CN103843663B - 一种促进苜蓿组培苗生根的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进苜蓿组培苗生根的方法，包括如下步骤：（A）制备中空圆柱体状的固体生根培养基（1）；（B）将组培获得的苜蓿幼苗接种在所述固体生根培养基（1）的上端面上，并使所述苜蓿幼苗的根沿所述中空圆柱体状固体生根培养基（1）的内壁向下半悬空生长；（C）接种后采用封口膜封口，放入组培室中进行生根培养，1-2周后待苜蓿幼苗的根长至5cm以上，炼苗、移栽。本发明所述的促进苜蓿组培苗快速生根的方法第一次通过特定结构的固体培养基进行苜蓿组培苗半悬空生根培养，并通过选择合适的生根培养基和生根剂，建立了一种高效的苜蓿生根培养体系。解决了苜蓿组培苗生根慢、侧根少、根系不发达、移栽成活率低等难题。

Description

一种促进苜蓿组培苗生根的方法
技术领域
本发明涉及组织培养技术领域，特别是涉及一种促进苜蓿组培苗快速生根的方法。
背景技术
苜蓿是豆科苜蓿属（Medicago）植物的通称，为一年生或多年生开花植物。苜蓿种类繁多，其中最著名的是作为牧草的紫花苜蓿（Medicago sativa）和作为豆科模式植物的蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）。紫花苜蓿为多年生植物，有牧草之王的美誉，全世界紫花苜蓿种植面积超过千万公顷，年产紫花苜蓿干草超过2亿吨，其蛋白含量非常丰富，是饲喂奶牛的最佳牧草。紫花苜蓿也可作为蔬菜供人食用，其营养价值很高，具有清脾胃、利大小肠、下膀胱结石的功效，含有最丰富的维生素K，高于绝大多数蔬菜。蒺藜苜蓿植株较为矮小，作为牧草的利用价值不高，但由于其生长周期较短，基因组较小，自花授粉等特点，主要作为研究豆科植物的一种重要模式植物，目前其基因组已完成测序。
近年来随着紫花苜蓿和蒺藜苜蓿相关研究的深入，苜蓿组培技术越来越多的应用于苜蓿育种、苜蓿突变体诱变、农杆菌介导苜蓿转基因等研究过程中。苜蓿组培苗在一般固体生根培养基中都表现出生根率低、生长缓慢、侧根较少等缺点，导致苜蓿组培苗生根阶段时间长、步骤繁琐、移栽成活率低等问题，进而影响苜蓿组培苗（或农杆菌介导转基因苗）的获得效率。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种快速高效、操作简单、成本低廉并使苜蓿组培周期大大缩短的苜蓿组培苗快速生根的方法。
一种促进苜蓿组培苗生根的方法，包括如下步骤：
步骤（A）、制备中空圆柱体状的固体生根培养基；
步骤（B）、将苜蓿愈伤组织分化获得的无根或刚长出少许根的幼芽接种在所述生根培养基的上端面上，并使所述苜蓿幼苗的根沿所述空中圆柱体状生根培养基的内壁向下半悬空生长；
步骤（C）、接种后采用封口膜封口，放入组培室中进行生根培养，1-2周后待苜蓿幼苗的根长至5cm以上，炼苗、移栽。
本发明所述的促进苜蓿组培苗生根的方法，其中所述生根培养基为含9%琼脂的1/2SH9固体生根培养基，pH值为5.8，其中含有采用75%的酒精配制的1mg/mL的吲哚丁酸，所述吲哚丁酸在所述固体培养基在高温液体状态时的浓度为0.2～0.4mg/L。
本发明所述的促进苜蓿组培苗生根的方法，其中所述中空圆柱体状的固体生根培养基的制备方法包括如下步骤：
步骤（a）、准备生根培养基制备装置：所述生根培养基制备装置包括：顶部开口的组培管，所述组培管的底部同轴设置有环形凸部，其外径小于所述组培管的内径；中空管，其长度大于所述组培管的长度，所述中空管的外径小于等于所述环形凸部的内径；实心棒，其与所述中空管同轴设置，所述实心棒的长度大于所述中空管的长度，所述实心棒的直径小于等于所述中空管的内径；将所述中空管嵌入到所述环形凸部内，将所述实心棒插入到所述中空管内，采用封口膜将整个组装好的组培管封口，121℃高温灭菌20分钟；
