CN105746352B - 多肉植物巨大赤线ho1的组织培养法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多肉植物巨大赤线HO1的组织培养法，包括以下步骤：取生长健壮且无病虫害的巨大赤线HO1花梗进行清洗、消毒，切段后横放接种到愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织的诱导；待无菌愈伤组织成簇状生长时，将小块愈伤组织接种到诱导不定芽培养基上进行不定芽诱导；待上述愈伤组织诱导的无菌苗长至直径0.6～1.5cm时，割取叶片接种到增殖培养基中进行叶片诱导不定芽培养；叶片诱导出的不定芽依次进行生根培养、壮苗培养、移栽。采用该方法能获得大量的巨大赤线HO1组培种苗。
Description
技术领域
本发明涉及多肉植物巨大赤线HO1的组织培养法。巨大赤线HO1的组织培养快速繁殖方法。
背景技术
多肉植物巨大赤线HO1是龙舌兰目独尾草科十二卷属玉露的一个品种。植株玲珑小巧，成株窗在2.5CM，叶色晶莹剔透，叶片绒毛多，棱角明显，可作为生活中工艺品，非常可爱，是近年来人气较旺的小型多肉植物品种之一，被许多多肉植物收藏家所青睐。但用传统的叶插和种子播种繁殖方法栽培时，不仅繁殖速度极慢，一年只生长1-2片叶子，而且成活率低，严重影响了HO1的繁殖，进而影响了其经济效益。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种巨大赤线HO1的组织培养法，采用该方法能获得大量的巨大赤线HO1组培种苗。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种巨大赤线HO1的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
1)、取生长健壮且无病虫害的巨大赤线HO1花梗，流水冲洗；
2)、愈伤组织的诱导：
将上述流水冲洗后的花梗经消毒(常规消毒)后，切割成长度为3～5mm，横放接种到愈伤组织诱导培养基上进行培养；
培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmol m-2·s-1，温度为25±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；
3)、不定芽诱导：
待无菌愈伤组织成簇状生长时，分割成0.5～1cm的小块；将小块愈伤组织接种到诱导不定芽培养基上进行培养；
培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmol m-2·s-1，温度为25±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；
4)、叶片诱导不定芽培养：
待上述愈伤组织诱导的无菌苗长至直径0.6～1.5cm时，割取单株小苗Ⅰ的叶片；将此叶片沿着叶脉竖切成2半(即分成左半部、右半部)之后接种到增殖培养基中，从而使叶片顶端接触增殖培养基；
培养条件为：16小时光照，光照强度40～50μmol m-2·s-1，温度为22～26℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；
5)、生根培养：
待上述叶片诱导出的不定芽长到直径2～5mm，割取后作为小苗Ⅱ接种到生根培养基上进行生根培养；
培养条件为：16小时光照，光照强度40～50μmol m-2·s-1，温度为22～26℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；
6)、壮苗培养：
待上述小苗Ⅱ生根后，接种到壮苗培养基上进行壮苗培养，培养条件为：16小时光照，光照强度40～50μmol m-2·s-1，温度为22～26℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行。
7)、待壮苗培养所得的小苗Ⅲ长至直径≥1.5cm、且长出长度大于2cm的根至少3条时，可出瓶种植。
作为本发明的多肉植物巨大赤线HO1的组织培养法的改进：
步骤2)的愈伤组织诱导培养基：MS+6-BA1～2mg/L+KT0.5～1mg/L+NAA0.1～0.2mg/L+白砂糖20～30g/L+琼脂7～9g/L，pH为5.5～6.0(较佳为pH为5.6)。
