CN105543278A - 一种砀山酥梨遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一种砀山酥梨遗传转化方法，包括以下步骤：(1)遗传转化受体的建立；(2)农杆菌的培养及侵染液的配置；(3)侵染与共培养；(4)除菌培养与筛选培养；(5)抗性愈伤组织GUS染色鉴定。本发明以砀山酥梨愈伤组织为受体，以NptII为标记基因，以GUS基因为报告基因，通过农杆菌EHA105介导的方法进行砀山酥梨的遗传转化，获得阳性愈伤组织，然后即可通过阳性愈伤组织再分化为试管苗；本发明首先建立起一种以砀山酥梨当年生新稍为外植体诱导出愈伤组织，进而进行遗传转化的方法，砀山酥梨春季新稍酚类物质含量低，而且携带病菌量少，接种褐化率和污染率都很低，而且取材方便，愈伤组织诱导率高，能够满足遗传转化的需求。

Description

一种砀山酥梨遗传转化方法
技术领域
本发明涉及园艺作物基因工程领域，具体涉及一种以砀山酥梨愈伤组织为受体的农杆菌介导的遗传转化方法。
背景技术
梨属于蔷薇科(Rosaceae)梨亚科(Pomaeeae)梨属(PyrusL.)植物，是世界上重要的落叶果树之一。梨的品种可分为东方梨和西洋梨两大类，东方梨主要栽培于中国、日本和韩国等亚洲国家，包括沙梨(Pyruspyrifolia)、白梨(Pyrusbretschneideri)和秋子梨(Pyrusussuriensis)等。梨在中国的栽培面积和产量仅次于柑橘和苹果，位居第三位，其中原产安徽省砀山县的砀山酥梨属白梨系，是我国梨出口的主要品种之一。
梨的童期较长，利用传统的育种技术选育新的品种需要很长的时间，利用基因工程进行种质改良，将极大的缩短育种进程，加快梨新品种的育种步伐。
随着分子生物学领域技术迅猛发展，大量果树的遗传转化技术也在逐步成熟，与其他物种相比梨遗传转化起步较晚。于1988年，由Viseur等率先开始了梨属植物上的转基因工作，他用梨试管苗叶片作外植体，用带致瘤质粒的农杆菌(pTiT37)感染转化，虽然成功诱导出了瘤组织并分化出了不定芽，但最终并未能获得转基因植株。此后，各个国家的科学者对梨的遗传转化都做了进一步深入的研究，但同国外的研究相比中国关于这方面的研究比国外晚了近10年，而且在现有的报道中，梨遗传转化主要集中在西洋梨品种上，东方梨鲜有报道，特别是东方梨中的白梨，因此对白梨系品种砀山酥梨进行转基因研究十分必要。
目前，梨树组织培养中所用外植体类型包括茎尖、子叶、花药、叶柄、叶片和原生质体等，利用这些外植体均可以获得再生试管苗，但是梨试管苗生根时容易产生大量愈伤组织且生根率低，还会因为根基不够健壮导致移栽成活率低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种砀山酥梨遗传转化方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种砀山酥梨遗传转化方法，包括以下步骤：
(1)遗传转化受体的建立
以砀山酥梨当年生新稍为外植体，接种在愈伤组织诱导培养基表面诱导培养出愈伤组织，即为遗传转化受体；
(2)农杆菌的培养及侵染液的配置
将带有目的基因质粒的农杆菌EHA105在LB固体培养基上划线活化，再用LB液体培养基培养至OD值达到0.6～0.8，并进行菌液PCR验证，确保质粒没有丢失，然后离心收集菌体，用液体愈伤分化培养基悬浮后培养2～3小时，即为侵染液；
(3)侵染与共培养
将愈伤组织浸泡在侵染液中，在28℃、50r/min条件下侵染10分钟，取出后用无菌滤纸吸干多余菌液，然后接种在共培养培养基上培养48～60小时；
(4)除菌培养与筛选培养
将愈伤组织从共培养培养基中取出，并用含有400mg/LCef的无菌水进行清洗，然后转接在除菌培养基上培养3～6天，再转接至筛选培养基中培养，培养一个月后，存活下来的即为抗性愈伤组织；
(5)抗性愈伤组织GUS染色鉴定
将抗性愈伤组织分成两份，其中一份用于GUS染色检测，有蓝色显色反应的抗性愈伤组织认定为阳性愈伤组织，表明砀山酥梨遗传转化成功。
所述农杆菌EHA105携带有PCAMBIA-1304重组质粒，并含有标记基因NptII以及报告基因GUS。
