CN103385173A - 一种高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法，包括百合花苞的选择与剪取、花苞低温处理、花苞消毒处理、花药摘取与低温处理、花药接种、花药诱导萌发、胚状体芽根诱导培养、幼苗秋水仙素加倍处理以及幼苗驯化培养。其特征在于：选择生长状态较好且处于花粉发育单核期的黄精灵百合的花苞，将花苞剪下后放置在3-5℃冰箱中进行低温处理，然后对花苞进行消毒与低温处理，接着将消毒处理后的花药接种到改良MS培养基中诱导形成胚状体，待胚状体形成后将其转入到MZ培养基中进一步诱导分化形成芽、根，然后利用300mg/L-500mg/L秋水仙素对黄精灵幼苗进行加倍处理，得到二倍体幼苗，通过幼苗驯化培养处理，得到二倍体黄精灵百合。本发明利用花药离体培养，解决了百合杂交培育过程中优良性状丢失以及周期长等不利问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种百合花药离体培养的方法，具体涉及一种高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法。
背景介绍
黄精灵百合是百合种类中花朵较为鲜艳、美丽的一大类，其花朵能够散发出强烈的香味，尤其受到人们的追捧，目前在我国南方一些地区被人们广泛种植栽培，视为观赏类百合不可多得的品系。目前百合的繁殖方式主要通过扦插繁殖、分球繁殖以及组织培养方式繁殖，随着我国社会与经济的发展与进步，人们对身边的花卉越来越重视，百合的种植面积和数量迅速增加，但通过扦插繁殖和分球繁殖方式繁殖的百合一般容易受病毒等侵扰，致使其品质逐渐下降，往往一些优良性状得不到很好的传代而丢失，有报道称通过分球繁殖的百合其病毒病发病率可达到40%-50%。
现在随着植物组织培养技术的发展，通过组织培养获得脱毒百合的技术不断完善，越来越受到人们的广泛应用，例如申请号为201210050972.2的中国专利公开的“东方百合种球脱毒方法”，综合运营热处理脱毒、茎尖培养脱毒和愈伤组织脱毒的脱毒方法，获得脱毒种球。又如申请号为201110071320.2的中国专利中公开的“细叶百合的组织培养方法”，采用细叶百合的鳞茎作为外植体，经过脱分化、再分化培育出脱毒百合。但是这些方法虽然能够得到脱毒百合，但得到的百合大多数为杂交，后代可能会出现性状分离。如何得到遗传物质为纯合的黄精灵百合呢？因此需要寻求一种高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法。
发明内容
本发明的目的是针对上述百合在培育过程中易受病虫害侵扰、以及后代遗传物质不纯正等问题，提供了一种高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法。
为达到上述目的，本发明采取的技术方案为：一种高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法，其特征在于：包括百合花苞的选择与剪取、花苞低温处理与低温处理、花药接种与花药诱导培养、胚状体芽根诱导培养、幼苗秋水仙素加倍处理以及幼苗驯化培养。
所述的高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法，具体步骤如下：
a、百合花苞的选择、剪取与低温处理
选择生长状态较好且处于花粉发育单核期的黄精灵百合的花苞，将花苞剪下后放置在5℃冰箱中处理3天；
b、花苞消毒处理与低温处理
将低温处理后的花苞用无菌水冲洗3次，投入到0.1%升汞溶液中消毒10min，取出后在75%酒精中浸泡30s，用无菌水冲洗干净；接着在无菌环境中切开花苞，剥取花药，得到的花药在75%酒精中浸泡30s，后在0.1%升汞溶液中处理7min，然后在5℃冰箱中处理3天；
c、花药接种与花药诱导培养
将低温处理后的花药接种在诱导愈伤组织形成的改良MS培养基中，每瓶培养基中加入花药10-15粒，置于人工气候培养箱中培养；所述培养条件为黑暗培养，温度为27℃，相对湿度为70%，接种4-5周后花药萌发形成黄白色、较小、生长缓慢的胚状体；
d、胚状体芽根诱导培养