愈伤组织诱导培养基的制作方法具体如下：以MS基本培养基为基础，分别加入6-苄基腺嘌呤(6-BA)、6-糖基氨基嘌呤(KT)、萘乙酸(NAA)、白砂糖、琼脂均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.5～6.0；每1L的MS基本培养基中加1～2mg的6-BA、0.5～1mg的KT、0.1～0.2mgNAA、20～30g白砂糖、7～9g琼脂。
步骤3)的不定芽诱导培养基：MS+NAA1mg/L+KT1mg/L+白砂糖20～30g/L +琼脂7～9g/L，pH为5.5～6.0(较佳为pH为5.6)。
不定芽诱导培养基的制作方法具体如下：以MS为基本培养基为基础，分别加入萘乙酸(NAA)、6-糖基氨基嘌呤(KT)、白砂糖、琼脂均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.5～6.0；每1L MS基本培养基中加1mg萘乙酸(NAA)、1mg 6-糖基氨基嘌呤(KT)、20～30g白砂糖、7～9g琼脂。
步骤4)的增殖培养基：MS+6-BA0.1～0.15mg/L+NAA0.05mg/L+白砂糖20～30g/L+琼脂7～9g/L，pH为5.5～6.0(较佳为pH为5.6)。
增殖培养基(叶片增殖培养基)的制作方法具体如下：以MS基本培养基为基础，分别加入6-BA、NAA、白砂糖、琼脂均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.5～6.0；每1L的MS基本培养基加入0.1～0.15mg的6-BA、0.05mg的NAA 、20～30g白砂糖、7～9g琼脂。
步骤5)的生根培养基为：1/2MS基本培养基+白砂糖15～30g/L+琼脂7～9g/L，pH为5.5～5.8(较佳为pH为5.6)。
生根培养基的制作方法具体如下：以1/2MS基本培养基(即溶液中大量元素的含量为MS基本培养基的一半)为基础，分别加入白砂糖、琼脂均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.5～5.8；每1L 的1/2MS基本培养基中加15～30g白砂糖、7～9g琼脂。
步骤6)的壮苗培养基：1/2MS基本培养基+0.1mg/LNAA+白砂糖15～30g/L+琼脂7～9g/L，pH为5.5～5.8(较佳为pH为5.6)。
壮苗培养基的制作方法具体如下：以1/2MS基本培养基(即溶液中大量元素的含量为MS基本培养基的一半)为基础，分别加入萘乙酸、白砂糖、琼脂均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.5～5.8；每1L的1/2MS基本培养基中加0.1mg萘乙酸、15～30g白砂糖、7～9g琼脂。
作为本发明的多肉植物巨大赤线HO1的组织培养法的进一步改进：
所述步骤4)的增殖培养基：MS+6-BA0.1～0.15mg/L+NAA0.05mg/L+1g/L活性炭+白砂糖20～30g/L +琼脂7～9g/L，pH为5.5～6.0；
所述步骤5)的生根培养基为：1/2MS基本培养基+1g/L活性炭+白砂糖15～30g/L+琼脂7～9g/L，pH为5.5～5.8；
所述步骤6)的壮苗培养基：1/2MS基本培养基+0.1mg/LNAA+1g/L活性炭+白砂糖15～30g/L+琼脂7～9g/L，pH为5.5～5.8。
在本发明中，作为优选的培养基如下：
愈伤组织诱导培养基：MS+6-BA2mg/L+KT1mg/L+NAA0.2mg/L+白砂糖25g/L +琼脂8g/L，pH为5.6。
不定芽诱导培养基：MS+NAA1mg/L+KT1mg/L+白砂糖25g/L+琼脂8g/L，pH为5.6。
增殖培养基：MS+6-BA0.15mg/L+NAA0.05mg/L+白砂糖25g/L+琼脂8g/L，pH为5.6。
生根培养基为：1/2MS基本培养基+白砂糖25g/L+琼脂8g/L，pH为5.6。
壮苗培养基：1/2MS基本培养基+0.1mg/LNAA+白砂糖25g/L+琼脂8g/L，pH为5.6。
更优选的培养基为：
增殖培养基：MS+6-BA0.15mg/L+NAA0.05mg/L+1g/L活性炭+白砂糖25g/L+琼脂8g/L，pH为5.6。
生根培养基为：1/2MS基本培养基+1g/L活性炭+白砂糖25g/L+琼脂8g/L，pH为5.6。