优选的，所述外植体选用3月至4月的砀山酥梨当年生新稍。本发明前期研究表明，此时段当年生新稍易于诱导愈伤组织，且褐化率极低，污染率低。
优选的，所述愈伤组织诱导培养基配方为：MS+6-BA1.0～2.0mg/L+IBA0.2～0.6mg/L+20～30g/L蔗糖+6～7g/L琼脂+0.1～0.2g/L活性炭，愈伤组织诱培养基的pH值为5.8～6.0；诱导培养的环境为16小时光照、8小时黑暗光周期培养室，光强1500～2000lx，温度25℃。
优选的，所述LB固体培养基及LB液体培养基中均附加0.5g/LKan和0.5g/LRif；所述液体愈伤分化培养基配方为：1/2MS+6-BA2.5～3.5mg/L+IBA0.2～0.4mg/L+10～20g/L山梨醇+AS0.15mmol/L；侵染液通过稀释控制OD值在0.4～0.5。
优选的，所述共培养培养基配方为：1/2MS+6-BA2.5～3.0mg/L+IBA0.2～0.4mg/L+10～20g/L山梨醇+AgNO30.5mg/L+AS0.15mmol/L；共培养温度25℃，暗培养。
优选的，所述除菌培养基配方为：1/2MS+6-BA2.5～3.0mg/L+IBA0.2～0.4mg/L+10～20g/L山梨醇+AgNO30.5mg/L+Cef350mg/L；除菌培养温度25℃，无光照。
优选的，所述筛选培养基配方为：1/2MS+6-BA2.5～3.0mg/L+IBA0.2～0.4mg/L+10～20g/L山梨醇+AgNO30.5mg/L+Cef300mg/L+Hyp3～5mg/L；筛选培养先暗培养10天，再转入16小时光照、8小时黑暗光周期培养室中培养，光强1500～2000lx，温度25℃，每20天在相同培养基上继代一次。
本发明的有益效果为：
1.本发明以砀山酥梨愈伤组织为受体，以NptII为标记基因，以GUS基因为报告基因，通过农杆菌EHA105介导的方法进行砀山酥梨的遗传转化，获得阳性愈伤组织，然后即可通过阳性愈伤组织再分化为试管苗，利用微嫁接的方式越过生根环节直接获得完整再生植株；
2.本发明首先建立起一种以砀山酥梨当年生新稍为外植体诱导出愈伤组织，进而进行遗传转化的方法，砀山酥梨春季新稍酚类物质含量低，而且携带病菌量少，接种褐化率和污染率都很低，而且取材方便，愈伤组织诱导率高，能够满足遗传转化的需求；
3.本发明建立的侵染和共培养条件，可以进一步保证了遗传转化效率；加入除菌培养环节，一方面可以防止农杆菌过度生长导致愈伤组织死亡，另一方面可以防止转化细胞直接接触筛选抗生素而死亡，因为转化细胞较为脆弱，一开始即接触筛选抗生素可能容易死亡或者丧失分化能力，而在不含筛选抗生素的除菌培养基上先培养一段时间，再转移至筛选培养基上可以提高其成活率；
4.本发明通过GUS染色法进行阳性愈伤组织的鉴定可以提前剔除假阳性愈伤，减少后期工作量，提高转化效率；愈伤组织分裂能力强，增殖快，将其分割后进行GUS染色鉴定，其剩余部分可继续用来诱导不定芽，避免利用试管苗进行染色而使得阳性植株损失；
5.本发明可以实现对砀山酥梨的品质、抗逆、营养成分等多个方面的遗传改良，补充白梨系品种转基因方法的研究；
6.本发明遗传转化效率高，获得阳性愈伤组织的成功率能够达到0.5％。
附图说明
图1为PCAMBIA-1304载体图谱。
图2为砀山酥梨当年生新稍诱导的愈伤组织图。
图3为抗性愈伤组织GUS染色图。
图4为抗性愈伤组织GUS染色显微观察图。
图5为抗性愈伤组织诱导出的不定芽图。
图6为不定芽继代培养生长图。
具体实施方式
下面结合附图、实施例对本发明作进一步描述：
本部分对本发明实验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料、设备和操作方法是本领域公知的。下述实施例中砀山酥梨新稍取自安徽省砀山果园场砀山酥梨(Pyrusbretschneidericv.DangshanSu)。
实施例1
遗传转化受体的建立
