CN101946703A - 以叶片为外植体的月季再生植株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物组织与细胞培养技术领域，具体涉及以月季叶片为外植体经过体细胞胚发生途径的再生植株方法。本发明包括以下三个培养阶段：(1)在诱导培养基上培养月季外植体，该外植体分别为月季未展开的叶片，从外植体上直接诱导体细胞胚；(2)将体细胞胚接种到增殖培养基上增殖并促进其进一步分化；(3)将增殖培养后的体细胞胚接种到体细胞胚成苗培养基和生根培养基上再生成完整植株。本发明的方法具有外植体来源广泛，取材方便等优点。所得到的体细胞胚是农杆菌介导的遗传转化的良好受体，可用于月季遗传转化的研究。本发明还涉及用于该方法的培养基组成。

Description

以叶片为外植体的月季再生植株的方法

技术领域

本发明属于植物组织与细胞培养技术领域，具体涉及以月季叶片为外植体，通过体细胞胚发生途径进行月季植株再生的方法。

背景技术

月季(Rosa hybrida)属于蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)多年生常绿木本植物。月季栽培历史悠久，被世界各国广泛种植，是非常重要的观赏花卉且具有重要的商业价值，在园林绿化中起着重要的作用。月季因其姿态优美、花色丰富艳丽，芳香浓郁、花期长、适应性强、繁殖容易且管理方便被誉为花中皇后。月季的用途非常广泛，例如可以用藤本月季布置长廊和拱门，用树状月季装饰主干道，将灌木月季做成绿篱，用聚花月季点缀花坛，茶香月季可以用于展览，微型月季用来作为室内陈设，切花月季可以应用于各种场所。

但是月季花的瓶插寿命比较短，易患白粉病、黑斑病，这些都影响了它的观赏价值和经济价值。在这些性状改良上，传统育种方法存在着很大的局限性。植物基因工程技术在保持品种的其他性状相对稳定的基础上，能够利用外源基因对其所控制的性状进行定向改良，从而为培育月季新品种提供了新的途径。而月季再生体系和遗传转化体系的建立是利用基因工程技术育种的重要基础。

植物的体细胞胚发生是植物的体细胞在离体条件下，通过与合子胚类似的发育途径得到新个体的过程。体细胞胚发生途径再生体系的建立有助于月季的试管苗快繁，人工种子的生产和冷藏保存，同时胚性细胞是进行月季遗传转化的最佳受体，可以以体细胞胚为受体进行月季遗传转化的研究。

不同的月季品种和外植体及实验方法被应用于月季体细胞胚发生的研究，结果表明由于基因型的限制很难找到一种通用的方法进行月季体细胞胚的诱导(Marchant et al.，Somatic embryogenesis and plant regeneration in floribunda rose(Rosa hybrida L.cvs.Trumpeter and Glad Tidings).Plant Science，1996，120：95-105)。以月季Rosa hybrida cv.Carl Red和R.canina的离体叶片或茎段为外植体可以获得胚性愈伤组织(Visessuwan et al.，Plant regeneration systems from leaf segment culture through embryogenic callus formation of Rosa hybrida and R.canina.Breed Sci，1997，47：217-222)。DeWit et al.(Somatic embryogenesis and regeneration of flowering plants in rose.Plant Cell Rep，1990，9：456-458)以R.hybrida cv.Domingo和R.hybrida cv.Vicky Brown的叶片为外植体也获得了胚性愈伤组织。Rout et al.(Somatic embryogenesis in callus culture of Rosa hybrida L.cv.Landora.Plant Cell Tiss Org Cult，1997，27：65-69)在月季R.hybrida cv.Landora体细胞胚诱导研究中，诱导未成熟的叶片或茎段可以获得体细胞胚。Marchant et al.(Somatic embryogenesis and plant regeneration in floribunda rose(Rosa hybrida L.cvs.Trumpeter and Glad Tidings).Plant Science，1996，120：95-105)以月季R.hybrida cv.Trumpeter和R.hybrida cv.Glad Tidings的叶柄和根为外植体诱导得到了体细胞胚。利用未成熟种子诱导得到体细胞胚(Kim et al.，Control of direct and indirect somatic embryogenesis by exogenous growth regulators in immature zygotic embryo cultures of rose.Plant Cell Tiss Org Cult，2003，74：61-66；Kamo et al.，Dispersal and size fractionation of embryogenic of callus increases the frequency of embryo maturation and conversion in hybrid tea roses.Plant Cell Rep，2004，22：787-792)。此外，体细胞胚可以通过诱导月季的花瓣获得(Arene et al.，A comparison of the somaclonal variation level of Rosa hybrida L.cv.Meirutral plants regenerated from callus of direct induction from different vegetative and embryonic tissues.Euphytica，1993，71：83-90)。目前，国内外还没有关于月季‘萨蔓莎’体细胞胚诱导的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种以月季未展开叶片为材料，通过体细胞胚发生途径，建立月季再生体系的方法。同时本发明方法所获得的体细胞胚能够长期继代并保持其分化能力，可作为月季遗传转化的材料。