步骤（b）、配制含9%琼脂的1/2SH9液体培养基，pH值为5.8，121℃高温灭菌20分钟冷却至60-80℃后加入75%酒精溶解配制的1mg/mL的吲哚丁酸至终浓度为0.2～0.4mg/L，揭开所述组装好的组培管的封口膜，将所述液体培养基倒入所述中空管和所述组培管之间的空隙内，放置12小时以上待所述液体培养基凝固后依次将所述实心棒和中空管拔出，得到固体生根培养基，其高度为所述组培管高度的1/2～3/5。
本发明所述的促进苜蓿组培苗生根的方法，其中所述组培管、所述中空管和所述实心棒均由玻璃材质制成。
本发明所述的促进苜蓿组培苗生根的方法，其中所述生根培养基制备装置中，所述环形凸部的高度为5mm，所述组培管的高度为15mm，所述中空管的高度为16mm，所述实心棒的高度为17mm。
本发明所述的促进苜蓿组培苗生根的方法，其中所述组培管的外径为64mm，内径为60mm，所述环形凸部的外径为40mm，内径为36mm，所述中空管的外径为35mm，内径为6mm，所述实心棒的直径为5mm。
本发明所述的促进苜蓿组培苗生根的方法，其中所述步骤（C）中的生根培养条件为：培养温度为白天24℃，夜晚20℃，光照时间为14h/d，光照强度为2500-3000Lx，炼苗湿度为75%，炼苗时间为2-3天，再移入温室土壤中或置于人工气候箱中继续生长。
本发明所述的促进苜蓿组培苗生根的方法，其中每个所述组培管中可移入4～10棵1～2cm高的待生根苜蓿幼苗。
本发明所述促进苜蓿组培苗生根的方法与现有技术不同之处在于：
本发明的促进苜蓿组培苗快速生根的方法通过选择了合适的生根培养基和最佳生根剂浓度，第一次通过特定圆柱形中空结构固体培养基将苜蓿组培幼苗进行垂直半悬空生根培养，建立了一种苜蓿组培苗的快速高效生根培养体系，具有如下优点：
①选择的生根培养基和生根激素对苜蓿组培苗生根具有很好的适应性，生根率达到95%以上，与常规内埋式生根方法相比，此方法能使苜蓿组培苗生根时间缩短至1-2周，生根培养2周后组培苜蓿幼苗根基本达到5cm以上，根生长速度是普通生根方法的2-5倍；
②该方法获得的苜蓿幼苗主根和侧根发育良好，特别是主根粗壮，侧根发达，幼苗健壮，移栽成活率达到90%以上。
③该方法解决了苜蓿组培幼苗在普通生根培养基中內埋式生长时由于氧气缺乏而生长缓慢、根系短小、侧根稀少等问题；
④该方法操作简单，将刚长出的无菌组培幼苗在无菌环境下直接移入生根组培管中进行生根培养，只需一次移苗生根培养，生根时间短，生根质量好，具有高效、经济、简洁、快速等特点，大幅度提高了苜蓿组培苗的繁殖速度和质量，为大规模的苜蓿组培和农杆菌介导转基因提供了保障。
本发明所述方法中的生根培养系统第一次通过特定圆柱形中空结构的固体培养基将植物组培幼苗接种在所述中空圆柱体状固体培养基的上端面，使大部分根裸露在外，不与培养基接触，进行垂直半悬空生根培养，传统培养基为容器底部的具有一定厚度的培养基，接种时植物的根系要全部插入培养基中，生根缓慢、根系短小、侧根稀少，本发明选择了中空圆柱体状的生根培养基，实现了植物组培幼苗半悬空生长，大大增加生根率和加快生根速度，组培苗根系发育良好，主根粗壮，侧根发达，建立了一种组培苗的快速高效生根培养体系。
本发明中采用了特制的制备生根培养基的专用设备，包括组培管、中空管和实心棒，组培管的底部同轴设置有环形凸部，起到限位作用，可以防止中空管的左右晃动，使用中空管和实心棒两个部分形成中空结构的优点是：防止在拔出过程中底部形成负压，如只有一个实心棒，拔出困难，同时会造成培养基的破坏，采用中空管和实心棒配合的结构，先抽离实心棒，空气会进入中空管的中心，在拔出中空管的时候就不会在底部形成负压破坏培养基，同时使中空管更容易拔出。采用本发明中的专用设备制备中空圆柱体状的固体生根培养基，具有操作简单、成本低廉、快速高效并大大缩短植物组培苗生根培养周期的特点，进而大幅度提高了植物组培苗移栽成活率。
下面结合附图对本发明的促进苜蓿组培苗生根的方法作进一步说明。
附图说明
图1为本发明中的中空圆柱体状的固体生根培养基的剖面图；
图2为图1的立体图；
图3为本发明中组培管的剖面图；
图4为图3的俯视图；
图5为本发明中的中空管的剖面图；
