依次包括有如下步骤：(1)无菌苗的培养；(2)将紫花苜蓿无菌苗叶片接种于愈伤诱导培养基中培养；(3)将愈伤组织转入继代培养基1中进行培养；(4)将要长出绿色芽点的愈伤组织转入愈伤组织继代培养基2中进行继代培养(5)挑选生长状态好的愈伤组织转入分化培养基中进行分化培养；(6)待分化出苗后转入生根培养基中进行生根培养。本发明的优点在于：本发明通过添加合适剂量的TDZ和连续继代实现了紫花苜蓿组织培养中植株的高效再生，应用本发明方法可以提高紫花苜蓿愈伤组织分化率，比现有技术的分化率平均高出12.3％。该方法操作简单、植株再生成功率高。本发明为进一步利用基因工程对其进行遗传改良奠定了基础。

Description

紫花苜蓿高效组织培养再生的方法
技术领域：
本发明涉及一种紫花苜蓿高效组织培养再生方法，尤其是涉及一种通过添加TDZ和连续继代实现紫花苜蓿植株高效再生的培养方法，属于农业生物技术领域。
背景技术：
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)为多年生豆科植物，是世界上重要的栽培牧草，在我国已有两千多年的栽培历史，其营养价值被列在各种牧草的首位，有“牧草之王”的美誉，在畜牧业生产中占有重要的地位。
随着生物技术的发展，利用基因工程培育和改良植物品种成为便捷和实用的手段。转基因技术通过引入少量有用基因取代了传统育种中大量基因的介入，减少了无用基因对性状改良的不良影响，从而可以快速实现育种目标。因此，通过转基因手段将优良基因转移到栽培品种中，可以加速培育新品种。而转基因的前提就是要建立高效组培再生体系。苜蓿组织培养最早见于Saunders等的报道，通过器官形成和体胚愈伤组织发育2条途径，最终分化成完整的植株，这标志着苜蓿组织培养研究的开始。尽管国内外对苜蓿离体再生体系的研究已经比较深入，但是再生频率低、受基因型影响大、再生周期长等问题目前仍有待于进一步研究解决。
利用现有技术进行紫花苜蓿组织培养，其愈伤组织易褐化、再生率低，针对其不足，
发明内容：
本发明的目的在于提供一种通过添加TDZ和连续继代实现紫花苜蓿高效组织培养再生的方法。
本发明的目的由如下技术方案实施：紫花苜蓿高效组织培养再生的方法，其依次包括有如下步骤：(1)无菌苗的培养；(2)将紫花苜蓿无菌苗叶片接种于愈伤诱导培养基中培养；(3)将愈伤组织转入继代培养基1中进行培养；(5)挑选生长状态好的愈伤组织转入分化培养基中进行分化培养；(6)待分化出苗后转入生根培养基中进行生根培养；在所述步骤(3)和步骤(5)之间增加步骤(4)，其中步骤(4)是将步骤(3)经愈伤组织转入继代培养基1中进行培养后，即将要长出绿色芽点的愈伤组织转入愈伤组织继代培养基2中进行继代培养5-8天；其中所述愈伤组织继代培养基2：MS+0.01-0.5mg/LTDZ+20g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，PH值：5.8-6.0。
术语解释：
TDZ为新型植物生长调节剂，TDZ(N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲)能够诱导外植体从愈伤组织形成到体细胞胚胎发生的一系列不同反应，具有植物细胞生长素和植物细胞分裂素的双重功效作用的特殊功能，在组织培养中TDZ通过单独或与其它生长调节物质共同对植物细胞起作用。
本发明的优点在于：本发明通过添加合适剂量的TDZ和连续继代实现了紫花苜蓿组织培养中植株的高效再生，应用本发明方法可以提高紫花苜蓿愈伤组织分化率，比现有技术的分化率平均高出12.3％。该方法操作简单、植株再生成功率高。本发明为进一步利用基因工程对其进行遗传改良奠定了基础。
附图说明：
图1为紫花苜蓿高效组织培养再生的方法的工艺流程图。
具体实施方式：
实施例1：紫花苜蓿高效组织培养再生的方法，其依次包括有如下步骤：
(1)无菌苗的培养；选择饱满、种皮完整无破损的优良紫花苜蓿种子，自来水冲洗种子30min，70％的酒精消毒1min，无菌水漂洗30s，然后转入20％的次氯酸钠中消毒20min，再用无菌水冲洗5次，用灭菌滤纸吸干种子表面的液体后接种到用于无菌苗培养的培养基中，培养至长出无菌苗。培养条件为：温度25℃，光照时间16h/d，光照强度1000-2000Lux；无菌苗培养基为：大量元素减半的MS(配方见附表1)(简称1/2MS)培养基+20g/L蔗糖+7.5g/L琼脂。
(2)将紫花苜蓿无菌苗叶片接种于愈伤诱导培养基中培养：将无菌苗的叶片从中脉剪开，接种到愈伤组织诱导培养基上进行培养20-30d。培养条件为：温度25℃，光照时间16h/d，光照强度1000-2000Lux；诱导培养基为：SH(配方见附表2)+4.0mg/L 2，4-D+0.5mg/L6-BA+20g/L蔗糖+7.5g/L琼脂。
