CN1201007C

CN1201007C - 编码参与子叶和侧根发育的转录因子的植物基因nac1

Info

Publication number: CN1201007C
Application number: CNB998160865A
Authority: CN
Inventors: 谢旗; 蔡南海
Original assignee: Institute of Molecular Agrobiology
Current assignee: Temasek Life Sciences Laboratory Ltd
Priority date: 1999-02-11
Filing date: 1999-02-11
Publication date: 2005-05-11
Anticipated expiration: 2019-02-11
Also published as: DK1151103T3; DE69919406D1; WO2000047742A1; US6844486B1; DE69919406T2; NO20013688D0; PT1151103E; ES2226428T3; NO20013688L; AU768692B2; CN1354793A; AU3284499A; NZ514072A; ATE273392T1; EP1151103B1; CA2360416A1; EP1151103A1

Abstract

从拟南芥属中分离了一种新基因nacl，这一基因编码的蛋白质(NACl)被鉴别为是NAC家族的一个成员。NACl与NAC基因产物的其它成员在N-末端具有高度氨基酸序列同源性。数据显示NACl属于新鉴别的转录因子家族。NACl参与子叶和侧根发育的调节。所述基因的过表达可导致产生具有比野生型植物大的植物，该植物具有更大的根和更多的侧根。

Description

编码参与子叶和侧根发育的转录因子的植物基因NAC1

发明背景

NAC基因(包括NAM，ATAF1，ATAF2和CUC2)属于目前只在植物中发现的相对大的基因家族。这些基因编码的蛋白质在其N末端至170位氨基酸是保守的，但在其C末端是高趋异的。先前在矮牵牛属植物(Souer等，1996)和拟南芥(Aida等，1997)中进行的遗传研究推测NAC家族的一些成员在茎干(shoot)和花分生组织的图式发育中起作用。

携带无顶端分生组织(nam)突变的矮牵牛属植物胚胎不能发育为茎尖分生组织。nam幼苗上的偶见的茎干所开的花在第二轮发育为10个而不是5个原基。具有同源异型基因green petals的双突变体示出nam在第二轮中的作用不依赖于器官相同性，且在第三轮中也影响原基数。令人惊奇的是，nam mRNA在分生组织和原基的边界的细胞中累积。现已示出nam在确定分生组织和原基的位置中起作用(Souer等，1996)。

拟南芥的基因CUC1和CUC2(代表杯状子叶，CUP-SHAPEDCOTYLEDON)中的突变，导致子叶(胚胎器官)，萼片和雄蕊(花器官)的分离以及茎尖分生组织的形成发生缺陷。这些缺陷大多数在双突变体中呈现。突变体的表型提示在胚胎和花中相同轮内分离相邻器官有一通用机制。克隆CUC2基因，发现其编码与矮牵牛属植物NAM蛋白同源的蛋白质(Aida等，1997)。

本文所用的举例说明本发明的背景，或提供另外关于实施的阐述的出版物及其它材料并入参考，并分别列于所附参考文献表中。

发明概述

本发明阐述了一种新的拟南芥NAC家族成员NAC1。此基因最初通过当过表达时其cDNA改变酵母S.pombe细胞形态的能力而用Xia等(1996)的方法分离。Northern分析显示NAC1以组织特异性方式在根中高水平表达，在叶中低水平表达。原位全样载片实验显示在活性分裂的根和茎干分生组织中表达。

NAC1与NAC基因产物的其它成员在N末端呈高度氨基酸序列同源。利用重组GST-NAC1蛋白和不同的截短的NAC1衍生物的体外DNA结合研究，表明35S启动子的-90区和该蛋白质保守的N末端结构域之间由相互作用。令人感兴趣地，酵母分析显示融合于GAL4 DNA结合结构域的NAC1的C末端能激活转录。不同的缺失融合分析显示反式激活结构域位于NAC1蛋白的C末端。另外，双杂交分析表明NAC1可同源二聚体化，且二聚体化结构域位于蛋白质保守的N末端区。一个21bp推定的二分核定位信号序列发现在N末端保守的NAC结构域中。在地塞米松(Dex)诱导的启动子-GVG系统的控制下，用GFP-NAC1融合结构产生转基因拟南芥。对在Dex诱导条件下表达GFP-NAC1融合蛋白的转基因品系的分析揭示了体内嵌合多肽的核定位。这些数据表明NAC1属于新鉴别家族的转录因子。

本发明第一方面是包含一种基因的转基因植物，这种基因编码NAC1或功能等价蛋白(指与NAC1一样结合相同DNA结合位点的蛋白质，且与NAC1至少有70％，优选80％，更优选90％，最优选95％的相同性)，使转基因植物比非转基因植物生长的大。该植物可以是因为它较重，因为它有较大的叶，较粗的干，更多的根，和/或具有较大的根而较大。

本发明第二方面是一种编码NAC1或功能等价蛋白的基因，其中此基因的转基因植物比非转基因植物生长的大。

本发明的第三方面是NAC1或功能等价蛋白，其中如果植物是用编码NAC1或所述功能等价蛋白的基因转基因生产的，则所述转基因植物将比未转基因植物生长的大。

本发明的另一方面是转基因植物细胞，其含有编码NAC1或功能等价蛋白的基因，使植物细胞比非转基因细胞生长的大。

附图简述

图1：NAC1基因的组织特异性表达。含有10ig分离自不同组织的总RNA的RNA凝胶印迹的放射自显影如图所示。幼苗采自两周龄的植物。茎生叶(叶)，主干和侧枝(干)，花簇(花)，和不同时期的长角采自35-40天土壤生长植物。根取自在SM平板上垂直生长二周的幼苗。滤膜用放射标记的NAC1的C末端杂交，然后用放射标记的18S rDNA探针再探查，作为加样对照。