胚状体形成后，将其分别转入MZ1培养基中继续培养诱导其根、芽生长，先诱导胚状体芽分化生长，然后再诱导其根分化生长，培养条件：光照为2000lux，15hr/d，27℃，相对湿度为70%下培养；先培养2-3周后，待胚状体嫩芽长出后，将胚状体转移到MZ2培养基，其他培养条件不变；在MZ2培养基培养2周左右，胚状体即长出新根；
e、幼苗秋水仙素加倍处理
将诱导培养长出新芽新根的胚状体从培养基中取出，置于添加有300mg/L-500mg/L秋水仙素的不含凝固剂琼脂的液体改良MS培养基中，放在温度为25℃的摇床中，40转/分钟振荡培养2天左右；加倍处理后，将胚状体取出后，用无菌水反复冲洗3次，洗去胚状体上沾有的秋水仙素，将胚状体接种到新的改良MS培养基中继续培养，培养条件：光照为2000lux，15hr/d，27℃，相对湿度为70%下培养；
f、幼苗驯化培养
当幼苗株高长到5cm-8cm，具有5-6个根时，将植物组织培养瓶的无菌瓶盖打开，将组织培养瓶从人工气候培养箱中拿出放在光照培养架上培养，逐渐将室内恒温空调关闭，连续驯化一周左右，然后将组培幼苗从组培瓶中移出，转移到灭菌后的百合营养花卉培养土中，移至室外遮阳网下生长，处理1-2周后，将生长健壮的百合苗移栽到土壤中，定期浇水、施肥处理，关注植株的生长状态。
所述改良MS培养基的配方为：NH4NO3 为1300 mg/L，KNO3为900 mg/L，CaCl2·2H2O为350 mg/L，MgSO4·7H2O为370 mg/L，KH2PO4为175 mg/L，KI为0.83 mg/L，H3BO3为6.2 mg/L，MnSO4·4H2O为22.3 mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.25 mg/L，CuSO4·5H2O为0.023 mg/L，CoCl2·6H2O为0.023 mg/L，FeSO4·7H2O为28.1 mg/L，Na2-EDTA·2H2O为37.3 mg/L，肌醇200 mg/L，烟酸0.5 mg/L，盐酸硫胺素0.1 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，生长素类物质为1.5-2.0mg/L，细胞分裂素类物质为1.5-2.0mg/L，蔗糖10g/L，琼脂条10g/L，pH为5.8。
所述MZ1培养基的配方为：NH4NO3 为1300 mg/L，KNO3为900 mg/L，CaCl2·2H2O为350 mg/L，MgSO4·7H2O为370 mg/L，KH2PO4为175 mg/L，KI为0.83 mg/L，H3BO3为6.2 mg/L，MnSO4·4H2O为22.3 mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.25 mg/L，CuSO4·5H2O为0.023 mg/L，CoCl2·6H2O为0.023 mg/L，FeSO4·7H2O为28.1 mg/L，Na2-EDTA·2H2O为37.3 mg/L，肌醇200 mg/L，烟酸0.5 mg/L，盐酸硫胺素0.1 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，细胞分裂素类物质为0.5-1.5mg/L，蔗糖5g/L，琼脂条10g/L，pH为5.8。
所述MZ2培养基的配方为：NH4NO3 为1300 mg/L，KNO3为900 mg/L，CaCl2·2H2O为350 mg/L，MgSO4·7H2O为370 mg/L，KH2PO4为175 mg/L，KI为0.83 mg/L，H3BO3为6.2 mg/L，MnSO4·4H2O为22.3 mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.25 mg/L，CuSO4·5H2O为0.023 mg/L，CoCl2·6H2O为0.023 mg/L，FeSO4·7H2O为28.1 mg/L，Na2-EDTA·2H2O为37.3 mg/L，肌醇200 mg/L，烟酸0.5 mg/L，盐酸硫胺素0.1 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，生长素类物质为0.5-1.5mg/L，蔗糖5g/L，琼脂条10g/L，pH为5.8。