本发明的技术方案和步骤如下：

①以月季未成熟叶片为外植体，将所述的外植体在诱导培养基中直接诱导出体细胞胚；

②将步骤①中的体细胞胚接种到体细胞胚增殖培养基中增殖并使其进一步分化，得到成熟体细胞胚；

③将步骤②得到的成熟体细胞胚接种到体细胞胚成苗培养基中使其再生出植株；

④将步骤③得到的植株接种到生根培养基中进行生根培养从而形成完整的植株。

其中

所述的诱导培养基的组成如下：MS基本培养基，2，4-二氯苯氧乙酸3-4mg/L，葡萄糖30g/L，植物凝胶2.5g/L；

所述的体细胞胚增殖培养基的组成如下：MS基本培养基，2，4-二氯苯氧乙酸0-1.0mg/L，6-苄基腺嘌呤0-0.05mg/L，葡萄糖60g/L，植物凝胶2.5g/L；

所述的体细胞胚成苗培养基的组成如下：MS基本培养基，唑重氮苯茎脲(TDZ)0-2.0mg/L，6-苄基腺嘌呤0.5-1.0mg/L，葡萄糖30g/L，植物凝胶2.5g/L。

所述的生根培养基的组成如下：MS基本培养基，萘乙酸0.01mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂粉7.5mg/L。

作为优选方案，所述的诱导培养基中的2，4-二氯苯氧乙酸为3.0mg/L。

作为优选方案，所述的体细胞胚增殖培养基中的2，4-二氯苯氧乙酸为1.0mg/L，6-苄基腺嘌呤为0.05mg/L。

作为优选方案，所述的体细胚胞成苗培养基中的唑重氮苯茎脲(TDZ)1.0mg/L，6-苄基腺嘌呤为0.5mg/L。

为了便于对本发明的理解，申请人对上述各个步骤中所用的培养基、培养基中所用到的植物激素做了如下定义：培养基包括：体细胞胚诱导培养基、体细胞胚增殖培养基、体细胞胚成苗培养基和生根培养基。本发明所使用基本培养基来源如下：MS基本培养基(Murashige T.and F.Skoog.Physiol.Plant，1962，15：473-497)。

在本发明中，所述的植物激素定义及简称如下：植物生长调节物质包括2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)，植物细胞分裂素包括唑重氮苯茎脲(TDZ)、6-苄基腺嘌呤(6-BA)。

本发明以月季品种‘萨蔓莎’未展开叶片为外植体，直接诱导体细胞胚发生，并能保持体细胞胚不断增殖和成苗的特性。这些体细胞胚为农杆菌介导的月季的遗传转化提供了良好的受体；同时，该再生体系也是月季遗传转化的理想受体并为制备转基因月季新品种的人工种子奠定了一定的技术基础。