图2：幼苗及花中NAC1的原位全样载片研究。原位全样载片杂交用地高辛(DIG)标记的C末端特异的反义探针(A，B，C，D和E)，和DIG标记的有义探针(F和G)在幼苗和花中进行的。A和F是12天的幼苗。根材料取自12天幼苗，D是7天幼苗。花取自40天土壤生长植物。

图3：与CaMV 35S启动子-90区结合的GST-NAC1融合蛋白。(A)GST-NAC1融合蛋白结合35S启动子-90区的亲和性。蛋白质数量如下：1泳道，500ng GST蛋白。2-9泳道是NAC1融合蛋白。2和6泳道，10ng；3和7泳道，100ng；4和8泳道，250ng；5和9泳道，500ng。作为非标记竞争剂，使用未标记的相同DNA片段。(B)与GST融合的NAC1的不同缺失图。(C)与CaMV 35S启动子的-90区结合的NAC1融合蛋白的不同缺失。使用20ng每种重组蛋白。

图4：酵母双杂交系统分析中NAC1和NAC1之间的特异相互作用。酵母HF7c细胞用表达GAL4BD或GAL4BD-NAC1融合体的质粒，及表达GAL4^AD或GAL4^AD-NAC1融合体的质粒共转化。(A)根据图中心所示分布状态，细胞在有或无组氨酸加上10mM 3-AT(Sigma)的平板上划线培养。在无组氨酸的情况下生长的能力依赖于GAL4活性的功能重建。(B)与pGA载体融合的NAC1蛋白的不同缺失图。(C)双杂交系统分析中NAC1不同缺失体之间的相互作用能力。

图5：NAC1蛋白中反式激活结构域的定位。将NAC1的不同缺失体克隆入Ga14 DNA结合载体中并转化入酵母菌株HF7c中。将转化混合物铺板于具有或不具有组氨酸且补加必需氨基酸的MM平板上。结果取自生长3天后的平板。

图6：植物中NAC1过表达的影响。(A)在无Dex情况下生长的野生型植物。(B)在有Dex情况下生长的野生型植物。(C)在无Dex情况下生长的转基因植物。(D)在有Dex情况下生长的转基因植物。

图7：C末端特异性反义植物中子叶发育变化。SEM示出子叶的远轴表面。A和D是野生型的，B和E是无严重表型的，C和F，G是严重表型的。字母A，B，和C框内示出详细区域。

图8：野生型或具有反义NAC1的转基因植物种子在MS或MS+Dex培养基上发芽生长。(A)在无Dex情况下生长的野生型植物；(B)用Dex诱导的野生型植物；(C)在无Dex情况下生长的转基因植物；和(D)用Dex诱导的转基因植物。

发明详述

在用Schizosaccharomyces pombe分离植物细胞骨架，细胞周期相关和极性相关蛋白质的计划中分离到nac1基因。将一个在pREP5N的硫胺素阻抑型nmt1启动子的控制下的A.thaliana cDNA文库转化入野生型S.pombe细胞中。当启动子脱阻抑时，一个转化体示出延伸的细胞和多隔性(multiseptimas)。一个cDNA克隆分离自此转化体并再转化入S.pombe中，以证实细胞形态改变是由于该cDNA表达所致。此分离的cDNA(At012)编码324个氨基酸(SEQ ID NO：2)的一个开放读框(ORF)。与GenBank相对照探查此推定的蛋白质序列。BLAST探查表明此蛋白质是新的。此蛋白质的N末端发现含有NAC结构域，这是一个在NAC基因家族的成员(NAM，ATAF1，ATAF2，CUC2)中发现的结构域。此结构域覆盖蛋白质的前175个氨基酸。由nac1编码的蛋白质的剩余部分与任何已知序列无高度同源。

多肽的同源性是用序列分析软件测定的。例如，威斯康辛大学生物技术中心遗传学计算机小组的序列分析软件包(910 UniversityAvenue，Madison，Wisconsin 53705)。蛋白质分析软件通过测定归因于各种取代，缺失及其它修饰的同源性而对比相似序列。保守取代典型的包括以下一组的取代：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。

NAC家族基因只在植物中鉴别。这些基因编码在N末端是高度保守的但在蛋白质其它部分是变化的蛋白质。前两个成员ATAF1和ATAF2来自拟南芥，且通过其在酵母中激活35S花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子的能力而分离(H.Hirt，基因库登记号X74755和X74756)。在番茄叶衰老研究中分离的SENU5 cDNA(基因库登记号Z75524；John等，1997)，和矮牵牛属植物nam基因产物NAM蛋白(Souer等，1996)，是茎尖分生组织正常发育所需的，且已提议用于确定分生组织定位。CUC2(Aida等，1997)是NAM家族成员，且是NAM的拟南芥同源物。拟南芥NAP蛋白也是此家族的成员(Sablowski和Meyerowitz，1998)。最后，GRAB1(基因登记号AJ010829)和GRAB2(基因登记号AJ010830)是两个最近报道的NAC家族成员。这些蛋白来自小麦且能与小麦矮化病毒(WDV)RepA蛋白相互作用。在35S启动子的控制下，GRAB1和GRAB2基因的反式过表达能抑制小麦细胞培养物中WDV复制。

