CN110172088B

CN110172088B - 蜡梅转录因子基因CpSNAC1及其应用

Info

Publication number: CN110172088B
Application number: CN201910539966.5A
Authority: CN
Inventors: 刘道凤; 郭曦; 田明杨; 李名扬; 眭顺照
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2019-06-21
Filing date: 2019-06-21
Publication date: 2020-11-13
Anticipated expiration: 2039-06-21
Also published as: CN110172088A

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及蜡梅SNAC1转录因子基因CpSNAC1及其应用。本发明的目的在于为提高蜡梅抗性提供一种新选择。本发明提供了蜡梅SNAC1转录因子，其蛋白质具有如SEQ ID No.2所示氨基酸序列。本发明还提供了所述的蜡梅SNAC1转录因子在调控蜡梅抗生物胁迫能力中的用途，其蛋白质具有如SEQ ID No.2所示氨基酸序列。本发明首次克隆获得蜡梅CpSNAC1基因，通过实时荧光定量PCR技术检测CpSNAC1基因的表达特性，并做转录激活活性验证、亚细胞定位分析、原核表达分析，通过转基因技术，在植物(拟南芥)中验证了该基因的功能。

Description

蜡梅转录因子基因CpSNAC1及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及蜡梅SNAC1转录因子基因CpSNAC1及其应用。

背景技术

蜡梅(Chimonanthus praecox)是蜡梅科(Calycanthaceae)蜡梅属(Chimonanthus)的一种落叶灌木或小乔木，花单生于叶腋，蜡黄色，芳香，具有较强的耐寒性，是少有的冬季开花植物。蜡梅原产于我国，具有悠久的栽培历史，是重要的传统观赏名花。目前关于蜡梅非生物胁迫耐性及冬季成花的分子机制已成为研究热点。

NAC转录因子是植物特有的一类具有多种生物功能的转录因子。其命名源于矮牵牛的NAM、拟南芥的ATAF1\2和CUC2这三个首先被报道基因的首字母。其编码蛋白的N末端具有高度保守的NAC结构域，大约由150个氨基酸组成，负责与DNA和其他蛋白质结合。目前大量研究表明，NAC蛋白参与植物生长发育和器官的模式建成；在植物信号转导以及非生物胁迫应答过程中，NAC作为转录因子起十分重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于为提高蜡梅抗性提供一种新选择。

本发明提供了蜡梅SNAC1转录因子，其蛋白质具有如SEQ ID No.2所示氨基酸序列。

具体的，所述蜡梅SNAC1转录因子的编码基因CpSNAC1具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列。

本发明还提供了所述的蜡梅SNAC1转录因子在调控蜡梅抗胁迫能力中的用途，其蛋白质具有如SEQ ID No.2所示氨基酸序列。

具体的，所述的胁迫为干旱、低温、高温、高盐或脱落酸ABA处理中的至少一种。

具体的，所述的低温为4℃。

具体的，所述的高温为42℃。

具体的，所述的高盐为1mol·L^-1的NaCl。

具体的，所述的干旱为30％质量分数PEG6000处理。

具体的，所述的脱落酸ABA处理为50μmol·L^-1的ABA。

本发明还提供了提高蜡梅抗逆能力的制剂，其主要活性成分为蜡梅SNAC1转录因子，或/和表达蜡梅SNAC1转录因子的载体或宿主，其蛋白质具有如SEQ ID No.2所示氨基酸序列。

具体的，所述的蜡梅SNAC1转录因子的编码基因CpSNAC1具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列。

本发明的有益效果：本发明首次克隆获得蜡梅CpSNAC1基因，并做转录激活活性验证、亚细胞定位分析、原核表达分析，通过转基因技术，在植物(拟南芥)中验证了该基因的功能。本发明的蜡梅CpSNAC1基因在拟南芥中超量表达可提高拟南芥的耐盐性，对干旱胁迫起负调控作用，该结果对蜡梅非生物胁迫响应的研究提供依据，为提高观赏植物非生物胁迫耐性提供参考。

附图说明

图1为CpSNAC1编码的蛋白与其他物种的NAC蛋白的多序列比对结果。序列来源于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)：ZmNAC1(GenBank ID:PWZ31933)、GmNAC1(GenBank ID:NP_001240958)、ANAC072(GenBank ID:OAO97067)、ATAF1(GenBank ID:CAA52771)、ATAF2(GenBank ID:AAM65967)、GmNAC4(GenBank ID:NP_001238424)、NnNAC2(GenBank ID:XP_010268987)

图2为CpSNAC1编码蛋白的蛋白聚类分析。

图3为CpSNAC1基因在不同组织中的表达分析。

图4为CpSNAC1基因在不同花发育时期的表达分析。

图5为不同非生物胁迫下CpSNAC1基因的表达分析。

图6为酵母中CpSNAC1转录激活活性。A：平板示意图；B：酵母菌生长情况；C：β-galactosidase法测定活性。

图7为CpSNAC1的亚细胞定位。35S:GFP：表达阳性对照质粒蛋白的烟草表皮细胞；35S:CpSNAC1-GFP：表达融合蛋白的烟草表皮细胞。(UV：紫外光；Bright：白光；Merge：融合光)

图8为CpSNAC1融合蛋白诱导表达SDS-PAGE电泳检测。M：蛋白Maker；1：pET32a(+)-CpSNAC1重组载体未诱导；2：pET32a(+)-CpSNAC1重组载体诱导。

图9为CpSNAC1重组蛋白诱导表达条件优化的SDS-PAGE电泳检测。A：IPTG诱导时间优化(1h、2h、4h、6h)；B：IPTG诱导温度优化(18℃、28℃、37℃)；C：IPTG浓度优化(0mM、0.1mM、0.5mM、1mM、1.5mM)。

图10为CpSNAC1基因原核表达产物的可溶性SDS-PAGE电泳检测。M：蛋白Maker；1：未诱导pET32a(+)空载体；2：pET32a(+)空载体诱导总蛋白；3：pET32a(+)空载体诱导上清；4：pET32a(+)空载体诱导沉淀；5：pET32a(+)-CpSNAC1重组载体未诱导；6：pET32a(+)-CpSNAC1重组载体诱导总蛋白；7：pET32a(+)-CpSNAC1重组载体诱导上清；8：pET32a(+)-CpSNAC1重组载体诱导沉淀。

图11为转CpSNAC1基因拟南芥叶片中CpSNAC1基因的相对表达量分析。1～9：转CpSNAC1基因拟南芥不同单株系；10：WT野生型拟南芥。

图12为CpSNAC1过表达转基因株系与野生型株系在干旱胁迫下的表型鉴定和植株存活率统计。WT：野生型株系；CpSNAC1-8，CpSNAC1-5，CpSNAC1-2：CpSNAC1过表达转基因株系。A图从左到右分别为为干旱处理前、干旱处理14天后、复水后4天拟南芥状态。