所述细胞分裂素物质为玉米素、还有玉米素核苷、二氢玉米素、异戊烯基腺嘌呤、激动素、6-苄基腺嘌呤、四氢吡喃苄基腺嘌呤、二苯脲或KT-30中的任意一种或几种的组合。
所述生长素类物质为6-苄氨基嘌呤、吲哚乙酸、吲哚丙酸、吲哚丁酸，萘乙酸、萘乙酸钠、萘氧乙酸、萘乙酰胺、2,4-D、2,4,5-T、4-碘苯氧乙酸或2,4-D丁酯中的任意一种或几种的组合。
本发明所述的一种高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法，与现有技术相比其有益效果为：
1、通过升汞和70%-75%酒精联合使用，能够有效对外植体进行消毒处理，大大提高实验成功率；
2、设计了一种黄精灵百合的诱导胚状体形成的改良MS培养基，通过改变生长素种类以及细胞分裂素的种类组合，能够有效地提高了愈伤组织形成的成功率，诱导花药萌发形成胚状体成功率基本保持在90%以上；
3、将花苞与花药进行低温处理，有效地提高花药萌发的几率，大大培育的成功率；
4、通过将胚状体移入到MZ1培养基中，将MZ1培养基培养基中只加入细胞分裂素，能够加速胚状体的新芽形成，同时一段时间后将长出新芽的胚状体转入MZ2培养基中，MZ2培养基中只加入生长素，能够加速胚状体新根的形成，这样有目的性地促进黄精灵幼苗的形成；
5、利用300mg/L-500mg/L秋水仙素对已分化形成芽、根的胚状体遗传物质进行加倍处理，使细胞内遗传物质加倍，同时使形成的幼苗变成二倍体，且为纯合体，避免后代发生性状分离，同时相对杂交育种，能够大大缩短育种周期；
6、通过对幼苗的驯化培养处理，后代的成活率大大提高；
7、通过花药离体组织培养法获得的黄精灵百合纯合二倍体幼苗经历了严格的无菌操作处理，避免的病虫害的侵扰，使其品质不会出现大幅度的下降，同时一些优良性状会一直保留下来。
具体实施方式
以下结合具体实施方式，对本发明进行详细说明。
实施例1
一种高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法，具体步骤如下：
a、 百合花苞的选择、剪取与低温处理
选择生长状态较好且处于花粉发育单核期的黄精灵百合的花苞，将花苞剪下后放置在5℃冰箱中处理3天；
b、花苞消毒处理与低温处理
将低温处理后的花苞用无菌水冲洗3次，投入到0.1%升汞溶液中消毒10min，取出后在75%酒精中浸泡30s，用无菌水冲洗干净；接着在无菌环境中切开花苞，剥取花药，得到的花药在75%酒精中浸泡30s，后在0.1%升汞溶液中处理7min，然后在5℃冰箱中处理3天；
c、花药接种与花药诱导培养
将低温处理后的花药接种在诱导愈伤组织形成的改良MS培养基中，每瓶培养基中加入花药10-15粒，置于人工气候培养箱中培养；所述培养条件为黑暗培养，温度为27℃，相对湿度为70%，接种4-5周后花药萌发形成黄白色、较小、生长缓慢的胚状体；
d、胚状体芽根诱导培养
胚状体形成后，将其分别转入MZ1培养基中继续培养诱导其根、芽生长，先诱导胚状体芽分化生长，然后再诱导其根分化生长，培养条件：光照为2000lux，15hr/d，27℃，相对湿度为70%下培养；先培养2-3周后，待胚状体嫩芽长出后，将胚状体转移到MZ2培养基，其他培养条件不变；在MZ2培养基培养2周左右，胚状体即长出新根；
e、幼苗秋水仙素加倍处理
将诱导培养长出新芽新根的胚状体从培养基中取出，置于添加有300mg/L秋水仙素的不含凝固剂琼脂的液体改良MS培养基中，放在温度为25℃的摇床中，40转/分钟振荡培养2天左右；加倍处理后，将胚状体取出后，用无菌水反复冲洗3次，洗去胚状体上沾有的秋水仙素，将胚状体接种到新的改良MS培养基中继续培养，培养条件：光照为2000lux，15hr/d，27℃，相对湿度为70%下培养；
f、幼苗驯化培养
当幼苗株高长到5cm，具有5个根时，将植物组织培养瓶的无菌瓶盖打开，将组织培养瓶从人工气候培养箱中拿出放在光照培养架上培养，逐渐将室内恒温空调关闭，连续驯化一周左右，然后将组培幼苗从组培瓶中移出，转移到灭菌后的百合营养花卉培养土中，移至室外遮阳网下生长，处理1周后，将生长健壮的百合苗移栽到土壤中，定期浇水、施肥处理，关注植株的生长状态。最终，植株成活率为94.1%