在此报道的研究工作根据保守性和每个模序的电荷将NAC结构域分为5个模序。NAC1蛋白与所有这些蛋白的序列对比揭示NAC1与其它NAC家族成员具有相似特征，相应于新近鉴别的NAC结构域。

nac1的基因组结构通过对比基因组序列与cDNA序列而分析。NAC1基因位于染色体1上。它在N末端编码区包括两个内含子。第一个内含子长度为1215碱基对且存在于第67位氨基酸的密码子内。第二个内含子长度为102碱基对且位于160-161位氨基酸之间。进行结构域探查而鉴别了NAC1的NAC结构域内推定的二分核定位信号。此21个氨基酸的信号序列位于117-137位氨基酸之间，且在NAC家族成员中是第一次发现。用其它报道的NAC家族成员进行相同探查不能显示相似信号。NAC同源物见于水稻EST数据库中，但在其它有机体如哺乳动物，果蝇和酵母中未见有同源物。

NAC1基因的发育调节

为研究NAC1基因在植物发育期间的作用，用nac1特异探针通过Northern分析其表达模式。由于NAC家族成员在N末端甚至在DNA水平是非常保守的，因此使用C-末端探针。来自各个组织的全部RNA的10μg RNA用于杂交。在根中检测到相对高水平的表达(图1)。在含有所有营养组织的两周龄幼苗中见到较低水平表达。在得自干(stem)及叶的材料中检测到非常低的表达。在混合阶段的长角和混合的成花及花序中，即使在长期曝光之后也未检测到表达。

用基因C末端编码区的有义和反义探针对7和12天的植物进行原位全样载片研究。在活性分裂的根和茎尖分生组织中见到nac1表达(图2)。表达在根尖分裂区(图2A和图2B)和侧根形成区(图2C)中特别高。在子叶和幼叶中检测到较低表达。这些结果均相应于Northern结果。在花中未检测到明显的特异杂交(图2E)。同样，在长角和干中未检测到信号(数据未示出)。在与有义RNA探针杂交的幼苗中未观测到特异信号(图2F和2G)。

DNA结合及DNA结合结构域

前两个NAC家族基因ATAF1和ATAF2，通过其在酵母中激活花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子结构的能力而克隆。这两个蛋白质以及其它NAC家族基因在N末端NAC结构域是保守的。来自小麦的GRAB1和GRAB2蛋白也与35S启动子-500区结合。CaMV35S启动子含有一些已知DNA结合元件。已经鉴别一些结合启动子调节区内的不同元件的植物转录因子。

为测试NAC1蛋白是否能结合35S启动子，35S启动子的-90区首先用作探针。将nac1克隆入GST融合载体pGEX4-2T中并转化入大肠杆菌中。纯化重组GST蛋白并进行分析以测试与DNA的特异结合。由于要分析GST融合蛋白，因此GST自身用作对照。即使当使用500ng纯化的蛋白质时，GST也不能结合35S启动子的-90区(见图3)。测试不同量的纯化的GSTNAC1蛋白。用少如10ng的蛋白质及只曝光4小时就可检测到结合(图3A)。必须注意到纯化的GST只含有大约10％完整的GST融合形式。大多数蛋白质在细菌生长和纯化期间降解。这是因为加入IPTG诱导蛋白质表达之后，细菌不能良好生长且蛋白质开始在纯化之前降解。加入过量的未标记的35S启动子竞争剂DNA能以浓度依赖性方式消除DNA-蛋白质复合物形成(图3A)。这些结果表明NAC1蛋白与35S启动子的-90区特异性结合。

对NAC1与AS-1因子和该因子的突变体形式，即35S启动子的-83至-63的结合也进行测试。已经鉴别植物zip转录因子与此区结合。此结合亲和性降低且在最初的AS-1因子和突变形式因子之间未发现明显不同。此结果表明NAC1具有与bZIP转录因子不同的DNA结合位点，及AS-1因子周围的序列对NAC1的特异结合是重要的。

为测试NAC1的DNA结合结构域，将nac1的不同缺失形式克隆入GST融合载体中，并分离融合蛋白以测试与35S启动子的-90区的DNA结合能力。20ng每种蛋白质用于此分析。结果示于图3C。截短形式的GSTNAC1含有是完整NAC结构域的前199个氨基酸。其保持与DNA探针相似的特异性结合。只含有NAC结构域的前三个完整模序和部分IV模序的截短形式丧失DNA结合活性。相似地，此缺失形式的互补体，即含有部分IV模序和完整V模序的蛋白质剩余部分不结合DNA探针。这些结果表明DNA结合结构域位于NAC结构域中，且IV模序对DNA结合是重要的，V模序不足以进行DNA结合。

NAC1同源二聚体和二聚体化结构域

转录因子当与DNA结合时，通常形成二聚体。为确定NAC1是否形成二聚体，使用双杂交方法。此方法有效地用于测试二聚体化并研究蛋白质-蛋白质之间的相互作用，包括二聚体化。将完整的NAC1融合于Gal4 DNA激活结构域和DNA结合结构域，并共转化入报道酵母中。当NAC1由这两个载体表达时，观测到明显的相互作用。即使当应用10mM 3-AT封阻非特异性相互作用时，酵母也能在三天内生长(图4A)。必须指出当NAC1只在DNA结合载体中表达时，其能在低水平自动活化此系统，从而酵母能非常缓慢的生长(图4A)。

