CN102286523B

CN102286523B - 农杆菌介导的玫瑰遗传转化方法

Info

Publication number: CN102286523B
Application number: CN 201110202403
Authority: CN
Inventors: 宁国贵; 邢文; 包满珠; 包颖
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2011-07-19
Filing date: 2011-07-19
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2031-07-19
Also published as: CN102286523A

Abstract

本发明公开了一种农杆菌介导的玫瑰遗传转化方法，以玫瑰未成熟叶片诱导得到的体细胞胚为受体，通过农杆菌介导的方法，经体胞胚诱导、转化受体的继代增殖培养、遗传转化，共培养，选择增殖培养、选择萌发成苗培养，最终获得玫瑰的转基因植株。本发明方法简单，培养周期较短，成功实现玫瑰转基因植株的培育，填补了目前无法实现玫瑰转基因植株的培育的空白。

Description

农杆菌介导的玫瑰遗传转化方法

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及一种以‘唐白’品种为例，以继代增殖的体细胞胚为转化受体材料，通过农杆菌介导进行玫瑰遗传转化的方法。

背景技术

玫瑰(Rosa rugosa)是蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)落叶直立丛生灌木，原产中国北部，其色艳花香，含油量高，是我国重要的经济植物，也是世界上重要的观赏与生产两型花卉之一。但玫瑰一年只开一次花，且花期不长，无法满足市场的需由。采用传统的杂交育种的方法选育新品种，周期长，工作量大，并且会受到育种材料自身变异的限制，改良幅度有限。随着生物技术的快速发展，植物细胞工程和基因工程技术日趋成熟，可以在保持品种的其他性状相对稳定的基础上，利用外源基因对其所控制的性状进行定向改良，提高了育种的效率，从而为培育玫瑰新品种提供了新的途径。

玫瑰遗传转化的研究是基因工程育种的基础，但是目前国内外还没有玫瑰遗传转化成功的报道。

华中农业大学的专利申请“玫瑰再生为完整植株的方法”(申请号为：201110099811.8)，提出以玫瑰未成熟叶片为外植体，通过体细胞胚发生途径，建立玫瑰再生体系的方法，但其不具有遗化转化步骤，无法实现品种改良。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种以玫瑰未成熟叶片为外植体，以体细胞胚为转化受体，通过农杆菌介导的玫瑰遗传转化的方法，，具有方法简单、培养周期短的优点。

本发明的农杆菌介导的玫瑰遗传转化方法，以玫瑰未成熟叶片诱导得到的体细胞胚为受体，通过农杆菌介导的方法，按下述步骤进行处理：

(1)体细胞诱导：以玫瑰未展开带叶柄小叶为外植体，将其接种于体细胞胚诱导培养，直接诱导出体细胞胚；

(2)转化受体的继代增殖培养：将诱导得到的体细胞胚接种于体细胞胚继代增殖培养基中继代增殖培养，为遗传转化提供转化受体材料；

(3)遗传转化：将经继代增殖培养的体细胞胚作为转化受体材料转入制备好的农杆菌菌液中进行侵染，所述侵染时间为50-60min；

(4)然后将侵染后的体细胞胚进行共培养，选择增殖培养、选择萌发成苗培养，最终获得玫瑰的转基因植株。

步骤(1)中所述体细胞胚诱导培养基包括：MS培养基为基础培养基，并添加2，4-D 3.0-4.0mg/L、葡萄糖30.0g/L、GEL 3.0mg/L，加蒸馏水至1L，pH 6.0。

步骤(2)中所述体细胞胚继代增殖培养基包括：MS培养基为基础培养基，并添加2，4-D 1.0mg/L、葡萄糖30.0g/L、GEL 3.0mg/L，加蒸馏水至1L，pH 6.0，每4周更新一次培养基，并选择在更新的体细胞继代增殖培养基中培养了2周的体细胞胚作为遗传转化的受体；所述培养条件为：温度24±2℃、光照强度为50-100lx。