所述改良MS培养基的配方为：NH4NO3 为1300 mg/L，KNO3为900 mg/L，CaCl2·2H2O为350 mg/L，MgSO4·7H2O为370 mg/L，KH2PO4为175 mg/L，KI为0.83 mg/L，H3BO3为6.2 mg/L，MnSO4·4H2O为22.3 mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.25 mg/L，CuSO4·5H2O为0.023 mg/L，CoCl2·6H2O为0.023 mg/L，FeSO4·7H2O为28.1 mg/L，Na2-EDTA·2H2O为37.3 mg/L，肌醇200 mg/L，烟酸0.5 mg/L，盐酸硫胺素0.1 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，萘乙酸0.5mg/L，6-苄氨基嘌呤0.5mg/L，2,4-D 1.0mg/L，二氢玉米素0.6mg/L，激动素0.7mg/L和二苯脲0.7mg/L，蔗糖10g/L，琼脂条10g/L，pH为5.8。
所述MZ1培养基的配方为：NH4NO3 为1300 mg/L，KNO3为900 mg/L，CaCl2·2H2O为350 mg/L，MgSO4·7H2O为370 mg/L，KH2PO4为175 mg/L，KI为0.83 mg/L，H3BO3为6.2 mg/L，MnSO4·4H2O为22.3 mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.25 mg/L，CuSO4·5H2O为0.023 mg/L，CoCl2·6H2O为0.023 mg/L，FeSO4·7H2O为28.1 mg/L，Na2-EDTA·2H2O为37.3 mg/L，肌醇200 mg/L，烟酸0.5 mg/L，盐酸硫胺素0.1 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，二氢玉米素0.2mg/L，激动素0.3mg/L，二苯脲0.3mg/L0.5-1.5mg/L，蔗糖5g/L，琼脂条10g/L，pH为5.8。
所述MZ2培养基的配方为：NH4NO3 为1300 mg/L，KNO3为900 mg/L，CaCl2·2H2O为350 mg/L，MgSO4·7H2O为370 mg/L，KH2PO4为175 mg/L，KI为0.83 mg/L，H3BO3为6.2 mg/L，MnSO4·4H2O为22.3 mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.25 mg/L，CuSO4·5H2O为0.023 mg/L，CoCl2·6H2O为0.023 mg/L，FeSO4·7H2O为28.1 mg/L，Na2-EDTA·2H2O为37.3 mg/L，肌醇200 mg/L，烟酸0.5 mg/L，盐酸硫胺素0.1 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，萘乙酸0.2mg/L，6-苄氨基嘌呤0.3mg/L，2,4-D 0.3mg/L 0.5-1.5mg/L，蔗糖5g/L，琼脂条10g/L，pH为5.8。
实施例2
一种高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法，具体步骤如下：
b、 百合花苞的选择、剪取与低温处理
选择生长状态较好且处于花粉发育单核期的黄精灵百合的花苞，将花苞剪下后放置在5℃冰箱中处理3天；
b、花苞消毒处理与低温处理
将低温处理后的花苞用无菌水冲洗3次，投入到0.1%升汞溶液中消毒10min，取出后在75%酒精中浸泡30s，用无菌水冲洗干净；接着在无菌环境中切开花苞，剥取花药，得到的花药在75%酒精中浸泡30s，后在0.1%升汞溶液中处理7min，然后在5℃冰箱中处理3天；
c、花药接种与花药诱导培养
将低温处理后的花药接种在诱导愈伤组织形成的改良MS培养基中，每瓶培养基中加入花药10-15粒，置于人工气候培养箱中培养；所述培养条件为黑暗培养，温度为27℃，相对湿度为70%，接种4-5周后花药萌发形成黄白色、较小、生长缓慢的胚状体；
d、胚状体芽根诱导培养