壮苗培养基：1/2MS基本培养基+0.1mg/LNAA+1g/L活性炭+白砂糖25g/L+琼脂8g/L，pH为5.6。
作为本发明的多肉植物巨大赤线HO1的组织培养法的进一步改进：所述步骤1)中的流水冲洗为：将巨大赤线HO1花梗放入纱袋中用自来水冲洗1～2小时。
依照上述方法，只需90～110天即可获得试管苗(即，获得小苗Ⅱ)；因此采用本发明的方法可以长期得到大量的试管苗。
本发明的巨大赤线HO1组织培养法，属于一种离体快速繁殖的组织培养方法。依照植物组织培养中细胞全能性的原理，利用叶片可以在短时间内产生大量遗传背景相同、长势一致的优质巨大赤线HO1，而且依靠实验室可以实现周年的长期提供优质种苗。在本发明的方法中，将长势健壮且无病虫害的巨大赤线HO1植株上取得的花梗进行消毒，通过合适的诱导培养基进行诱导不定芽以及增殖不定芽，再通过叶片插入培养基培养产生不定芽，可以获得大量的无菌苗。采用本发明的方法，一般仅需90～110天即可得到可出瓶种植的种苗。因此巨大赤线HO1组培苗一周年内的繁殖系数理论上为35倍以上，且采用了较低浓度的植物激素培养，建立质优量大的繁育体系，保证了培养过程中培养物体内外源激素的积累水平比较低，从而保障了种苗质量和较高的增殖系数。所以，本发明的巨大赤线HO1的组织培养法，是一种不受季节等因素影响，高效、快速提供优质巨大赤线HO1，克服了巨大赤线HO1常规栽培方法繁殖缓慢的缺点。
综上所述，本发明建立的巨大赤线HO1组织培养体系将为良种(巨大赤线HO1)繁育提供理论依据和技术支撑。
本发明的发明点在于：
1)、本发明利用巨大赤线HO1花梗作为外植体，诱导愈伤组织容易；进行壮苗培养能够大大提高巨大赤线HO1的移栽成活率；十二卷属植物是对外源激素比较敏感的物种，外源激素过高，会导致培养物的玻璃化，影响所繁殖苗的质量，进而降低增殖系数和代数，影响繁殖总量。本发明在各阶段培养中均采用了较低浓度的植物激素培养，建立质优量大的繁育体系，保证了培养过程中培养物体内外源激素的积累水平比较低，从而保障了较高的增殖系数和代数。
2)、愈伤组织容易玻璃化，因此不适合用来大量诱导不定芽，容易影响增殖系数。本发明利用叶片来诱导，增殖系数大。
3)、本发明对叶片插入培养基的方式进行了比较，发现将叶片沿叶脉切开(分成左右2个半片)后，竖起来插入培养基增殖倍数高。
4)、本发明在生根后利用壮苗培养基培养，有利于增加根的粗壮度和根的数量，有利于提高移栽成活率。
本发明所得的种苗可采用以下方法进行种植：待种苗直径达1.5cm、具有至少3条长于2cm的根时，进行炼苗驯化，在室温下(25℃左右)放置2～3d后开瓶，然后在自然光下放置2～3d后取出小苗，用温水(30℃左右)洗净根部琼脂，并晾干，移栽入营养土中，(草炭：珍珠岩：蛭石＝2：1：1的体积比)，于人工气候箱室培养，培养条件：温度20～25℃，湿度65％～90％，光照强度15～25μmol m-2·s-1；3～5周后光照强度30～40μmol m-2·s-1；2个月后，存活率达到95％以上。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为实施例1中所诱导出来的巨大赤线HO1愈伤组织；
图2为实施例1中愈伤组织所诱导出来的巨大赤线HO1不定芽；
图3为实施例1中叶片的切割方式：沿叶脉切割，水平放在培养基上；
图4为实施例1中叶片诱导产生的不定芽；
图5为实施例1中经过继代培养后的小苗；
图6为实施例2中花梗诱导的愈伤组织；
图7为实施例2中叶片切割后在培养基上的放置方式；
图8为实施例2中愈伤组织诱导的丛生芽；
图9为实施例2中叶片诱导不定芽经过继代以后的丛生芽；
图10为实施例2中壮苗培养基上生长的完整植株。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1：一种多肉植物巨大赤线HO1的组织培养法，依次进行以下步骤：
1)、取生长健壮且无病虫害的巨大赤线HO1植株的花梗，放入纱袋中用自来水冲洗1～2小时；
2)、愈伤组织的诱导：
将上述流水冲洗后的花梗经常规消毒后(即0.1％w/v HgCl2处理6～8分钟后，无菌水冲洗5～6遍，然后用无菌滤纸吸干)，切成3～5mm大小，接种到诱导愈伤组织培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmol m-2·s-1，温度为(25±1)℃；8小时暗培养，温度为(21±1)℃；上述光照和暗培养交替进行；