图13为干旱胁迫条件下转基因植株与野生型株系生理指标测定结果。A：叶绿素含量；B：相对电导率；C：脯氨酸含量。WT：野生型株系；CpSNAC1-8，CpSNAC1-5，CpSNAC1-2：CpSNAC1过表达转基因株系。

图14为CpSNAC1过表达转基因株系与野生型株系在300mM盐胁迫下的表型鉴定和植株存活率统计。WT：野生型株系；CpSNAC1-8，CpSNAC1-5，CpSNAC1-2：CpSNAC1过表达转基因株系。A图左为处理前拟南芥状态，右为300mM NaCl处理14天后拟南芥状态。B图为植株存活率统计。

图15为300mM盐胁迫条件下转基因植株与野生型株系生理指标测定结果。A：叶绿素含量；B：相对电导率；C：脯氨酸含量。WT：野生型株系；CpSNAC1-8，CpSNAC1-5，CpSNAC1-2：CpSNAC1过表达转基因株系。

具体实施方式

实施例1蜡梅CpSNAC1基因的分离

用Trizol法提取蜡梅叶片总RNA，通过反转录合成cDNA。根据蜡梅花转录组数据库库中已知的序列片段，用软件Primer primer 5.0设计特异引物进行PCR扩增，引物序列如下：

NAC1-ORF-F：5'-gttgtgaggcgcatttcttgcgt-3'(SEQ ID No.3)

NAC1-ORF-R：3'-gcttctgctctacatgctcttcctc-5'(SEQ ID No.4)

以蜡梅cDNA为模板，扩增蜡梅CpSNAC1基因，PCR反应体系及反应条件如下：ddH₂O17.8μL，10×HiFiTaq PCR BufferⅡ2.5μL，dNTP(10mM)1.5μL，SNAC1-ORF-F(10μM)1μL，SNAC1-ORF-R(10μM)1μL，蜡梅cDNA 1μL，TaKaRa Ex Taq^TM 0.2μL。94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火

30s，72℃延伸1min，28个循环；72℃延伸10min。

将PCR产物回收后连接到pMD19-T载体，转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取重组子进行测序。

注：实验所用RNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；ExTaq(Lot#I202708)高保真聚合酶、

RT-PCR Kit反转录试剂盒均购自日本TaKaRa公司(大连)；大肠杆菌感受态DH5α由西南大学园林花卉研究所保存。

蜡梅CpSNAC1基因cDNA序列如SEQ ID No.1所示。CpSNAC1基因的cDNA全长为1008bp，包含891bp的最大开放阅读框，编码297个氨基酸。在NCBI数据库进行Blastp对比(图1)，结果显示蜡梅CpSNAC1基因编码蛋白(SEQ ID No.2)与拟南芥ATAF1、ATAF2，大豆GmNAC2，玉米ZmNAC1蛋白序列具有较高的同源性。构建进化树分析发现(图2)，CpSNAC1属于SNAC亚家族，在遗传性距离上，CpSNAC1与大豆GmNAC2、拟南芥ATAF1的进化距离较近，ATAF1、GmNAC2及ZmNAC1等基因已经被证明具有胁迫响应功能。

实施例2蜡梅CpSNAC1基因表达特性分析

1蜡梅花发育不同时期、各个组织及其幼苗不同胁迫处理材料的采集

采取蜡梅的根、茎、子叶、幼叶、成熟叶、内瓣、外瓣、雄蕊和雌蕊的实验样品经液氮预冷保存于-80℃冰箱备用。再分别采取蜡梅花萌动期、花蕾期、露瓣期、初开期、盛开期及衰败期几个时期的花，每个时期取三个平行实验的样品经液氮预冷之后保存于-80℃冰箱。将在温室培养的大小一致且健壮的蜡梅幼苗用来进行低温(4℃)、高温(42℃)、高盐(NaCl1mol·L^-1)、干旱(30％PEG6000)和脱落酸(ABA 50μmol·L^-1)非生物胁迫处理。将低温处理的幼苗放入4℃的低温人工气候培养箱，将按浓度配好的NaCl、PEG、ABA的溶液喷洒蜡梅幼苗叶片进行非生物胁迫，每个处理设置0h、0.25h、1h、6h、12h等5个时间梯度，每个时间处理设计三个重复编号。

2蜡梅总RNA提取及cDNA第一链的合成

RNA提取采用的是Trizol试剂方法，具体操作：

(1)取植物新鲜组织在液氮中充分研磨，取大约0.50mg放入1.5mL Rnase-Free离心管中，加入600μL Trizol(在通风橱中进行)涡旋1min振荡混匀。

(2)将裂解后的液体在室温下放置10min，使核酸与核蛋白充分分离。

(3)加入120μL氯仿(20％)，盖好管盖，涡旋振荡30s，室温放置10min。

(4)4℃12000rpm离心15min，样品分3层，下层有机，中间层和上层无水色相，RNA主要存在于水相中，把水相(约200μL)转移到新的Rnase-Free离心管中(注意不要吸中间层物质，否则会有DNA污染)。

(5)往转移液中缓慢加入2倍的无水乙醇(约400μL)轻混匀。

(6)将混合液(可能有沉淀)12000rpm离心10min，吸取上清，留白色沉淀。

(7)往沉淀中加入700-800μL的75％乙醇漂洗、重悬静置2min，12000rpm离心1min，吸取上清留下白色沉淀。

(8)重复7三次。

(9)将有沉淀的离心管在超净工作台上吹15min，至沉淀变为透明状。

(10)加入30～50μL Rnase-Free ddH₂O，静置5min后电泳检测。

蜡梅cDNA第一链的合成：用PrimeScript RT-PCR Kit反转录试剂盒以及提取的总RNA合成cDNA第一链。

(1)去基因组DNA的反应：5×gDNA Eraser Buffer 2μL，gDNA Eraser 1μL，蜡梅总RNA 1μL，RNase-freeddH₂O 6μL。42℃反应5min，获得反应液Ⅰ。

(2)反转录反应：反应液Ⅰ10μL，5×PrimeScript Buffer 4μL，Prime ScriptEnzyme Mix I 1μL，RT Primer Mix1μL，RNase-free ddH₂O 4μL。37℃反应15min，85℃反应5s。-20℃冰箱保存反应产物。

3荧光定量

(1)实时荧光定量PCR引物的设计

选用蜡梅Actin和Tublin基因作为双内参基因，运用Primer Premier 6.0软件设计内参基因和目标基因CpSNAC1扩增所需的特异引物，引物序列见表1。