胚状体形成后，将其分别转入MZ1培养基中继续培养诱导其根、芽生长，先诱导胚状体芽分化生长，然后再诱导其根分化生长，培养条件：光照为2000lux，15hr/d，27℃，相对湿度为70%下培养；先培养2-3周后，待胚状体嫩芽长出后，将胚状体转移到MZ2培养基，其他培养条件不变；在MZ2培养基培养2周左右，胚状体即长出新根；
e、幼苗秋水仙素加倍处理
将诱导培养长出新芽新根的胚状体从培养基中取出，置于添加有500mg/L秋水仙素的不含凝固剂琼脂的液体改良MS培养基中，放在温度为25℃的摇床中，40转/分钟振荡培养2天左右；加倍处理后，将胚状体取出后，用无菌水反复冲洗3次，洗去胚状体上沾有的秋水仙素，将胚状体接种到新的改良MS培养基中继续培养，培养条件：光照为2000lux，15hr/d，27℃，相对湿度为70%下培养；
f、幼苗驯化培养
当幼苗株高长到8cm，具有6个根时，将植物组织培养瓶的无菌瓶盖打开，将组织培养瓶从人工气候培养箱中拿出放在光照培养架上培养，逐渐将室内恒温空调关闭，连续驯化一周左右，然后将组培幼苗从组培瓶中移出，转移到灭菌后的百合营养花卉培养土中，移至室外遮阳网下生长，处理2周后，将生长健壮的百合苗移栽到土壤中，定期浇水、施肥处理，关注植株的生长状态。最终，植株成活率为95.4%
所述改良MS培养基的配方为：NH4NO3 为1300 mg/L，KNO3为900 mg/L，CaCl2·2H2O为350 mg/L，MgSO4·7H2O为370 mg/L，KH2PO4为175 mg/L，KI为0.83 mg/L，H3BO3为6.2 mg/L，MnSO4·4H2O为22.3 mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.25 mg/L，CuSO4·5H2O为0.023 mg/L，CoCl2·6H2O为0.023 mg/L，FeSO4·7H2O为28.1 mg/L，Na2-EDTA·2H2O为37.3 mg/L，肌醇200 mg/L，烟酸0.5 mg/L，盐酸硫胺素0.1 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，萘乙酰胺0.4mg/L，吲哚丁酸0.6mg/L，2,4-D 1.0mg/L，四氢吡喃苄基腺嘌呤0.7mg/L，6-苄基腺嘌0.7mg/L，KT-30为0.6mg/L，蔗糖10g/L，琼脂条10g/L，pH为5.8。
所述MZ1培养基的配方为：NH4NO3 为1300 mg/L，KNO3为900 mg/L，CaCl2·2H2O为350 mg/L，MgSO4·7H2O为370 mg/L，KH2PO4为175 mg/L，KI为0.83 mg/L，H3BO3为6.2 mg/L，MnSO4·4H2O为22.3 mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.25 mg/L，CuSO4·5H2O为0.023 mg/L，CoCl2·6H2O为0.023 mg/L，FeSO4·7H2O为28.1 mg/L，Na2-EDTA·2H2O为37.3 mg/L，肌醇200 mg/L，烟酸0.5 mg/L，盐酸硫胺素0.1 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，四氢吡喃苄基腺嘌呤0.3mg/L，6-苄基腺嘌0.3mg/L，KT-30为0.3mg/L，，蔗糖5g/L，琼脂条10g/L，pH为5.8。
所述MZ2培养基的配方为：NH4NO3 为1300 mg/L，KNO3为900 mg/L，CaCl2·2H2O为350 mg/L，MgSO4·7H2O为370 mg/L，KH2PO4为175 mg/L，KI为0.83 mg/L，H3BO3为6.2 mg/L，MnSO4·4H2O为22.3 mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.25 mg/L，CuSO4·5H2O为0.023 mg/L，CoCl2·6H2O为0.023 mg/L，FeSO4·7H2O为28.1 mg/L，Na2-EDTA·2H2O为37.3 mg/L，肌醇200 mg/L，烟酸0.5 mg/L，盐酸硫胺素0.1 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，萘乙酰胺0.3mg/L，吲哚丁酸0.3mg/L，2,4-D 0.3mg/L，蔗糖5g/L，琼脂条10g/L，pH为5.8。
