CN103931499B - 一种红千层的组织培养快速繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种红千层的组织培养快速繁殖方法，属于植物组织培养技术领域。其培养步骤为：（1）外植体选取及消毒；（2）初代培养；（3）继代培养；（4）生根培养；（5）炼苗移栽。上述培养方法，炼苗移栽后苗木适应性较强，使得垂枝红千层组培苗的炼苗移栽成活率达到95%以上。与常规的种子繁殖和扦插繁殖相比，采用组织培养快速繁殖方法，大大缩短了垂枝红千层的育苗周期，能极大地提高繁殖效率，育苗周期由1年缩短到3至4个月，每年育苗批数由1批提高到4至8批，具有广阔的市场应用前景。

Description

一种红千层的组织培养快速繁殖方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及红千层组织培养快速繁殖方法。

背景技术

垂枝红千层(Callistemonviminalis)原产澳大利亚，是桃金娘科(Myrtaceae)红千层属(Callistemon)常绿灌木或小乔木，其花形像试管刷，故又称瓶刷树、红瓶刷。该植物适应性较广，能在暖热气候中生长，也能适应较热或较寒的气候。适于栽培在湿润、疏松的肥沃土壤中，但也能在贫瘠干旱的土壤中生长良好。该植物的萌芽力强，生长缓慢，耐修剪，抗大气污染力强。

作为一种极具观赏价值的花木，红千层株形优美，小枝细长而弯垂，树冠垂柳形，叶片有透明油腺点，揉之有芳香油气味，花稠密生于枝顶部叶腋，花期3-5月及10月，穗状花序独特美丽，盛开时红花压枝头，极为优雅。用于公园、风景区、居住区、道路等园林绿化，可与多种植物搭配，以孤植、丛植、片植等方式种植，营造出丰富的园林景观。该植物还是优良的经济树种，具有很好的药用价值。

种子繁殖、扦插繁殖和嫁接繁殖是树木常用的常规繁殖方法。到目前为止，红千层属植物最常用的繁殖方法是种子繁殖。然而，一方面，垂枝红千层的果实一旦成熟就会立即开裂，种子极易散落，难于采集，且其种子极细小，后熟期较长，萌发率较低；另一方面，垂枝红千层的扦插繁殖成活率低；至于嫁接繁殖，同样需要首先通过种子繁殖或扦插繁殖培育砧木苗。因此，对于垂枝红千层这一特色优良园林绿化树种，几种常用的常规繁殖方法都不适于规模化应用。针对这一问题，为了适应市场需要，急需建立起一种新的繁殖技术体系。

组织培养快速繁殖是基于组织培养的快速繁殖苗木新方法。目前，国内外关于红千层属植物组织培养快速繁殖方面的研究很少，全面系统的研究更少，即使原产地国家澳大利亚也一直未建立起任何一种红千层属植物的组织培养快速繁殖技术体系。因此，我们以该属的垂枝红千层为对象进行研究，以期探索建立起其组织培养快速繁殖技术体系，为其苗木规模化、标准化、工厂化育苗提供技术支撑，满足生产需要，对于红千层属植物应用具有重大的理论与实践意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种红千层组织培养快速繁殖方法，为红千层规模化、标准化、工厂化、全年化育苗提供技术支撑，为进一步的遗传育种提供理论与技术基础，对于该植物在我国的引种和推广利用具有重要的理论与实践意义。

本发明目通过以下技术方案来实现。

1.一种红千层的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：

1)外植体的选择及灭菌：以当年生半木质化的垂枝红千层枝条为外植体，将枝条剪成2～3cm的带腋芽茎段，剪去叶片，用流水清洗灰尘，以洗洁精溶液浸泡3min，再以流水冲洗2h；在超净工作台上先将茎段用70％的酒精浸泡30s，摇动25s，倒去酒精并用无菌水冲洗5遍，再用0.1％的升汞浸泡8min，每隔2min摇动一次，并用无菌水冲洗5～7遍，将其放入无菌水中浸泡备用；