表1引物

(2)实时荧光定量PCR引物特异性检测

采用EvaGreen染料法进行荧光定量PCR检测。预实验按照SsoFast^TM

Supermix试剂盒(Bio-Rad)说明书进行，3次技术重复，反应体系：2×SsoFastEvaGreenSupermix 5μL，Primer-F(10μM)0.5μL Primer-R(10μM)0.5μL cDNA模板0.5μL RNase FreedH₂O 3.5μL；反应条件如下：95℃预变性30s，95℃变性5s58℃退火5s，39个循环。每个循环后采集荧光信号，反应结束后从65℃-95℃做溶解曲线分析，分析扩增的特异性。

(3)CpSNAC1基因表达的荧光定量分析

以反转录获得的cDNA为模板，按照预实验配制的反应体系，对CpSNAC1基因在蜡梅不同花发育时期及幼苗在不同非生物胁迫处理下的表达情况进行实时荧光定量PCR分析。试验所得的数据用Bio-RadManager^TM Software(Version 1.1)分析，用2^-ΔΔCT法计算CpSNAC1基因在不同材料中的相对表达量。

注：本步所用Trizol试剂，

RT-PCR Kit反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司(大连)；SsoFast^TM EvaGreen Supermix荧光定量试剂盒购自百乐(Bio-Rad，美国)公司；所用主要设备有NANODRAC2000微量核酸测定仪(美国Thermo)，Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪等。

通过对CpSNAC1基因在各组织的表达分析显示，CpSNAC1基因在各器官各组织中均有所表达，其中在成熟叶中表达量最高，总体来说在叶片中的表达量较高，其次是雄雌蕊，在茎中表达量最低(图3)。检测该基因在蜡梅花发育各时期的表达量发现，该基因在各时期均有表达，其中在蜡梅花朵萌动期的表达量最高(图4)。

进一步分析CpSNAC1基因在非生物胁迫和激素的表达模式，结果表明该基因能够被低温、高温、NaCl、聚乙二醇PEG和脱落酸ABA诱导表达，并在随着不同的胁迫处理时间呈现出不同的表达模式(图5)。

实施例3蜡梅Cp SNAC1基因亚细胞定位

1亚细胞定位载体的构建

去除CpSNAC1基因终止子后，分析基因ORF框所含酶切位点种类及所用的亚细胞定位载体pCAMBIA1300-GFP多克隆位点酶切位点的需要，在两端设计含酶切位点的特异引物CpSNAC1-F、CpSNAC1-R，分别在基因上下游引入SalI和BamHI酶切位点。

引物序列如下：

CpSNAC1-F:5'-gcgtcgcgacTCTAAAACCAGGAGGCAG-3'(SEQ ID No.11)

CpSNAC1-R:5'-cgggatccGTCATGGGTTGATGGGCA-3'(SEQ ID No.12)

PCR扩增CpSNAC1基因，PCR体系及条件如下：ddH₂O 17.8μL，10×HiFi TaqPCRBuffer 2.5μL，dNTP(10mM)2.0μL，CpSNAC1-F(10μM)1μL，CpSNAC1-R(10μM)1μL，质粒模板1μL，HiFi Taq^TM 0.2μL。94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，28个循环；72℃延伸10min。

取2μLPCR产物经琼脂糖凝胶电泳初步检测后，回收目的片段进行连接转化培养，挑取单克隆进行PCR鉴定，扩大培养阳性克隆，提取质粒进行酶切验证。用SalⅠ和Bam HI酶分别酶切该重组质粒和载体pCAMBIA1300-GFP，37℃酶切4h，80℃灭活30s，1％琼脂糖凝胶电泳后，回收酶切产物中载体大片段及目的小片段。用T4连接酶连接两个片段，4℃连接过夜。酶切反应体系如下：10×green buffer 2μL，BamHI0.5μL，SalI 0.5μL，重组质粒/pCAMBIA1300-GFP 7μL，ddH₂O 10μL。连接体系如下：ddH₂O 1μL，目标片段6.7μL，载体片段1μL，10×T4buffer 1μL，T4DNA ligase 0.3μL。4℃过夜连接，将过夜的连接产物转化大肠杆菌TOP10后，涂布在含kan(50mg/L)的LB平板上37℃倒置过夜培养，挑取单克隆进行PCR菌液检测，扩大培养阳性克隆，提取质粒进行酶切验证。将PCR鉴定和酶切验证均正确的阳性质粒进行测序，确定无碱基突变后，命名为pCAMBIA1300-CpSNAC1，即为CpSNAC1基因亚细胞定位载体。

将重组质粒pCAMBIA1300-CpSNAC1以电转法转化农杆菌GV3101感受态细胞(西南大学园林花卉研究所提供)，挑取单菌落，置于800μL含有YEB+Kan+Gen无菌的1.5mL离心管中(50mg/LKan和3Gen)中，28℃振荡培养36～48h，以菌液为模板进行PCR检测。验证正确的农杆菌菌液即为含有表达载体pCAMBIA1300-CpSNAC1重组质粒的工程菌。

2融合载体注射烟草表皮细胞

将含有pCAMBIA1300-CpSNAC1载体质粒和空载质粒的农杆菌工程菌分别加入50mLYEB液体培养基，28℃，180rpm振荡培养至OD600＝1.0～2.0。离心后用包含0mg/L Kan、50mg/L Gen、200uM AS、10mM MES-KOH(PH值5.7)、10mMgCl₂的注射缓冲液重悬，调整OD至0.5。选取4～6叶期(一月龄)健壮本氏烟草，用1～2mL注射器吸取农杆菌渗透注射悬浮液，去除针头，左手食指前端平顶叶片针孔处，右手轻推注射器使液体缓慢注射入叶片内。小孔注射后避光保湿培养36h，小心切取所取注射部位的2mm*2mm烟草叶片组织，浸没于5g/mL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液中3～5min。然后在载玻片上滴一滴10％甘油，将叶片背面朝下铺于载玻片上，盖上盖玻片后置于共聚焦显微镜下，488nm处激发GFP，40倍镜下观察烟草表皮细胞中绿色荧光表达情况并拍照保存。

注：实验所用本式烟草(Nicotiana Benthamiana)、根癌农杆菌(AgrobacteriumTumefaciens)菌株GV3101、亚细胞定位载体pCAMBIA1300-GFP由西南大学园林花卉研究所提供；限制性内切酶SalI、BamHI以及T4DNA连接酶购自日本TaKaRa公司(大连)；Bio-RadMolecular Imager Gel Dox XR+紫外与可见分析系统来自美国Bio-Rad公司。

实验结果显示，空载体pCAMBIA1300-GFP荧光信号则分布于整个细胞，而重组质粒的GFP融合蛋白荧光信号只分布在细胞核中(如图7)，说明其GFP融合蛋白定位于烟草表皮细胞的细胞核。综上，CpSNAC1基因具有核定位的性质。