实施例3
一种高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法，具体步骤如下：
c、 百合花苞的选择、剪取与低温处理
选择生长状态较好且处于花粉发育单核期的黄精灵百合的花苞，将花苞剪下后放置在5℃冰箱中处理3天；
b、花苞消毒处理与低温处理
将低温处理后的花苞用无菌水冲洗3次，投入到0.1%升汞溶液中消毒10min，取出后在75%酒精中浸泡30s，用无菌水冲洗干净；接着在无菌环境中切开花苞，剥取花药，得到的花药在75%酒精中浸泡30s，后在0.1%升汞溶液中处理7min，然后在5℃冰箱中处理3天；
c、花药接种与花药诱导培养
将低温处理后的花药接种在诱导愈伤组织形成的改良MS培养基中，每瓶培养基中加入花药10-15粒，置于人工气候培养箱中培养；所述培养条件为黑暗培养，温度为27℃，相对湿度为70%，接种4-5周后花药萌发形成黄白色、较小、生长缓慢的胚状体；
d、胚状体芽根诱导培养
胚状体形成后，将其分别转入MZ1培养基中继续培养诱导其根、芽生长，先诱导胚状体芽分化生长，然后再诱导其根分化生长，培养条件：光照为2000lux，15hr/d，27℃，相对湿度为70%下培养；先培养2-3周后，待胚状体嫩芽长出后，将胚状体转移到MZ2培养基，其他培养条件不变；在MZ2培养基培养2周左右，胚状体即长出新根；
e、幼苗秋水仙素加倍处理
将诱导培养长出新芽新根的胚状体从培养基中取出，置于添加有400mg/L秋水仙素的不含凝固剂琼脂的液体改良MS培养基中，放在温度为25℃的摇床中，40转/分钟振荡培养2天左右；加倍处理后，将胚状体取出后，用无菌水反复冲洗3次，洗去胚状体上沾有的秋水仙素，将胚状体接种到新的改良MS培养基中继续培养，培养条件：光照为2000lux，15hr/d，27℃，相对湿度为70%下培养；
f、幼苗驯化培养
当幼苗株高长到7cm，具有6个根时，将植物组织培养瓶的无菌瓶盖打开，将组织培养瓶从人工气候培养箱中拿出放在光照培养架上培养，逐渐将室内恒温空调关闭，连续驯化一周左右，然后将组培幼苗从组培瓶中移出，转移到灭菌后的百合营养花卉培养土中，移至室外遮阳网下生长，处理2周后，将生长健壮的百合苗移栽到土壤中，定期浇水、施肥处理，关注植株的生长状态。最终，植株成活率为96.2%
所述改良MS培养基的配方为：NH4NO3 为1300 mg/L，KNO3为900 mg/L，CaCl2·2H2O为350 mg/L，MgSO4·7H2O为370 mg/L，KH2PO4为175 mg/L，KI为0.83 mg/L，H3BO3为6.2 mg/L，MnSO4·4H2O为22.3 mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.25 mg/L，CuSO4·5H2O为0.023 mg/L，CoCl2·6H2O为0.023 mg/L，FeSO4·7H2O为28.1 mg/L，Na2-EDTA·2H2O为37.3 mg/L，肌醇200 mg/L，烟酸0.5 mg/L，盐酸硫胺素0.1 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，萘乙酸0.5mg/L，6-苄氨基嘌呤0.5mg/L，2,4-D 1.0mg/L、四氢吡喃苄基腺嘌呤0.7mg/L，6-苄基腺嘌0.7mg/L，KT-30为0.6mg/L，蔗糖10g/L，琼脂条10g/L，pH为5.8。
所述MZ1培养基的配方为：NH4NO3 为1300 mg/L，KNO3为900 mg/L，CaCl2·2H2O为350 mg/L，MgSO4·7H2O为370 mg/L，KH2PO4为175 mg/L，KI为0.83 mg/L，H3BO3为6.2 mg/L，MnSO4·4H2O为22.3 mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.25 mg/L，CuSO4·5H2O为0.023 mg/L，CoCl2·6H2O为0.023 mg/L，FeSO4·7H2O为28.1 mg/L，Na2-EDTA·2H2O为37.3 mg/L，肌醇200 mg/L，烟酸0.5 mg/L，盐酸硫胺素0.1 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，四氢吡喃苄基腺嘌呤0.2mg/L，6-苄基腺嘌0.3mg/L，KT-30为0.7mg/L，蔗糖5g/L，琼脂条10g/L，pH为5.8。