所述步骤(3)中侵染时间为60min。

所述步骤(4)中，先将侵染后的体细胞胚转入共培养培养基中，在24±2℃、黑暗条件下进行共培养，共培养2天后转入体细胞胚选择增殖培养基在24±2℃、光照强度为50-100lx条件下进行选择增殖培养10周，每2周更新一次培养基，筛选得到抗性体胚；将在选择增殖培养基中筛选得到的抗性体胚转入选择萌发成苗培养基中，每三周更新一次培养基，在24±2℃、光照强度为1000-1500lx下萌发成苗，最终获得玫瑰的转基因植株。

所述共培养培养基包括：MS培养基为基本培养基、添加2，4-D1.0mg/L，AS 100μmol/L，葡萄糖30.0g/L，GEL 3.0mg/L，加蒸馏水至1L，pH 5.8；所述体细胞胚选择增殖培养基包括：MS培养基为基本培养基，并添加2，4-D 1.0mg/L，Km75-100mg/L，Cef300mg/L，葡萄糖30.0g/L，GEL 3.0mg/L，加蒸馏水至1L，pH 6.0；所述选择萌发成苗培养基包括：1/2MS培养基为基本培养基，并添加BA1.0，Km 75mg/L，Cef 300mg/L，葡萄糖30g/L，GEL 3.0mg/L，加蒸馏水至1L，pH 6.0。

所述的Km是卡那霉素(Kanamycin)：用无菌蒸馏水配制成100mg/L的母液，Cef是头孢霉素(Cefotaxime)：用无菌蒸馏水配制成200mg/L的母液，AS是乙酰丁香酮：称取一定量的AS，用甲醇溶解，最后用无菌蒸馏水定容，配制成10μmol/ml的母液，以上三种生化试剂均采用0.45μm滤膜过滤灭菌，于-20℃保存；

所述的MS是基本培养基，2，4-D是2，4-二氯苯氧乙酸，BA是6-苄基腺嘌呤，Glucose是葡萄糖，GEL是植物凝胶。

本发明中，玫瑰的侵染时间必须严格控制在50-60min，优选为60min。侵染时间过短，农杆菌无法吸附到受体材料的伤口或组织表面，降低了转化效率；侵染时间过长，农杆菌对受体材料伤害过大，使受体材料褐化死亡；所述农杆菌菌液的制备可以采用常规方法进行，优选OD₆₀₀值为0.1-0.6，更为优选为0.3。

共培养阶段是农杆菌T-DNA转移到植物细胞的一个重要阶段，共培养时间对转化率有着重要影响，玫瑰最适合的共培养时间为2d。共培养时间过短，遗传转化的效率降低，无法得到转化植株；共培养时间超过2d，农杆菌过度生长，植物细胞容易受到毒害而死亡；

研究表明，玫瑰的体细胞胚选择增殖培养过程必须在弱光照条件(光照强度为50-100lx)下进行，玫瑰的体细胞胚对光照敏感，在正常光照条件下，体细胞胚无法增殖，会逐渐萌发，影响了对抗性体细胞胚的筛选过程；

筛选的过程是遗传转化的关键步骤，直接影响转化的成败，玫瑰遗传转化后的筛选过程必须严格经过体细胞胚选择增殖培养，筛选出抗性的体细胞胚，然后再进入选择萌发成苗培养阶段进一步的筛选成苗。如果直接进入萌发成苗阶段则无法得倒转化植株，只能得到假阳性植株。另外，本研究表明，玫瑰的选择萌发和选择成苗是同时进行，直接进行选择萌发成苗即可，可以使用同一选择压力(Km 75mg/L)；

选择增殖培养、选择萌发成苗培养过程中相应培养基中选择压力(卡那霉素含量)的控制对提高转化效率也具有重要影响，本研究表明，体细胞胚选择增殖培养基中卡那霉素含量为75-100mg/L，优选100mg/L，选择萌发成苗培养基中卡那霉素含量为75mg/L。

一些以体细胞胚再生体系为基础的遗传转化研究中，多使用胚性愈伤为转化受体材料，而本发明利用经继代增殖培养的体细胞胚作为转化受体材料，侵染后可直接进行体细胞胚选择增殖培养，减少了工艺步骤，较现有的以胚性愈伤组织为受体材料进行遗传转化得到转基因植株方法的培养周期相比，可减少4-8周时间，从而缩短了培养周期，并成功获得了玫瑰转基因植株。