实施例4蜡梅CpSNAC1基因转录激活活性分析

1酵母表达载体的构建

根据CpSNAC1基因ORF全长的位置，设计一对基因特异引物，并分别在引物上下游加入酶切位点Xmal和SalI及相应的保护碱基；根据已知的VP16人工转录激活酶基因，设计一对带酶切位点的特异引物，并在引物上游加上酶切位点NcoI以及引物下游包含CpSNAC1的前20个碱基，根据已知的CpSNAC1基因ORF序列，设计一对异引物，上游引物不带酶切位点，下游引物同JMCpSNAC1-R，进行两轮PCR，从而获得CpSNAC1基因ORF连VP16序列片段。引物序列：

(1)CpSNAC1-ORF获得

CpSNAC1-F(JM)：

5'-tccccccggggGAACAGCAATCGGTTGTGAGGC-3'(SEQ ID No.13)

CpSNAC1-R(JM)：5'-gcgtcgacGGTGAGTTGTAGCCTGGGTATG-3'(SEQ ID No.14)

(2)CpSNAC1-VP16获得

VP16-F：5'-catgccatggGAACAGCAATCGGTTGTGAGGC-3'(SEQ ID No.15)

VP16-R：5'-GCAGTGGCAGACTCACATAGGGTGAGTTGTAGCCTGGGTATG-3'(SEQ ID No.16)

CpSNAC1-F：5'-GAACAGCAATCGGTTGTGAGGC-3'(SEQ ID No.17)

CpSNAC1-R：5'-gcgtcgacGGTGAGTTGTAGCCTGGGTATG-3'(SEQ ID No.18)

以提取的CpSNAC1基因的质粒作为模板进行PCR扩增，反应体系和扩增条件如下：ddH₂O 17.8μL，10×Ex Taq PCR Buffer 2.5μL，dNTP(10mM)1.5μL，Forword Primer(10μM)1μL，Reverse Primer(10μM)1μL，模板1μL，Ex Taq^TMDNA聚合酶0.2μL。94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，28个循环；72℃延伸10min。将PCR产物回收目标片段，连接到pMD19-T克隆载体上，并转化大肠杆菌，进行PCR验证，将鉴定是阳性的菌落送测。

提取三种不同阳性重组子以及pGBKT7载体的质粒进行酶切，电泳后回收目的片段，酶切体系如下：

(1)CpSNAC1-ORF片段以及pGBKT7载体片段获得：质粒DNA 12μL，10×greenbuffer 2μL，Xmal

1μL，ddH₂O 5μL。回收目标片段12μL，10×green buffer 2μL，SalI 1μL，ddH₂O 5μL。

(2)CpSNAC1-VP16片段获得：质粒DNA 12μL，Buffer 10X Tango^TM2μL，SalI 1μL，NcoI 1μL ddH₂O5μL。各回收片段按照Fermentas公司的T4连接酶说明书进行4℃过夜连接，连接体系如下：ddH₂O 1μL，目标片段6.5μL，pGBKT7载体片段1μL，Buffer 10X Tango^TM1μL，T4DNA ligase 0.5μL。

把连接产物转化到大肠杆菌DH5α，并涂布在含50mg/L Kan的LB平板上于37℃倒置过夜培养，挑取单克隆进行PCR检测，将阳性的菌液送测。将测序正确的菌液活化后提取质粒进行双酶切验证，双酶切验证正确则表示CpSNAC1基因酵母表达载体构建成功。分别命名为pGBKT7-CpSNAC1-ORF，pGBKT7-CpSNAC1-VP16。

2转录激活活性验证及活力测定

将构建成功的三种重组质粒pGBKT7-CpSNAC1、pGBKT7-CpSNAC1-VP16和pGBKT7-VP16以及空载体pGBKT7转入酵母菌株AH109中，将这四种质粒分别涂布在SD/Trp单缺培养基上，30℃，培养3d。发现，除了空载体pGBKT7质粒不能正常生长以外，其余三种重组质粒均能正常生长。这三种重组质粒成功激活了酵母菌株AH109中含有的报告基因LacZ，说明成功转入到了酵母菌株AH109中。而继续挑取其阳性单克隆菌株，划线于SD/His+X-α-gal筛选培养基上，30℃培养3d后，发现除了空载体pGBKT7没有变成蓝色以外，其余三种重组质粒均变成蓝色(图6-B)。这三种重组质粒激活了酵母菌株AH109中的His报告基因，而pGBKT7质粒并没有这个功能。因此初步判定CpSNAC1基因具有转录激活活性。

按照Yeastβ-Galactosidase Assay Kit试剂盒说明书的步骤测定该基因的β-galactosidase活性，发现CpSNAC1基因的活力高于VP16的转录激活活力(图6-C)，表明CpSNAC1基因是转录激活子。

注：实验所用Yeastβ-Galactosidase Assay Kit试剂盒来自天根生化科技(北京)有限公司；酵母菌株AH109、pGBKT7载体均购于美国Clontech公司，VP16质粒、pGBKT7-VP16重组质粒(西南大学食品科学院提供)；酵母YPDA培养基粉末，酵母单缺培养基粉末(SD/Trp、SD/His)，均购于美国Clontech公司。

VP16序列：

atggcccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccacttagacggcgaggacgtggcgatggcgcatgccgacgcgctagacgatttcgatctggacatgttgggggacggggattccccgggtccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtgggtaa(SEQ ID No.27)

实施例5蜡梅CpSNAC1基因原核表达分析

1原核表达载体构建

根据CpSNAC1基因的最大ORF框设定一对特异引物，并且分别加上下游引物的酶切位点BamH I和Hind III以及相应的保护碱基。

引物序列如下：

YH-BamH I-F:5'-cgggatccTTGGCTTATCGGCTCCGGTG-3'(SEQ ID No.19)

YH-Hind III-R:5'-cccaagcttTACGGTGGTTAGGGAAATCA-3'(SEQ ID No.20)

以测序鉴定正确的CpSNAC1基因T载体克隆阳性菌落质粒DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系及条件如下：ddH₂O 17.8μL，10×PCR Easy Taq Buffer 2.5μL，dNTP(2mM)2.0μL，YH-BamH I-F(10μM)1μL，YH-Hind III-R(10μM)1μL，质粒模板1μL，ExTaqDNA聚合酶0.2μL。94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，28个循环；72℃延伸10min。

将PCR产物与1％的琼脂糖凝胶上电泳检测，回收PCR产物并连接克隆载体pMD19-T，连接产物转化大肠杆菌Top10，菌液经PCR鉴定后，挑选阳性菌液进行测序。根据测序结果，将连接有目的基因CpSNAC1的重组质粒命名为CpSNAC1-T。提取重组质粒和pET32a载体质粒，用BamHⅠ和HindⅢ分别酶切CpSNAC1-T质粒和pET32a(+)载体，酶切体系如下：GreenBuffer 2.5μL，BamHⅠ0.5μL，HindⅢ0.5μL，CpSNAC1-T/pET32a(+)15μL，ddH₂O 6.5μL。