愈伤组织诱导培养基：MS+6-BA2mg/L+KT1mg/L+NAA0.2mg/L+白砂糖25g/L+琼脂8g/L，pH为5.6。
3)、不定芽诱导：
待有成簇状愈伤组织产生以后(约25天)，将其切成1cm左右大小，接种到不定芽诱导培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmol m-2·s-1，温度为(25±1)℃；8小时暗培养，温度为(21±1)℃；上述光照和暗培养交替进行；
不定芽诱导培养基：MS+NAA1mg/L+KT1mg/L+白砂糖25g/L+琼脂8g/L，pH为5.6。
4)、叶片诱导不定芽培养：
待上述愈伤组织诱导的无菌苗长至直径约1cm时(约40天)，割取单株小苗Ⅰ的叶片；沿叶脉竖切成两半，叶片顶端接触增殖培养基(即，基部背离培养基)接种到增殖培养基(叶片增殖培养基)进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度40～50μmol m-2·s-1，温度为(25±1)℃；8小时暗培养，温度为(21±1)℃；上述光照和暗培养交替进行；
在培养的过程中，有出现一定程度的褐化现象，褐化率为10％。
增殖培养基：MS+6-BA0.15mg/L+NAA0.05mg/L+白砂糖25g/L+琼脂8g/L，pH为5.6。
5)、生根培养：
待上述叶片诱导出的不定芽长到直径0.5cm时(约25天)，割取后作为小苗Ⅱ；将此小苗Ⅱ接种到生根培养基中；培养条件为：16小时光照，光照强度40～50μmol m-2·s-1，温度为(25±1)℃；8小时暗培养，温度为(21±1)℃；上述光照和暗培养交替进行；
生根培养基为：1/2MS基本培养基+白砂糖25g/L+琼脂8g/L，pH为5.6。
备注说明：小苗Ⅱ约20天就生根，在24天统计生根率为80％。
6)、壮苗培养：
待小苗Ⅱ在生根培养基上生根以后(约20天)，接种到壮苗培养基上培养，培养条件为：16小时光照，光照强度40～50μmol m-2·s-1，温度为(25±1)℃；8小时暗培养，温度为(21±1)℃；上述光照和暗培养交替进行；
壮苗培养基：1/2MS基本培养基+0.1mg/LNAA+白砂糖25g/L+琼脂8g/L，pH为5.6。
7)、移栽：
待壮苗培养所得的小苗Ⅲ长成直径1.5cm、且长出长度大于2cm的根至少3条时，可出瓶种植。
依照上述方法，只需90天即可获得试管苗(即，获得小苗Ⅱ的时间需90天)，相比传统基质栽培方式，节省了大量时间；因此采用本发明的方法可以长期得到大量的试管苗。存活率≥95％。
实施例2：
相对于实施例1而言，在步骤4)～6)中所用到的培养基上增加了0.1％活性炭，即为：
增殖培养基：MS+6-BA0.15mg/L+NAA0.05mg/L+1g/L活性炭+白砂糖25g/L+琼脂8g/L，pH为5.6。
生根培养基为：1/2MS基本培养基+1g/L活性炭+白砂糖25g/L+琼脂8g/L，pH为5.6。
壮苗培养基：1/2MS基本培养基+0.1mg/LNAA+1g/L活性炭+白砂糖25g/L+琼脂8g/L，pH为5.6。
其余等同于实施例1。
所得结果为：
在步骤4)的叶片诱导不定芽培养过程中未见到明显的褐化现象。
在步骤5)的生根培养，24天统计生根率为90％。
该实施例2与实施例1相比较，在增殖(继代)、生根及壮苗的培养基上增加了0.1％活性炭。活性炭有吸附植物产生有害物质，能防止植株褐化以及为植物生根提供暗环境的作用。
对比例1、将实施例1步骤2)中的愈伤组织诱导培养基的配方更改为：MS+6-BA3mg/L+NAA0.2mg/L+白砂糖25g/L+琼脂8g/L，pH为5.6。其余等同于实施例1。
最终所得的结果为：需要40天才能有成簇状愈伤组织产生，且还会有愈伤组织呈水渍状导致不能诱导成幼苗的缺点。
对比例2、将实施例1步骤3)中的不定芽诱导培养基的配方更改为：MS+KT 3mg/L+NAA0.2mg/L+白砂糖25g/L+琼脂8g/L，pH为5.6。
其余等同于实施例1。
最终所得的结果为：愈伤组织诱导的无菌苗长至直径约1cm时，约需60天。
对比例3、将实施例1步骤4)中的叶片增殖培养基的配方更改为：M S+KT 1.5mg/L+NAA0.1mg/L+白砂糖25g/L+琼脂8g/L，pH为5.6。
