CN111454986A - 一种梨遗传转化方法 - Google Patents

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CN111454986A CN202010287373.7A CN202010287373A CN111454986A CN 111454986 A CN111454986 A CN 111454986A CN 202010287373 A CN202010287373 A CN 202010287373A CN 111454986 A CN111454986 A CN 111454986A
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王鹏
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Abstract

本发明公开了一种梨遗传转化方法，该方法包括以下步骤：(1)播种与育苗；(2)挑取含有目的基因的发根农杆菌菌株在液体培养基中振荡培养得到侵染液，将侵染液注射至梨苗距根部1～3cm的位置，然后将梨苗用脱脂棉沾取侵染液包裹伤口继续培养；(3)经过筛选及鉴定获得转化成功的阳性植株。本发明通过直接侵染实生梨苗的方法，成功实现了外源基因在梨中的表达，该方法克服了梨遗传背景复杂、童期长、缺乏高效稳定的遗传转化方法等困难，操作简便，转化率高，周期较短，为梨树基因功能研究和遗传改良提供了新型工具，为提高梨树遗传转化成功率奠定了基础。

Description

一种梨遗传转化方法
技术领域
本发明涉及植物遗传转化，尤其涉及一种梨遗传转化方法。
背景技术
梨是蔷薇科(Rosaceae)多年生木本果树，在进化过程中形成了高度杂合的基因型，遗传背景复杂，并且童期长，因此导致梨育种周期较长。植物基因工程是实现快速精准育种的有效方法，而遗传转化则是其中最关键的环节之一。农杆菌介导的植物转化是目前应用最广泛的方法，农杆菌分为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。根癌农杆菌中含穿梭质粒-Ti质粒，该质粒含有可以整合到植物基因组上的T-DNA区段。目前借助根癌农杆菌已成功实现水稻、玉米、大豆、苹果、柑橘等重要作物的遗传转化。发根农杆菌在感染植物后，能诱导植物产生大量高度分支的毛状根。发根农杆菌中的Ri质粒经过改造修饰后，其T-DNA片段区可以将目标基因插入宿主植物的基因组中，产生转基因毛状根。发根农杆菌侵染植物所产生的毛状根具有生长速度快、分化程度高、生理生化和遗传性稳定、操作控制简单等特点。目前通过发根农杆菌转化在烟草、苜蓿、豌豆、咖啡等植物中获得了提高抗性相关的转基因植株，如抗病、抗虫、耐受重金属等。此外，近年来在茶树、龙眼、枳、山定子和枣树等果树中也有较多关于发根农杆菌遗传改良和抗病性的研究。然而，梨遗传转化体系起步较其他物种较晚，目前还缺乏高效快速的遗传转化方法，严重限制了梨基因功能研究和梨精准分子育种应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种梨遗传转化方法，大大提高了梨的转化效率，而且有效缩短了转化的时间，为梨根系基因功能研究提供了新的工具。
为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
一种梨遗传转化方法，该方法包括以下步骤：
(1)播种与育苗：将梨种子经层积发芽并移栽培养梨苗，梨苗生长至6-8片真叶，株高6～8cm时，用于侵染(优选为梨苗生长至6-8片真叶，株高7cm时，用于侵染)；
(2)挑取含有目的基因的发根农杆菌菌株在液体培养基中振荡培养得到侵染液，将侵染液注射至梨苗距根部1～3cm的位置，然后将梨苗用脱脂棉沾取侵染液包裹伤口继续培养；
(3)经过筛选及鉴定获得转化成功的阳性植株。
作为一种优选技术方案，步骤(1)中所述层积发芽的过程为：
层积前浸种：将水和梨种子按5:1的质量比混合浸种，浸种期间每天翻动种子2次，换水1次，并清除空瘪粒和杂质，浸种2天后，将种子捞出，晾1h；
层积方法：先在花盆底部铺3cm厚的湿沙，沙子含水量以紧握成团不滴水、落地即散为准(含水量为60％左右)，然后将种子与沙相间分层放置，最上层种子覆3cm厚的湿沙，并盖3-4层报纸用于保水；将花盆放入4℃冷库中，每间隔1-2天喷一次水，以保持湿润。
作为一种优选技术方案，步骤(1)中梨苗的培养条件为：光照16h/黑暗8h，温度25±1℃，湿度50-70％，光照强度为90μmol.m-2.s-1，每2/3天浇水一次；步骤(2)中侵染结束后，暗处理24h，再置于与步骤(1)相同的培养条件下继续进行培养。