37℃酶切2～4h，70℃灭活10min，琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物中CpSNAC1-T小片段及pET32a(+)载体大片段。目的片段与表达载体的连接按照Fermentas公司的T4连接酶说明书进行4℃过夜连接，连接体系如下：10×T4DNA Ligase Buffer 2.5μL，Insert DNA约0.3pmol，载体DNA约0.03pmol，T4DNA Ligase1μL，加ddH₂O至总体积25μL。

将连接产物进行转化、PCR检测、质粒提取。将提取的质粒用BamHⅠ和HindⅢ进行双酶切验证。将PCR检测和双酶切鉴定均正确的阳性质粒送生物公司测序，比对后确定无碱基突变，即获得CpSNAC1基因的原核表达重组质粒，命名为pET32a(+)-CpSNAC1。

2重组蛋白的诱导表达、条件优化及可溶性分析

2.1诱导表达及电泳检测

(1)将验证为阳性的重组质粒pET32a(+)-CpSNAC1和载体质粒pET32a(+)分别转化原核表达菌株BL21(DE3)Chemically Competent Cell，接种于Amp抗性的LB平板，37℃过夜培养；

(2)挑取阳性单克隆，接种于10mL LB液体培养基(含Amp 50mg/L)，37℃，180rpm震荡过夜；

(3)将此培养物以1:100(v/v)的比例接种LB液体培养基(含Amp 50mg/L)扩大培养，37℃震荡培养至OD600＝0.6时(约3h)，加入异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mmol/L诱导。同时，设置未加诱导剂的菌液作为对照，继续培养4h后，收集pET32a(+)-CpSNAC1/BL21菌液和pET32a(+)/BL21菌液各1mL(同时，收集未加诱导剂的菌液各1mL)；

(4)将样品离心收集菌体，加入100μl PBS缓冲液重悬菌体，在1:3(v/v)的比例加入4×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴中煮10min，12,000rpm离心2min。取10μL上清进行12％SDS-PAGE电泳分析。SDS-PAGE电泳：

(1)制胶：按照比例配制12％分离胶，快速混匀后灌入制胶槽内，加入无水乙醇排去气泡，压平胶面；静置40min使其彻底凝固。凝固后将无水乙醇倒出并用滤纸吸干残留的无水乙醇。按比例配制5％的浓缩胶，快速混匀后平稳的将其倒入至距离边缘0.5cm处，马上插入1.0mm厚的梳子，避免气泡，垂直放置至浓缩胶凝固后拔掉梳子，用电解液冲洗孔道。

(2)点样：取21μL蛋白样品，加入4×SDS-PAGE上样缓冲液7μL，沸水浴中煮10min，冷却至室温后12,000rpm离心10min，吸取上清10μL加样。

(3)电泳：电泳槽中倒入1×电泳缓冲液，溴酚蓝指示剂在浓缩胶时，电压恒定在80V；跑至分离胶时，稳压120V，当指示剂距板底0.5cm时，停止电泳。

(4)染色：将凝胶放入盛有染色液的培养皿中，置于低速摇床上染色1h。

(5)脱色：将染色后的凝胶用蒸馏水漂洗数次后放入装有脱色液的培养皿中，置于低速摇床上脱色，中途更换脱色液1～2次，直到蛋白质条带清晰。在观片灯上观察与照相。

2.2CpSNAC1重组蛋白诱导表达条件的优化

(1)诱导时间优化

将含有重组质粒pET32a(+)-CpSNAC1的大肠杆菌BL21(DE3)活化后，将培养物以1:100(v/v)的比例接种到50ml LB液体培养基(含Amp 50mg/L)扩大培养，37℃震荡培养至OD600＝0.6时(约3h)，加入IPTG诱导(采用经过IPTG诱导优化后获得较好结果的浓度)，继续诱导培养，分别在1h、2h、4h、6h时收集1mL菌液；将不同时刻收集到的样品离心获得菌体，加入100μL PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)重悬菌体，在以1:3(v/v)的比例加入4×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴中煮10min，12,000rpm离心2min。取10μL上清进行12％SDS-PAGE电泳分析。

(2)诱导温度优化

将培养物以1:100(v/v)的比例接种到50ml LB液体培养基(含Amp 50mg/L)扩大培养，37℃震荡培养至OD600＝0.6时(约3h)，加入IPTG诱导(采用经过IPTG诱导优化后获得较好结果的浓度)，分别在18℃、28℃、37℃诱导6h，各温度条件下收集1mL菌液；将不同温度条件下收集到的样品离心获得菌体，加入100μL PBS缓冲液重悬菌体，在以1:3(v/v)的比例加入4×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴中煮10min，12,000rpm离心2min。取10μl上清进行12％SDS-PAGE电泳分析。

(3)IPTG诱导剂浓度优化

将培养物以1:100(v/v)的比例接种到50mL LB液体培养基(含Amp 50mg/L)扩大培养，37℃震荡培养至OD600＝0.6时(约3h)；将上述菌液分为4瓶，各10mL，分别加入终浓度为0.1mM、0.5mM、1.0mM、1.5mM的IPTG进行诱导表达6h。收集不同诱导剂浓度的菌液各1mL；将收集到的样品离心获得菌体，加入100μL PBS缓冲液重悬菌体，在以1:3(v/v)的比例加入4×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴中煮10min，12,000rpm离心2min。取10μL上清进行12％SDS-PAGE电泳分析。

2.3CpSNAC1基因原核表达产物的可溶性分析

(1)将含有空载体质粒pET32a(+)和重组质粒pET32a(+)-CpSNAC1的BL21(DE3)菌株加入10mL LB液体培养基(含50mg/L Amp)中培养过夜。

(2)按1:100(v/v)的比例分别接种至100ml LB液体培养基(含50mg/L Amp)中扩大培养，37℃，200rpm振荡培养至对数生长期(OD600达到0.6左右)，加入IPTG至终浓度0.1mM，37℃，180rpm振荡诱导6h。同时设置空白和阴性对照，即不加入IPTG的含空载质粒pET32a(+)和重组质粒pET32a(+)-CpSNAC1的BL21(DE3)菌液，同时进行振荡培养。

(3)诱导结束后，分别收集诱导菌液，4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，将离心管倒置在吸水纸上吸干，加入PBS缓冲液重悬菌体，4℃，12,000rpm离心10min，弃上清(重复1次)。最后加入6～8ml PBS缓冲液重悬菌体，-80℃保存备用。

(4)取未诱导的空载体和重组质粒菌液各1mL，4℃，12,000rpm离心10min，沉淀用1mL PBS缓冲液重悬后，吸取21μL加入7μL 4×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸5min，作为空白对照和阴性对照。