为鉴别二聚体化所需的NAC1区，我们构建了一系列缺失体并分析它们在酵母中形成复合物的能力。首先产生从蛋白质第200位氨基酸至末端的C末端缺失体，由此产生前199个氨基酸的蛋白质。此199个氨基酸的蛋白质片段含有完整的NAC结构域，且能与完整的NAC1形成二聚体。此199个氨基酸没有与野生型全长NAC1一样的背景信号。因此，此199个氨基酸用作固定的配偶体以测试其它的缺失体。在活化结构域制备各种不同的缺失体(图4B)。当在pGA中制备相同缺失体(缺失超出199位氨基酸的序列)时，相互作用与完整的蛋白质一样强。但当缺失体影响NAC结构域的模序IV，且构建体只含有NAC结构域的前三个完整模序时，不能形成二聚体(图4C)。只缺失后半部分IV模序和完整V模序的N末端缺失体导致蛋白质不能形成二聚体。此论据强有力的支持了NAC1的NAM结构域含有二聚体化结构域这一论点。IV模序对二聚体形成是重要的，但V模序自身不足以形成二聚体。NAC1蛋白能形成同源二聚体，且此通过凝胶过滤可证实。当细菌表达NAC1的前199个氨基酸的蛋白质时，包括完整NAC结构域的纯化的肽在天然凝胶如变性凝胶中的2倍。

反式激活和反式激活结构域

在酵母双杂交分析中，我们发现NAC1能低水平自动激活系统，但C末端缺失体不能。因此我们使用具有杂合转录因子的经修改的单杂交方法，鉴别NAC1基因的激活结构域。使用只含有Gal4 DNA结合结构域而无激活结构域的pGBT8载体。将NAC1基因的不同缺失体克隆入此质粒中与Gal4 DNA结合结构域融合，并将所得质粒转化入含有UAS_gall-CYC1-HIS3报道基因的酵母中。在组氨酸平板上进行筛选。如果部分融合蛋白含有激活活性，应重建Gal4转录并激活HIS3启动子。随着组氨酸合成，酵母可在没有组氨酸的培养基上生长。Gal4激活结构域用作阳性对照，其具有充足活性，如图5所示。如上所述，完整的NAC1蛋白只有较低激活活性。含有前132个氨基酸或前199个氨基酸的N末端融合体无活性。具有143-199位氨基酸的肽片段的融合体也无活性。相反，含有133位至羧基端氨基酸的融合体充分激活报道基因，提供的信号与阳性对照Gal4转录因子一样强。只含有143-269位氨基酸的融合体也有充足活性。这是高度酸性氨基酸区。只含有后54个氨基酸的C末端融合体的活性低。结果表明NAC1的激活结构域位于C末端。

由于NAC家族只在植物中可见，而在其它有机体中未见到，因此它对检测植物中反式活性是重要的。设计一种体内试验以检测激活结构域。构建两种质粒。第一个携带用CaMV 35S启动子标记的Gal4 DNA结合-MCS-Nos末端盒。测试基因可克隆入MCS的具有Gal4 DNA结合结构域同框。另一质粒含有报道基因构建体6xUAS-TATA-Luc，如果一些蛋白质能结合6xUAS因子以激活启动子，其能表达荧光素酶。用两个质粒以不同组合一起轰击表明此系统是可重复及可应用的。我们用来自VP16病毒的激活结构域作为阳性对照，其具有非常高的活性。相反，第二个质粒(pTALuc)单独或其加上载体pGal也无明显的荧光素酶活性。从酵母系统中获得相似结果。充足的反式激活活性在143-269位氨基酸的肽中鉴别出。后54个氨基酸也有较低活性。NAC1的N末端无活性，载体对照也是如此。在酵母和植物系统中，已证实NAC1含有反式激活结构域且相应于此活性的区域在142-269位氨基酸之间。

过表达和低表达NAC1的转基因拟南芥植物

在此研究中，如前所述使用糖皮质激素诱导的转基因系统(Aoyama和Chua，1997)。糖皮质激素调节的转录因子由GVG编码，GVG的转录由CaMV 35S启动子控制。转基因的转录由糖皮质激素激活的启动子(6XUASgal4)控制。将长度为1287个碱基对的完整NAC1的编码cDNA(SEQ ID NO：1)以两个方向克隆入双向植物转化载体pTA7002中，通过根茎转化法独立转化入Arabidopsisthaliana lansberg生态型中。过表达和低表达转基因品系选自含有潮霉素的培养基。选择6个过表达的独立转基因品系和4个低表达的独立品系。所有品系根据潮霉素抗性分离率分离一个T-DNA基因座。

此6个过表达转基因植物有三种不同表型。其中四个是一种表型，而另两个各有其不同表型。后两种表型类似于以下所述的反义植物。对前四个相似表型的品系的研究示出那些植物在体外和土壤生长条件下均比未转基因植物生长的更快，更大。当应用诱导条件如在平板上垂直生长或在plantcon中生长时，产生更多的侧根。数据代表在体外生长条件下生长。从MS培养基中将不同龄的幼苗移至加入10μM地塞米松(Dex)的MS培养基中，然后在生长一周后检测。每个纯合品系的10种植物在清除琼脂或泥土后称重。移至Dex培养基的一周龄幼苗比未诱导的植物重1.1-1.3倍，15天龄的幼苗重1.3-1.8倍，25天龄的幼苗重1.4-2.6倍。诱导的植物重量增加是因为叶较大，茎较粗，根较多所致，叶大小是主要因素。通过扫描电镜(SEM)分析植物不同部分的叶表皮细胞。SEM示出老叶的细胞大于对照细胞，而新生长的叶细胞大小无明显不同。代表品系的垂直生长的根示于图6。在Dex诱导的品系中产生更多更长的侧根。从48小时诱导的植物及模拟对照中制备总RNA，并通过用nac1的C末端特异探针探查Northern印迹而测定。结果表明所有四个转基因品系均示出转基因被表达。此转基因mRNA的大小比天然mRNA大且易于辨别。