作为一种优选技术方案，步骤(2)中所述含有目的基因的发根农杆菌的构建过程为：将目的基因克隆到表达载体上得到重组表达载体，然后冻融法制备发根农杆菌感受态并进行转化得到含有目的基因的发根农杆菌；
所述冻融法制备发根农杆菌感受态并进行转化的步骤如下：
a、首先将发根农杆菌菌株K599于LB固体培养基(含50μg/mL利福平)的平板上划线，28℃恒温倒置培养36-48h；
b、挑取单菌落到2-5mL LB液体培养基(含50μg/mL利福平)，之后按1％接种率接种于100mL LB液体培养基(含50μg/mL利福平)中，28℃/220rpm震荡培养至OD600＝0.8；
c、将菌液分装与50mL无菌离心管中，冰浴10min，于4℃/5000rpm离心10min，弃上清；
d、在超净工作台中加入2-5mL预冷的10％甘油，吸打混匀后加等体积冰预冷的10％甘油，4℃/5000rpm离心10min后弃上清；
e、重复d步骤一次，然后加入200μL过滤除菌的100mg/mL山梨醇溶液重悬制备发根农杆菌感受态；
f、将发根农杆菌感受态分装为50μL/管，液氮速冻后于-80℃保存待用；
g、取500ng重组表达载体加入50μL融化的发根农杆菌感受态中，冰上放置30min；液氮速冻1min后立即37℃水浴1min；冰上放置3min后加入500μL无抗生素LB液体培养基，28℃/220rpm恒温摇床中培养4h，然后5000rpm离心5min，弃去部分培养基，留100μL重悬菌体后涂于含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB平板上放于30℃培养箱中培养36-48h，筛选阳性克隆，并进行PCR鉴定得到含有目的基因的发根农杆菌的阳性菌液，在其中加入50％甘油，于-80℃保存。将鉴定出来的阳性菌液提取质粒，再次进行大肠杆菌转化，并选择测序结果正确的阳性克隆菌液，再次证明在农杆菌的质粒中含目的基因。
进一步优选的，所述的目的基因为mCherry荧光蛋白基因(基因序列如SEQ IDNo.1所示)，但不限于此，所述的表达载体为pROK2表达载体(购自TAIR)，但不限于此。
以将mCherry荧光蛋白基因克隆到载体pROK2制得重组载体pROK2-35S:mCherry为例。以含有mCherry基因的载体(购自TAKAR)为模板，设计正反向引物进行PCR扩增，将扩增产物与用BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切进行的线性化的pROK2表达载体进行连接获得重组载体pROK2-35S:mCherry。
正向引物：5'-acgggggactctagaggatcc ATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3'，
反向引物：5'-gggaaattcgagctcggtacc TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3'。
PCR反应体系为50μL总反应体积中，包括5X Phusion GC Buffer 10μL，10X d NTPMix 1μL，10μM正向引物2.5μL，10μM反向引物2.5μL，模板DNA1μL，ddH2O 32.5μL，PhusionDNA Polymerase 0.5μL。PCR反应程序为预变性：98℃30s，循环反应(30个循环)98℃10s→65℃30s→72℃45s，终延伸72℃10min。
检测构建的表达载体，例如pROK2-35S:mCherry的表达效率：采用农杆菌注射法将pROK2-35S:mCherry载体转入到烟草表皮细胞中，用去掉针头的注射器将诱导好的菌体注入烟草叶片的背面，之后于25℃培养3d。叶片剪取1cm2大小制成临时装片，使用激光共聚焦显微镜观察烟草叶片在561nm激发光下检测mCherry表达情况。
进一步优选的，步骤(2)的具体过程为：挑取含有目的基因的发根农杆菌菌株K599(例如含有pROK2-35S:mCherry的发根农杆菌菌株K599)，将其单克隆在5mL LB液体培养基(含50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素)中28℃振荡(180rpm)培养3-4h，取1mL发根农杆菌菌液加到含25mL LB液体培养基(含50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素)的锥形瓶中28℃过夜培养，OD600值达到0.3-0.4后，将培养物在室温下以8000rpm离心10min，然后重悬于MES缓冲液(10mM MES-KOH，pH 5.2，10mM MgCl2和100μM乙酰丁香酮)，60rpm室温缓慢振荡孵育3h得到侵染液；将0.1ml侵染液用1mL注射器注入梨苗距根部1.5cm位置，然后将梨苗用脱脂棉沾取少量侵染液包裹伤口继续培养。