(5)将第(3)步得到的菌液用液氮反复冻融3次后，加入溶菌酶至1mg/mL，冰上孵育30min。

(6)将裂解液保持在冰浴中，超声破碎，输出功率200～300W，超声破碎3s，间歇5s，共10min，根据破碎情况，重复2～3次。

(7)破碎后的样品先收集200μL的总蛋白液，剩余破碎样品于4℃，12,000rpm，离心30min，收集90μL上清制备电泳上样品，剩余上清转移到一个干净离心管中，-20℃保存。沉淀用5min PBS缓冲液重悬沉淀，4℃，12,000rpm，离心10min(重复2次)。最后用2～4mL PBS缓冲液重悬沉淀，取90μL制备电泳上样品。

(8)再以1:3(v/v)的比例向收集的总蛋白液、上清、沉淀中加入4×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴中煮10min，12,000rpm离心2min。取10μL上清进行12％SDS-PAGE电泳分析。

注：实验所用原核表达菌株BL21(DE3)Chemically Cell购自于北京全式金生物技术有限公司，原核表达载体pET32a(+)由本西南大学园林花卉研究所提供。所用仪器主要有SCIENTA-II D型超声波细胞粉碎机隔音箱(宁波新芝生物科技股份有限公司)，POWER PAC3000电泳仪。

实验结果显示，融合蛋白pET32a(+)-CpSNAC1在58kD左右处有较为明显的特异表达(图8)；该融合蛋白的表达量随着诱导时间的增加而增多，在6h时，达到最大(图9A)；在一定的时间和诱导剂浓度下，该融合蛋白的表达量随着诱导温度的增加而增多(图9B)；在一定时间和温度的诱导条件下，没有诱导剂时，融合蛋白并没有表达出特异的条带，而随着诱导剂浓度的增加，融合蛋白的表达量并没有呈现出太明显的变化(图9C)。

目的蛋白经过IPTG诱导剂诱导之后的重组载体pET32a(+)-CpSNAC1在破碎离心后沉淀中有特异表达，上清液中基本没有表达出的目的蛋白。结果表明该融合蛋白主要存在于沉淀中，初步判断为包涵体蛋白(图10)。

实施例6农杆菌介导的蜡梅CpSNAC1基因转化(拟南芥)

1蜡梅CpSNAC1基因植物超表达载体的构建

根据蜡梅基因CpSNAC1的最大ORF框序列以及结合植物表达载体pCAMBIA-1300的多克隆位点的分析，设计一对特异的引物序列，并且在引物的上下游分别加上酶切位点SacI和XbaI以及它们相应的保护碱基。引物序列如下：

CpSNAC1-F-z:5'-gcgagctcAACAGCAATCGGTTGTGAGGC-3'(SEQ ID No.21)

CpSNAC1-R-z:5'-gctctagaACTTTGGCTGGCTCTGGACCT-3'(SEQ ID No.22)

以提取得到的CpSNAC1基因的质粒为模板进行PCR扩增，扩增体系及条件如下：ddH₂O 17.8μL，10×PCR Easy Taq Buffer 2.5μL，dNTP(2mM)2.0μL，P-CpSNAC1-F(10μM)1μL，Q-CpSNAC1-R(10μM)1μL，质粒模板1μL，ExTaq DNA聚合酶0.2μL。94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，28个循环；72℃延伸10min。

将PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳后，回收目标片段，然后连接到pMD19-T克隆载体上，并转化到大肠杆菌中，涂布于Amp抗性的LB平板上37℃倒置过夜培养，挑单克隆菌落进行PCR鉴定，将阳性菌落送测。

将测序正确的含目的基因的单菌落提取质粒，用Sac I和Xba I分别酶切带酶切位点的CpSNAC1基因质粒和pCAMBIA1300载体质粒，反应体系如下：质粒DNA 12μL，10×greenbuffer 2μL，Xba I 0.5μL，Sac I 0.5μL，ddH₂O 5μL。

37℃恒温箱酶切3～4h，80℃灭活5min。1％琼脂糖电泳后回收各自片段。将回收的CpSNAC1基因片段和pCAMBIA1300载体片段连接，连接体系同上。

把连接产物转化到大肠杆菌中，并涂布在含50mg/L Kan的LB平板上于37℃倒置过夜培养，挑取单克隆进行PCR检测，阳性的菌液送测。将测序正确的菌液活化后提取质粒进行双酶切验证，双酶切验证正确则表示CpSNAC1基因植物超表达载体构建成功。命名为pCAMBIA1300-CpSNAC1。以电转的方式将重组质粒转到农杆菌GV3101中。

2蜡梅CpSNAC1转化拟南芥

(1)拟南芥的培养

取适量拟南芥种子于1.5mL离心管中，并向离心管中加入17％浓度的次氯酸钠(NaClO)消毒8～10min(期间充分振荡)，快速用枪头将上层的NaClO溶液洗掉，然后无菌水将种子冲洗5-6次，再用移液枪将拟南芥的种子播种在MS培养基上，4℃春化3d后将平板放在16h光照，8h黑暗，2000Lux照明条件，以及22℃、70％湿度的环境下培养，约14天左右将拟南芥移栽至培养基质中(蚯蚓土：蛭石：草炭＝1:1:1)，注意在培养过程中可以减掉拟南芥最开始长出的顶生花序，以达到促进侧枝生长的目的。一般拟南芥在基质中生长到花葶长度约为5cm左右时即可进行侵染。

(2)花序侵染法转化拟南芥

在YEB+Kan 50mg/L+Gen 100mg/L培养基平板上活化含有植物超表达载体质粒的农杆菌，28℃暗培养36-48h。挑取单菌落接种到650μL YEB(Kan：50mg/L，Gen：100mg/L)液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养36～48h。

对培养的农杆菌菌液用特异引物进行PCR鉴定，确定正确后取500μL上述菌液接种于25mL无抗的YEB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养至OD600在1～1.2之间备用。

吸取10mL上述菌液于无菌离心管，28℃，5000rpm离心15min，倒掉上清，收集沉淀，然后用现配侵染液(无菌水+5％蔗糖+0.5‰L-77)重悬，稀释至OD600约0.8。

初次侵染要剪去拟南芥植株上面已开放的花朵，只留下刚刚露白的花蕾，此外可以在处理前一天浇水以保持基质的湿度，侵染前也需要用喷壶将纸箱四壁喷湿。将花葶头大约0.5cm长度放入到浸入侵染液中10秒左右，取出放入纸箱中，避光，于22℃培养20h后取出，然后转移到正常的生长环境中。