两个其余的过表达品系以及所有四个选择的反义转基因植物品系示出一些不同表型组合的形态。两个过表达品系之一和反义品系之一示出在幼苗阶段子叶的向上卷曲表型。在晚期营养花序发育阶段未检测到明显表型。两个反义品系在幼苗以及cuc2突变体中示出非常典型的表型。在此情况中，单一的心形和融合的子叶及更进一步的玫瑰花结形幼苗以7-10％的低百分率在萌发幼苗中检测到。不能产生茎尖分生组织的这些幼苗的大部分在后期死亡。

反义品系之一和一个过表达品系在所有幼苗和营养生长阶段期间，未呈现出任何不同于未诱导植物之处。但在花序发育阶段，开花器官尤其花瓣和雄蕊受到影响。此表型在花序的首先开的一些花中发现。这些花的花瓣和雄蕊小，且那些具有更明显表型的花不能充分开放。其中有一些可以开放，但雄蕊明显较短。这些花是雄性及雌性不育的。这种表型与另一个拟南芥NAC家族成员-NAP基因的过表达重叠。

C末端特异性NAC1基因的转基因拟南芥植物的低表达

由于NAC基因家族的成员在N末端是高度保守的，不仅在氨基酸水平而且在核苷酸序列水平，此区域的反义核酸将影响如矮牵牛属植物中所示的同源基因。因此，如上述用载体pTA7002制备C末端特异性反义构建体，并转化入拟南芥中。就此构建体而言，我们使用0.6kb的BamHI-NotI C-末端片段。Northern印迹显示当用此片段作为我们选择用于分析的6个纯合品系中的4个品系的探针时，在所有组织中只有一条相应于NAC1基因的条带。所有显示出的相似表型主要影响子叶和根的发育。在植物生长的所有其它阶段未检测到明显的表型。本文阐述了一个代表性的C末端特异性反义植物品系。野生型或未诱导的幼苗的子叶呈现轻微的向下卷曲及平滑的表面。在发芽生长的第一周，在子叶发育中未检测到明显的表型，但在10天龄的幼苗中，有20-25％示出明显的子叶向上卷曲的表型。少数也示出向后的卷曲表型。此现象在光学显微镜下甚至用肉眼即可易于检测。在晚期阶段，在子叶的表面可见到黑点。远轴表皮细胞通过SEM检测，在所有子叶表面均发现异常细胞扩展，尽管严重性水平不同(图7)。那些细胞丧失正常的令人难解的结构，并成为具有不同细胞大小和细胞形状的异常细胞(图7C，7F和7G)。在光学显微镜下未示出严重或明显向上卷曲表型的那些75-80％幼苗的子叶也通过SEM检测。SEM结果表明那些子叶的表面细胞也是异常的。细胞看起来是膨胀的且更加扩展。

根的表型在垂直生长的幼苗上易于检测。种子在MS或MS加Dex的培养基上发芽生长。在发芽生长一周后，将幼苗移自相同的新鲜培养基中并持续生长一周，然后检测。含有C末端反义表达的幼苗中产生少量的根。三个品系具有短或少量侧根，一个品系几乎没有侧根。具有短或少量侧根的那些幼苗通过显微镜检测，发现侧根可以原发但不能延长。因此，此幼苗看起来比未诱导的幼苗具有较少的根(图8)。从在液体中生长的C末端反义植物中得到相似结果。将一周龄的幼苗加入液体MS或MS加Dex的培养基中，生长12天后的幼苗未诱导的根比诱导的根大。

本发明在以下实施例中得以进一步阐述，实施例只是举例说明本发明而非以任何方式限制本发明。实施例使用的是本领域熟知的标准方法或以下特别阐述的方法。

实施例1：植物材料和生长条件

实验中使用Arabidopsis thaliana lansberg生态型。种子用20％漂白剂加上0.01％Triton X-100灭菌，并用无菌水冲洗三次。在最后一次冲洗之后，向种子中加入0.15％琼脂糖，并将它们铺板于具有3％蔗糖的不同浓度MS或MS加地塞米松(Dex)的培养基上。将平板在4℃温育二天，并在长日照条件下(光照16小时/黑暗8小时)在22℃移至组织培养室中。在2-3周后，将幼苗栽到土壤中，并在22℃和75％湿度的光周期为光照16小时/黑暗8小时的生长室中生长。

就Dex处理而言，将地塞米松(Sigma)溶解于DMSO中，产生100mM的地塞米松母液，在-20℃贮存。对于体外生长的植物，将Dex以0.1，1和10μM浓度加入平板中。持续每周向培养基中加入一次Dex。使用photocon和plantcon。Dex首先溶解于1/25th体积培养基的无菌水中，然后加入培养基的表面。为处理在土壤中生长的植物，以30μM将Dex加入到含0.01％Triton X-100的无菌水中，然后喷洒至植物的所有表面，两天一次。模拟对照是将含有0.01％TritonX-100的无菌水喷洒至相同数量的植物上。