进一步优选的，步骤(3)中鉴定阳性植株的过程包括：收集毛状根提取总RNA，进行反转录后，以cDNA为模板，利用Premier 5.0设计引物，进行逆转录-PCR检测。
逆转录-PCR检测：采用20μL体系(ddH2O 7μL、2×Taq Master Mix10μL、10μM正反向引物各1μL、DNA模板1μL；)，设置PCR程序为，预解链95℃(3min)/解链95℃(3min)/退火60℃(15s)/延长72℃(45s)/后延长(5min)，扩增梨毛状根和质粒中的目的片段。配制1.0％琼脂糖的TAE溶液30～70mL，微波炉加热至完全溶解，待冷却至50～70℃时加入核酸染色剂EB2.5～5.5μL，倒入模板，冷却后用量程为10μL的移液枪在点样口注入7～10μL的样品和DNAMarker，上样口靠近负极，120V电压下运行10～15min后，拿出胶块，紫外灯下观察、拍照。其中目的片段长度为711bp，PCR对照包括质粒阳性对照和未侵染的实生苗根阴性对照。上述逆转录-PCR检测过程中所涉及的正反向引物为：
正向引物：5'-acgggggactctagaggatcc ATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3'，
反向引物：5'-gggaaattcgagctcggtacc TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3'
上述的梨遗传转化方法，在不损伤植物的情况下，将梨苗直接从盆中取出，用蒸馏水冲洗干净后，直接放在体视显微镜下观察梨毛状根中mCherry荧光蛋白的荧光，与未注射的阴性对照梨苗进行比较。
本发明所述的室温为25±5℃。
本发明的优点如下：
本发明通过直接侵染梨苗根部的方式，获得了一种周期短、转化率高、易操作的一种高效梨遗传转化方法，解决了因梨遗传背景复杂，童期长等而导致的遗传转化困难的问题，阳性率可达17.6％，通过本发明建立的梨遗传转化技术体系，可用于在梨上面开展基因功能验证、次生代谢物及植物根系发育的研究，为梨树基因功能研究和遗传改良提供了新型工具，为梨功能基因组学研究提供了技术支撑。
附图说明
图1为烟草叶片中瞬时表达检测pROK2-35S:mCherry载体的表达效率；
其中，a为mCherry在烟草叶片中的表达情况；d为未转化阴性对照在561nm激发光下未检测到荧光信号，标尺＝100μm。
图2‘梨’实生苗生长情况；
其中，a为注射前对照‘梨’实生苗；b为发根农杆菌注射侵染后的‘梨’实生苗，箭头指示注射位置为距根部1.5cm-2.0cm处，形成毛状根的‘梨’实生苗，箭头指示为产生的毛状根；c为未侵染对照CK，标尺＝2cm。
图3为RT-PCR检测梨转基因毛状根中mCherry的表达；
其中，P为质粒阳性对照；1，2，26，29，30，32均为检测阳性的‘梨’毛状根；CK，未侵染的实生苗根(阴性对照)；M，DNA标准分子量。
图4为转化的梨毛状根中在561nm激发光下可以观察到mCherry的红色荧光信号，标尺＝2mm。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。
实施例1一种梨遗传转化方法
(1)播种与育苗：
层积前浸种：将水和梨种子按5:1的质量比混合浸种，浸种期间每天翻动种子2次，换水1次，并清除空瘪粒和杂质，浸种2天后，将种子捞出，晾1h；
层积方法：先在花盆底部铺3cm厚的湿沙，沙子含水量以紧握成团不滴水、落地即散为准(含水量为60％左右)，然后将种子与沙相间分层放置，最上层种子覆3cm厚的湿沙，并盖3-4层报纸用于保水；将花盆放入4℃冷库中，每间隔1-2天喷一次水，以保持湿润。
将梨种子经4℃沙藏层积催芽35天后，移栽至装有基质(营养土：蛭石＝1:1)的花盆中，继续生长。生长期间育苗管理：幼苗的生长环境为光照16h/黑暗8h，温度25±1℃，湿度50-70％，光照强度为90μmol.m-2.s-1，水分管理，每2/3天浇水一次。生长至6-8片真叶，株高约7cm时(图2)，用于侵染。