本发明的积极效果是：

1、本发明所采用的外植体来源不受季节限制，可以周年进行月季‘萨蔓莎’的组织和细胞培养。

2、离体培养下的月季‘萨蔓莎’体细胞胚可通过次生胚不断增殖，具有良好的增殖效果。

3、离体培养下的月季‘萨蔓莎’体细胞胚可以长期继代保存并能保持其进一步分化为小植株的能力。

附图说明

图1：本发明中月季‘萨蔓莎’体细胞胚的增殖。

图2：本发明中月季‘萨蔓莎’体细胞胚的萌发。

图3：本发明中月季‘萨蔓莎’的体细胞胚在体细胞胚成苗培养基上形成的无根小苗。

图4：本发明中月季‘萨蔓莎’的无根小苗生根培养后形成的根。

图5：本发明中田间条件下生长的月季‘萨蔓莎’的再生植株。

具体实施方式

实施例1

试验材料选择、培养基设计与接种培养

1、试验材料来源及其处理：

本发明中的试验材料选自月季‘萨蔓莎’未展开的叶片，采自湖北省武汉市华中农业大学花卉试验基地，采取生长健壮，无病虫害的优良月季‘萨蔓莎’的未展开的复叶片。该品种原始来源为购自湖北省武汉市武昌雄楚大街湖北省花卉苗木市场的公开销售品种。田间采集的月季‘萨蔓莎’的未展开的复叶片按常规方法消毒(高莉萍.月季品种‘萨蔓莎’植株再生体系的建立和根癌农杆菌介导的遗传转化研究.[博士学位论文].武汉：华中农业大学图书馆，2004，见中国知网：http://www.cnki.net/)，将消毒后的月季‘萨蔓莎’的未展开的复叶片，自小叶柄处将其切成带有小叶柄的单叶，以叶背面朝下接种于诱导培养基上。

2、培养基设计：

表1列出了本发明的各种培养基的成分及其用量。

表1月季的离体培养基设计

注：MS基本培养基的配制参见：Murashige T.and F.Skoog.Physiol.Plant，1962，15：473-497

表1中的体细胞胚继代培养基，既作为一般继代培养基，也是本发明所指的体细胞胚长期继代培养基。

培养基中各种成分的代号如下：2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、6-苄基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、植物凝胶(GEL)均可以从商业上购买。

3、培养条件

培养室培养温度24±2℃，光照强度1000-1500lx，光照周期为14h；黑暗培养温度24±2℃。

4、接种与培养：

在超净工作台上将月季‘萨蔓莎’的未展开的复叶片，自小叶柄处将其切成带有小叶柄的单叶，以叶背面朝下接种于诱导培养基(培养基如表1所示)上，每一培养皿中接种10-12个带有小叶柄的单叶，黑暗培养。两个月后小叶片上有体细胞胚产生，有的外植体则变褐死亡，未能诱导出体细胞胚。

将体细胞胚接种到体细胞胚增殖培养基(见表1所示)上，在光照条件下培养。这些体细胞胚可在体细胞胚增殖培养基上快速增殖(见图1)，将体细胞胚接种到体细胞胚继代培养基(见表1所示)上，可长期保存。将成熟体细胞胚接种到体细胞胚成苗培养基(见表1所示)上，体细胞胚成熟并萌发(见图2)。将萌发的体细胞胚接种到新鲜的体细胞胚成苗培养基上，月季‘萨蔓莎’的体细胞胚在体细胞胚成苗培养基上能形成无根或根系生长较弱的小苗(见图3)，当小苗长到2-3cm高时，转到生根培养基(见表1所示)进行根的诱导(见图4)。

1个月后，将根系发育良好的月季再生植株移到有散射光的自然条件下，炼苗一周，取出生根小植株，洗净根部培养基，然后移栽到装有泥炭土∶珍珠岩(体积比1∶1)的塑料杯中，弱光下培养3-4天，使其长出新根，再在强光下培养。当在塑料杯中看到明显新根时，将其移栽到装有泥炭土的瓦盆中，使其健康生长(见图5)。

实施例2

不同浓度的2，4-D对月季‘萨蔓莎’体细胞胚发生的影响

在植物组织培养中，2，4-D是一种应用得比较广泛的生长素类生长调节剂，它被公认是一种最有效的启动细胞脱分化，形成愈伤组织或器官发生的生长素。不同浓度2，4-D对月季‘萨蔓莎’体细胞胚发生的影响实验结果如表2所示：2，4-D浓度在0-2mg/L时，小叶片的叶柄处膨大，在继续培养的过程中褐化死亡；2，4-D浓度为3mg/L和4mg/L时，小叶片的叶柄处有体细胞胚发生；2，4-D浓度在5-8mg/L时，小叶片有不定根生成。因此，3mg/L 2，4-D是月季‘萨蔓莎’体细胞胚诱导的最佳激素浓度。