2)初代培养：将灭菌后外植体伤口处切掉1～2mm，将末端向下垂直插入Y1培养基中，培养3～7d后转入到新的Y1培养基中，并继续培养10～15d长出新芽；

3)新芽伸长培养：将长出的新芽茎段基部发黑部分切除后转移至Y2培养基中进行新芽伸长培养，20d后新芽伸长到≥3.0cm；

4)继代增殖培养：将伸长生长后的新芽切成1cm左右的小段，将其转入Y2培养基中进行继代增殖培养，25～30d后增殖新芽萌发并伸长到2cm以上；继代增殖培养代数不超过4代；

5)生根培养：将步骤4)长至2cm以上的新芽剪下，去掉靠近培养基基部的叶片并转移至Y3培养基，培养15d后陆续长出新根；

6)炼苗移栽：将生根的植株的组培瓶瓶盖打开3d；取出生根苗，洗净根部培养基，自来水栽培5d，并用聚乙烯塑料袋盖住水杯，保持湿度；取出生根苗，移栽至装有基质的盆里，保持温度22～25℃，湿度85～95％，适当遮荫，

其中，所述各培养基的组分为：

Y1培养基：MS基本培养基(各成分用量详见后面的MS基本培养基说明)、30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂粉、0.1mg/L6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、0.05mg/L萘乙酸(NAA)，pH为5.8；

Y2培养基：MS基本培养基、30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂粉、1.0mg/L6-BA、0.2mg/LNAA，pH为5.8；

Y3培养基：大量元素减半的MS基本培养基、20g/L蔗糖、7.5g/L琼脂粉、0.25mg/L吲哚丁酸(IBA)、0.25mg/LNAA，pH为5.8；

其中，步骤2-5中所述的培养条件是：温度23-27℃，每天用1400Lx光强照射16h，然后暗箱保藏8小时。

本发明的有益效果是：针对红千层常规繁殖效率很低的问题，首次建立起该树种的组织培养快速繁殖技术体系，使其苗木繁殖不受时间、季节、气候及场地的限制，极大地缩短了育苗周期，极大地提高了育苗效率，育苗周期由1年缩短到3至4个月，每年育苗批数由1批提高到4至8批，为其大面积推广应用提供一条有效途径。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：

一种红千层的组织培养快速繁殖方法，具体如下：

1)外植体的选择及灭菌：以当年生半木质化的垂枝红千层枝条为外植体，将枝条剪成2～3cm的茎段，剪去叶片，用流水清洗灰尘，以洗洁精溶液浸泡3min，再以流水冲洗2h；在超净工作台上先将茎段用70％的酒精浸泡30s，摇动25s，倒去酒精并用无菌水冲洗5遍，再用0.1％的升汞浸泡8min，每隔2min摇动一次，并用无菌水冲洗6遍，将其放入无菌水中浸泡备用；

2)初代培养：将灭菌后外植体伤口处切掉1～2mm，将末端向下垂直插入Y1培养基中，培养5d后转入到新的Y1培养基中，并继续培养12d长出新芽；

3)新芽伸长培养：将长出的新芽茎段基部发黑部分切除后转移至Y2培养基中进行新芽伸长培养，20d后新芽伸长到≥3.0cm；

4)继代增殖培养：将伸长生长后的新芽切成1cm左右的小段，将其转入Y2培养基中进行继代增殖培养，28d后增殖新芽萌发并伸长到2cm以上；继代增殖培养代数为4代；

5)生根培养：将步骤4)长至2cm以上的新芽剪下，去掉靠近培养基基部的叶片并转移至Y3培养基，培养15d后陆续长出新根；

6)炼苗移栽：将生根的红千层植株的组培瓶瓶盖打开3d；取出生根苗，洗净根部培养基，自来水栽培5d，并用聚乙烯塑料袋盖住水杯，保持湿度；取出生根苗，移栽至装有基质的盆里，保持温度22～25℃，湿度85～95％，适当遮荫，成活率达95％。

其中，步骤2-5中所述的培养条件是：温度25±2℃，每天用1400Lx光强照射16h，然后暗箱保藏8小时。

其中，所述各培养基的组分为：

Y1培养基：MS基本培养基、30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂粉、0.1mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.05mg/L萘乙酸，pH为5.8；