(2)挑取含有目的基因的发根农杆菌菌株在液体培养基中振荡培养得到侵染液，将0.1ml发根农杆菌侵染液用1mL注射器注入梨苗距根部1.5cm的位置，侵染结束后，将梨苗用脱脂棉沾取少量侵染液包裹伤口并暗处理24h，然后移入土中，再置于步骤(1)所述的培养环境中继续培养。
Ⅰ.构建含有目的基因的发根农杆菌：将目的基因克隆到表达载体上得到重组表达载体，然后冻融法制备发根农杆菌感受态并进行转化得到含有目的基因的发根农杆菌。所述的目的基因为mCherry荧光蛋白基因(含有mCherry基因的载体购自TAKAR)，所述的表达载体为pROK2表达载体(购自TAIR)。以将mCherry荧光蛋白基因克隆到载体pROK2制得重组载体pROK2-35S:mCherry为例；克隆mCherry荧光蛋白基因并通过同源重组构建到pROK2，mCherry基因编码区长度为711bp，基因序列如SEQ ID No.1所示。以含有mCherry基因的载体(购自TAKAR)为模板，设计正反向引物进行PCR扩增，将扩增产物与用BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切进行的线性化的pROK2表达载体进行连接获得重组载体pROK2-35S:mCherry。
正向引物：5'-acgggggactctagaggatcc ATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3'，
反向引物：5'-gggaaattcgagctcggtacc TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3'。
采用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒，PCR反应体系为50μL总反应体积中，包括5X Phusion GC Buffer 10μL，10X d NTP Mix 1μL，10μM正向引物2.5μL，10μM反向引物2.5μL，模板DNA 1μL，ddH2O 32.5μL，Phusion DNA Polymerase 0.5μL。PCR反应程序为预变性：98℃30s，循环反应(30个循环)98℃10s→65℃30s→72℃45s，终延伸72℃10min。
检测构建的表达载体pROK2-35S:mCherry的表达效率：采用农杆菌注射法将pROK2-35S:mCherry载体转入到烟草表皮细胞中，用去掉针头的注射器将诱导好的菌体注入烟草叶片的背面，之后于25℃培养3d。叶片剪取1cm2大小制成临时装片，使用激光共聚焦显微镜观察烟草叶片在561nm激发光下检测mCherry表达情况，注射携带pROK2-35S:mCherry农杆菌的烟草叶片中有红色荧光产生，说明mCherry可以正常表达(图1)。
所述冻融法制备发根农杆菌感受态并进行转化的步骤如下：
a、首先将农杆菌菌株K599于LB固体培养基(含50μg/mL利福平)的平板上划线，28℃恒温倒置培养36-48h；
b、挑取单菌落到2-5mL LB液体培养基(含50μg/mL利福平)，之后按1％接种率接种于100mL LB液体(含50μg/mL利福平)培养基中，28℃/220rpm震荡培养至OD600＝0.8；
c、将菌液分装与50mL无菌离心管中，冰浴10min，于4℃/5000rpm离心10min，弃上清；
d、在超净工作台中加入2-5mL预冷的10％甘油，吸打混匀后加等体积冰预冷的10％甘油，4℃/5000rpm离心10min后弃上清；
e、重复d步骤一次，然后加入200μL过滤除菌的山梨醇(100mg/mL)重悬制备发根农杆菌感受态。
f、将发根农杆菌感受态分装为50μL/管，液氮速冻后于-80℃保存待用。
g、取500ng重组表达载体pROK2-35S:mCherry加入50μL融化的农杆菌感受态中，冰上放置30min；液氮速冻1min后立即37℃水浴1min；冰上放置3min后加入500μL无抗生素LB液体培养基，28℃/220rpm恒温摇床中培养4h，然后5000rpm离心5min，弃去部分培养基，留100μL重悬菌体后涂于含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB平板上放于30℃培养箱中培养36-48h，筛选阳性克隆，并进行PCR鉴定得到含有目的基因的发根农杆菌的阳性菌液，在其中加入50％甘油，于-80℃保存。将鉴定出来的阳性菌液提取质粒，再次进行大肠杆菌转化，并选择测序结果正确的阳性克隆菌液，再次证明在农杆菌的质粒中含目的基。