侵染1周后根据拟南芥的生长情况看是否能够进行二次侵染以提高转化效率。

(3)转基因拟南芥的筛选和鉴定

在转化1个月后，收取成熟的T0代种子，放在37℃恒温烘箱中约2周后，于4度冰箱存储，用于后续实验。将T0代转基因种子消毒后，播种于含25mg/L Hyg的MS平板上，密封后于4℃冰箱放置3d，然后转移到正常培养环境，转基因拟南芥可以在含Hyg的培养基上正常生长。得到若干不同株系，并对各株系的T1、T2代种子继续筛选，直至所有株系收获的种子播种后都为绿色抗性苗，一般T3代种子即为转基因纯合株系。

利用CTAB法，提取转基因株系以及野生型株系的植株叶片DNA，用一对CpSNAC1基因的特异引物进行PCR鉴定，且重组质粒pCAMBIA1300-CpSNAC1作为阳性对照。结果显示，T₃代转基因拟南芥的DNA和阳性对照质粒都能检测到大小一致的目的条带，而野生型拟南芥的DNA并没有被检测到，表明目的基因CpSNAC1已成功插入到拟南芥基因组中。

(4)转基因拟南芥的荧光定量PCR检测

提取DNA检测为阳性的转基因拟南芥叶片的总RNA，将提取的RNA反转录获得cDNA第一链，用拟南芥的AtActin基因作为内参基因，采用实时荧光定量PCR检测CpSNAC1基因在不同转基因株系种的表达量，每个转基因株系设置2个生物重复以及3个技术重复。引物序列如表2：

表2引物

检测结果显示，CpSNAC1基因在转基因拟南芥中有不同程度的表达，其中2号表达量最高，5号和9号表达量稍低，1、3、6号表达量最低(图11)。选取表达量最高、表达量中等和表达量最低的2号、5号和8号株系代表转基因不同表达量的株系进行表型观察和相关处理。

注：实验所用Silwet L-77购于Sigma公司；SsoFast^TM EvaGreen Supermix荧光定量试剂盒购自Bio-Rad公司；所用主要设备NANO DRAC2000微量核酸测定仪购自Thermo公司，CFX96荧光定量PCR仪购自Bio-Rad公司。

实施例7转基因拟南芥功能分析

1干旱胁迫研究

对表达量高CpSNAC1-2、中CpSNAC1-5和低CpSNAC1-8的三个转基因T3代株系以及野生型株系进行干旱处理两周，观察并拍照记录其表型。复水，4天之后观察复水情况，拍照，统计存活率。本实验重复三次，每次对照盆3个，处理盆9个，苗数为5株/盆。处理完后进行CpSNAC1转基因拟南芥相关生理指标(相对电导率、叶绿素、脯氨酸)的测定(参见郝再彬主编《植物生理实验》的方法)。

通过观察表型发现所有试验植株均受到不同程度的伤害，转基因植株大部分叶片枯黄，生长发育不良，植株萎焉，而野生型拟南芥叶片则大部分呈绿色，植株生长良好。此时对实验植株进行复水处理，4d后观察表型并统计存活率，发现CpSNAC1转基因植株绝大部分不能抵抗干旱胁迫而死亡，野生型拟南芥植株大部分能够复活，植株挺拔，叶片鲜绿，继续生长发育，完成其生活史(图12-A)。复水之后的野生型拟南芥植株有高达82.2％的存活率，转基因株系CpSNAC1-2、CpSNAC1-5、CpSNAC1-8的存活率则仅分别为28.9％、55.6％、66.7％(图12-B)。因此在干旱胁迫情况下，野生型株系的存活率高于CpSNAC1转基因株系。

对干旱迫实验植株进行生理指标测定，结果(图13-A)显示CpSNAC1转基因拟南芥的电导率比野生型拟南芥高了11～28％，CpSNAC1转基因拟南芥的叶绿素含量约为0.21～0.55mg.g^-1，比野生型拟南芥降低了12.7～66.7％，CpSNAC1转基因拟南芥的脯氨酸含量也比野生型拟南芥降低了10.7～42.9％。实验研究结果显示转基因拟南芥的电导率显著高于野生型拟南芥，而叶绿素含量和脯氨酸含量显著低于野生型拟南芥(图13-B、C)。综上所述，CpSNAC1基因与植物抗旱性相关，且在植物的抗旱性上起到负调控作用。

2盐胁迫研究

待上述株系的拟南芥萌发、培养两周之后，用足量的300mM浓度的NaCl溶液处理，每隔三天浇一次，确保每棵植株都能吸饱水。大约两周之后观察植株表型，统计存活率，并拍照记录下来。本实验重复三次，每次对照盆3个，处理盆9个，苗数为5株/盆。存活标准：叶片没有严重萎焉枯黄致死，算为存活植株；而叶片严重萎焉枯竭而死的，为死亡植株。处理完后进行CpSNAC1转基因拟南芥相关生理指标(相对电导率、叶绿素、脯氨酸)测定(参见郝再彬主编《植物生理实验》的方法)。

研究发现拟南芥CpSNAC1转基因株系和野生型株系在300mM NaCl浓度胁迫下，生长均受到一定程度的伤害(图14-A)。通过观察植株表型得知，野生型植株大部分叶片呈黄褐色，生长受损，植株萎焉，不少植株已死亡；CpSNAC1转基因植株虽有少部分叶片枯黄，但大部分叶片仍为鲜绿色，生长发育良好。统计实验植株存活率，转基因株系CpSNAC1-2、CpSNAC1-5、CpSNAC1-8的存活率为分别为44.4％、35.6％、24.4％，野生型株系的存活率为13.3％(图14-B)，CpSNAC1转基因拟南芥存活率高于野生型植株。

对盐胁迫实验植株进行生理指标测定，结果显示野生型拟南芥植株在盐胁迫下，脯氨酸含量约为1500μg.g^-1，而转基因型植株含量约为1760～2300μg.g^-1，含量高出野生型植株17.3～53.3％；野生型叶绿素含量约为0.13mg.g^-1，转基因植株约为0.22～0.43mg.g^-1，高出野生型约69.2～231％；从相对电导率来看，野生型拟南芥植株的相对电导率约为78.5％，而转基因型植株约为54.1～69.5％，转基因拟南芥植株叶片受到的伤害小于野生型植株(图15)。通过生理指标综合分析可得，在盐胁迫下，CpSNAC1转基因拟南芥植株受到的伤害远远小于野生型植株，其耐盐性优于野生型植株。因此，CpSNAC1基因在高盐胁迫下对拟南芥植株起到正调控的作用。

注：实验所用DDS-309+智能电导率仪购自成都世纪方舟科技有限公司，VarioskanFlash全波长扫描式多功能酶标仪购自Thermo Scientific公司。

上文已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，对本技术领域的技术人员，在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<120> 蜡梅转录因子基因CpSNAC1及其应用