实施例2：转化构建体和植物转化

含有完全的二组分糖皮质激素诱导系统的双向转化质粒pTA7002(Aoyama和Chua，1997)用作载体。就过表达和完全反义构建体而言，将含有完整NAC1编码cDNA的长度为1287个碱基对的SalI-NotI片段平端化，并克隆入经XhoI酶切及牛小肠碱性磷酸酶处理的pTA7002载体中。为制备C末端特异性反义构建体，将含有NAC1编码cDNA的C末端特异区的长度为605个碱基对的BamHI-NotI片段平端化，并克隆入如上述的pTA7002载体中。对于含有GFP-NAC1融合表达盒的转基因构建体，将通过PCR产生的只含有NAC1编码区的NaeI-SalI片段克隆入由NaeI和SalI酶切的中间GFP融合载体pGFP2(GA)5II中，以产生质粒pGFPNAC1。然后将GFPNAC1融合体通过XbaI和PacI酶切，并用如上相同步骤克隆入pTA7002载体中。Arabidopsis thaliana lansberg的根用作用于转化的植物材料(Valvekens等，1988)。将T2种子在含有20μg/ml潮霉素B的SM平板上发芽生长，以选择抗性植物及移至土壤中以产生并获得纯合T3种子。单一插入每个构建体的纯合T4植物的两个独立品系用于详细分析。

实施例3：Northern分析和原位全样载片分析

使用Qiagen RNA制备试剂盒从不同组织中分离全部RNA。根据Nagy等(1988)所述进行Northern印迹分析。覆盖200-324位氨基酸的PCR片段用a-³²P dCTP，使用Rediprimed标记试剂盒(Amersham International)标记以作为探针。将整个植物或花固定以进行整量原位杂交。NAC1的C末端特异性区域的反义RNA用地高辛UTP(Boehringer Biochemica，Mannheim，Germany)标记。杂交用碱性磷酸酶缀合的抗地高辛Fab片段检测。作为对照探针，有义转录物用T3转录酶制备自相同克隆。

实施例4：酵母双杂交分析

双杂交分析(Bartel等；Fields和Song，1989；Chevray和Nathans，1992；Lee等，1995)用于二聚体化分析。使用含有两个报道基因LacZ和HIS3的酵母菌株HF7c(MATa ura3-52 his3-200 ade2-101 lys2-801trp1-901 leu2-3112 gal4-542 gal80-538 LYS2∷GAL1 UAS-GAL1TATA-HIS3 URA3∷GAL4_17mer(x3)-CyC1_TATA-LacZ)。通过本领域技术人员熟知的方法，用携带不同的Gal4 DNA结合结构域和Gal4激活结构域融合体的质粒联合转化酵母。例如见Burke和Olson，1986；Rudolph等，1985；Sakai等，1984所述。其它条件在别处已经详述且已为本领域技术人员所熟知。为证实两个融合蛋白之间的相互作用，通过影印滤膜分析对β-半乳糖苷酶进行分析。

将两种NAC1克隆入Gal4 DNA结合结构域载体pGBT8中，pGBT8是pGBT9(Clontech)的衍生物，其含有更通用多接头。质粒pGBNAC11-324含有融合于Gal4 DNA结合结构域的NAC1的完整开放读框。质粒pGBNAC11-199只含有在相同载体上的编码前199个氨基酸的核酸。将不同的截短形式的NAC1融合于Gal4激活结构域载体pGAD424。质粒pGANAC11-324含有NAC1的完整开放读框。质粒pGANAC11-199含有编码NAC1的前199个氨基酸的核酸。质粒pGANAC11-142含有编码NAC1的前142个氨基酸的核酸，质粒pGANAC1143-324含有编码143位氨基酸至肽的C末端的核酸。

实施例5：通过粒子轰击转染表皮细胞

将花瓣切成2×2cm的片并置于用液体MS培养基浸泡的滤膜上。将2μg每种质粒组合用1100psi的氦压用于在27英尺汞柱真空中的每个茎干。在轰击之后将平板在植物生长室中温育过夜(16小时)，并将50mM荧光素(Promega)喷洒在材料上。在温育10分钟后检测结果。

实施例6：GST-融合蛋白的产生及DNA结合

将含有NAC1基因的完整编码区的PCR产物克隆入pGEX-4-2T中，以产生pGST-NAC1融合构建体。GST-NAC11-199通过用BamHI和SalI酶切pGST-NAC1而产生，用Klenow处理并再连接以产生只含有NAC1蛋白的前199个氨基酸的pGST-NAC11-199。GST-NAC11-132通过用XhoI和SalI酶切并再连接而获得。GST-NAC1133-324通过将原始cDNA中的XhoI-NotI片段克隆入pGEX-4-2T中而构建。将质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。转化体生长至OD₆₀₀为0.6-0.9，然后通过加入IPTG至0.4mM进行诱导，以在30℃表达融合蛋白4小时。用PBS冲洗细胞一次并再悬浮于GST缓冲液中(GCB：50mM Tris-HCl pH8.0，200mM NaCl，1mMEDTA，1％TritonX-100，10mM β-巯基乙醇，各5μg/ml亮抑蛋白酶肽、胃蛋白酶抑制剂和抑蛋白酶肽，及1mM PMSF)。细胞在冰上通过超声处理裂解(5×30秒)，裂解物通过离心而澄清(12000rpm，15分钟)。通过在谷胱甘肽-琼脂糖珠(Pharmacia)上亲和层析回收融合蛋白。DNA结合反应液含有2×10⁵cpm DNA探针，5μL 4x反应缓冲液(100mMNaCl，40mM HEPES，pH7.5，2mM EDTA，20％甘油，140mM a-巯基乙醇)，0.5μg聚dIdC(Pharmacia)，1μL 1％Nonidet P40和不同数量的蛋白质，总体积为20μL。将10μL反应液用于4-6％1/2TBE天然凝胶上。将长度为100个碱基对的含有35S-90区域的BamHI片段，在Klenow标记反应中用α-³²PdCTP标记。