有益效果：

1、通过本发明方法成功实现以玫瑰体细胞胚为转化受体材料，通过农杆菌介导的遗传转化，获得了含有GUS报告基因的转基因植株，为玫瑰基因工程育种打下了良好的基础。

2、工艺简单、培养周期较短。

3、本发明所采用的外植体来源不受季节限制，可以周年进行玫瑰的组织和细胞培养。

附图说明

图1：本发明的遗传转化流程示意图。

图2：本发明的转基因植株叶片和茎段GUS活性检测图。

其中，a为阴性对照(未转化植株)；b、c、d为转化植株的叶片和茎段染色。

图3a：为阴性对照(未转化植株)的转基因植株幼苗GUS活性检测图。

图3b：转化植株的幼苗染色的转基因植株幼苗GUS活性检测图。

具体实施方式

试验材料选择、培养基设计与遗传转化过程

1.试验材料来源及其处理：

1)受体材料：玫瑰‘唐白’未成熟叶片诱导得到的体细胞胚经过增殖继代培养后，选择生长旺盛的体细胞胚转入增殖培养基中培养2周的体细胞胚为受体材料；

2)菌株和质粒：实验所用农杆菌菌株为EHA105，携带载体pBI121质粒，该质粒于35s组成型表达启动子后携带gus和npt II基因，gus基因含有内含子，以确保其只在植物细胞中表达而不在农杆菌中表达。

3)培养基设计

表1列出了本发明的各种培养基的成分及其用量。

表1玫瑰的离体培养基设计

注：MS基本培养基的配制参见：Murashige T.and F.Skoog.Physiol.Plant，1962，15：473-497。

表1中的卡那霉素(Kanamycin，Km)、头孢霉素(Cefotaxime，Cef)、乙酰丁香酮(AS)均采用0.45μm滤膜过滤灭菌，培养基高温灭菌后加入。

培养基中各种成分的代号如下：2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、6-苄基腺嘌呤(6-BA)、卡那霉素(Kanamycin，Km)、头孢霉素(Cefotaxime，Cef)、乙酰丁香酮(AS)、植物凝胶(GEL)均可以从商业上购买。

2.培养条件

培养室培养温度24±2℃，正常光照强度1000-1500lx，光照周期为14h；弱光光照强度50-100lx，光照周期14h；黑暗培养温度24±2℃。

3.GUS染液配制

50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中含有：0.1mol/L K₃[Fe(CN)₆]，0.1mol/L K₄[Fe(CN)₆]，10mmol/L Na₂EDTA，0.001％(v/v)TritonX-100，20％甲醇，0.5mg/L X-Gluc。(参照：植物基因工程，王关林，方宏筠主编)

4.遗传转化过程

1)受体材料的准备：以玫瑰‘唐白’未展开带叶柄小叶为外植体，将其接种于胚诱导培养基，直接诱导体细胞胚，将诱导得到的体细胞胚转入体细胞胚增殖继代培养基中增殖继代培养，将继代培养2周后生长旺盛的体细胞胚用于遗传转化；

2)农杆菌菌液的制备：农杆菌在含100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线培养并保存，每隔2个月继代活化一次。转化前挑取单菌落接种到含100mg/L卡那霉素的液体LB培养基中，于26-28℃振荡培养(180-200r/min)过夜，至对数生长期。然后将菌液于4000r/min条件下离心10min，并用农杆菌重悬培养基(MS培养基+100μM)重新悬浮菌液，使其OD₆₀₀值为0.1-0.6；所述含100mg/L Km固体或液体LB培养基，其主要配方是：10g/L蛋白胨+5g/L 酵母提取物+10g/L氯化钠，固体培养基中加15g/L琼脂粉，pH值为7.0。