所述MZ2培养基的配方为：NH4NO3 为1300 mg/L，KNO3为900 mg/L，CaCl2·2H2O为350 mg/L，MgSO4·7H2O为370 mg/L，KH2PO4为175 mg/L，KI为0.83 mg/L，H3BO3为6.2 mg/L，MnSO4·4H2O为22.3 mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.25 mg/L，CuSO4·5H2O为0.023 mg/L，CoCl2·6H2O为0.023 mg/L，FeSO4·7H2O为28.1 mg/L，Na2-EDTA·2H2O为37.3 mg/L，肌醇200 mg/L，烟酸0.5 mg/L，盐酸硫胺素0.1 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，萘乙酸0.3mg/L，6-苄氨基嘌呤0.3mg/L，2,4-D 0.6mg/L，蔗糖5g/L，琼脂条10g/L，pH为5.8。
Claims (7)
1.一种高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法，其特征在于：包括百合花苞的选择与剪取、花苞低温处理与低温处理、花药接种与花药诱导培养、胚状体芽根诱导培养、幼苗秋水仙素加倍处理以及幼苗驯化培养。
2.根据权利要求1所述的高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法，其特征在于：具体步骤如下：
a百合花苞的选择、剪取与低温处理
选择生长状态较好且处于花粉发育单核期的黄精灵百合的花苞，将花苞剪下后放置在5℃冰箱中处理3天；
b花苞消毒处理与低温处理
将低温处理后的花苞用无菌水冲洗3次，投入到0.1%升汞溶液中消毒10min，取出后在75%酒精中浸泡30s，用无菌水冲洗干净；接着在无菌环境中切开花苞，剥取花药，得到的花药在75%酒精中浸泡30s，后在0.1%升汞溶液中处理7min，然后在5℃冰箱中处理3天；
c花药接种与花药诱导培养
将低温处理后的花药接种在诱导愈伤组织形成的改良MS培养基中，每瓶培养基中加入花药10-15粒，置于人工气候培养箱中培养；所述培养条件为黑暗培养，温度为27℃，相对湿度为70%，接种4-5周后花药萌发形成黄白色、较小、生长缓慢的胚状体；
d胚状体芽根诱导培养
胚状体形成后，将其分别转入MZ1培养基中继续培养诱导其根、芽生长，先诱导胚状体芽分化生长，然后再诱导其根分化生长，培养条件：光照为2000lux，15hr/d，27℃，相对湿度为70%下培养；先培养2-3周后，待胚状体嫩芽长出后，将胚状体转移到MZ2培养基，其他培养条件不变；在MZ2培养基培养2周左右，胚状体即长出新根；
e幼苗秋水仙素加倍处理
将诱导培养长出新芽新根的胚状体从培养基中取出，置于添加有300mg/L-500mg/L秋水仙素的不含凝固剂琼脂的液体改良MS培养基中，放在温度为25℃的摇床中，40转/分钟振荡培养2天左右；加倍处理后，将胚状体取出后，用无菌水反复冲洗3次，洗去胚状体上沾有的秋水仙素，将胚状体接种到新的改良MS培养基中继续培养，培养条件：光照为2000lux，15hr/d，27℃，相对湿度为70%下培养；
f幼苗驯化培养
当幼苗株高长到5cm-8cm，具有5-6个根时，将植物组织培养瓶的无菌瓶盖打开，将组织培养瓶从人工气候培养箱中拿出放在光照培养架上培养，逐渐将室内恒温空调关闭，连续驯化一周左右，然后将组培幼苗从组培瓶中移出，转移到灭菌后的百合营养花卉培养土中，移至室外遮阳网下生长，处理1-2周后，将生长健壮的百合苗移栽到土壤中，定期浇水、施肥处理，关注植株的生长状态。