表2不同浓度2，4-D对月季‘萨蔓莎’体细胞胚发生的影响

实施例3

2，4-D和6-BA不同浓度组合对月季‘萨蔓莎’体细胞胚生长的影响

将体细胞胚接种到含有不同浓度2，4-D(0，0.5，1.0mg/L)和6-6-BA(0，0.05mg/L)的MS培养基上，葡萄糖浓度为60g/L，植物凝胶为2.5g/L。置于光照条件下培养。4周后比较外源激素对体细胞胚生长状态的影响。其结果如表3所示：当2，4-D浓度过低时，体细胞胚长势弱，增殖缓慢且愈伤化严重。体细胞胚在含有1.0mg/L 2，4-D，0.05mg/L 6-BA的培养基上生长状态最好，体细胞胚生长旺盛，增殖明显且迅速，体细胞胚组织比例达90％以上，因此适合月季体细胞胚的增殖与保存。

表3 2，4-D和6-BA不同浓度组合对月季‘萨蔓莎’体细胞胚生长的影响

注：体细胞胚增殖系数＝增殖后体细胞胚重量/接种时体细胞胚重量；体细胞胚组织比例为每个体胚团上体胚百分比的平均值。

实施例4

不同的培养基对月季‘萨蔓莎’体细胞胚的萌发和植株再生的影响如表4所示：试验中的8种培养基对月季体细胞胚萌发的影响存在显著性差异。在MS+1.0mg/L TDZ+0.5mg/L 6-BA+3％Glucose+0.25％GEL培养基上，体细胞胚萌发率最高，达到36.38％，在1/2MS+0.5mg/L 6-BA+3％Glucose+0.25％GEL培养基上，体细胞胚萌发率仅有2.33％。MS培养基较1/2MS培养基更有利于月季‘萨蔓莎’体细胞胚的萌发，L-p对月季‘萨蔓莎’体细胞胚的萌发没有明显的促进作用。TDZ对月季‘萨蔓莎’体细胞胚的萌发产生着重要的影响，但TDZ浓度过高时会抑制体细胞胚的萌发。体细胞胚萌发率高的培养基，单位体细胞胚成苗率也相应较高，单位体细胞胚成苗率最高达到56.24％。月季‘萨蔓莎’体细胞胚在相同的培养基培养3个月后可再生成植株，但再生的植株不能直接长根或根系生长较弱，需转入到MS+0.01mg/LNAA+3％Sucrose+7.5g/LAgar培养基上进行生根后才能炼苗，移栽下地。

表4不同培养基对月季‘萨蔓莎’体细胞胚的萌发和植株再生的影响

注：数据显示为平均值±标准误，不同字母表示在P＜0.05水平上差异显著。体细胞胚萌发率(％)＝萌发的体细胞胚数/接种的体细胞胚总数×100％；单位体细胞胚成苗率(％)＝成苗总数/接种的体细胞胚总数×100％。L-p(L-proline)为L-脯氨酸。

Claims (4)

1.一种月季再生为完整植株的方法，它包括下列步骤：

①以月季未成熟叶片为外植体，将所述的外植体在诱导培养基中直接诱导出体细胞胚；

②将步骤①中的体细胞胚接种到体细胞胚增殖培养基中增殖并使其进一步分化，得到成熟体细胞胚；

③将步骤②得到的成熟体细胞胚接种到体细胞胚成苗培养基中使其再生出植株；

④将步骤③得到的植株接种到生根培养基中进行生根培养得到完整植株；

其中

所述的诱导培养基的组成如下：MS基本培养基，2，4-二氯苯氧乙酸3-4mg/L，葡萄糖30g/L，植物凝胶2.5g/L；

所述的体细胞胚增殖培养基的组成如下：MS基本培养基，2，4-二氯苯氧乙酸0-1.0mg/L，6-苄基腺嘌呤0-0.05mg/L，葡萄糖60g/L，植物凝胶2.5g/L；

所述的体细胞胚成苗培养基的组成如下：MS基本培养基，唑重氮苯茎脲0-2.0mg/L，6-苄基腺嘌呤0.5-1.0mg/L，葡萄糖30g/L，植物凝胶2.5g/L；

所述的生根培养基的组成如下：MS基本培养基，萘乙酸0.01mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂粉7.5mg/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的体细胞胚增殖培养基中的2，4-二氯苯氧乙酸为1.0mg/L，6-苄基腺嘌呤为0.05mg/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的体细胚胞胚成苗培养基中的唑重氮苯茎脲1.0mg/L，6-苄基腺嘌呤为0.5mg/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤②所述的方法还包括将所述的体细胞胚接种到体细胞胚继代培养基上，使其继代并保持分化能力。

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