3)侵染：将步骤1)中准备好的体细胞胚直接投入步骤2)中制备好的菌液中侵染，使菌液与体细胞胚充分接触，侵染时间为50-60min；

4)共培养：将侵染后的体细胞胚置于无菌滤纸上吸去表面多余菌液，接入共培养培养基中，置于24±2℃，黑暗条件下培养2d；

5)选择培养：将经过2d共培养的体细胞胚转入选择培养基，于24±2℃、弱光(光照强度50-100lx)条件下进行抗性体细胞胚的筛选，每两周更新一次培养基，培养10周；将筛选得到的抗性体细胞胚接种到体细胞胚选择萌发成苗培养基中，置于24±2℃、正常光照(光照强度1000-1500lx)条件下培养，每三周更新一次培养基，直至获得完整植株；

6)转基因植株检测：将得到的转基因植株和未转化植株置于GUS染液中，进行GUS活性检测，以未转化的植株为阴性对照；以转化植株叶片为材料，采用CTAB法提取总DNA，进行PCR检测。

5.试验结果

试验中进行转化的体细胞胚总数为600，经过GUS活性检测和PCR检测，共获得8个转基因植株，转化效率为1.33％。

Claims

1.一种农杆菌介导的玫瑰遗传转化方法，其特征在于，以玫瑰未成熟叶片诱导得到的体细胞胚为受体，通过农杆菌介导的方法，按下述步骤进行处理：

（1）体细胞诱导：以玫瑰未展开带叶柄小叶为外植体，将其接种于体细胞胚诱导培养基中，直接诱导出体细胞胚；

（2）转化受体的继代增殖培养：将诱导得到的体细胞胚接种于体细胞胚继代增殖培养基中继代增殖培养，为遗传转化提供转化受体材料；

（3）遗传转化：将经继代增殖培养的体细胞胚作为转化受体材料转入制备好的农杆菌菌液中进行侵染，所述侵染时间为50-60min，农杆菌菌液OD₆₀₀值为0.1-0.6；

（4）然后将侵染后的体细胞胚进行共培养，选择增殖培养、选择萌发成苗培养，最终获得玫瑰的转基因植株，具体为：先将侵染后的体细胞胚转入共培养培养基中，在24±2℃、黑暗条件下进行共培养，共培养2天后转入体细胞胚选择增殖培养基在24±2℃、光照强度为50-100lx条件下进行选择增殖培养10周，每2周更新一次培养基，筛选得到抗性体胚；将在选择增殖培养基中筛选得到的抗性体胚转入选择萌发成苗培养基中，每三周更新一次培养基，在24±2℃、光照强度为1000-1500 lx下萌发成苗，最终获得玫瑰的转基因植株；

其中，

步骤（1）中所述体细胞胚诱导培养基包括：MS培养基为基础培养基，并添加2, 4-D 3.0-4.0mg/L、葡萄糖30.0g/L、GEL 3.0 mg/L，加蒸馏水至1L，pH 6.0；

步骤（2）中所述体细胞胚继代增殖培养基包括：MS培养基为基础培养基，并添加2, 4-D 1.0mg/L、葡萄糖30.0g/L、GEL 3.0 mg/L，加蒸馏水至1L，pH 6.0，每4周更新一次培养基，并选择在更新的体细胞继代增殖培养基中培养了2周的体细胞胚作为遗传转化的受体；所述培养条件为：温度24±2℃、光照强度为50-100lx；

步骤（4）中，所述共培养培养基包括：MS培养基为基本培养基、添加2, 4-D 1.0mg/L，AS 100μmol/L，葡萄糖30.0g/L，GEL 3.0 mg/L，加蒸馏水至1L，pH 5.8；所述体细胞胚选择增殖培养基包括：MS培养基为基本培养基，并添加2, 4-D 1.0mg/L，Km75-100mg/L，Cef300mg/L，葡萄糖30.0g/L，GEL 3.0 mg/L，加蒸馏水至1L，pH 6.0；所述选择萌发成苗培养基包括：1/2MS培养基为基本培养基，并添加BA1.0 mg/L，Km 75mg/L, Cef 300mg/L,葡萄糖30g/L，GEL 3.0 mg/L，加蒸馏水至1L，pH 6.0。

2.如权利要求1所述的农杆菌介导的玫瑰遗传转化方法，其特征在于，所述步骤（3）中侵染时间为60min。