(3)将愈伤组织转入继代培养基1中进行培养；愈伤组织产生后转移到继代培养基1中进行继代培养20-30d。培养条件为：温度25℃，光照时间16h/d，光照强度1000-2000Lux；继代培养基1为：MSO(配方见附表3)+0.5mg/LNAA+0.5mg/L 6-BA+1.0mg/LAgNO3+20g/L蔗糖+7.5g/L琼脂。
(4)将要长出绿色芽点的愈伤组织转入愈伤组织继代培养基2中进行继代培养5-8天；培养条件为：温度25℃，光照时间16h/d，光照强度1000-2000Lux；其中愈伤组织继代培养基2：MS+0.01mg/LTDZ+20g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，PH值：5.8-6.0；
(5)挑选生长状态好的愈伤组织转入分化培养基中进行分化培养：将继代培养II后的愈伤组织转接到分化培养基上培养，直至分化出苗，每15d继代一次。培养条件为：温度25℃，光照时间16h/d，光照强度1000-2000Lux；分化培养基为：MS+20g/L蔗糖+7.5g/L琼脂。
(6)待分化出苗后转入生根培养基中进行生根培养：待小苗长至3-5cm时转入生根培养基中培养。培养条件为：温度25℃，光照时间16h/d，光照强度1000-2000Lux；生根培养基为：1/2MS+20g/L蔗糖+7.5g/L琼脂。
其中附表1
MS基本培养基成分
Figure BSA00000254855200031
附表2
SH基本培养基成分
Figure BSA00000254855200042
附表3
MSO基本培养基成分
Figure BSA00000254855200051
实施例2：培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于步骤(4)中愈伤组织继代培养基2为MS+0.05mg/LTDZ+20g/L蔗糖+7.5g/L琼脂。
实施例3：培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于愈伤组织继代培养基2为MS+0.1mg/LTDZ+20g/L蔗糖+7.5g/L琼脂。
实施例4：培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于愈伤组织继代培养基2为MS+0.3mg/LTDZ+20g/L蔗糖+7.5g/L琼脂。
实施例5：培养程序均按实施例1进行，所不同之处在于愈伤组织继代培养基2为MS+0.5mg/L TDZ+20g/L蔗糖+7.5g/L琼脂。
实施例6：本发明和现有技术对紫花苜蓿组织培养再生的对比
1.1材料与方法
(1)本实验选用紫花苜蓿的四个品种“中苜1号”、“公农1号”、“猎人河”和“WL-323”为供试材料。按照实施例1，实施例2，实施例3，实施例4和实施例5的紫花苜蓿组织培养再生方法进行培养，待分化出小苗后转入生根培养基中生根之后进行结果分析。
(2)同时选取上述四种紫花苜蓿品种，培养程序均按实施例1进行，所不同之处是不进行实施例1中(4)步骤，待分化出小苗后转入生根培养基中生根之后进行结果分析。
1.2两种方法对紫花苜蓿组织培养再生的影响(如下表)
Figure BSA00000254855200061
从表中可以看出，四种紫花苜蓿经过在不同的愈伤组织继代培养基2中培养过后，分化率都有所提高，采用本发明的技术方法比现有技术的分化率平均提高了12.3％。

Claims (1)

1.紫花苜蓿高效组织培养再生的方法，其依次包括有如下步骤：(1)无菌苗的培养；(2)将紫花苜蓿无菌苗叶片接种于愈伤诱导培养基中培养；(3)将愈伤组织转入继代培养基1中进行培养；(5)挑选生长状态好的愈伤组织转入分化培养基中进行分化培养；(6)待分化出苗后转入生根培养基中进行生根培养；其特征在于：在所述步骤(3)和步骤(5)之间增加步骤(4)，其中步骤(4)是将步骤(3)经愈伤组织转入继代培养基1中进行培养后，即将要长出绿色芽点的愈伤组织转入愈伤组织继代培养基2中进行继代培养5-8天；其中所述愈伤组织继代培养基2：MS+0.01-0.5mg/LTDZ+20g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，PH值：5.8-6.0。
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