Y2培养基：MS基本培养基、30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂粉、1.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.2mg/L萘乙酸，pH为5.8；

Y3培养基：大量元素减半的MS基本培养基、20g/L蔗糖、7.5g/L琼脂粉、0.25mg/L吲哚丁酸、0.25mg/L萘乙酸，pH为5.8；

其中的含量(g/L或mg/L)均是指各组分占总培养基的重量体积比，如Y1培养基中的30g/L蔗糖，指的是每1LY1培养基中含蔗糖30g。

所述MS基本培养基含有大量元素、微量元素、铁盐、有机成分四大类，Y1、Y2培养基中，MS基本培养基的各组分占总培养基的含量为：大量元素为：KNO₃(1900mg/L)，NH₄NO₃(1650mg/L)，MgSO₄·7H₂O(370mg/L)，KH₂PO₄(170mg/L)，CaCl₂(440mg/L)；微量元素为：KI(0.83mg/L)，H₃BO₃(6.2mg/L)，MnSO₄·H₂O(16.9mg/L)，ZnSO₄·4H₂O(8.6mg/L)，CuSO₄·5H₂O(0.025mg/L)，CoCl₂·6H₂O(0.025mg/L)，Na₂MoO₄·2H₂O(0.25mg/L)；铁盐为：FeSO₄·7H₂O(27.85mg/L)，Na₂EDTA(37.25mg/L)；有机成分为：甘氨酸(2.0mg/L)，烟酸B3(0.5mg/L)，盐酸硫胺素B1(0.1mg/L)，盐酸吡哆醇B6(0.5mg/L)，肌醇(100mg/L)。

Y3培养基中的大量元素减半，即KNO₃、NH₄NO₃、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄、CaCl₂的含量减半，其它成分的含量不变。

Claims (1)

1.一种红千层的组织培养快速繁殖方法，其特征在于包括以下步骤：

1)外植体的选择及灭菌：以当年生半木质化的垂枝红千层枝条为外植体，将枝条剪成2～3cm的带腋芽茎段，剪去叶片，用流水清洗灰尘，以洗洁精溶液浸泡3min，再以流水冲洗2h；在超净工作台上先将茎段用70％的酒精浸泡30s，摇动25s，倒去酒精并用无菌水冲洗5遍，再用0.1％的升汞浸泡8min，每隔2min摇动一次，并用无菌水冲洗5～7遍，将其放入无菌水中浸泡备用；

2)初代培养：将灭菌后外植体伤口处切掉1～2mm，将末端向下垂直插入Y1培养基中，培养3～7d后转入到新的Y1培养基中，并继续培养10～15d长出新芽；

3)新芽伸长培养：将长出的新芽茎段基部发黑部分切除后转移至Y2培养基中进行新芽伸长培养，20d后新芽伸长到≥3.0cm；

4)继代增殖培养：将伸长生长后的新芽切成1cm左右的小段，将其转入Y2培养基中进行继代增殖培养，25～30d后增殖新芽萌发并伸长到2cm以上；继代增殖培养代数不超过4代；

5)生根培养：将步骤4)长至2cm以上的新芽剪下，去掉靠近培养基基部的叶片并转移至Y3培养基，培养15d后陆续长出新根；

6)炼苗移栽：将生根的植株的组培瓶瓶盖打开3d；取出生根苗，洗净根部培养基，自来水栽培5d，并用聚乙烯塑料袋盖住水杯，保持湿度；取出生根苗，移栽至装有基质的盆里，保持温度22～25℃，湿度85～95％，适当遮荫，

其中，所述各培养基的组分为：

Y1培养基：MS基本培养基、30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂粉、0.1mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.05mg/L萘乙酸，pH为5.8；

Y2培养基：MS基本培养基、30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂粉、1.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.2mg/L萘乙酸，pH为5.8；

Y3培养基：大量元素减半的MS基本培养基、20g/L蔗糖、7.5g/L琼脂粉、0.25mg/L吲哚丁酸、0.25mg/L萘乙酸，pH为5.8；

其中，步骤2)-5)的培养条件是：温度23-27℃，每天用1400Lx光强照射16h，然后暗箱保藏8小时。