图6为图5的俯视图；
图7为本发明中实心棒的剖面图。
具体实施方式
实施例1
一种促进苜蓿组培苗生根的方法，包括如下步骤：
步骤（A）、制备如图1和图2所示的中空圆柱体状的固体生根培养基1；
步骤（B）、将苜蓿愈伤组织分化获得的无根或刚长出少许根幼芽接种在所述固体生根培养基1的上端面上，并使所述苜蓿幼苗的根沿所述中空圆柱体状固体生根培养基1的内壁向下半悬空生长；
步骤（C）、接种后采用封口膜封口，放入组培室中进行生根培养，1-2周后待苜蓿幼苗的根长至5cm以上，炼苗、移栽。
实施例2
步骤（A）、制备如图1和图2所示的中空圆柱体状的固体生根培养基1；固体生根培养基1为含9%琼脂的1/2SH9培养基，pH值为5.8，其中各营养成分浓度如表1。
表11/2SH9固体生根培养基配方
化合物 浓度
MgSO4·7H2O 0.375mM
KNO3 14mM
(NH4)2SO4 1.75mM
CaCl2·2H2O 0.55mM
KH2PO4 1.5mM
MnSO4·H2O 3μM
 
H3BO3 40μM
ZnSO4·7H2O 1.75μM
KI 3μM
Na2MoO4·2H2O 0.5μM
CuSO4·5H2O 0.4μM
CoCl2·6H2O 0.2μM
烟酸 20μM
维生素B1 7.5μM
维生素B6 12μM
FeSO4 0.19mM
肌醇 0.275mM
蔗糖 1%
琼脂 0.9%
在固体生根培养基1中含有采用75%的酒精配制的1mg/mL的吲哚丁酸，吲哚丁酸在固体生根培养基1在高温液体状态时的终浓度为0.4mg/L。中空圆柱体状的固体生根培养基1的制备方法包括如下步骤：
准备生根培养基制备装置：如图3～图7所示，生根培养基制备装置包括：顶部开口的组培管2，组培管2的底部同轴设置有环形凸部3，其外径小于组培管2的内径；中空管4，其长度大于组培管2的长度，中空管4的外径小于等于环形凸部3的内径；实心棒5，其长度大于中空管4的长度，实心棒5与中空管4同轴，且实心棒5的直径小于等于中空管4的内径；将中空管4嵌入到环形凸部3内，再将实心棒5插入到中空管4内，采用封口膜将整个组装好的组培管封口，121℃高温灭菌20分钟；组培管2、中空管4和实心棒5均由玻璃材质制成，生根培养基制备装置中，环形凸部3的高度为5mm，组培管2的高度为15mm，中空管4的高度为16mm，实心棒5的高度为17mm，组培管2的外径为64mm，内径为60mm，环形凸部3的外径为40mm，内径为36mm，中空管4的外径为35mm，内径为6mm，实心棒5的直径为5mm。
配制含9%琼脂的1/2SH9液体培养基，pH值为5.8，121℃高温灭菌20分钟冷却至60-80℃后加入75%酒精溶解配制的1mg/mL的吲哚丁酸至终浓度为0.4mg/L，揭开组装好的组培管的封口膜，将液体培养基倒入中空管4和组培管2之间的空隙内，放置12小时以上待液体培养基凝固后依次将实心棒5和中空管4拔出，得到固体生根培养基1，其高度为组培管2高度的1/2。
步骤（B）、将苜蓿愈伤组织分化获得的无根或刚长出少许根幼芽接种在固体生根培养基1的上端面上，并使苜蓿幼苗的根沿中空圆柱体状固体生根培养基1的内壁向下半悬空生长，使苜蓿幼苗既能接触到培养基吸收营养，又能使其绝大部分的根悬空生长，有自由伸展的空间，同时也不会影响叶的生长。
步骤（C）、接种后采用封口膜封口，放入组培室中进行生根培养，1-2周后待苜蓿幼苗的根长至5cm以上，炼苗、移栽，在每个组培管2中的固体生根培养基1上接种6棵1～2cm高的苜蓿幼苗，生根培养条件为：培养温度为白天24℃，夜晚20℃，光照时间为14h/d，光照强度为2500-3000Lx，炼苗湿度为75%，炼苗时间为2-3天，再移入温室土壤中或置于人工气候箱中继续生长。
实施例3
与实施例2的区别在于：吲哚丁酸在固体生根培养基1在高温液体状态时的终浓度为0.2mg/L，固体生根培养基1，其高度为组培管2高度的3/5，在每个组培管2中的固体生根培养基1上接种4棵1～2cm高的待生根苜蓿幼苗，其他同实施例2。