Ⅱ、制备侵染液：挑取含有pROK2-35S:mCherry的发根农杆菌菌株K599的单克隆在5mL LB液体培养基(含50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素)中，28℃振荡(180rpm)培养3-4h，取1mL农杆菌加到含25mL LB培养基(含50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素)的锥形瓶中28℃过夜培养，OD600值达到0.3-0.4后，将培养物在室温下以8000rpm离心10min，然后重悬于MES缓冲液(10mM MES-KOH，pH 5.2，10mM MgCl2和100μM乙酰丁香酮)，60rpm室温缓慢振荡孵育3h，制成侵染液。
Ⅲ、侵染：将0.1ml农杆菌侵染液用1mL注射器注入梨苗距根部1.5cm位置，然后用脱脂棉沾取少量菌液包裹伤口移入土中继续培养(图2)。
(3)经过筛选及鉴定获得转化成功的阳性植株
逆转录-PCR检测：选取生长良好的梨实生苗转化植株的毛状根，收集毛状根提取总RNA，进行反转录后，以cDNA为模板，利用Premier 5.0设计引物，进行逆转录-PCR检测，以未侵染的根作为阴性对照，pROK2-35S:mCherry质粒为阳性对照，扩增检测mCherry基因，用1％琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测。
逆转录-PCR检测过程：采用20μL体系(ddH2O 7μL、2×Taq Master Mix10μL、10μM正反向引物各1μL、DNA模板1μL；)，设置PCR程序为，预解链95℃(3min)/解链95℃(3min)/退火60℃(15s)/延长72℃(45s)/后延长(5min)，扩增梨毛状根和质粒中的目的片段。配制1.0％琼脂糖的TAE溶液30～70mL，微波炉加热至完全溶解，待冷却至50～70℃时加入核酸染色剂EB 2.5～5.5μL，倒入模板，冷却后用量程为10μL的移液枪在点样口注入7～10μL的样品和DNA Marker，上样口靠近负极，120V电压下运行10～15min后，拿出胶块，紫外灯下观察、拍照。其中目的片段长度为711bp，PCR对照包括质粒阳性对照和未侵染的实生苗根阴性对照。上述逆转录-PCR检测过程中所使用的正反向引物为：
正向引物：5'-acgggggactctagaggatcc ATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3'，
反向引物：5'-gggaaattcgagctcggtacc TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3'。
结果表明(图3)，34个产生毛状根的植株中，有6个植株及阳性对照质粒均扩增出了大小与mCherry基因完全一致的条带，而阴性对照植株(CK)则没有扩增出相应的条带。
体式荧光显微镜检测：进一步确定mCherry在‘梨’毛状根中的表达，在不损伤植物的情况下，将梨苗直接从盆中取出，用蒸馏水冲洗干净后，直接用体式显微镜对梨毛状根部进行观察，结果表明可以在根中直接观察到mCherry荧光蛋白的红色荧光，而在未转化阴性对照梨根中则无荧光信号(图4)。
PCR和荧光观察的结果显示农杆菌质粒中mCherry基因在梨转化植株的毛状根中稳定表达。本实施侵染20d后，可见不定根在茎的注射部位生长，注射后45天可见毛状根生长良好，使用该方法可在45天获得长势良好的转基因‘梨’毛状根且植株阳性率可达17.6％。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种梨遗传转化方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta a 711
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgggggact ctagaggatc catggtgagc aagggcgagg 40
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggaaattcg agctcggtac cttacttgta cagctcgtcc atgcc 45

Claims (8)

1.一种梨遗传转化方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)播种与育苗：将梨种子经层积发芽并移栽培养梨苗，梨苗生长至6-8片真叶，株高6～8cm时，用于侵染；