3.根据权利要求2所述的高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法，其特征在于：所述改良MS培养基的配方为：NH4NO3 为1300 mg/L，KNO3为900 mg/L，CaCl2·2H2O为350 mg/L，MgSO4·7H2O为370 mg/L，KH2PO4为175 mg/L，KI为0.83 mg/L，H3BO3为6.2 mg/L，MnSO4·4H2O为22.3 mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.25 mg/L，CuSO4·5H2O为0.023 mg/L，CoCl2·6H2O为0.023 mg/L，FeSO4·7H2O为28.1 mg/L，Na2-EDTA·2H2O为37.3 mg/L，肌醇200 mg/L，烟酸0.5 mg/L，盐酸硫胺素0.1 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，生长素类物质为1.5-2.0mg/L，细胞分裂素类物质为1.5-2.0mg/L，蔗糖10g/L，琼脂条10g/L，pH为5.8。
4.根据权利要求2所述的高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法，其特征在于：所述MZ1培养基的配方为：NH4NO3 为1300 mg/L，KNO3为900 mg/L，CaCl2·2H2O为350 mg/L，MgSO4·7H2O为370 mg/L，KH2PO4为175 mg/L，KI为0.83 mg/L，H3BO3为6.2 mg/L，MnSO4·4H2O为22.3 mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.25 mg/L，CuSO4·5H2O为0.023 mg/L，CoCl2·6H2O为0.023 mg/L，FeSO4·7H2O为28.1 mg/L，Na2-EDTA·2H2O为37.3 mg/L，肌醇200 mg/L，烟酸0.5 mg/L，盐酸硫胺素0.1 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，细胞分裂素类物质为0.5-1.5mg/L，蔗糖5g/L，琼脂条10g/L，pH为5.8。
5.根据权利要求2所述的高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法，其特征在于：所述MZ2培养基的配方为：NH4NO3 为1300 mg/L，KNO3为900 mg/L，CaCl2·2H2O为350 mg/L，MgSO4·7H2O为370 mg/L，KH2PO4为175 mg/L，KI为0.83 mg/L，H3BO3为6.2 mg/L，MnSO4·4H2O为22.3 mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.25 mg/L，CuSO4·5H2O为0.023 mg/L，CoCl2·6H2O为0.023 mg/L，FeSO4·7H2O为28.1 mg/L，Na2-EDTA·2H2O为37.3 mg/L，肌醇200 mg/L，烟酸0.5 mg/L，盐酸硫胺素0.1 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，生长素类物质为0.5-1.5mg/L，蔗糖5g/L，琼脂条10g/L，pH为5.8。
6.根据权利要求2-5任一项所述的高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法，其特征在于：所述细胞分裂素物质为玉米素、还有玉米素核苷、二氢玉米素、异戊烯基腺嘌呤、激动素、6-苄基腺嘌呤、四氢吡喃苄基腺嘌呤、二苯脲或KT-30中的任意一种或几种的组合。
7.根据权利要求2-5任一项所述的高效获得黄精灵百合纯合二倍体幼苗的方法，其特征在于：所述生长素类物质为6-苄氨基嘌呤、吲哚乙酸、吲哚丙酸、吲哚丁酸，萘乙酸、萘乙酸钠、萘氧乙酸、萘乙酰胺、2,4-D、2,4,5-T、4-碘苯氧乙酸或2,4-D丁酯中的任意一种或几种的组合。
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