其余等同于实施例1。
最终所得的结果为：待叶片诱导出的的不定芽长到直径0.5cm时，约35天，且由于所用激素浓度较高，在后期的生根培养中有植株生长畸形的缺点。
对比例4、将实施例1步骤4)中的“割下单株小苗Ⅰ叶片，沿叶脉纵向切开，叶片顶端接触增殖培养基接种到增殖培养基进行培养”更改成“将该叶片直接接种到增殖培养基进行培养”。其余等同于实施例1。
最终所得的结果为：得到增殖系数为23，而本发明增殖系数为35；且待上述叶片诱导出的不定芽长到直径0.5cm时约需40天，而本发明仅仅需要25天。
对比例5、取消实施例1步骤6)的壮苗培养，即“待小苗Ⅱ在生根培养基上生根以后”直接进行相应的移栽种植，2个月后，其存活率仅为70％；而本发明的存活率达到95％以上。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (2)
1.多肉植物巨大赤线HO1的组织培养法，其特征在于包括以下步骤：
1)、取生长健壮且无病虫害的巨大赤线HO1花梗，流水冲洗；
2)、愈伤组织的诱导：
将上述流水冲洗后的花梗经消毒后，切割成长度为3～5mm，横放接种到愈伤组织诱导培养基上进行培养；
培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmol m-2·s-1，温度为25±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；
所述愈伤组织诱导培养基：MS+6-BA1～2mg/L+KT0.5～1mg/L+NAA0.1～0.2mg/L+白砂糖20～30g/L+琼脂7～9g/L，pH为5.5～6.0；
3)、不定芽诱导：
待无菌愈伤组织成簇状生长时，分割成0.5～1cm的小块；将小块愈伤组织接种到诱导不定芽培养基上进行培养；
培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmol m-2·s-1，温度为25±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；
所述不定芽诱导培养基：MS+NAA1mg/L+KT1mg/L+白砂糖20～30g/L+琼脂7～9g/L，pH为5.5～6.0；
4)、叶片诱导不定芽培养：
待上述愈伤组织诱导的无菌苗长至直径0.6～1.5cm时，割取单株小苗Ⅰ的叶片；将此叶片沿着叶脉竖切成2半之后接种到增殖培养基中，从而使叶片顶端接触增殖培养基；
培养条件为：16小时光照，光照强度40～50μmol m-2·s-1，温度为22～26℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；
所述增殖培养基：MS+6-BA0.1～0.15mg/L+NAA0.05mg/L+1g/L活性炭+白砂糖20～30g/L+琼脂7～9g/L，pH为5.5～6.0；
5)、生根培养：
待上述叶片诱导出的不定芽长到直径2～5mm，割取后作为小苗Ⅱ接种到生根培养基上进行生根培养；
培养条件为：16小时光照，光照强度40～50μmol m-2·s-1，温度为22～26℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；
所述生根培养基为：1/2MS基本培养基+1g/L活性炭+白砂糖15～30g/L+琼脂7～9g/L，pH为5.5～5.8；
6)、壮苗培养：
待上述小苗Ⅱ生根后，接种到壮苗培养基上进行壮苗培养，培养条件为：16小时光照，光照强度40～50μmol m-2·s-1，温度为22～26℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；
所述壮苗培养基：1/2MS基本培养基+0.1mg/LNAA+1g/L活性炭+白砂糖15～30g/L+琼脂7～9g/L，pH为5.5～5.8；
7)、移栽：
待壮苗培养所得的小苗Ⅲ长至直径≥1.5cm、且长出长度大于2cm的根至少3条时，可出瓶种植。
2.根据权利要求1所述的多肉植物巨大赤线HO1的组织培养法，其特征是：所述步骤1)中的流水冲洗为：将巨大赤线HO1花梗放入纱袋中用自来水冲洗1～2小时。
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