(2)挑取含有目的基因的发根农杆菌菌株在液体培养基中振荡培养得到侵染液，将侵染液注射至梨苗距根部1～3cm的位置，然后将梨苗用脱脂棉沾取侵染液包裹伤口继续培养；
(3)经过筛选及鉴定获得转化成功的阳性植株。
2.根据权利要求1所述的梨遗传转化方法，其特征在于，步骤(1)中所述层积发芽的过程为：
层积前浸种：将水和梨种子按5:1的质量比混合浸种，浸种期间每天翻动种子2次，换水1次，并清除空瘪粒和杂质，浸种2天后，将种子捞出，晾1h；
层积方法：先在花盆底部铺3cm厚的湿沙，沙子含水量以紧握成团不滴水、落地即散为准，然后将种子与沙相间分层放置，最上层种子覆3cm厚的湿沙，并盖3-4层报纸用于保水；将花盆放入4℃冷库中，每间隔1-2天喷一次水，以保持湿润。
3.根据权利要求1所述的梨遗传转化方法，其特征在于，
步骤(1)中梨苗的培养条件为：光照16h/黑暗8h，温度25±1℃，湿度50-70％，光照强度为90μmol.m-2.s-1，每2/3天浇水一次；
步骤(2)中侵染结束后，暗处理24h，再置于与步骤(1)相同的培养条件下继续进行培养。
4.根据权利要求1所述的梨遗传转化方法，其特征在于，步骤(2)中所述含有目的基因的发根农杆菌的构建过程为：将目的基因克隆到表达载体上得到重组表达载体，然后冻融法制备发根农杆菌感受态并进行转化得到含有目的基因的发根农杆菌；
所述冻融法制备发根农杆菌感受态并进行转化的步骤如下：
a、首先将发根农杆菌菌株K599于LB固体培养基(含50μg/mL利福平)的平板上划线，28℃恒温倒置培养36-48h；
b、挑取单菌落到2-5mL LB液体培养基(含50μg/mL利福平)，之后按1％接种率接种于100mL LB液体培养基(含50μg/mL利福平)中，28℃/220rpm震荡培养至OD600＝0.8；
c、将菌液分装与50mL无菌离心管中，冰浴10min，于4℃/5000rpm离心10min，弃上清；
d、在超净工作台中加入2-5mL预冷的10％甘油，吸打混匀后加等体积冰预冷的10％甘油，4℃/5000rpm离心10min后弃上清；
e、重复d步骤一次，然后加入200μL过滤除菌的100mg/mL山梨醇溶液重悬制备发根农杆菌感受态；
f、将发根农杆菌感受态分装为50μL/管，液氮速冻后于-80℃保存待用；
g、取500ng重组表达载体加入50μL融化的发根农杆菌感受态中，冰上放置30min；液氮速冻1min后立即37℃水浴1min；冰上放置3min后加入500μL无抗生素LB液体培养基，28℃/220rpm恒温摇床中培养4h，然后5000rpm离心5min，弃去部分培养基，留100μL重悬菌体后涂于含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB平板上放于30℃培养箱中培养36-48h，筛选阳性克隆，并进行PCR鉴定得到含有目的基因的发根农杆菌的阳性菌液。
5.根据权利要求1或4所述的梨遗传转化方法，其特征在于，所述的目的基因为mCherry荧光蛋白基因，所述的表达载体为pROK2表达载体。
6.根据权利要求1所述的梨遗传转化方法，其特征在于，步骤(2)的具体过程为：挑取含有目的基因的发根农杆菌菌株K599，将其单克隆在5mL LB液体培养基(含50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素)中28℃/180rpm振荡培养3-4h，取1mL发根农杆菌菌液加到含25mL LB液体培养基(含50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素)的锥形瓶中28℃过夜培养，OD600值达到0.3-0.4后，将培养物在室温下以8000rpm离心10min，然后重悬于MES缓冲液，60rpm室温缓慢振荡孵育3h得到侵染液；将0.1ml侵染液用1mL注射器注入梨苗距根部1.5cm位置，然后将梨苗用脱脂棉沾取少量侵染液包裹伤口继续培养。
7.据权利要求1所述的梨遗传转化方法，其特征在于，步骤(3)中鉴定阳性植株的过程包括：收集毛状根提取总RNA，进行反转录后，以cDNA为模板，进行逆转录-PCR检测。
8.据权利要求1所述的梨遗传转化方法，其特征在于，步骤(3)中鉴定阳性植株的过程还包括：在不损伤植物的情况下，用体视荧光显微镜观察梨毛状根中荧光蛋白的荧光，与未注射的阴性对照梨苗进行比较。
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