表2为以蒺藜苜蓿组培苗生根为例，使用本发明方法和常规内埋式生根方法的比较；
表2蒺藜苜蓿组培苗生根培养2周后两种生根方法的效果比较
生根方法 生根率 根生长速度 主根平均长度 侧根数 茎叶高度 移栽成活率
本发明方法 95% 30mm/周 50mm 3～10根 50～80mm 90%
常规内埋式方法 55% 10mm/周 20mm 2～4根 20～40mm 40%
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种促进苜蓿组培苗生根的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤(A)、制备中空圆柱体状的固体生根培养基(1)；
步骤(B)、将苜蓿愈伤组织分化获得的无根或刚长出少许根幼芽接种在所述固体生根培养基(1)的上端面上，并使所述苜蓿幼苗的根沿所述中空圆柱体状固体生根培养基(1)的内壁向下半悬空生长；
步骤(C)、接种后采用封口膜封口，放入组培室中进行生根培养，1-2周后待苜蓿幼苗的根长至5cm以上，炼苗、移栽；
所述固体生根培养基(1)为含9％琼脂的1/2SH9培养基，pH值为5.8，其中含有采用75％的酒精配制的1mg/mL的吲哚丁酸，所述吲哚丁酸在所述固体生根培养基(1)在高温液体状态时的终浓度为0.2～0.4mg/L；
所述中空圆柱体状的固体生根培养基(1)的制备方法包括如下步骤：
步骤(a)、准备生根培养基制备装置：所述生根培养基制备装置包括：顶部开口的组培管(2)，所述组培管(2)的底部同轴设置有环形凸部(3)，其外径小于所述组培管(2)的内径；中空管(4)，其长度大于所述组培管(2)的长度，所述中空管(4)的外径小于等于所述环形凸部(3)的内径；实心棒(5)，其长度大于所述中空管(4)的长度，所述实心棒(5)与所述中空管(4)同轴，且所述实心棒(5)的直径小于等于所述中空管(4)的内径；将所述中空管(4)嵌入到所述环形凸部(3)内，再将所述实心棒(5)插入到所述中空管(4)内，采用封口膜将整个组装好的组培管封口，121℃高温灭菌20分钟；
步骤(b)、配制含9％琼脂的1/2SH9液体培养基，pH值为5.8，121℃高温灭菌20分钟冷却至60-80℃后在无菌组培超净工作台内，加入75％酒精溶解配制的1mg/mL的吲哚丁酸至终浓度为0.2～0.4mg/L，揭开所述组装好的组培管的封口膜，将所述液体培养基倒入所述中空管(4)和所述组培管(2)之间的空隙内，放置12小时以上待所述液体培养基凝固后依次将所述实心棒(5)和所述中空管(4)拔出，得到固体生根培养基(1)，其高度为所述组培管(2)高度的1/2～3/5。
2.根据权利要求1所述的促进苜蓿组培苗生根的方法，其特征在于：所述组培管(2)、所述中空管(4)和所述实心棒(5)均由玻璃材质制成。
3.根据权利要求2所述的促进苜蓿组培苗生根的方法，其特征在于：所述生根培养基制备装置中，所述环形凸部(3)的高度为5mm，所述组培管(2)的高度为15mm，所述中空管(4)的高度为16mm，所述实心棒(5)的高度为17mm。
4.根据权利要求3所述的促进苜蓿组培苗生根的方法，其特征在于：所述组培管(2)的外径为64mm，内径为60mm，所述环形凸部(3)的外径为40mm，内径为36mm，所述中空管(4)的外径为35mm，内径为6mm，所述实心棒(5)的直径为5mm。
5.根据权利要求1所述的促进苜蓿组培苗生根的方法，其特征在于：所述步骤(C)中的生根培养条件为：培养温度为白天24℃，夜晚20℃，光照时间为14h/d，光照强度为2500-3000Lx，炼苗湿度为75％，炼苗时间为2-3天，再移入温室土壤中或置于人工气候箱中继续生长。
6.根据权利要求1所述的促进苜蓿组培苗生根的方法，其特征在于：在每个所述组培管(2)中的固体生根培养基(1)上可接种4～10棵1～2cm高的苜蓿幼苗。
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