3月份至4月份从大田中剪取砀山酥梨当年生新稍为外植体，用洗衣粉水浸泡20分钟，再流水冲洗1小时，在超净台上将外植体置于75％酒精中浸泡30s，无菌水冲洗一至两次，再置于0.1％升汞溶液中浸泡5～6分钟，其中升汞溶液中需加入1到2滴吐温-80，无菌水冲洗4～5次，用无菌滤纸将多余水分吸干，水平接种在愈伤组织诱导培养基表面，置于16小时光照、8小时黑暗光周期培养室中培养，光强1500～2000lx，温度25℃；20天左右即可诱导出愈伤组织，如图2所示，愈伤组织可直接作为遗传转化受体；愈伤组织诱导培养基配方为：MS+6-BA1.0～2.0mg/L+IBA0.2～0.6mg/L+20～30g/L蔗糖+6～7g/L琼脂+0.1～0.2g/L活性炭，pH值为5.8～6.0。
实施例2
农杆菌的培养及侵染液的配置
选择的农杆菌EHA105携带有PCAMBIA-1304重组质粒，并含有标记基因NptII以及报告基因GUS，PCAMBIA-1304载体图谱如图1所示，其中插入的目的基因为本实验室克隆的阿魏酸5-羟基化酶基因(F5H)(Genbank登录号：KC852907)，插入位点为NcoI与BglII，阿魏酸5-羟基化酶基因(F5H)用于调控木质素合成过程中G-木质素向S-木质素转化的酶，S-木质素含量越高，形成的石细胞聚合度就越低，石细胞团就越小，梨果实的品质也就越好；将保存的农杆菌在双抗LB固体培养基上划线活化，28℃过夜培养后，挑取单菌落至1毫升双抗LB液体培养基中28℃，180r/min进行小摇培养，当OD值达到0.8～1.0时，将菌液再转移至100毫升双抗LB液体培养基中进行扩大培养，培养条件为28℃，180r/min；当OD值达到0.6～0.8时利用引物(PbF5H-F：CATGCCATGGATTCTCTTCTGC；PbF5H-R：GGAAGATCTAGTGGACAAACCACC)进行菌液PCR验证，以确保质粒没有丢失。菌液PCR验证所用引物为PCAMBIA-1304载体上所插入的目的基因克隆引物，PCR条件及体系与常规标准操作一致；离心收集菌体，用液体愈伤分化培养基悬浮后培养2～3小时，再通过稀释控制OD值在0.4～0.5，即配置好侵染液；其中，LB固体培养基及LB液体培养基中均附加0.5g/LKan和0.5g/LRif(即双抗)；液体愈伤分化培养基配方为：1/2MS+6-BA2.5～3.5mg/L+IBA0.2～0.4mg/L+10～20g/L山梨醇+AS0.15mmol/L。
实施例3
侵染与共培养
将愈伤组织浸泡在侵染液中，在28℃、50r/min条件下侵染10分钟，取出后用无菌滤纸吸干多余菌液，然后接种在共培养培养基上培养；共培养培养基配方为：1/2MS+6-BA2.5～3.0mg/L+IBA0.2～0.4mg/L+10～20g/L山梨醇+AgNO30.5mg/L+AS0.15mmol/L，共培养时间为48～60小时，温度25℃，暗培养。
实施例4
除菌培养与筛选培养
共培养结束后，将愈伤组织从共培养培养基中取出，并用含有400mg/LCef的无菌水清洗两次，然后转接在除菌培养基上暗培养3～6天，培养温度25℃，再转接至筛选培养基中培养，筛选培养先暗培养10天再转入16小时光照、8小时黑暗光周期培养室中培养，光强1500～2000lx，温度25℃，每20天在相同培养基上继代一次，培养一个月后，存活下来的即为抗性愈伤组织；其中，除菌培养基配方为：1/2MS+6-BA2.5～3.0mg/L+IBA0.2～0.4mg/L+10～20g/L山梨醇+AgNO30.5mg/L+Cef350mg/L；筛选培养基配方为：1/2MS+6-BA2.5～3.0mg/L+IBA0.2～0.4mg/L+10～20g/L山梨醇+AgNO30.5mg/L+Cef300mg/L+Hyp3～5mg/L。
实施例5
抗性愈伤组织GUS染色鉴定
将抗性愈伤组织分成两份，其中一份利用中国瑞泰(北京)生物科技有限公司所售的GUS染色试剂盒进行GUS染色检测，有蓝色显色反应的抗性愈伤组织认定为阳性愈伤组织，如图3、图4所示，肉眼或显微镜下观察下，蓝色即为GUS表达位点，可见，外源基因已被高效转化，表明砀山酥梨遗传转化成功，然后将其另一份继续接种在筛选培养基中培养，诱导不定芽，参见图5。
经过大量的试验验证，按实施例1至实施例4提供的方法操作，砀山酥梨遗传转化成功率可达到0.5％，而目前其它梨树等果树的遗传转化方法的成功率均不超过0.1％。
实施例6
再生植株微嫁接