应知本发明优选的实施方案是举例说明而非限制本发明之意，本领域技术人员在本发明精神和所附权利要求范围内对本发明可加以修改。

参考文献：

Aida M，等(1997)，植物细胞9：841-857

Aoyama T和Chua N-H(1997)植物杂志11：605-612

Bartel PL等，“用双杂交系统检测蛋白质-蛋白质之间的相互作用”，发育中细胞间相互作用实用方法，牛津大学出版社，pp153-179Burke DT和Olson MV(1986)，DNA 5：325-332

Chevray PM和Nathans DN(1992)，美国科学院院报89：5789-5793

Fields S和Song O-K(1989)，自然340：245-246

John I等，植物分子生物学33：641-651

Lee JE等，科学268：836-844

Nagy F等(1988)，植物分子生物学手册，B4(Gelvin S和SchilperoortR编辑)，Dordrecht，新西兰，Kluwer科学出版社，pp1-12Rudolph H等(1985)，基因36：87-95

Sablowski RWM和Meyerowitz EM(1998)，细胞92：93-103

Sakai K等(1984)，细胞分子生物学4：651-656

Souer E等，(1996)，细胞85：159-170

Valvekens D等(1988)，美国科学院院报85：5536-5540

Xia Q等(1996)，植物杂志10：761-769

序列表

<110>谢旗

蔡南海

国立新加坡大学分子农业生物学院

<120>编码参与子叶和侧根发育的转录因子的植物基因NAC1

<130>2248-115

<140>未知

<141>1999-02-11

<160>2

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>1287

<212>DNA

<213>Arabidopsis thaliana

<220>

<221>CDS

<222>(89)..(1060)