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1007

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcagtggcag actcacatag cagattatag aagaaagaag aagaagaaga agaagaagat 60

gagttgtaat ttgcagctgc ctcctggttt tagatttcac ccaacagatg aggaattggt 120

actgcactat ttatgcaaga aatgcgcctc acaaccgatt gctgttccta taattgcaga 180

gattgatctt tataaatatg atccttggca acttcctgga aaggctcttt atggagaaaa 240

ggaatggtac ttcttctctc cgagggaccg gaagtatccg aacgggtcaa ggcccaatcg 300

ggctgcagcg accggatatt ggaaggccac cggagccgat aagccaatta ggcccagtgg 360

aagtctaaag cctgttggaa tcaagaaggc cctggtcttt tatgctggaa aggccccaaa 420

gggtgaaaag tccaactgga tcatgcacga atacaggctt gcagatgttg atcgctctgc 480

taggaagaaa aatagtctaa ggctggacga ttgggtgttg tgtaggatct acaacaaaaa 540

atggggtttg gaaggaaagc aaccaaaatc cagcatcaaa tgcagggaga atgagatgga 600

ggaagagcat gtagagcaga agcctgaact tcttacaaat gcccatcaac ccatgactcc 660

cattctcaac gatttcacct acttcgactc ggccgattcc atacccaggc tacaactcac 720

cgattccagc tgctcggagc acgtggtttc ccccgagttc acctgcgaaa gggaggtcca 780

gagccagcca aagtggaaga gagactggaa caacaccctc cacatccctc ccattaacaa 840

catggatgcc accaatccct ttagtcagat ggacggtgtg gagctttctc cacttttccg 900

aattccgtca ttacaggaca tatccatgta cttgcagaag ccattctgat tgattctatg 960

ggccatccta tttctattct ttcatatgag ccaaccacac atatcac 1007

<210> 2

<211> 296

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Cys Asn Leu Gln Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr

1 5 10 15

Asp Glu Glu Leu Val Leu His Tyr Leu Cys Lys Lys Cys Ala Ser Gln

20 25 30

Pro Ile Ala Val Pro Ile Ile Ala Glu Ile Asp Leu Tyr Lys Tyr Asp

35 40 45

Pro Trp Gln Leu Pro Gly Lys Ala Leu Tyr Gly Glu Lys Glu Trp Tyr

50 55 60

Phe Phe Ser Pro Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser Arg Pro Asn

65 70 75 80

Arg Ala Ala Ala Thr Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Ala Asp Lys Pro

85 90 95

Ile Arg Pro Ser Gly Ser Leu Lys Pro Val Gly Ile Lys Lys Ala Leu

100 105 110

Val Phe Tyr Ala Gly Lys Ala Pro Lys Gly Glu Lys Ser Asn Trp Ile

115 120 125

Met His Glu Tyr Arg Leu Ala Asp Val Asp Arg Ser Ala Arg Lys Lys

130 135 140

Asn Ser Leu Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile Tyr Asn Lys

145 150 155 160

Lys Trp Gly Leu Glu Gly Lys Gln Pro Lys Ser Ser Ile Lys Cys Arg

165 170 175

Glu Asn Glu Met Glu Glu Glu His Val Glu Gln Lys Pro Glu Leu Leu

180 185 190

Thr Asn Ala His Gln Pro Met Thr Pro Ile Leu Asn Asp Phe Thr Tyr

195 200 205

Phe Asp Ser Ala Asp Ser Ile Pro Arg Leu Gln Leu Thr Asp Ser Ser

210 215 220

Cys Ser Glu His Val Val Ser Pro Glu Phe Thr Cys Glu Arg Glu Val

225 230 235 240

Gln Ser Gln Pro Lys Trp Lys Arg Asp Trp Asn Asn Thr Leu His Ile

245 250 255

Pro Pro Ile Asn Asn Met Asp Ala Thr Asn Pro Phe Ser Gln Met Asp

260 265 270

Gly Val Glu Leu Ser Pro Leu Phe Arg Ile Pro Ser Leu Gln Asp Ile

275 280 285

Ser Met Tyr Leu Gln Lys Pro Phe

290 295

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gttgtgaggc gcatttcttg cgt 23

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcttctgctc tacatgctct tcctc 25

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aagcctgaac ttcttacaaa tgcc 24

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

actttggctg gctctggacc 20

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gttatggttg ggatgggaca gaaag 25

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gggcttcagt aaggaaacag ga 22

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tagtgacaag acagtaggtg gaggt 25

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtaggttcca gtcctcactt catc 24

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcgtcgcgac tctaaaacca ggaggcag 28

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgggatccgt catgggttga tgggca 26

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tccccccggg ggaacagcaa tcggttgtga ggc 33

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcgtcgacgg tgagttgtag cctgggtatg 30

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

catgccatgg gaacagcaat cggttgtgag gc 32

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gcagtggcag actcacatag ggtgagttgt agcctgggta tg 42

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gaacagcaat cggttgtgag gc 22

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcgtcgacgg tgagttgtag cctgggtatg 30

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cgggatcctt ggcttatcgg ctccggtg 28

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cccaagcttt acggtggtta gggaaatca 29

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcgagctcaa cagcaatcgg ttgtgaggc 29

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gctctagaac tttggctggc tctggacct 29

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gtatgggtcc gatgttgagt ggc 23

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gcgagtgttg gctaacgaca ag 22

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cttaggtctc ggtcgcag 18

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

atcggtggtt agggacac 18

<210> 27

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

atggcccccc cgaccgatgt cagcctgggg gacgagctcc acttagacgg cgaggacgtg 60

gcgatggcgc atgccgacgc gctagacgat ttcgatctgg acatgttggg ggacggggat 120

tccccgggtc cgggatttac cccccacgac tccgccccct acggcgctct ggatatggcc 180

gacttcgagt ttgagcagat gtttaccgat gcccttggaa ttgacgagta cggtgggtaa 240

Claims

1.蜡梅SNAC1转录因子，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述的蜡梅SNAC1转录因子，其特征在于：所述蜡梅SNAC1转录因子的编码基因CpSNAC1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.蜡梅SNAC1转录因子在调控蜡梅非生物胁迫能力中的用途，其特征在于：SNAC1转录因子的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述的非生物胁迫为干旱和/或高盐。

4.如权利要求3所述的蜡梅SNAC1转录因子在调控蜡梅非生物胁迫能力中的用途，其特征在于：所述蜡梅SNAC1转录因子的编码基因CpSNAC1核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

5.如权利要求3或4所述的蜡梅SNAC1转录因子在调控蜡梅非生物胁迫能力中的用途，其特征在于：所述的高盐为1mol/L的NaCl。

6.如权利要求3或4所述的蜡梅SNAC1转录因子在调控蜡梅非生物胁迫能力中的用途，其特征在于：所述的干旱为30％质量分数PEG6000处理。