当不定芽生长到2～3cm左右时，切下并转接到继代培养基中进行继代培养，参见图6，继代培养基配方为：MS+6-BA1.0～2.0mg/L+IBA0.2～0.4mg/L+30g/L蔗糖+GA31.5mg/L+Cef300mg/L+Hyp3～5mg/L；每20天继代一次，将继代两次的不定芽以杜梨实生苗为砧木进行微嫁接，即可获得完整的遗传转化植株。先在接穗芽基部切成楔形，对砧木茎同样切出楔形缺口，切口要比芽片稍长，将接穗芽片嵌入砧木切口，使接穗和砧木形成层有一边对齐，绑扎后培养即可获得完整的遗传转化植株。
通过微嫁接的方式获得完整转基因植株，不但可以解决梨试管苗生根难得问题，还可以缩短培养周期，避免大田嫁接所导致的病毒感染，本发明使用的杜梨实生苗能够保证较高的嫁接成活率，而且有利于生长。
应当理解本文所述的例子和实施方式仅为了说明，本领域技术人员可根据它做出各种修改或变化，在不脱离本发明精神实质的情况下，都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种砀山酥梨遗传转化方法，包括以下步骤：
(1)遗传转化受体的建立
以砀山酥梨当年生新稍为外植体，接种在愈伤组织诱导培养基表面诱导培养出愈伤组织，即为遗传转化受体；
(2)农杆菌的培养及侵染液的配置
将带有目的基因质粒的农杆菌EHA105在LB固体培养基上划线活化，再用LB液体培养基培养至OD值达到0.6～0.8，并进行菌液PCR验证，确保质粒没有丢失，然后离心收集菌体，用液体愈伤分化培养基悬浮后培养2～3小时，即为侵染液；
(3)侵染与共培养
将愈伤组织浸泡在侵染液中，在28℃、50r/min条件下侵染10分钟，取出后用无菌滤纸吸干多余菌液，然后接种在共培养培养基上培养48～60小时；
(4)除菌培养与筛选培养
将愈伤组织从共培养培养基中取出，并用含有400mg/LCef的无菌水进行清洗，然后转接在除菌培养基上培养3～6天，再转接至筛选培养基中培养，培养一个月后，存活下来的即为抗性愈伤组织；
(5)抗性愈伤组织GUS染色鉴定
将抗性愈伤组织分成两份，其中一份用于GUS染色检测，有蓝色显色反应的抗性愈伤组织认定为阳性愈伤组织，表明砀山酥梨遗传转化成功。
2.如权利要求1所述的砀山酥梨遗传转化方法，其特征在于：所述外植体选用3月至4月的砀山酥梨当年生新稍。
3.如权利要求1或2所述的砀山酥梨遗传转化方法，其特征在于：所述愈伤组织诱导培养基配方为：MS+6-BA1.0～2.0mg/L+IBA0.2～0.6mg/L+20～30g/L蔗糖+6～7g/L琼脂+0.1～0.2g/L活性炭，愈伤组织诱培养基的pH值为5.8～6.0；诱导培养的环境为16小时光照、8小时黑暗光周期培养室，光强1500～2000lx，温度25℃。
4.如权利要求1或2所述的砀山酥梨遗传转化方法，其特征在于：所述LB固体培养基及LB液体培养基中均附加0.5g/LKan和0.5g/LRif；所述液体愈伤分化培养基配方为：1/2MS+6-BA2.5～3.5mg/L+IBA0.2～0.4mg/L+10～20g/L山梨醇+AS0.15mmol/L；侵染液通过稀释控制OD值在0.4～0.5。
5.如权利要求1或2所述的砀山酥梨遗传转化方法，其特征在于：所述共培养培养基配方为：1/2MS+6-BA2.5～3.0mg/L+IBA0.2～0.4mg/L+10～20g/L山梨醇+AgNO30.5mg/L+AS0.15mmol/L；共培养温度25℃，暗培养。
6.如权利要求1或2所述的砀山酥梨遗传转化方法，其特征在于：所述除菌培养基配方为：1/2MS+6-BA2.5～3.0mg/L+IBA0.2～0.4mg/L+10～20g/L山梨醇+AgNO30.5mg/L+Cef350mg/L；除菌培养温度25℃，无光照。
7.如权利要求1或2所述的砀山酥梨遗传转化方法，其特征在于：所述筛选培养基配方为：1/2MS+6-BA2.5～3.0mg/L+IBA0.2～0.4mg/L+10～20g/L山梨醇+AgNO30.5mg/L+Cef300mg/L+Hyp3～5mg/L；筛选培养先暗培养10天，再转入16小时光照、8小时黑暗光周期培养室中培养，光强1500～2000lx，温度25℃，每20天在相同培养基上继代一次。
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