<400>1

gtcgaccacg cctccgtctt tatctctctt ttcctcttaa ccatccacta atcaaacact 60

aaaacctaga aaaaaaaagg atcaaatc atg gag acg gaa gaa gag atg aag 112

Met Glu Thr Glu Glu Glu Met Lys

1 5

gaa agt agt ata agc atg gtg gag gca aag ttg cct ccg gga ttc aga 160

Glu Ser Ser Ile Ser Met Val Glu Ala Lys Leu Pro Pro Gly Phe Arg

10 15 20

ttt cac ccg aag gac gat gag ctt gtc tgc gat tac ttg atg aga cga 208

Phe His Pro Lys Asp Asp Glu Leu Val Cys Asp Tyr Leu Met Arg Arg

25 30 35 40

tcg ctt cac aat aat cat cga cca cct ctt gtc ctg atc caa gtc gat 256

Ser Leu His Asn Asn His Arg Pro Pro Leu Val Leu Ile Gln Val Asp

45 50 55

ctc aac aag tgt gag cct tgg gac atc cca aaa atg gca tgc gtg gga 304

Leu Asn Lys Cys Glu Pro Trp Asp Ile Pro Lys Met Ala Cys Val Gly

60 65 70

ggg aag gat tgg tat ttc tac agc caa aga gac cga aaa tac gcg acg 352

Gly Lys Asp Trp Tyr Phe Tyr Ser Gln Arg Asp Arg Lys Tyr Ala Thr

75 80 85

ggg ctg aga act aac cga gca acg gcc acc gga tat tgg aaa gcc acc 400

Gly Leu Arg Thr Asn Arg Ala Thr Ala Thr Gly Tyr Trp Lys Ala Thr

90 95 100

ggc aaa gac aga acc att cta aga aag ggt aag cta gtt ggg atg agg 448

Gly Lys Asp Arg Thr Ile Leu Arg Lys Gly Lys Leu Val Gly Met Arg

105 110 115 120

aag aca ttg gtt ttc tat caa ggt cga gct cct cga ggc cgt aaa acc 496

Lys Thr Leu Val Phe Tyr Gln Gly Arg Ala Pro Arg Gly Arg Lys Thr

125 130 135

gat tgg gtc atg cac gaa ttc cgt ctc caa gga tct cat cat cct ccc 544

Asp Trp Val Met His Glu Phe Arg Leu Gln Gly Ser His His Pro Pro

140 145 150

aat cat tct ctg agc tct cca aag gaa gac tgg gtc ttg tgt agg gta 592

Asn His Ser Leu Ser Ser Pro Lys Glu Asp Trp Val Leu Cys Arg Val

155 160 165

ttc cat aag aat acg gaa gga gtt ata tgt aga gac aac atg gga agc 640

Phe His Lys Asn Thr Glu Gly Val Ile Cys Arg Asp Asn Met Gly Ser

170 175 180

tgt ttt gat gag aca gcc tct gca tcg ctt cct cca ctg atg gat cct 688

Cys Phe Asp Glu Thr Ala Ser Ala Ser Leu Pro Pro Leu Met Asp Pro

185 190 195 200

tac atc aac ttt gac caa gaa ccc tct tct tat ctc agt gat gat cat 736

Tyr Ile Asn Phe Asp Gln Glu Pro Ser Ser Tyr Leu Ser Asp Asp His

205 210 215

cac tac atc atc aat gag cac gta ccc tgc ttc tcc aat ttg tca cag 784

His Tyr Ile Ile Asn Glu His Val Pro Cys Phe Ser Asn Leu Ser Gln

220 225 230

aac caa acc tta aac tcg aac cta acc aac tca gtc tct gaa ctc aag 832

Asn Gln Thr Leu Asn Ser Asn Leu Thr Asn Ser Val Ser Glu Leu Lys

235 240 245

att cca tgc aag aac cct aac ccc ttg ttt act ggt ggt tca gcc tca 880

Ile Pro Cys Lys Asn Pro Asn Pro Leu Phe Thr Gly Gly Ser Ala Ser

250 255 260

gcc acg ctc aca ggc ctc gac tca ttc tgt tct tca gat cag atg gtt 928

Ala Thr Leu Thr Gly Leu Asp Ser Phe Cys Ser Ser Asp Gln Met Val

265 270 275 280

ctc aga gct cta ctc agt cag ctc act aag att gat gga agc ctc ggg 976

Leu Arg Ala Leu Leu Ser Gln Leu Thr Lys Ile Asp Gly Ser Leu Gly

285 290 295

cct aaa gaa tca cag agt tat gga gaa ggt agc tcg gag agc ctc ctg 1024

Pro Lys Glu Ser Gln Ser Tyr Gly Glu Gly Ser Ser Glu Ser Leu Leu

300 305 310

acc gac atc ggt att cca agc act gtt tgg aat tgc tgatgatcga 1070

Thr Asp Ile Gly Ile Pro Ser Thr Val Trp Asn Cys

315 320

gtgtaacgag agttactatt gctatattcc tatccatgat tggaacaatt cttcgggggg 1130

aaataacgtg tgcttgtctg attgtacaaa catttcctca ctcttgtacc cacggtagat 1190

tcatgtaaaa taccacttat gacgctagac atacatatat ttcatcgtag ttccatttgt 1250

ttcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaggg cggccgc 1287

<210>2

<211>324

<212>PRT

<213>Arabidopsis thaliana

<400>2

Met Glu Thr Glu Glu Glu Met Lys Glu Ser Ser Ile Ser Met Val Glu

1 5 10 15

Ala Lys Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Lys Asp Asp Glu Leu

20 25 30

Val Cys Asp Tyr Leu Met Arg Arg Ser Leu His Asn Asn His Arg Pro

35 40 45

Pro Leu Val Leu Ile Gln Val Asp Leu Asn Lys Cys Glu Pro Trp Asp

50 55 60

Ile Pro Lys Met Ala Cys Val Gly Gly Lys Asp Trp Tyr Phe Tyr Ser

65 70 75 80

Gln Arg Asp Arg Lys Tyr Ala Thr Gly Leu Arg Thr Asn Arg Ala Thr

85 90 95

Ala Thr Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Lys Asp Arg Thr Ile Leu Arg

100 105 110

Lys Gly Lys Leu Val Gly Met Arg Lys Thr Leu Val Phe Tyr Gln Gly

115 120 125

Arg Ala Pro Arg Gly Arg Lys Thr Asp Trp Val Met His Glu Phe Arg

130 135 140

Leu Gln Gly Ser His His Pro Pro Asn His Ser Leu Ser Ser Pro Lys

145 150 155 160

Glu Asp Trp Val Leu Cys Arg Val Phe His Lys Asn Thr Glu Gly Val

165 170 175

Ile Cys Arg Asp Asn Met Gly Ser Cys Phe Asp Glu Thr Ala Ser Ala

180 185 190

Ser Leu Pro Pro Leu Met Asp Pro Tyr Ile Asn Phe Asp Gln Glu Pro

195 200 205

Ser Ser Tyr Leu Ser Asp Asp His His Tyr Ile Ile Asn Glu His Val

210 215 220

Pro Cys Phe Ser Asn Leu Ser Gln Asn Gln Thr Leu Asn Ser Asn Leu

225 230 235 240

Thr Asn Ser Val Ser Glu Leu Lys Ile Pro Cys Lys Asn Pro Asn Pro

245 250 255

Leu Phe Thr Gly Gly Ser Ala Ser Ala Thr Leu Thr Gly Leu Asp Ser

260 265 270

Phe Cys Ser Ser Asp Gln Met Val Leu Arg Ala Leu Leu Ser Gln Leu

275 280 285

Thr Lys Ile Asp Gly Ser Leu Gly Pro Lys Glu Ser Gln Ser Tyr Gly

290 295 300

Glu Gly Ser Ser Glu Ser Leu Leu Thr Asp Ile Gly Ile Pro Ser Thr

305 310 315 320

Val Trp Asn Cys

Claims

1.一种与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的蛋白质具有至少90％相同性的分离的蛋白质，其中所述分离的蛋白质是SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的蛋白质的功能等价物。

2.权利要求1的分离的蛋白质，所述分离的蛋白质由SEQ IDNO：2的氨基酸序列组成。

3.权利要求1的分离的蛋白质，其中所述蛋白质与权利要求2所述的蛋白质具有至少95％相同性。

4.一种编码权利要求1的蛋白质的分离的核酸。

5.权利要求4的核酸，所述核酸是包含SEQ ID NO：1的89-1060位核苷酸的分离的核酸。

6.一种制备转基因植物细胞的方法，包括将权利要求4的核酸插入相同物种的未转基因的植物细胞中。

7.一种转基因植物细胞，其包含权利要求4的核酸。

8.一种培养植物的方法，包括用权利要求4的核酸转化所述植物，并选择比相同物种未转化植物生长更快的植物，其中所述转化的植物具有比未转化植物更大的叶、更粗的干和/或更多的侧根。

9.权利要求8的方法，其中所述核酸由糖皮质激素激活的启动子控制。

10.权利要求9的方法，其中所述转化的植物是用糖皮质激素处理的。

11.权利要求10的方法，其中所述糖皮质激素是地塞米松。

12.权利要求8的方法，其中所述植物用权利要求5的核酸转化。